CN102094054A - 一种枯草杆菌抗菌脂肽的生产方法及其在仔猪饲料中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌抗菌脂肽的生产方法及其在仔猪饲料中的应用，属于饲料添加剂和生物技术领域。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)fmbJ种子培养基扩大培养后，2~5%接种，28～35℃，5000L发酵罐液体深层发酵30～48h，然后提取，喷雾干燥生产抗菌脂肽产品。这种抗菌脂肽按照4000IU/kg添加至仔猪基础日料中，提高了饲料利用率，并对促进仔猪生长发育、预防仔猪腹泻和提高仔猪免疫力均有较好的效果。本发明菌株枯草芽孢杆菌为安全的微生物，其抗菌产物安全性高。另外与目前仔猪饲料中使用的黄霉素相比，具有更好的效果，对取代饲料抗生素添加和保障食品安全具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌抗菌脂肽的生产方法及其在仔猪饲料中的应用，属于农业领域中的畜牧养殖技术领域和生物技术领域。涉及利用抗菌肽替代饲料中抗生素的添加，在预防仔猪腹泻的前提下，减少仔猪中抗生素的残留和保障食品的安全。
背景技术
饲料安全即食品安全的概念在世界范围内已成为共识。食品和饲料在美国属于同一管理范围，适用于同一部法律；丹麦政府为了保证食品安全，制定了饲料生产中禁止使用抗生素的规定；欧盟已禁止在动物饲养中使用抗生素作为饲料促进剂。随着人民生活水平的提高，对动物产品的需求量越来越大，对绿色食品的呼声越来越高。我国是养殖生产大国，但畜产品的出口比例相当低下，与我国作为一个畜产品生产大国的地位极不相称。我国的一些农副产品由于农药、抗生素等药物残留，重金属含量等技术指标超过欧盟及主要进口国的质量标准，被拒收、扣留和终止合同等。近年来, 畜产品中的抗生素药物残留问题越来越受到人们的重视,我国已严格限制将某些抗生素作为保健和促生长剂用于饲料。2002年，农业部发布了《动物性食品中兽药最高残留限量》公告，这表明传统抗生素必将逐渐淡出历史舞台，寻找安全高效的抗生素替代品就显得十分重要，鉴于抗生素的不利影响，开发通过调整动物胃肠道平衡而达到促进生长、维持动物健康、无毒副作用的绿色饲料添加剂已成为人们研究的热点。特别是在我国未来养殖业的发展中，政府将进一步加大对饲料、兽药与畜产品卫生安全的监管力度，积极推动发展绿色养殖业。因此，应用现代高科技手段研究和开发安全、高效、环保的抗菌添加剂，保障动物和人类自身的健康与安全，才能使我国由养殖生产大国成为养殖生产强国，实现养殖业的现代化。
国外对抗菌肽已有较多研究，在动物生产实际中也已开始应用，其作为饲料添加剂的使用效果已被实验证实，并已形成一定的市场需求。但一般抗菌肽的抗菌谱窄，通常只能抑制革兰氏阳性菌。动物源抗菌肽天然资源有限，限制了在饲料中的大规模使用。微生物抗菌制肽由10个以下的氨基酸和一个脂肪酸组成一个环形的多肽分子，它和动物源抗菌肽相比，具有广谱高效抗菌的优势。利用微生物发酵生产抗菌肽脂，可大规模工业化生产，生产周期短，生产成本大大降低，且不受季节和气候变化等外在环境的影响，是克服抗菌肽实际应用技术瓶颈的最佳途径。
发明内容
技术问题
针对饲料中抗生素的使用导致食品安全的问题和动物源抗菌肽生产量低的问题。本发明利用枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的方法及其产品在仔猪饲料中的应用。发明目的之一：抗菌肽生产方法及产品。发明目的之二：在仔猪饲料中的添加方法。
技术方案
一种来自枯草芽孢杆菌的抗菌脂肽的生产方法，包括：
以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)fmbJ，种子培养基扩大培养，种子培养基：胰蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水1000 ml，pH7.2；体积比 2~5%接种，28～35℃，5000 L发酵罐液体深层发酵30～48 h，液体发酵培养基：葡萄糖20.0 g/L，胰蛋白胨5.0 g/L，谷氨酸钠2~5%，MgSO4 0.5 g/L,
KCl 0.5 g/L, KH2PO4 1 g/L，FeSO4 0.15 mg/L, MnSO4
5.0 mg/L，CuSO4 0.16 mg/L，pH7.0；发酵工艺参数为：温度28～35℃，搅拌转速180 r∕min，通气量80 m3/h，罐压0.10~0.12 Mpa，pH7.0，消泡剂0.3%；发酵液经离心去除菌体，然后在上清液中加入HCl 调整pH至2.0，静置后离心，沉淀按发酵液体积分数25~30%加乙醇并调pH至7.0，进一步提取，提取物经赋型剂（麦芽糊精：多孔淀粉=6~9：1）吸附、干燥，或直接进行吸附、干燥，得抗菌肽成品，产品抗菌效价为20000~300000 IU/g。消泡剂为聚醚、硅油或大豆油，优选大豆油。
所述的枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌脂肽在仔猪饲料中的应用，其特征为：在仔猪基础日粮中按照4000 IU/kg添加所述的抗菌脂肽。
有益效果
本发明的主要优点和积极效果如下：
1. 本发明首次将枯草芽孢杆菌抗菌脂肽用于仔猪饲料中，可以显著减少仔猪的腹泻率，提高仔猪的饲料利用率，并通过提高三碘甲状腺氨酸(T3)和降低甲状腺素(T4)水平而提高机体免疫力。添加抗菌脂肽对仔猪的生长发育和免疫机能具有较好的调节和促进作用，提高鸡的饲料利用率和免疫功能有积极的意义。
2. 本发明与目前仔猪饲料中使用的黄霉素相比，具有更好的促进生产和调节免疫的效果，对取代饲料抗生素添加和保障食品的安全具有重要意义。
具体实施方式
实施例1
采用5000 L的发酵罐，以500 L放大后的最佳发酵工艺条件对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）fmbJ（保藏号：CGMCC No.0943，见专利公开号：CN1477189）进行发酵生产。最佳发酵工艺参数为：温度28～35℃，搅拌转速180 r∕min，通气量80 m3/h ，罐压0.10～0.12Mpa，pH7.0，大豆油0.3%。
以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌种fmbJ，种子培养基扩大培养，种子培养基：胰蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水1000 ml，pH7.2；体积比 2~5%接种，28～35℃，5000 L发酵罐液体深层发酵30～48 h，液体发酵培养基：葡萄糖20.0 g/L，胰蛋白胨5.0 g/L，谷氨酸钠2~5%，MgSO4 0.5 g/L,
KCl 0.5 g/L, KH2PO4 1 g/L，FeSO4 0.15 mg/L, MnSO4
5.0 mg/L，CuSO4 0.16 mg/L，pH7.0；发酵工艺参数为：温度28～35℃，搅拌转速180 r∕min，通气量80 m3/h，罐压0.10~0.12 Mpa，pH7.0，消泡剂大豆油0.3%；
发酵液采用的工业离心机为碟片式离心机（江苏巨能机械有限公司生产，DBY211型），转速为6000 r/min，去除菌体，然后将离心所得清液用6N HCl调pH至2.0、静置24 h，过滤除滤液得沉淀，沉淀按发酵液体积分数25~30%加乙醇并调pH至7.0，进一步提取，提取物经赋型剂[麦芽糊精（山东西王淀粉有限公司）：多孔淀粉（重庆泰威生物工程股份有限公司）=6~9：1] 吸附、干燥，或直接进行干燥，得抗菌肽成品。抗菌肽的回收率为48.4%，纯度为 58.5%，抑菌效价为50000~300000 IU/g。
实施例2
采用5000L的发酵罐，以1000 L放大后的最佳发酵工艺条件对Bacillus subtilis fmbJ进行发酵生产。最佳发酵工艺参数为：温度32℃，搅拌转速180 r∕min，通气量80 m3/h ，罐压0.10～0.12Mpa，pH7.0，大豆油0.3%。
采用的工业离心机为碟片式离心机，转速为6000 r/min，去除菌体，然后采用喷雾干燥方式进行干燥。其工艺为：温度210℃、风机转速70转/s、赋形剂：麦芽糊精：多孔淀粉=6~9：1，此时抗菌肽的回收率达54%，抑菌效价为20000~70000 IU/g干粉。
实施例 3
选用28日龄断奶的长×大二元杂交健康仔猪360头，根据公母各半、来源不同的原则随机分为4个处理组，每处理设6重复，每重复15头，各重复仔猪体重相近（P>0.05）。基础日粮选用玉米-豆粕型，营养需要参照NRC (1998)《猪的营养需要》回肠表观可消化氨基酸模式，日粮组成和营养成分。处理组分别为空白对照组（C组）饲喂基础日粮（基础日粮中不含抗生素和抗菌脂肽），抗生素对照组（AC）在基础日粮中添加5 mg/kg的黄霉素，试验І在基础日粮中添加枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌脂肽2000 IU/kg，预试期为3天，试验期为28天。
添加2000 IU/kg的І组28天的平均体重较C组提高3.76%；I组的平均体重日增量较C组增加8.27%，增加显著，较AC组增加1.7%，但不显著；I组的料重比F/G较AC组降低4.14%，较C组也降低2.87%。1~14天，I组的肠道大肠杆菌数量，较C组降低2个数量级，较AC组减少1个数量级，降低显著，但是乳酸杆菌的数量较C组降低了1个数量级（P>0.05），与AC组大致相当；1~14天的腹泻率较C组降低29.5%，和AC组相同（P<0.05）。显著降低了1~14天的仔猪腹泻率。
添加2000 IU/kg抗菌脂肽能显著提高血清三碘甲状腺氨酸T3水平，降低甲状腺素T4水平。 I组的三碘甲状腺氨酸T3水平较AC组提高61.61%（P<0.01），较C组也提高37.12%（P<0.05）；I组的甲状腺素T4水平较C组和AC组分别降低14.21%（P<0.05）和19.61%（P<0.05）。胰岛素水平I组较C组也升高17.63%（P<0.05）。但是抗菌脂肽对仔猪血清生长激素和皮质醇水平无显著影响。
甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平C组、AC组和I组均无显著差异。但I组的TG水平较C组和AC组有升高趋势，LDL-C水平较C组和AC组也有降低趋势。I组高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平较C组和AC组也有升高趋势。I组的高低密度脂蛋白胆固醇之比（H/L）较C组分别升高31.43%（ P<0.05 ）。I组总胆固醇（TC）水平较C组也降低19.31%（ P<0.05 ）。表明抗菌脂肽对断奶仔猪脂肪代谢有一定作用。血清总蛋白TP方面， I组较C组和AC组也有升高趋势，但差异不显著。各组尿素氮（UN）无显著差异且无明显变化趋势。
实施例 4
选用28日龄断奶的长×大二元杂交健康仔猪360头，根据公母各半、来源不同的原则随机分为4个处理组，每处理设6重复，每重复15头，各重复仔猪体重相近（P>0.05）。基础日粮选用玉米-豆粕型，营养需要参照NRC (1998)《猪的营养需要》回肠表观可消化氨基酸模式，日粮组成和营养成分。处理组分别为空白对照组（C组）饲喂基础日粮（基础日粮中不含抗生素和抗菌脂肽），抗生素对照组（AC）在基础日粮中添加5 mg/kg的黄霉素，试验ІІ组在基础日粮中添加枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌脂肽4000 IU/kg，预试期为3天，试验期为28天。
添加4000 IU/kg的ІІ组28天的平均体重较C组提高5.73%（P<0.05），ІІ组的平均体重日增量较C组增加10.06%，增加显著（P<0.05），较AC组增加3.9%，但不显著；ІІ组的料重比（F/G）较AC组和C组差异不显著。1~14天，ІІ组的肠道大肠杆菌数量，较C组降低2.7个数量级，降低显著，较AC组减少1个数量级（P>0.05），但是乳酸杆菌的数量较C组增加了1.5个数量级（P<0.05），与AC组大致相当；1~14天的腹泻率较C组降低35.5%，和AC组相同（P<0.05），显著降低了1~14天的仔猪腹泻率。
添加4000 IU/kg抗菌脂肽能显著提高血清三碘甲状腺氨酸T3水平，降低甲状腺素T4水平。ІІ组的三碘甲状腺氨酸T3水平较AC组提高59.82%（P<0.01），较C组也提高35.12%（P<0.05）；ІІ组的甲状腺素T4水平较C组和AC组分别降低7.15%和13.00%（P<0.05）。胰岛素水平ІІ组较C组也升高23.56%（P<0.05）。但是抗菌脂肽对仔猪血清生长激素和皮质醇水平无显著影响。
甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平各组间均无显著差异，但II组的TG水平较C组和AC组有升高趋势，LDL-C水平较C组和AC组也有降低趋势。II组高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平较C组和AC组有升高18.46%（P<0.05）和11.59%（P>0.05）。II组的高低密度脂蛋白胆固醇之比（H/L）较C组分别升高42.86%（P<0.01），II组较AC组也升高25%（P<0.05）。II组总胆固醇TC水平最低，较C组降低21.72%（P<0.01），表明抗菌脂肽对断奶仔猪脂肪代谢有一定作用。血清总蛋白TP方面，II组较C组和AC组分别升高15.65%和16.84%（P<0.05）。各组尿素氮（UN）无显著差异且无明显变化趋势。
Claims (4)
1.一种枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)fmbJ抗菌脂肽的生产方法，其特征为：以枯草芽孢杆菌fmbJ菌种，种子培养基扩大培养，种子培养基：胰蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水1000 ml，pH7.2；体积比 2~5%接种，28～35℃，5000 L发酵罐液体深层发酵30～48 h，液体发酵培养基：葡萄糖20.0 g/L，胰蛋白胨5.0 g/L，谷氨酸钠2~5%，MgSO4
0.5 g/L, KCl 0.5 g/L, KH2PO4 1
g/L，FeSO4
0.15 mg/L, MnSO4 5.0 mg/L，CuSO4 0.16 mg/L，pH7.0；发酵工艺参数为：温度28～35℃，搅拌转速180 r∕min，通气量80 m3/h ，罐压0.10~0.12 Mpa，pH7.0，消泡剂0.3%；发酵液经离心去除菌体，然后在上清液中加入HCl 调整pH至2.0，静置后离心，沉淀按发酵液体积分数25~30%加乙醇并调pH至7.0，进一步提取，提取物经赋型剂吸附、干燥，或直接进行吸附、干燥，得抗菌脂肽产品，产品抗菌效价为20000~300000 IU/g。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，消泡剂为聚醚、硅油或大豆油，优选大豆油。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，赋型剂为体积比麦芽糊精：多孔淀粉=6~9：1。
4.权利要求1-3之一所述的枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌脂肽在仔猪饲料中的应用，其特征为：在仔猪基础日粮中按照4000
IU/kg添加所述的枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌脂肽。
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