CN113528377A - 一种具有促生长及防腐作用的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一种具有促生长及防腐作用的枯草芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有促生长及防腐作用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL‑B12005；该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2021642。本发明还提供了枯草芽孢杆菌在生物促生长剂、生物防腐剂中的应用；本发明还提供了一种生物抑菌剂，该生物抑菌剂含有上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL‑B12005和/或所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL‑B12005的培养物。该菌株针对引发果实腐烂的多种致腐菌、致病菌均具有良好的拮抗作用，菌悬液及发酵上清液均具有较好的抑制效果，安全性高，具有良好的抑菌、促生长、防腐的功效。

Description

一种具有促生长及防腐作用的枯草芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物保鲜技术领域，具体涉及一种具有促生长及防腐作用的枯草芽孢杆菌及其应用。
背景技术
目前市场上果蔬的保鲜主要以物理方法(如冷藏、气调、紫外照射等)和使用各类广谱杀菌剂为主，多用于采摘后；但这些方法往往伴随着资金高投入、能源高消耗、农药高残留等诸多问题，用微生物进行果实病害的生物防治不损害人体健康，不造成环境污染，而且不易引起植物的抗药性，因此，防病效果明显、环境友好型且成本较低的生物防治技术成为国内外果蔬采后贮藏保鲜的研究热点。
针对目前果蔬保鲜技术存在的问题，微生物菌剂可以作为在存贮过程中保护农产品的替代手段，但是，研究发现，拮抗菌具有效果不稳定，防腐谱较窄等缺点，且拮抗菌的拮抗机理是通过营养与生存空间竞争或分泌活性抗菌物质单方面相关，如：拮抗酵母YT-2的拮抗机理只是通过与致病菌的营养物质和生存空间的竞争作用。因此，寻找活性生物防腐剂的策略应该是不仅要着手与可以定殖在水果受损区域的微生物，而且需要在广泛的温度条件下，能对营养基质与病原菌表现出抗性与竞争作用的微生物。
发明内容
针对上述研究背景，发明人提供一种一种具有促生长及防腐作用的枯草芽孢杆菌，该枯草芽孢杆菌通过营养与生存空间竞争和分泌活性抗菌物质同时起到抑制致病菌和腐败菌的作用，能够减少果实的发病及腐烂率，在果实防腐保鲜方面具有良好的应用价值。
为了实现上述技术效果，本发明提供以下技术方案：
本发明的第一个目的是提供一种具有促生长及防腐作用的枯草芽孢杆菌，该菌株分离自山东省肥城市中央桃行的桃果实样品，其菌落形态满足芽孢杆菌特征，经基因组测序比对，与其他已知同属的芽孢杆菌的16S rDNA序列有98％的相似性，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间MALDI-TOF MS质谱分析，本发明菌株与Bacillus subtilis准确率达2.201。综合形态特征、16S rDNA基因序列结果和MALDI-TOF MS质谱分析确定，本发明菌株属于枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005。该菌株已于2021年05月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏地址：中国武汉武汉大学，其生物保藏号为：CCTCC M 2021642。
进一步的，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005菌体特征为：革兰氏阳性直杆，大小为0.6×1.0-1.4微米，单个或成对分组，形成内生孢子；芽孢是椭圆形的，具有中心或亚顶部定位；孢子囊没有肿胀。
菌落特征为：LB平板固体培养基37℃培养24h后形成浅米色的圆形菌落，边缘较规则，直径2-4mm，无光泽，中心略有同心圆褶皱突起，质地粘稠。
进一步的，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005的生理生化特征如下：
能水解淀粉、糖蜜，不能利用木糖、阿拉伯糖及甘露醇，能还原硝酸盐，在7％氯化钠和pH5.7条件下可以生长。
进一步的，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005菌株通过萝卜种子植物毒性试验和兽医毒理学研究，结果表明，本发明菌株无致病性，无毒，可用于微生物生产。
进一步的，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005菌株通过萝卜种子植物毒性试验研究，结果表明，本发明菌株不仅不具有植物毒性，而且还对萝卜幼苗有一定的促生长作用。
进一步的，本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005菌株对引起水果作物各种病害的多种致病菌均具有良好的抑制作用，其中包括但不限于互隔交链格孢菌、桃褐腐病病菌、枝孢样枝孢霉、桃吉尔霉、扩展青霉、枯萎镰刀菌等。
本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005菌株对致病菌和植物病原细菌亦有一定的抑制作用，其中包括但不限于大肠杆菌和番茄青枯菌等。
本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005菌株的抑菌效果是菌体和其代谢产物的共同作用。
进一步的，上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005的培养基包括糖蜜2.0-4.0％，豆粕/酵母浸膏/玉米膏0％-3.0％，K2HPO4×3H20 0.5-1.0％，(NH4)2SO40.15-0.4％，磷酸二氢钠0.6-1.0％，碳酸钙0.1-0.4％，MgSO4×7H20 0.01-0.06％，硫酸锰0.02-0.12％，余量为水，pH6.5-7.2。
进一步的，上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005的培养基以1％-3％的甜菜糖蜜或甘蔗糖蜜为碳源，以0％-4％豆粕为氮源。
进一步的，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005的最佳培养基为甜菜糖蜜3.0％，K2HPO4×3H20 0.7％，(NH4)2SO4 0.15％,磷酸二氢钠0.8％，碳酸钙0.2％，MgSO4×7H20 0.03％，硫酸锰0.03％，余量为水，pH为7.0-7.2。
进一步的，上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005的较佳适宜培养温度为28℃-35°С，接种量1％-5％，进一步优选的，最适宜温度为30℃，接种量5％。
本发明的第二个目的是提供上述枯草芽孢杆菌在生物促生长剂中的应用。
本发明的第三个目的是提供上述枯草芽孢杆菌在生物防腐剂中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种生物抑菌剂，该生物抑菌剂含有上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005和/或所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005的培养物。
进一步的，上述一种生物抑菌剂，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005的有效活菌数为≥20亿CFU/ml
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明中提供的一种枯草芽孢杆菌菌株具有良好广谱抑菌效果，针对引发果实腐烂的多种致腐菌、致病菌均具有良好的拮抗作用，菌悬液及发酵上清液均具有较好的抑制效果，弥补了单一效果不稳定的缺陷，从而有利于提高防腐效果；经发酵优化后，能够获得较高的活菌数，并且本发明菌株安全性高，具有良好的抑菌、促生长、防腐的功效。因此，本发明菌株在果实防腐保鲜上的生物防治有较为广阔的发展潜力。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明菌株NBL-B12005的菌落形态图；
图2为本发明菌株NBL-B12005的菌体形态图；
图3为实施例3中显微镜下观察对照组中桃褐腐病菌3-4菌丝生长情况；
图4为实施例3中显微镜下观察NBL-B12005对桃褐腐病菌3-4菌丝生长的影响；
具体实施方式
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1菌株的筛选及鉴定
(1)菌株的离体抑菌试验
从山东省肥城市中央桃行采集的桃果实、桃叶、土壤、果柄等8份样品中分离菌株，称取1g样品接入100mL无菌水中，37℃恒温箱中震荡摇匀，对样液进行梯度稀释，稀释液涂布在含有NA固体培养基的平板内，37℃培养过夜。从长出菌落的平板上分离菌株并纯化，转接NA斜面培养基保存。
从样品中分离出100株可以形成孢子的细菌。以从腐败桃果实中分离纯化出的三株致腐菌(互隔交链孢菌、桃褐腐病病菌、枝孢样枝孢霉)为测试对象，使用打孔法，研究分离纯化出的菌株发酵液的抑菌活性，选择明显抑菌作用的菌株。根据抑菌圈直径初步筛选得到几株有不同程度抑菌致病菌扩展的菌株。分离纯化菌株的抑菌活性见表1：
表1菌株的抗真菌活性
Figure BDA0003124041230000041
(2)果实活体抑菌试验
将有明显抑菌作用的菌落30℃条件下200r/min，在LB液体培养基中摇培24h后进行桃果实体内实验。桃果实用浓度为2％的次氯酸钠溶液浸泡杀菌2-3min，然后用无菌生理盐水冲洗掉残余的次氯酸钠后，置于无菌操作台中自然晾干，备用。用无菌打孔器在果实的赤道上人为打一个直径5mm，深3mm左右大小一致的孔。每一孔内用移液枪加入20μL拮抗菌悬浮液(1×108CFU/ml)，无菌工作台中静止2h后，至果粒伤口内及周围无流动菌悬液。然后用移液枪伤口处加入20μL病原菌孢子悬浮液(1×105CFU/ml)，室温下放置2h，待果实伤口及周围无流动菌悬液后后用保鲜膜密封，放于塑料盆中，置于28℃/93％RH的培养箱中进行恒温保湿培养，5d后观察并记录果实的腐烂情况，测量伤口病斑直径，并统计发病率，对照组加入无菌水(对照2)和对应的病原菌孢子悬浮液(对照1)。每个处理选用10个桃果实，平行3次，实验重复2次。
发病率计算公式为：发病率(％)＝处理组果实发病数/处理组果实个数×100。
根据果实的发病率和有伤接种后病斑的扩展情况，将具有拮抗作用的菌株挑选出来。
在本实施例中，筛选得到2株浓度为1×109CFU/ml以上可完全抑制桃褐腐病菌的菌株，其中，NBL-B12005菌株防治效果最佳。根据其特征对其进行种属鉴定。
(3)菌种的鉴定
显微镜下观察纯化后的B8菌株特征，如图2所示：细菌形状的革兰氏阳性，杆菌，大小为0.6×1.0-1.4微米，单个、成对或短链排列，形成内生孢子。孢子是椭圆形的，具有中心或亚顶部定位。孢子囊没有肿胀。
菌落特征，如图1所示：LB平板固体培养基37℃培养24h后形成浅米色的圆形菌落，边缘较规则，直径2-4mm，无光泽，中心略有同心圆褶皱突起，质地粘稠。
挑取单菌落接种于LB液体培养基中，37℃，180rpm震荡培养24h，取1-5ml菌液利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株基因组DNA。16S rRNA通用引物27f(5'-agagtttgatcctggctcag-3')和1492r(5'-ggttaccttgttacgactt-3')对该菌株基因组DNA扩增并送至上海铂尚生物工程股份有限公司测序。BLAST软件比对分析该菌株与以下菌株的同一性可达99.50％以上：Bacillus subtilis strain 168(99.65％)，Bacillus subtilisstrain DSM 10(99.50％)，Bacillus subtilis strain JCM 1465(99.50％)。
通过基质辅助激光解吸电离飞行时间MALDI-TOF MS质谱分析，本发明菌株与Bacillus subtilis准确率达2.201。
综合形态特征、16S rDNA基因序列结果和MALDI-TOF MS质谱分析确定，本发明菌株属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005；并提供了该枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005的基因序列，长度为1413bp。
实施例2植物毒性及促生长试验
细菌的植物毒性检测是以萝卜种子为模型测试对象进行，研究了本发明菌种对植物生长和发育的影响，评估了本发明菌种的植物毒性。将种子在2％浓度的单一菌液、5％浓度的单一菌液以及蒸馏水(控制组)中浸泡10min。然后用蒸馏水冲洗，均匀放置于铺好湿滤纸的培养皿中，放入恒温培养箱，温度设置为24℃。3-4天后记录种子发芽率，7天后分别记录实验组和对照组的幼苗长度。通过观察种子发芽率和幼苗的生长情况，判断植物毒性。结果如表2所示。
表2所筛细菌菌液对萝卜种子的发芽率及幼苗生长的影响
Figure BDA0003124041230000051
Figure BDA0003124041230000061
由表2可知，用2％和5％细菌菌液处理的萝卜种子与用水处理的对照组种子的发芽率没有显着差异。7天的幼苗的长度超出对照组8-16％。根据获得的数据，可以得出结论，所研究的细菌不仅不具有植物毒性，而且还对萝卜幼苗有一定的促生长作用，
同时进行了兽医毒理学研究，结果表明，枯草芽孢杆菌NBL-B12005无致病性，无毒，可用于微生物生产。
实施例3枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的抗真菌活性谱
在实验室研究基础上选用改良后的Maynell以3％的甘蔗糖蜜和2％的豆粕分别作为碳源和氮源的条件下，30℃摇培2d，活菌数和孢子数分别达到3.3×109CFU/ml和2.9×109孢子/ml。
采用平板打孔拮抗法测定枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)对引起水果作物引起病害的多种植物致病真菌和细菌的抑制作用。下层培养基为2％PDA培养基，凝固后取1ml病原菌与5ml1.2％PDA培养基充分混匀作上层培养基，凝固后打孔器打孔(9cm)，加入100微升菌液，于冰箱内静置2h，30℃正置培养4d。通过测量抑菌圈直径，检测待测菌的抑菌谱，结果见表3和表4。
表3枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005的抗真菌活性谱1
Figure BDA0003124041230000062
表4枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005的抗菌活性谱2
Figure BDA0003124041230000071
结果表明，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005对引起水果作物各种病害的多种致病菌(互隔交链格孢霉Alternaria sp.、桃褐腐病菌3-4Moniliniafructicola、枝孢样枝孢霉Cladosporium sp.、桃吉尔霉Gilbertella persicaria、桃褐腐病菌2Monilinia fructicola、枯萎镰刀菌Fusarium avenaceum、链孢霉Alternariaalternata、枝孢霉Cladosporium cladosporioides、扩展青霉Penicillum expansum、链孢霉Alternaria alternata)均有良好的抑制作用，不仅形成了抑菌圈直径为20.8-29.0mm的病原体生长抑制区，在菌液的作用下，致病真菌的菌丝体上还出现了肿瘤样肿胀气泡，并且其发育停止了。
实施例4枯草芽孢杆菌NBL-B12005不同处理液对病原菌生长的影响
实验方法：将枯草芽孢杆菌菌种接种于LB培养基中，于30℃200r/min条件下恒温振荡培养12-24h，即得到芽孢杆菌发酵液；取芽孢杆菌发酵液在12000r/min下，4℃离心10min，用0.22μm滤膜将上清液过滤，即得芽孢杆菌发酵上清液；菌体用相同体积无菌生理盐水悬浮获得菌体悬浮液。采用体外平板打孔法测定枯草芽孢杆菌不同处理液对桃果实致病菌的的抑菌效果。结果如表5所示。
表5不同处理液对桃致腐菌的抑菌效果
不同处理液 发酵液 菌悬液 发酵上清液
抑菌圈直径mm 26.0±1.0 17.5±1.1 23.5±1.2
结果表明，上述三种不同处理液对桃果实致病菌均有一定的抑制效果，发酵液和发酵上清液的抑菌效果显著。发酵液的抑菌效果更强。这说明本发明菌株的拮抗作用是菌体和其代谢产物的共同作用；本发明菌株的拮抗机理可能是营养与生存空间竞争和分泌活性抗菌物质。
实施例5培养基及培养条件优化
在实验室内使用三角瓶在振荡器中研究了不同碳源和氮源培养基对枯草芽孢杆菌(B.subtilis)NBL-B12005活菌数和抑菌活性的影响。
具体方法：取培养好的斜面，在LB平板上划线分离，培养20-24h后在无菌条件下，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，在30℃下培养180rpm震荡培养18-24h获得种子液，按照2％(v/v)的接种量，将种子液接种于不同培养基中，在温度30℃条件下，180rpm震荡培养48h，检测活菌数和抑菌活性。结果如表6所示。
表6不同碳源和氮源培养基对枯草芽孢杆菌NBL-B12005活菌数和抑菌活性的影响
培养基 活菌数CFU/mL 对M.fructicola 3-4的抑菌圈直径,mm
1 2.0×10<sup>9</sup> 20
2 2.6×10<sup>9</sup> 23
3 3.0×10<sup>9</sup> 28
4 2.3×10<sup>9</sup> 23
5 2.6×10<sup>9</sup> 24
6 2.2×10<sup>9</sup> 22
7 2.6×10<sup>9</sup> 25
8 2.7×10<sup>9</sup> 27
注:*在所有的培养基中都使用了糖蜜及不同种类碳和氮来源的添加剂：1-甜菜糖蜜(1％)，2-甜菜糖蜜(2％)，3-甜菜糖蜜(3％)，4-甜菜糖蜜(3％)+酵母浸膏(0.25％)，5-甜菜糖蜜(3％)+玉米膏(0.25％)，6-甘蔗糖蜜(1％)，7-甘蔗糖蜜(3％)，8-甘蔗糖蜜(5％)。
结果表明，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)NBL-B12005的活菌数和抑菌活性在3号培养基中达到最佳效果。培养基中补充的有机氮源(酵母浸膏和玉米膏)在一定程度上降低了菌株的生物量积累水平和抑菌活性。根据活菌数和抑菌活性综合分析，最终获得枯草芽孢杆菌(B.subtilis)NBL-B12005的发酵培养基如下：甜菜糖蜜3.0％，K2HPO4×3H20 0.7％，(NH4)2SO4 0.15％,磷酸二氢钠0.8％，碳酸钙0.2％，MgSO4×7H20 0.03％，硫酸锰0.03％；рН7.0-7.2。使用上述优化培养基在实验室环境下进行培养温度和接种量优化实验。结果如表7和表8所示。
表7温度对枯草芽孢杆菌(B.subtilis)NBL-B12005菌株活菌数及抑菌活性的影响
Figure BDA0003124041230000091
表8接种量对枯草芽孢杆菌(B.subtilis)NBL-B12005菌株活菌数的影响
Figure BDA0003124041230000092
根据表7和表8实验数据可知，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)NBL-B12005的最适宜温度为30°С；为达到最高活菌数，应使用3％-5％的接种量。
实施例7果实体内防腐效果试验
为考察本发明菌株对采后果实的防腐效果，本实施例中，分别以桃和梨为果实的代表，选取大小一致、健康无损伤的果实，进行果实体内实验。
(1)试验方法：果实用浓度为2％的次氯酸钠溶液浸泡杀菌2-3min，然后用无菌生理盐水冲洗掉残余的次氯酸钠后，置于无菌操作台中自然晾干，备用。用无菌打孔器在果实的赤道上人为打一个直径5mm，深3mm左右大小一致的孔。每一孔内用移液枪加入20μL液体菌剂，无菌工作台中静止2h后，至果粒伤口内及周围无流动菌悬液。然后用移液枪伤口处加入20μL病原菌孢子悬浮液(1×105CFU/ml)，室温下放置2h，待果实伤口及周围无流动菌悬液后后用保鲜膜密封，放于塑料盆中，置于28℃/93％RH的培养箱中进行恒温保湿培养，5d后观察并记录果实的腐烂情况，测量伤口病斑直径，并统计发病率，对照组加入无菌水(对照2)和对应的病原菌孢子悬浮液(对照1)。每个处理选用10个果实，平行3次，实验重复2次。
计算公式如下：
发病率(％)＝处理组果实发病数/处理组果实个数×100。
对致病菌扩展的抑制程度(％)＝(对照组1的病斑直径-处理组的病斑直径)/对照组1的病斑直径]×100
(2)不同处理液对桃褐腐病的抑制效果
在本实施例中，根据实施例4中方法获得菌悬液、发酵液、发酵上清液。结果如表9所示。
表9不同处理液对桃褐腐病的抑制效果
组别 发病率，％ 病斑直径，mm
对照1 100 68.5
菌悬液 20 15.2
发酵液 0 0
发酵上清液 10 10.8
结果表明，菌悬液、发酵液及其上清液对桃褐腐病(M.fructicola 3-4)都有一定抑制作用，其中发酵液的效果最好，其次为上清夜和菌悬液。本实施例再次证明，本发明菌株是菌体及其代谢产物的共同作用来控制果实采后腐烂的发展。
(3)不同浓度发酵液在桃果实体内防腐效果
在本实施例中，分别配制浓度为1×106、1×107、1×108、1×109CFU/ml的枯草芽孢杆菌NBL-B12005发酵液，分别为T4、T3、T2、T1组，结果如表10所示。
表10不同浓度的菌液在桃果实上的防腐效果
Figure BDA0003124041230000101
Figure BDA0003124041230000111
结果表明，4个处理组在桃上对桃褐腐病M.fructicola 3-4和互隔交链孢菌Alternaria sp.的防腐效果均可达60％以上，其中浓度为1×109CFU/ml发酵液可完全抑制桃采后病原菌的生长，降低采后微生物病害的发生，具有显著的拮抗作用。其次1×108CFU/ml发酵液组腐败率仅为10％，对两种果实病害的抑制率分别为86.0％、77.1％。
(4)皇冠梨体内防腐效果
在本实施例中，配制浓度为1×108CFU/ml和1×107CFU/ml的NBL-B12005发酵液与发明专利201410190713.9中优选的枯草芽孢杆菌AFB041和AFB096的菌悬液(1×107CFU/ml)对桃吉尔霉在皇冠梨体内的防腐效果进行比较。对照组加入无菌水(对照2)和对应的病原菌孢子悬浮液(对照1)。如表11所示。
表11在皇冠梨果实上的防腐效果
Figure BDA0003124041230000112
结果表明，浓度为1×108CFU/ml的枯草处理组发病率为0，相同浓度(1×107CFU/ml)下，本发明菌株处理组的发病率仅为15％，发病率和病斑直径均明显低于发明专利201410190713.9中优选的枯草芽孢杆菌AFB041和AFB096菌悬液。因此，本发明菌株发酵液在果实体内的防腐效果极为显著。不仅可以减少果实腐败的发生，而且还可以抑制腐败菌的扩展。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 山东碧蓝生物科技有限公司
<120> 一种具有促生长及防腐作用的枯草芽孢杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1413
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
ggcggctggc tcctaaaggt tacctcaccg acttcgggtg ttacaaactc tcgtggtgtg 60
acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg gcatgctgat ccgcgattac 120
tagcgattcc agcttcacgc agtcgagttg cagactgcga tccgaactga gaacagattt 180
gtgggattgg cttaacctcg cggtttcgct gccctttgtt ctgtccattg tagcacgtgt 240
gtagcccagg tcataagggg catgatgatt tgacgtcatc cccaccttcc tccggtttgt 300
caccggcagt caccttagag tgcccaactg aatgctggca actaagatca agggttgcgc 360
tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacaacca tgcaccacct 420
gtcactctgc ccccgaaggg gacgtcctat ctctaggatt gtcagaggat gtcaagacct 480
ggtaaggttc ttcgcgttgc ttcgaattaa accacatgct ccaccgcttg tgcgggcccc 540
cgtcaattcc tttgagtttc agtcttgcga ccgtactccc caggcggagt gcttaatgcg 600
ttagctgcag cactaagggg cggaaacccc ctaacactta gcactcatcg tttacggcgt 660
ggactaccag ggtatctaat cctgttcgct ccccacgctt tcgctcctca gcgtcagtta 720
cagaccagag agtcgccttc gccactggtg ttcctccaca tctctacgca tttcaccgct 780
acacgtggaa ttccactctc ctcttctgca ctcaagttcc ccagtttcca atgaccctcc 840
ccggttgagc cgggggcttt cacatcagac ttaagaaacc gcctgcgagc cctttacgcc 900
caataattcc ggacaacgct tgccacctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag 960
ccgtggcttt ctggttaggt accgtcaagg tgccgcccta tttgaacggc acttgttctt 1020
ccctaacaac agagctttac gatccgaaaa ccttcatcac tcacgcggcg ttgctccgtc 1080
agactttcgt ccattgcgga agattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgtg 1140
tctcagtccc agtgtggccg atcaccctct caggtcggct acgcatcgtc gccttggtga 1200
gccgttacct caccaactag ctaatgcgcc gcgggtccat ctgtaagtgg tagccgaagc 1260
caccttttat gtctgaacca tgcggttcag acaaccatcc ggtattagcc ccggtttccc 1320
ggagttatcc cagtcttaca ggcaggttac ccacgtgtta ctcacccgtc cgccgctaac 1380
atcagggagc aagctcccat ctgtccgctc gac 1413

Claims (10)

1.一种具有促生长及防腐作用的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏号：CCTCC M 2021642，保藏日期：2021年05月31日。
2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)NBL-B12005菌体特征为革兰氏阳性直杆，大小为0.6×1.0-1.4微米，单个或成对分组，形成内生孢子；芽孢是椭圆形的，具有中心或亚顶部定位；孢子囊没有肿胀。
3.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)NBL-B12005的培养基包括糖蜜2.0-4.0％，豆粕/酵母浸膏/玉米膏0％-3.0％，K2HPO4×3H20 0.5-1.0％，(NH4)2SO4 0.15-0.4％，磷酸二氢钠0.6-1.0％，碳酸钙0.1-0.4％，MgSO4×7H20 0.01-0.06％，硫酸锰0.02-0.12％，余量为水，pH6.5-7.2。
4.根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)NBL-B12005的培养基为甜菜糖蜜3.0％，K2HPO4×3H20 0.7％，(NH4)2SO40.15％,磷酸二氢钠0.8％，碳酸钙0.2％，MgSO4×7H20 0.03％，硫酸锰0.03％，余量为水，pH为7.0-7.2。
5.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)NBL-B12005的培养温度为28℃-35℃，接种量为1％-5％。
6.根据权利要求5所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)NBL-B12005的培养温度为30℃，接种量为5％。
7.一种如权利要求1-6任一所述的枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005用作于生物促生长剂。
8.一种如权利要求1-6任一所述的枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005用作于生物防腐剂。
9.一种含有权利要求1-6任一项所述的生物抑菌剂，其特征在于：生物抑菌剂含有所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005和/或所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)NBL-B12005的培养物。
10.一种如权利要求9所述的生物抑菌剂，其特征在于：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)NBL-B12005的有效活菌数为≥20亿CFU/ml。
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