CN111004756B - 一种乳酸菌剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乳酸菌剂及其制备方法与应用，所述乳酸菌剂的制备方法包括如下步骤：(1)将食用菌接入第一培养基中，同时加入营养加强剂，发酵，得到第一发酵液；其中，所述的第一培养基中包括酒糟；(2)将豆粕胃蛋白酶水解液加入第一发酵液中，得到第二培养基；先向第二培养基中接入乳酸菌菌种，发酵，得到第二发酵液，即乳酸菌剂。本发明具有如下优势：增殖速度快，乳酸菌剂活菌数量高，其终浓度可达到106‑109cfu/mL以上，易在动物肠道繁殖，可有效增强改善动物的机体免疫力，调节肠道生态平衡，促进其生长发育，提高动物幼体的生存率和生长质量。
Description
技术领域
本发明属于微生物菌剂领域，具体涉及一种乳酸菌剂及其制备方法与应用。
背景技术
在畜牧、水产养殖行业广泛使用抗生素会导致动物肠道菌群紊乱和耐药性病原菌的传播，而饲喂乳酸菌等益生菌可以有效维持和改善肠道健康菌群结构，降低耐药性病菌传播的风险。
肠道益生菌是抵御病原菌的主要屏障，肠道微生物与宿主相互关系的紊乱是肠道菌群失调的主要原因。益生菌(probiotics)是一类通过改善宿主肠道菌群组成从而发挥有益作用的活性微生物，益生菌要发挥作用必须达到足够的活性菌数量。然而，市场上现有的最常见的益生菌产品如发酵乳制品、益生菌强化食品以及含益生菌的胶囊或片剂所含乳酸菌活力低，货架期较短限制了其广泛应用。因此，开发活性好，活菌数高且成本低的益生菌菌剂，具有十分重要的意义。
在大多数情况下，益生菌的活力高低以好坏与其所处环境中低聚糖为代表的益生素密切相关。益生素能够进肠道菌群中特定有益微生物生长或活性增加，通常为低聚木糖、低聚半乳糖等不消化食物组分。大量研究表明，益生素可促进益生茵在肠道内的定殖以改善肠道菌群结构，进而改善健康。低聚木糖选择性地促进肠道内乳酸菌等益生菌的生长，发酵低聚木糖产生乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸，降低肠道pH，抑制病原菌生长，加速肠道蠕动，防止食物在肠道过度发酵产生有害物质。高剂量添加的低聚木糖可增加家禽盲肠中乳酸菌数量，进而调整肠道菌群结构。
在大多数情况下，益生菌的活力高低及好坏与其所处环境中低聚糖为代表的益生素密切相关。益生素能够进肠道菌群中特定有益微生物生长或活性增加，通常为低聚木糖、低聚半乳糖等不消化食物组分。益生素可促进益生茵在肠道内的定殖以改善肠道菌群结构，进而改善养殖动物的健康。
目前，国内市场上在售的低聚糖种类众多，但成分较单一，生产成本高，因此影响了在养殖行业的应用。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种乳酸菌剂。
本发明还要解决的技术问题是提供上述乳酸菌剂的制备方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述乳酸菌剂的应用。
发明思路：通过一株高产半纤维素酶的食用菌，优选香菇菌通过液体深层培养对酒糟首先进行生物转化，产生富含木聚糖，以及氨基酸、维生素、有机酸等营养丰富的培养基，在此基础上调整培养基C/N比后经接入乳酸菌培养，进而获得高浓度乳酸菌活菌制剂，可作为益生菌饲喂养殖动物，改善其肠道生理健康状况。
其中，啤酒糟是啤酒生产过程中的主要副产物，主要以大麦为原料，经糖化提取籽实中碳水化合物之后的残渣。啤酒糟干物质中含粗蛋白25.13％、粗脂肪7.13％、粗纤维13.81％、灰分3.64％、钙0.4％、磷0.57％；在氨基酸组成上，赖氨酸占0.95％、蛋氨酸0.51％、胱氨酸0.30％、精氨酸1.52％、异亮氨酸1.40％、亮氨酸1.67％、苯丙氨酸1.31％、酪氨酸1.15％；还含有丰富的锰、铁、铜等矿物元素营养加强剂。但是，啤酒糟除了含有一定量的蛋白质、脂肪等营养物质外，还含有大量的不能被人及禽畜消化利用纤维素、半纤维素等成分，因而，不能被大量、广泛有效利用。而食用菌中含有许多降解啤酒糟中纤维素、半纤维素的酶，利用食用菌对其进行生物转化，同时形成多糖、寡糖、氨基酸、维生素等多种生理活性物质。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种乳酸菌剂的制备方法，其包括如下步骤：
(1)酒糟的生物转化：将食用菌接入第一培养基中，同时加入营养加强剂，液体深层次发酵，得到第一发酵液；其中，所述的第一培养基中包括酒糟；
(2)制备乳酸菌悬浮液：将豆粕胃蛋白酶水解液加入步骤(1)得到的第一发酵液中，即第二培养基；再向第二培养基中接入乳酸菌菌种，液体深层次发酵，得到第二发酵液，即乳酸菌剂。
步骤(1)中，所述的食用菌为包括香菇菌、侧耳、杏鲍、金针菇、木耳等；其中，优选香菇菌JK-3，其为一株在稻壳、酒糟混合培养基上驯化后的香菇菌种。
步骤(1)中，PDA培养基培养的食用菌液体种子按照15％v/v的接种量接入到第一培养基中。
步骤(1)中，所述的第一培养基中各组分的质量分数为：酒糟5％～35％，玉米浆5％～15％，麦麸1％～5％，黄豆粉0.05％～1.0％，其余为水，pH为6～8；所述的营养加强剂为磷酸氢二钾、硫酸镁、木糖、阿拉伯糖，控制添加量使其浓度分别为0.1％～0.5％W/V；0.05％～0.5％W/W；0.1％～5％W/V；0.1％～5％W/V。
其中，本发明所涉及到的％W/V指100mL溶剂中有多少克溶质，或者100L溶剂中有多少千克溶质。
其中，所述的酒糟为酒精糟和啤酒糟的任意一种或两种组合。
优选地，所述的酒糟为酒精糟和啤酒糟的组合，其中，酒精糟和啤酒糟的质量百分比为1∶0.2～1∶5。
其中，pH的调节剂为富含钙离子的碱性溶液；通过加入pH的调节剂以降低培养基中酒糟带来的酸度，同时促进所接入的食用菌菌株的生长。
其中，所述的富含钙离子的碱性溶液为氢氧化钙，CaCO3和NH3H2O混合物中的任意一种或几种组合。
步骤(1)中，发酵的条件为：通气量10～50m3/h，溶氧量为5％～50％v/v，在20～30℃下发酵1～7天。
步骤(1)中，所得的第一发酵液为适合乳酸菌生长的发酵转化液，其所含的低聚糖不低于100mg/mL；其中，所述的低聚糖为低聚木糖。
优选地，在食用菌接入第一培养基发酵转化过程中，在发酵过程中通过补加10-30％V/V的1.5～3倍系数浓度第一培养基的方式增加发酵产物浓度进而进一步提高最终发酵液中乳酸菌的浓度和活力。
步骤(2)中，所述的乳酸菌优选为动物双歧杆菌CICC 21711、植物乳杆菌CICC21790、乳酸链球菌CICC 6242中的任意一种或几种组合。
步骤(2)中，所述的豆粕胃蛋白酶水解液为将质量百分比为1～15％的胃蛋白酶水溶液(活力为200-10000U/g)添加到质量百分数为30～85％豆粕水溶液中，于10～50℃水解0.5～30h，得到的豆粕胃蛋白酶水解液。其中胃蛋白酶的活力单位定义为：每分钟能催化水解血红蛋白生成1μmol酪氨酸的酶量。
步骤(2)中，所述豆粕胃蛋白酶水解液与第一发酵液的用量为1～15％V/V；发酵的条件为：通气量1～30m3/h，溶氧量为1％～35％V/V，在30～40℃下发酵至乳酸菌浓度不低于106cfu/mL，优选107～109cfu/mL。
步骤(2)中，按照1～30v/v％的接种量将上述各乳酸菌以单菌或多菌种的方式接入到第二培养基。
上述方法制备得到的乳酸菌剂也在本发明的保护范围之内；其中，所述乳酸菌剂的浓度不低于107cfu/mL，且其同时含有丰富的包括8种必须氨基酸在内的氨基酸、维生素、微量元素、β-1,3葡聚糖、木糖、木聚糖、戊聚糖、γ-氨基丁酸、谷胱甘肽，其中，低聚糖的浓度在15％W/V以上，β-1,3葡聚糖的含量为0.1％～1％w/V；其中，所述的低聚糖为低聚木糖。
其中，所述的乳酸菌剂是一种很好的益生菌与益生素复合体，比一般的单一的益生菌或益生素更有效增强改善养殖动物的机体免疫力，调节肠道生态平衡，促进其生长发育，在不饲喂含抗生素饲料的情况下，可显著提高动物幼体的生存率和生长质量。
上述乳酸菌剂在饲料中的应用也在本发明的保护范围之内。
本发明根据益生菌对畜牧水产养殖行业的重要意义，以营养丰富、来源广泛、成本低廉的啤酒糟为主要原料，利用食用菌可有效对其生物转化的特点，发明一种新型高浓度乳酸菌活菌制剂的制备方法。该方法可利用食用菌对啤酒糟生物转化产生大量低聚木糖的特点，利用深层发酵技术，先制备出富含低聚糖，同时含有丰富氨基酸、维生素、微量元素的发酵液，然后接种乳酸菌、双歧杆菌等益生菌进行培养，获得高浓度乳酸菌活菌制剂，同时含有丰富的包括8种必须氨基酸在内的氨基酸、维生素、微量元素、β-1，3葡聚糖、木糖、木聚糖、戊聚糖、γ-氨基丁酸、谷胱甘肽益生菌与益生素复合体，可显著提高动物机体免疫力，幼体的生存率和生长质量，生物活性高、价格低廉，可广泛应用于畜牧、家禽和水产养殖业。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：
(1)本发明所制备的乳酸菌剂增殖速度快，乳酸菌剂活菌数量高，其终浓度可达到106-109cfu/mL以上，易在动物肠道繁殖，可有效增强改善鸡鸭及鱼虾等养殖动物的机体免疫力，调节肠道生态平衡，促进其生长发育，在不饲喂含抗生素饲料的情况下，可显著提高动物幼体的生存率和生长质量。
(2)该菌剂符合绿色饵料及饲料添加剂的要求，制备成本低廉、使用方便，可在水产育苗和养殖业领域广泛推广使用。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
1.1酒糟的生物转化
取质量比为1∶1.5酒精糟和啤酒糟25％，玉米浆10％，麦麸3％，黄豆粉1％，用石灰水调pH至6～8，经高压灭菌后接入15％V/V的香菇菌JK-3液体菌种(用PDA培养基培养的香菇菌JK-3液体菌种)和无菌过滤的磷酸氢二钾、硫酸镁、木糖、阿拉伯糖溶液，使其终浓度为磷酸氢二钾0.2％W/V，硫酸镁0.15％W/V，木糖1％W/V，阿拉伯糖1％W/V，运用100L气升式发酵罐进行液体深层培养。其间控制通气量25m3/小时，溶氧量15％V/V，25℃，发酵周期为3天至低聚木糖浓度为3000mg/L。
1.2乳酸菌菌悬液制备
利用上述食用菌发酵为培养基，补加5％V/V经灭菌处理的豆粕胃蛋白酶水解液，接入15％v/v的双歧杆菌菌种CICC 21711，调整温度至40℃，运用气升式发酵罐进行液体深层培养。其间控制通气量5m3/小时，溶氧量2％v/v，发酵至109cfu/mL即停止发酵，即得乳酸菌剂。
对上述乳酸菌剂进行检测，平板法检测其活菌数量浓度不低于107cfu/mL；高效液相法对产品检测证明其含有丰富的包括8种必须氨基酸在内的游离氨基酸，平均浓度可达100μg/100mL；荧光法检测维生素B1、B2的含量均为30μg/mL；原子吸收法分析显示种类较丰富的微量元素，其中钙、钾、镁、锌、硒、锗等元素的含量分别可以达到100mg/100mL、40mg/100mL、20mg/100mL、15mg/100mL、0.6mg/100mL、0.2mg/100mL的浓度；HPLC、LC/MS法检测含有β-1,3葡聚糖、木糖、木聚糖、戊聚糖、γ-氨基丁酸、谷胱甘肽等活性成分，其中，低聚糖的浓度在15％W/V以上，木糖、木聚糖、戊聚糖、等约为5～10％(不同批次若为有变化)，β-1,3葡聚糖含量为1％，其余γ-氨基丁酸、谷胱甘肽等活性成分在1％以下。
实施例2：
取质量比为1∶1.5酒精糟和啤酒糟25％，玉米浆12％，麦麸3％，黄豆粉1％，在1000L气升式发酵罐中投入培养基500L，用石灰水调pH至6～8，经高压灭菌后接入无菌过滤的加入磷酸氢二钾、硫酸镁、木糖、阿拉伯糖，使其终浓度为磷酸氢二钾0.2％W/V，硫酸镁0.15％W/V，木糖1％W/V，阿拉伯糖1％W/V。并接入实施例1中所述培养好的香菇菌JK-3培养上清液和菌丝混合物(二级扩大菌种)，接种量为15％V/V，以通气量30m3/小时，溶氧量25％v/v，25℃条件下培养。培养72小时后，按发酵液体积30％的量补加3倍系数浓度的酒精糟/啤酒糟、玉米浆物料液，即150L 75％W/V酒精糟/啤酒糟，玉米浆30％W/V(同样用石灰水调pH至6～8)，以通气量45m3/小时，溶氧量35％v/v，进行补料发酵，发酵至低聚木糖浓度为7000mg/L。
接入15％V/V的乳酸菌菌种植物乳杆菌CICC 21790，同时补加补加15％V/V经灭菌处理的豆粕胃蛋白酶水解液，培养至1012cfu/mL以上，其间控制通气量5m3/小时，溶氧量2％v/v，即得乳酸菌剂。该实施例中通过补料发酵的食用菌培养上清的营养更丰富，可有效提高乳酸菌的活菌数量。对乳酸菌剂进行平板法检测，其活菌数量浓度不低于108cfu/mL。
实施例3：
取上述实施例中1、2制备的高浓度乳酸菌活菌制剂，按5％的比例投入不含抗生素的日常饲料中，饲喂200只一周龄的新生小鸡，共饲养30天。另做两个对照组，一组饲喂不含抗生素的日常饲料，另一组饲喂通用的含抗生素的饲料，培养天数相同。最后比较三组小鸡生长情况和死亡率。
实验结果显示：
(1)实验组饲养情况为：饲喂实施例中1产品鸡重量平均650g，偏差在12％左右，死亡率在.5％，5只；饲喂实施例2中产品的鸡重量平均750g，偏差在8％左右，死亡率为2％，4只。
(2)不含抗生素组死亡率较高，达32只，超过15％，平均体重在600g上下，体重偏差在15％以上；
(3)含抗生素组死亡率在5％，达10只。平均体重670g、体重偏差20％。
由上述对比养殖实验结果可看出，饲喂本发明产品的饲养鸡的生长速度要大大高于不含抗生素组，同时死亡率也大大降低，生长状态也远高于该组。对比结果还可看出：实验组的死亡率与不含抗生素组接近，但生长状况要好于该组。由此说明用本发明的乳酸菌菌剂高含量的活菌可以改善饲养鸡的肠道健康状况，其抑菌效果可与抗生素相当。同时，其丰富的氨基酸、多糖等营养要素可以促进饲养鸡的良好发育。因此，本发明产品作为优秀的益生菌菌剂，对发展绿色养殖，减少抗生素对机体的伤害和对环境的污染具有积极的意义。
Claims (6)
1.一种乳酸菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)酒糟的生物转化：将食用菌接入第一培养基中，同时加入营养加强剂，发酵，得到第一发酵液；
(2)制备乳酸菌悬浮液：将豆粕胃蛋白酶水解液加入步骤(1)得到的第一发酵液中，即第二培养基；再向第二培养基中接入乳酸菌菌种，发酵，得到第二发酵液，即乳酸菌剂；
步骤(1)中，所述食用菌为香菇菌、侧耳、杏鲍、金针菇和木耳中的任意一种；
步骤(1)中，所述的第一培养基中各组分的质量分数为：酒糟5％～35％，玉米浆5％～15％，麦麸1％～5％，黄豆粉0.05％～1.0％，溶剂为水，pH为6～8；所述的营养加强剂为磷酸氢二钾、硫酸镁、木糖、阿拉伯糖，控制添加量使其浓度分别为0.1％～0.5％w/v；0.05％～0.5％w/v；0.1％～5％w/v；0.1％～5％w/v；
步骤(1)中，发酵的条件为：通气量10～50m3/h，溶氧量为5％～50％v/v，在20～30℃下发酵1～7天；
步骤(2)中，所述的乳酸菌为动物双歧杆菌CICC 21711或植物乳杆菌CICC 21790；
步骤(2)中，所述的豆粕胃蛋白酶水解液为将质量百分比为1～15％的胃蛋白酶水溶液添加到质量百分数为30～85％豆粕水溶液中，于10～50℃水解0.5～30h，得到的豆粕胃蛋白酶水解液；所述豆粕胃蛋白酶水解液与第一发酵液的用量为1～15％v/v；
步骤(2)中，发酵的条件为：通气量1～30m3/h，溶氧量为1％～35％v/v，在30～40℃下发酵至乳酸菌浓度不低于106cfu/mL。
2.根据权利要求1所述的乳酸菌剂的制备方法，其特征在于，所述的酒糟为酒精糟和啤酒糟的任意一种或两种组合。
3.根据权利要求2所述的乳酸菌剂的制备方法，其特征在于，所述的酒糟为酒精糟和啤酒糟的组合，其中，酒精糟和啤酒糟的质量百分比为1:0.2～1:5。
4.根据权利要求1所述的乳酸菌剂的制备方法，其特征在于，pH的调节剂为富含钙离子的碱性溶液；
其中，所述的富含钙离子的碱性溶液为氢氧化钙，CaCO3和NH3· H2O混合物中的任意一种或几种组合。
5.权利要求1～4所述方法制备得到的乳酸菌剂。
6.权利要求5所述乳酸菌剂在制备饲料中的应用。
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