CN106148225A - 一种枯草芽孢杆菌、其筛选方法和用途及生物防腐剂、其制备方法以及果蔬防腐方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌、其筛选方法和用途及生物防腐剂、其制备方法以及果蔬防腐方法，所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌Cy‑29，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2013年7月12日，保藏编号为CGMCC 7916。所述生物防腐剂包括上述的枯草芽孢杆菌Cy‑29，所述果蔬防腐方法包括使用上述枯草芽孢杆菌Cy‑29的发酵产物的方法。本发明通过枯草芽孢杆菌Cy‑29的定植，生长和/或其产生的抑菌物质的拮抗作用有效抑制果实的呼吸作用，明显降低果实冷藏期间的腐烂率且多种植物病原真菌具有较强的抑制作用。

Description

一种枯草芽孢杆菌、其筛选方法和用途及生物防腐剂、其制备 方法以及果蔬防腐方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌、其筛选方法和用途及生物防腐剂、其制备方法以及果蔬防腐方法。
背景技术
农业生产中，植物病害是导致作物产量损失和品质下降的主要原因之一，其中大部分由真菌引起。据报道，发达国家每年有10％-30％的新鲜水果损失于采后腐烂，而在缺乏冷藏贮运设施的发展中国家，果实腐烂率则超过40％，而引起果实腐烂的大多为真菌。在实际生产过程中，植物病害防治主要依赖于化学农药，化学农药在保护农业生产方面起到重大作用。但其长期普遍使用会导致病原菌产生抗药性、产品农药残留超标、环境污染等系列问题，同时也使本身具有优良品质的农产品因农药的过渡而受影响。所以，保证农产品优质高产、保护生态环境的病害防治技术的研究势在必行。而生物防治，作为有望代替化学药剂的一种安全、高效的新方法成为当前的研究热点。目前植物病害生防微生物已涉及真菌、放线菌、细菌乃至病毒(噬菌体)等很多生物群类，其中枯草芽孢杆菌在生物防治中应用较为广泛。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种嗜热、好氧、产芽孢的G+杆状细菌。对人畜无毒无害，不污染环境，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。在自然界中分布广泛，不仅可以在土壤、植物根际、体表等外界环境中生长，还是植物体内常见的内生细菌。其突出特点是生长快、营养简单，有利于生防菌剂的生产、剂型加工及在环境中的存活、定殖与繁殖，且批量生产工艺简单，成本较低，施用方便，储存期长，是一种理想的生防微生物。目前国内外已有关于芽孢杆菌作为生防菌应用于多种植物生长病害和贮藏病害防治中的研究报道。
例如申请公布号为CN101870959A的发明专利公开了一种枯草芽孢杆菌、其菌剂、以及其制剂在水果保鲜领域的应用，涉及的枯草芽孢杆菌命名为Bacillussubstilis J18，现保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏 号为CGMCC No：3665，菌株经过发酵培养后，制成发酵剂，发酵剂分别与氯化钙和壳聚糖溶液混合制成干粉剂和被膜剂，其对梨采后黑斑病同时对梨轮纹病、葡萄灰霉病、西瓜枯萎病等都有显著的防治效果。但其仅对梨采后病原菌一黑斑病有显著拮抗效果，并不具有对其他易腐烂水果产生有效防腐的作用效果，并且其具有广谱性不佳的缺点，同时该菌株对果蔬所产生的呼吸抑制效果不明显，进一步降低了防腐效果。
由此可见，能否基于现有技术中的不足，筛选出一种具有高效广谱性、防腐效果好，同时能够有效的抑制采摘后果蔬的呼吸作用，成为本领域技术人员亟待解决的技术难题。
发明内容
本发明为了解决上述技术问题，提供了一种来源于土壤的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cy-29，最初来源于果园的土壤样本，样本经过梯度稀释，分离纯化之后得到对植物病原真菌有抑制作用的菌株，并对菌株进行鉴定，最终得到的菌株具有高效广谱性，防腐效果好，同时能够有效抑制采摘后果蔬的呼吸作用。
为了达到上述技术效果，本发明包括以下技术方案：
一种枯草芽孢杆菌，所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cy-29，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2013年7月12日，保藏编号为CGMCC 7916。
本发明在土壤中提取并筛选出一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cy-29，最初来源于果园的土壤样本，样本经过梯度稀释，分离纯化之后得到对植物病原真菌有抑制作用的菌株，并对菌株进行鉴定得到。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cy-29及其发酵产生的抑菌物质具有较强的广谱抗真菌作用，对于多种植物生长病原真菌和果蔬贮藏真菌有较好的抑制作用，为植物生长病害和果蔬贮藏病害的生物防治提供了依据。枯草芽孢杆菌Cy-29发酵所产生的抑菌物质具有以下性质：耐热性良好，能耐受121℃的高温；在pH在3-10内能保持较高的活性，作用范围较广；短时间紫外线照射对其影响较小；经木瓜蛋白酶处理后仍有部分活性。
进一步的，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cy-29的细胞呈短杆状， 革兰氏染色为阳性，存在芽孢。在营养琼脂培养基上，菌落表明粗糙，低凸起，边缘不规则，无光泽不透明。
进一步的，所述枯草芽孢杆菌的16S rDNA序列长1589bp，其序列如SEQ ID No.1所示。同源比对结果表明：该序列与序列号为序号为FR729926的枯草芽孢杆菌ZWQ-1的16SrDNA序列同源性最高，相似性为99％，结合菌体形态特征，生理生化鉴定结果确定Cy-29属于芽孢杆菌(Bacillus)，为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
一种上述枯草芽孢杆菌在制备植物生长抗菌剂或果蔬防腐剂中的应用。
一种上述的枯草芽孢杆菌的筛选方法，包括以下步骤：取土壤置于无菌水中振荡均匀，与恒温水浴保温后进行梯度稀释，取土壤稀释液涂布于指示板，挑选出对指示菌指状青霉有抑制作用的菌落置于牛肉膏蛋白胨培养平板上纯化，将纯化后的拮抗菌株进行抑菌效果检测，筛选得到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cy-29。
进一步的，所述指示板的制备方法包括以下步骤：配制指状青霉孢子悬液，将指状青霉孢子悬液加入PDA固体培养基中倾注含指示菌孢子的指示平板中；
所述牛肉膏蛋白胨培养平板中的牛肉膏蛋白胨培养基的制备方法包括以下步骤：取以下重量份数1～10份的牛肉膏、5～20份的蛋白胨和3～15份的NaCl作为原料组分，加入去蒸馏水至总重量份数为1000份，调节pH值至7.0～7.2，灭菌处理得到牛肉膏蛋白胨培养基；
所述PDA固体培养基的制备方法包括以下步骤：取重量份数为100～400份的马铃薯、10～35份的葡萄糖和10～25份的琼脂粉，加入去蒸馏水至总重量份数为1000份，调节pH值至7.0～7.2，灭菌处理得到PDA固体培养基。
上述的牛肉膏蛋白胨培养基和PDA固体培养基配方成分设计合理，且该配方成分的培养基能够筛选得到本发明所述的枯草芽孢杆菌Cy-29。
一种生物防腐剂，包括上述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cy-29的发酵产物。
本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cy-29产生的发酵产物，其对多种植物病原真菌具有较强的抑制作用，有效抑制果实的呼吸作用，明显降低 果实冷藏期间的腐烂率。
进一步的，所述的发酵产物为菌悬液和/或发酵上清液，所述菌悬液的菌体浓度为107CFU/mL。
优选地，所述的菌悬液为对数期的枯草芽孢杆菌Cy-29菌悬液，所述发酵上清液为稳定期的枯草芽孢杆菌Cy-29的发酵上清液。
一种上述的生物防腐剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：枯草芽孢杆菌Cy-29的活化：取枯草芽孢杆菌Cy-29于牛肉膏蛋白胨琼脂培养平板进行划线，置于培养箱中培养，挑取单菌落再次在牛肉膏蛋白胨琼脂培养平板划线，继续置于培养箱中培养得到活化的枯草芽孢杆菌Cy-29单菌落；
步骤二：枯草芽孢杆菌Cy-29的发酵产物的制备：取活化的枯草芽孢杆菌Cy-29单菌落于牛肉膏蛋白胨培养基中，振荡培养制得种子液，将所述种子液接种于LNB培养基中，振荡培养获得枯草芽孢杆菌Cy-29的发酵产物。
进一步的，所述的发酵产物为菌悬液和/或发酵上清液，振荡培养获得枯草芽孢杆菌Cy-29的发酵产物的方法为：37℃条件下于180r/min振荡培养14h后，获得对数期的枯草芽孢杆菌Cy-29菌悬液；继续培养30h后，将菌悬液离心处理，取上清液即获得稳定期的枯草芽孢杆菌Cy-29的发酵上清液。
一种果蔬防腐方法，包括以下步骤：将采摘的果蔬经散热处理后喷洒生物防腐剂，所述生物防腐剂为上述的生物防腐剂。
采用上述技术方案，包括以下有益效果：本发明提供一种枯草芽孢杆菌、其筛选方法和用途及生物防腐剂、其制备方法以及果蔬防腐方法，通过枯草芽孢杆菌Cy-29的定植，生长和/或其产生的抑菌物质的拮抗作用，有效抑制果实的呼吸作用，明显降低果实冷藏期间的腐烂率且对多种植物病原真菌具有较强的抑制作用，本发明提供的筛选方法科学合理，有效筛选出抑菌效果更优，且使筛选的枯草芽孢杆菌Cy-29能够有效降低过时腐烂率；同时本发明提供的生物防腐剂广谱高效、无毒的然微生物活菌防腐保鲜剂，其喷涂于果蔬表面，能够有效抑制果实的呼吸作用，同时具有很强的生物拮抗作用，在果蔬的表面形成一道有力的生物屏障，抵御和防止其他腐败细菌的侵染和繁殖，达到防治果蔬腐烂 变质的目的，增加果蔬的保鲜期和货架寿命，减少经济损失，另外本发明提供的生物防腐剂的制备方法工艺合理简便，适合批量工业化生产。本发明提供的果蔬防腐方法，采用枯草芽孢杆菌Cy-29的发酵产物，针对果蔬防腐效果明显，通过降低果蔬的呼吸作用和对腐败细菌的抑制作用，双重作用方式明显的降低了果蔬的腐烂率，与现有的筛选得到的枯草芽孢杆菌相比，其防腐效果更佳，大大延长了果蔬的保鲜期，尤其是针对猕猴桃、木瓜或芒果等易腐烂水果，防腐效果更佳明显，且无任何危害。
附图说明
图1为本发明对数期的枯草芽孢杆菌Cy-29菌悬液处理猕猴桃对其呼吸强度的影响；
图2为本发明对数期的枯草芽孢杆菌Cy-29菌悬液处理猕猴桃对其腐烂率的影响；
图3为本发明稳定期的枯草芽孢杆菌Cy-29发酵上清液处理猕猴桃对其呼吸强度的影响；
图4为本发明稳定期的枯草芽孢杆菌Cy-29发酵上清液处理猕猴桃对其腐烂率的影响；
图5枯草芽孢杆菌C y-29与相近菌株16S rDNA序列进行同源比对构建的系统发育树。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明做进一步的详细描述。
实施例一：一种枯草芽孢杆菌，所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)Cy-29，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会微生物中心，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2013年7月12日，保藏编号为CGMCC 7916。
本发明在土壤中提取并筛选出一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cy-29，最初来源于果园的土壤样本，样本经过梯度稀释，分离纯化之后得到对植物病原真菌有抑制作用的菌株，并对菌株进行鉴定得到。枯 草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cy-29及其发酵产生的抑菌物质具有较强的广谱抗真菌作用，对于多种植物生长病原真菌和果蔬贮藏真菌有较好的抑制作用，为植物生长病害和果蔬贮藏病害的生物防治提供了依据。
枯草芽孢杆菌Cy-29发酵所产生的抑菌物质具有以下性质：耐热性良好，能耐受121℃的高温；在pH在3-10内能保持较高的活性，作用范围较广；短时间紫外线照射对其影响较小；经木瓜蛋白酶处理后仍有部分活性。
采用牛津杯法进行抑菌实验，每个含菌平板内放置一个灭菌牛津杯，在牛津杯中加入250μL无菌发酵液，每株供试菌含菌平板做3个平行，同时准备空白对照平板一个，牛津杯中加入250μL无菌水，30℃培养4-5d，观察枯草芽孢杆菌Cy-29抑菌效果，结果表1所示。
表1枯草芽孢杆菌Cy-29的酵上清液对真菌的抑制效果
病原菌 抑菌效果 病原菌 抑菌效果
禾谷镰刀病菌 - 葡萄座腔菌 +
土豆早疫病菌 - 桃褐腐病菌 +
西瓜枯萎病菌 + 尖孢炭疽菌 +
玉米大斑病菌 - 扩展青霉 +
莴苣灰霉病菌 - 指状青霉 +
注：“+”表示有抑菌效果，“-”表示无抑菌效果
试验结果表明，枯草芽孢杆菌Cy-29对多种植物病原真菌具有较强的抑制作用。相对比现有技术中筛选得到的枯草芽孢杆菌本发明的枯草芽孢杆菌Cy-29对植物病原真菌的抑菌范围更广，大大优于现有技术中的枯草芽孢杆菌。
实施例二：一种枯草芽孢杆菌，所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)Cy-29，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2013年7月12日，保藏编号为CGMCC 7916。所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cy-29的细胞呈短杆状，革兰氏染色为阳性，存在芽孢。在营养琼脂培养基上，菌落表明粗糙，低凸起，边缘不规则，无光泽不透 明。
实施例三：一种枯草芽孢杆菌，所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)Cy-29，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2013年7月12日，保藏编号为CGMCC 7916。所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cy-29的细胞呈短杆状，革兰氏染色为阳性，存在芽孢。在营养琼脂培养基上，菌落表明粗糙，低凸起，边缘不规则，无光泽不透明。所述枯草芽孢杆菌的16S rDNA序列长1589bp，其序列如SEQ ID No.1所示。
实施例四：一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cy-29在制备植物生长抗菌剂或果蔬防腐剂中的应用。
枯草芽孢杆菌Cy-29的发酵液进行抑菌活性测定：
具体步骤如下：
枯草芽孢杆菌Cy-29活化：从保种斜面挑取枯草芽孢杆菌Cy-29，在牛肉膏蛋白胨琼脂培养平板进行划线，于37℃培养箱中培养24-48h；再次挑取单菌落在牛肉膏蛋白胨琼脂培养平板划线，于37℃培养箱中培养15h。
枯草芽孢杆菌Cy-29发酵液制备：挑取活化的Cy-29单菌落接种于5mL牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃、180r/min振荡培养15h制备种子液；再将种子液按10％接种量接种于50mLNB培养基中，37℃、180r/min振荡培养32h后，于4℃、8000r/min离心20min取上清液沸水浴处理30min。
指示平板制备：调整10株供试真菌孢子悬液浓度，制备带菌PDA指示平板。
采用牛津杯法进行抑菌实验，每个含菌平板内放置一个灭菌牛津杯，在牛津杯中加入250μL无菌发酵液，每株供试菌含菌平板做3个平行，同时准备空白对照平板一个，牛津杯中加入250μL无菌水，30℃培养4-5d，观察抑菌效果，结果表2所示。
表2枯草芽孢杆菌Cy-29的发酵上清液对真菌的抑制效果
注：“+”表示有抑菌效果，“-”表示无抑菌效果
试验结果表明，枯草芽孢杆菌Cy-29对多种植物病原真菌具有较强的抑制作用。相对比现有技术中筛选得到的枯草芽孢杆菌本发明的枯草芽孢杆菌Cy-29对植物病原真菌的抑菌范围更广，大大优于现有技术中的枯草芽孢杆菌。
针对猕猴桃防腐作用效果实验：
具体包括以下步骤：
以红阳猕猴桃为实验材料，采于四川省雅安市。
(1)采摘猕猴桃后选择无病害、无损伤的果实16℃散热12h；
(2)散热后的猕猴桃分为三组，第一组不做任何处理，直接放置于0-2℃冷藏；第二组用实施例十三的枯草芽孢杆菌Cy-29对数期菌悬液喷洒，晾干后置于0-2℃冷藏；第三组用实施例十三的枯草芽孢杆菌Cy-29稳定期发酵上清液喷洒，晾干后0-2℃冷藏。
定期测定果实的呼吸强度和腐烂率。每个实验组设置3个平行。
检测标准：
果实呼吸强度：采用静置法对鲜果进行测定，结果以CO2mg/kg.h表示。
果实腐烂率：腐烂果实占检查果实的百分数。
实验结果：观察用枯草芽孢杆菌Cy-29对数期菌悬液处理果实与对照组呼吸强度实验结果，显示在贮藏的第14d对照组的呼吸强度达到了最大值235.35mg/kg.h，然后迅速下降，而实验组果实呼吸强度21d才达到最大值102.58mg/kg.h，说明经过枯草芽孢杆菌Cy-29对数期菌悬液处理的实验组则较好地抑制了果实呼吸强度，参见图1。
观察用枯草芽孢杆菌Cy-29对数期菌悬液处理果实与对照腐烂率实验 结果，显示实验组果实腐烂速度明显较慢，到贮藏结束，对照组腐烂率达30％，实验组腐烂率只有13％。整个贮藏期，未经处理的对照组腐烂率始终高于实验组，参见图2。
观察用枯草芽孢杆菌Cy-29稳定期发酵上清液处理果实与对照组呼吸强度实验结果，显示实验组呼吸强度在整个试验期间均低于对照组，峰值出现在第14d，为168.9mg/kg.h，明显低于对照组235.35mg/kg.h，说明枯草芽孢杆菌Cy-29稳定期发酵上清液处理较好地降低了果实呼吸强度，参见图3。
观察用枯草芽孢杆菌Cy-29稳定期发酵上清液处理果实与对照组腐烂率实验结果，显示实验组果实腐烂速度明显较慢，到贮藏结束，对照组腐烂率达33％，实验组腐烂率只有18％。整个贮藏期，未经处理的对照组腐烂率始终高于实验组，参见图4。
本发明以猕猴桃为例来证明包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cy-29的发酵产物对果实具有呼吸抑制性和防腐性，能够用户制备生物防腐剂，但本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cy-29所适用的果蔬范围不局限于猕猴桃，针对常规食用且常见的果蔬均具有呼吸抑制性和防腐性，本领域技术人员基于上述实验方法和实验结论能够直接得到本发明草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cy-29的发酵产物对其他果蔬的呼吸抑制性和防腐性。
实施例五：一种枯草芽孢杆菌的筛选方法，包括以下步骤：取土壤置于无菌水中振荡均匀，与恒温水浴保温后进行梯度稀释，取土壤稀释液涂布于指示板，挑选出对指示菌指状青霉有抑制作用的菌落置于牛肉膏蛋白胨培养平板上纯化，将纯化后的拮抗菌株进行抑菌效果检测，筛选得到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cy-29。
实施例六：一种枯草芽孢杆菌的筛选方法，包括以下步骤：一种枯草芽孢杆菌的筛选方法，包括以下步骤：取土壤置于无菌水中振荡均匀，与恒温水浴保温后进行梯度稀释，取土壤稀释液涂布于指示板，挑选出对指示菌指状青霉有抑制作用的菌落置于牛肉膏蛋白胨培养平板上纯化，将纯化后的拮抗菌株进行抑菌效果检测，筛选得到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cy-29。
所述指示板的制备方法包括以下步骤：配制指状青霉孢子悬液，将指状青霉孢子悬液加入PDA固体培养基中倾注含指示菌孢子的指示平板中。
所述牛肉膏蛋白胨培养平板中的牛肉膏蛋白胨培养基的制备方法包括以下步骤：取以下重量份数10份的牛肉膏、5份的蛋白胨和15份的NaCl作为原料组分，加入去蒸馏水至总重量份数为1000份，调节pH值至7.0-7.2，灭菌处理得到牛肉膏蛋白胨培养基；
所述PDA固体培养基的制备方法包括以下步骤：取重量份数为100份的马铃薯、35份的葡萄糖和10份的琼脂粉，加入去蒸馏水至总重量份数为1000份，调节pH值至7.0-7.2，灭菌处理得到PDA固体培养基。
实施例七：一种枯草芽孢杆菌的筛选方法，包括以下步骤：取土壤样品2g于10mL无菌水中，振荡均匀后于80℃恒温水浴保温40min；然后对样品进行梯度稀释；取适宜浓度梯度的土壤稀释液涂布指示平板；于25℃培养2-3d后观察，挑出对指示菌指状青霉有抑制作用的菌落在牛肉膏蛋白胨培养平板上反复划线纯化；纯化后的拮抗菌株，对比抑菌效果，选择抑菌效果最佳的纯化菌株保留，即得枯草芽孢杆菌Cy-29。
所述指示板的制备方法包括以下步骤：配制指状青霉孢子悬液，孢子浓度为106cfu/mL，将孢子悬液按照每100mL培养基中加入1mL孢子液的比例加入到50℃左右的PDA固体培养基中倾注含指示菌孢子的指示平板。
本实施方式枯草芽孢杆菌Cy-29在本实施方式枯草芽孢杆菌Cy-29可在牛肉膏蛋白胨培养基上生长，牛肉膏蛋白胨培养基(1000mL)由3.0g牛肉膏、10.0g蛋白胨、5.0gNaCl，15g琼脂粉，加去蒸馏水至1000mL，调节pH值至7.0-7.2，121℃高压灭菌30min。
指示菌指状青霉可在PDA琼脂培养基上生长，PDA琼脂培养基(1000mL)由200g马铃薯、20g葡萄糖、15g琼脂粉，加去蒸馏水至1000mL，121℃高压灭菌30min。
实施例八：一种枯草芽孢杆菌的筛选方法，包括以下步骤：一种枯草芽孢杆菌的筛选方法，包括以下步骤：取土壤置于无菌水中振荡均匀，与恒温水浴保温后进行梯度稀释，取土壤稀释液涂布于指示板，挑选出对指示菌指状青霉有抑制作用的菌落置于牛肉膏蛋白胨培养平板上纯化，将纯 化后的拮抗菌株进行抑菌效果检测，筛选得到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cy-29。
所述指示板的制备方法包括以下步骤：配制指状青霉孢子悬液，将指状青霉孢子悬液加入PDA固体培养基中倾注含指示菌孢子的指示平板中。
所述牛肉膏蛋白胨培养平板中的牛肉膏蛋白胨培养基的制备方法包括以下步骤：取以下重量份数1份的牛肉膏、20份的蛋白胨和3份的NaCl作为原料组分，加入去蒸馏水至总重量份数为1000份，调节pH值至7.0-7.2，灭菌处理得到牛肉膏蛋白胨培养基；
所述PDA固体培养基的制备方法包括以下步骤：取重量份数为400份的马铃薯、10份的葡萄糖和25份的琼脂粉，加入去蒸馏水至总重量份数为1000份，调节pH值至7.0-7.2，灭菌处理得到PDA固体培养基。
将实施例五～实施例八所制备的枯草芽孢杆菌Cy-29进行鉴定：
实验方法：参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版和《常见细菌系统鉴定手册》对枯草芽孢杆菌Cy-29进行生理生化鉴定结果如表3所示。
表3枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cy-29生理生化特征
+：阳性反应：-：阴性反应
对筛选得到的枯草芽孢杆菌Cy-29进行分子鉴定，按以下步骤进行：提取菌株基因组DNA，利用细菌16S rDNA通用引物，以基因组DNA为模板进行PCR扩增；然后利用胶回收试剂盒回收PCR产物，进行克隆、转化，筛选阳性克隆，经扩大培养后委托南京金斯瑞公司对核苷酸序列测序。
枯草芽孢杆菌Cy-29的16S rDNA序列长1589bp，其序列如SEQ ID No.1所示，经测序结果与Genbank中16S rDNA序列进行同源比对，然后用MEGA软件构建系统发育树如图5所示，以确定菌株的种属关系。同源比对结果表明：该序列与序列号为序号为FR729926的枯草芽孢杆菌ZWQ-1的16S rDNA序列同源性最高，相似性为99％，结合菌体形态特征，生理生化鉴定结果确定Cy-29属于芽孢杆菌(Bacillus)，为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
PCR引物由上海生工生物技术有限公司合成，胶回收试剂盒购自Axygen公司，亚克隆载体pMD18-T试剂盒购自TaKaRa公司。
实施例九：一种生物防腐剂，包括实施例一至四所述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)Cy-29的发酵产物。
本申请的生物防腐剂尤其针对易腐烂水果的防腐作用更佳，下述以猕猴桃为例，进行防腐效果实验，通过降低果蔬的呼吸作用和对腐败细菌的抑制作用，双重作用方式明显的降低了果蔬的腐烂率，与现有的筛选得到的枯草芽孢杆菌相比，其防腐效果更佳，大大延长了果蔬的保鲜期，明显降低了腐烂率。
针对猕猴桃防腐作用效果实验：
具体包括以下步骤：
以红阳猕猴桃为实验材料，采于四川省雅安市。
(1)采摘猕猴桃后选择无病害、无损伤的果实16℃散热12h；
(2)散热后的猕猴桃分为三组，第一组不做任何处理，直接放置于0-2℃冷藏；第二组用枯草芽孢杆菌Cy-29对数期菌悬液喷洒，晾干后置于0-2℃冷藏；第三组用枯草芽孢杆菌Cy-29稳定期发酵上清液喷洒，晾干后0-2℃冷藏。所述枯草芽孢杆菌Cy-29对数期菌悬液的制备方法如实施例十三所述内容，所述枯草芽孢杆菌Cy-29稳定期发酵上清液的制备方法如实施例十三所述内容。
定期测定果实的呼吸强度和腐烂率。每个实验组设置3个平行。
检测标准：
果实呼吸强度：采用静置法对鲜果进行测定，结果以CO2mg/kg.h表示。
果实腐烂率：腐烂果实占检查果实的百分数。
实验结果：观察用枯草芽孢杆菌Cy-29对数期菌悬液处理果实与对照组呼吸强度实验结果，显示在贮藏的第14d对照组的呼吸强度达到了最大值235.35mg/kg.h，然后迅速下降，而实验组果实呼吸强度21d才达到最大值102.58mg/kg.h，说明经过枯草芽孢杆菌Cy-29对数期菌悬液处理的实验组则较好地抑制了果实呼吸强度，参见图1。
观察用枯草芽孢杆菌Cy-29对数期菌悬液处理果实与对照腐烂率实验结果，显示实验组果实腐烂速度明显较慢，到贮藏结束，对照组腐烂率达30％，实验组腐烂率只有13％。整个贮藏期，未经处理的对照组腐烂率始终高于实验组，参见图2。
观察用枯草芽孢杆菌Cy-29稳定期发酵上清液处理果实与对照组呼吸强度实验结果，显示实验组呼吸强度在整个试验期间均低于对照组，峰值出现在第14d，为168.9mg/kg.h，明显低于对照组235.35mg/kg.h，说明枯草芽孢杆菌Cy-29稳定期发酵上清液处理较好地降低了果实呼吸强度，参见图3。
观察用枯草芽孢杆菌Cy-29稳定期发酵上清液处理果实与对照组腐烂率 实验结果，显示实验组果实腐烂速度明显较慢，到贮藏结束，对照组腐烂率达33％，实验组腐烂率只有18％。整个贮藏期，未经处理的对照组腐烂率始终高于实验组，参见图4。
猕猴桃原产于我国长江流域，因其风味独特，营养丰富尤其Vc含量高而被人们誉为果中珍品和Vc之王，但其属于呼吸跃变型果实，在常温下难以长久贮藏，极易腐烂变质，导致其货架期严重缩短。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cy-29是一种嗜热、好氧、产芽孢的G+杆状细菌，对人畜无毒无害，不污染环境，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。
本发明以猕猴桃为例来证明包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cy-29的发酵产物的生物防腐剂对果实具有呼吸抑制性和防腐性，但本发明的生物防腐剂所适用的果蔬范围不局限于猕猴桃，针对常规食用且常见的果蔬均具有呼吸抑制性和防腐性，本领域技术人员基于上述实验方法和实验结论能够直接得到本发明生物防腐剂对其他果蔬的呼吸抑制性和防腐性。
实施例十：一种生物防腐剂，包括为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cy-29的菌悬液和/或发酵上清液。
由上述实施例九实验数据可知，所述的菌悬液为对数期的枯草芽孢杆菌Cy-29菌悬液，所述发酵上清液为稳定期的枯草芽孢杆菌Cy-29的发酵上清液。
实施例十一：一种实施例八和实施例九所述的生物防腐剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：枯草芽孢杆菌Cy-29的活化：取枯草芽孢杆菌Cy-29于牛肉膏蛋白胨琼脂培养平板进行划线，置于培养箱中培养，挑取单菌落再次在牛肉膏蛋白胨琼脂培养平板划线，继续置于培养箱中培养得到活化的枯草芽孢杆菌Cy-29单菌落；
步骤二：枯草芽孢杆菌Cy-29的发酵产物的制备：取活化的枯草芽孢杆菌Cy-29单菌落于牛肉膏蛋白胨培养基中，振荡培养制得种子液，将所述种子液接种于LNB培养基中，振荡培养获得枯草芽孢杆菌Cy-29的发酵产物。
进一步的，所述牛肉膏蛋白胨琼脂培养平板中的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的制备方法包括以下步骤：取以下重量份数10份的牛肉膏、5份的蛋白胨、15份的NaCl和10份的琼脂粉作为原料组分，加入去蒸馏水至总重量份数为1000份，调节pH值至7.0-7.2，灭菌处理得到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。
实施例十二：一种实施例八和实施例九所述的生物防腐剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：枯草芽孢杆菌Cy-29的活化：取枯草芽孢杆菌Cy-29于牛肉膏蛋白胨琼脂培养平板进行划线，置于培养箱中培养，挑取单菌落再次在牛肉膏蛋白胨琼脂培养平板划线，继续置于培养箱中培养得到活化的枯草芽孢杆菌Cy-29单菌落；
步骤二：枯草芽孢杆菌Cy-29的发酵产物的制备：取活化的枯草芽孢杆菌Cy-29单菌落于牛肉膏蛋白胨培养基中，振荡培养制得种子液，将所述种子液接种于LNB培养基中，振荡培养获得枯草芽孢杆菌Cy-29的发酵产物。
所述的发酵产物为菌悬液和/或发酵上清液，振荡培养获得枯草芽孢杆菌Cy-29的发酵产物的方法为：37℃条件下于180r/min振荡培养14h后，获得对数期的枯草芽孢杆菌Cy-29菌悬液；继续培养30h后，将菌悬液离心处理，取上清液即获得稳定期的枯草芽孢杆菌Cy-29的发酵上清液。
进一步的，所述牛肉膏蛋白胨琼脂培养平板中的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的制备方法包括以下步骤：取以下重量份数1份的牛肉膏、20份的蛋白胨、3份的NaCl和30份的琼脂粉作为原料组分，加入去蒸馏水至总重量份数为1000份，调节pH值至7.0-7.2，灭菌处理得到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。
实施例十三：一种实施例八和实施例九所述的生物防腐剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：枯草芽孢杆菌的活化：从保种斜面挑取枯草芽孢杆菌Cy-29，在牛肉膏蛋白胨琼脂培养平板进行划线，于37℃培养箱中培养24-48h；再次挑取单菌落在牛肉膏蛋白胨琼脂培养平板划线，于37℃培养 箱中培养15h；
步骤二：挑取活化的Cy-29单菌落接种于5mL牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃、180r/min振荡培养15h制备种子液；再将种子液按10％接种量接种于50mLNB培养基中，37℃、180r/min振荡培养14h后，获得枯草芽孢杆菌Cy-29对数期菌悬液；培养30h后，将菌悬液8000rpm离心5min，取上清液即获得枯草芽孢杆菌Cy-29稳定期发酵上清液。
其中牛肉膏蛋白胨琼脂培养基牛肉膏蛋白胨培养基(1000mL)由3.0g牛肉膏、10.0g蛋白胨、5.0gNaCl，15g琼脂粉加去蒸馏水至1000mL，调节pH值至7.0-7.2，121℃高压灭菌30min；
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)Cy-29，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2013年7月12日，保藏编号为CGMCC 7916。
2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)Cy-29的细胞呈短杆状，革兰氏染色为阳性，存在芽孢；所述枯草芽孢杆菌的16SrDNA序列长1589bp，其序列如SEQ ID No.1所示。
3.一种权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌在制备植物生长抗菌剂或果蔬防腐剂中的应用。
4.一种权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：取土壤置于无菌水中振荡均匀，与恒温水浴保温后进行梯度稀释，取土壤稀释液涂布于指示板，挑选出对指示菌指状青霉有抑制作用的菌落置于牛肉膏蛋白胨培养平板上纯化，将纯化后的拮抗菌株进行抑菌效果检测，筛选得到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cy-29。
5.根据权利要求4所述的枯草芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，所述指示板的制备方法包括以下步骤：配制指状青霉孢子悬液，将指状青霉孢子悬液加入PDA固体培养基中倾注含指示菌孢子的指示平板中。
6.一种生物防腐剂，其特征在于，包括权利要求1～2任一项所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Cy-29的发酵产物。
7.根据权利要求6所述的生物防腐剂，其特征在于，所述的发酵产物为菌悬液和/或发酵上清液，所述菌悬液的菌体浓度为107CFU/mL。
8.一种权利要求6或7所述的生物防腐剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：枯草芽孢杆菌Cy-29的活化：取枯草芽孢杆菌Cy-29于牛肉膏蛋白胨琼脂培养平板进行划线，置于培养箱中培养，挑取单菌落再次在牛肉膏蛋白胨琼脂培养平板划线，继续置于培养箱中培养得到活化的枯草芽孢杆菌Cy-29单菌落；
步骤二：枯草芽孢杆菌Cy-29的发酵产物的制备：取活化的枯草芽孢杆菌Cy-29单菌落于牛肉膏蛋白胨培养基中，振荡培养制得种子液，将所述种子液接种于LB培养基中，振荡培养获得枯草芽孢杆菌Cy-29的发酵产物。
9.根据权利要求8所述的生物防腐剂的制备方法，其特征在于，所述的发酵产物为菌悬液和/或发酵上清液，振荡培养获得枯草芽孢杆菌Cy-29的发酵产物的方法为：37℃条件下于180r/min振荡培养14h后，获得对数期的枯草芽孢杆菌Cy-29菌悬液；继续培养30h后，将菌悬液离心处理，取上清液即获得稳定期的枯草芽孢杆菌Cy-29的发酵上清液。
10.一种果蔬防腐方法，其特征在于，包括以下步骤：将采摘的果蔬经散热处理后喷洒生物防腐剂，所述生物防腐剂为权利要求6或7所述的生物防腐剂。
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