CN102827798A - 一种维生素k2高产菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于公开一种维生素K2高产菌株，与现有技术相比，以纳豆芽孢杆菌BS-5为出发菌株，经过紫外和亚硝基弧的复合诱变处理，筛选得到突变株BS-53，突变株BS-53与维生素K2产量低但生长速度快的纳豆芽孢杆菌CICC10262进行原生质体融合，通过平板筛选获得融合子，融合子经过发酵性能实验筛选获得；具有双亲优良特性，即同时具有MK高产和生长速度快的双重功效，为实现MK高产提供了有效措施，具有重要的科学意义和应用价值，实现本发明的目的。
Description
技术领域
本发明涉及一种菌株，特别涉及一种维生素K2高产菌株。
背景技术
维生素K是一类具有叶绿醌生物活性的萘醌基团衍生物，在控制凝血方面发挥着重要作用。天然存在的有维生素K1和K2，维生素K1广泛存在于绿色植物中，是食物中维生素K的重要来源；维生素K2主要由人体的肠道细菌合成。
研究发现，维生素K2属于脂溶性维生素，具有维持机体的正常凝血作用，预防骨质疏松以及抗癌等作用。研究表明维生素K2参与合成血液凝固的多种蛋白质，在这一形成过程中，凝血酶原与磷脂形成一种聚合体，其中钙离子能够促进聚合体的合成，但在缺乏维生素K2时，凝血酶原与钙离子的亲和性显著降低，凝血过程受到阻碍。
原生质体融合起源于20世纪60年代，并于70年代逐渐发展起来的重要基因重组技术。是通过酶或机械的方法除去细胞壁，使双亲株的微生物菌体细胞形成球状原生质体，经过物理、化学或生物方法使双亲株的原生质体融合，再发生染色体基因组间的交换重组，使融合子具有双亲的优势性状，在适宜的培养条件下再生细胞壁，经过合理的筛选，从再生菌体中获得重组子。
近年来，该技术已成为细胞生物学研究领域迅速发展的方向之一。该技术不仅能够改良菌种遗传性状、提升有用代谢产物产量，还能综合不同菌株的代谢特性，产生新的有用代谢产物，在工业生产和遗传育种上展示出美好的应用前景。实践证明，利用原生质体融合技术可以获得具有双亲优良特性的融合子，并且细菌之间的原生质体融合可以克服细菌种属之间的差异而实现基因重组。
因此，特别需要一种维生素K2高产菌株，已解决上述现有存在的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种维生素K2高产菌株，针对现有技术的不足，利用先进的生物技术手段，显著提高了维生素K2的产量，为规模化生产维生素K2提供了方法，具有重要的实际意义。
本发明所解决的技术问题可以采用以下技术方案来实现：
一种维生素K2高产菌株，其特征在于，它由纳豆芽孢杆菌BS-5的突变体BS-53原生质体与纳豆芽孢杆菌CICC10262原生质体融合后筛选获得。
在本发明的一个实施例中，所述突变体BS-53是由纳豆芽孢杆菌BS-5菌株经过紫外和亚硝基弧复合诱变获得。
在本发明的一个实施例中，所述纳豆芽孢杆菌BS-5菌株是合肥工业大学食品学院微生物实验室提供的，所述纳豆芽孢杆菌CICC10262由中国微生物菌种保藏管理中心提供。
在本发明的一个实施例中，所述突变体BS-53原生质体与纳豆芽孢杆菌CICC10262原生质体之间的融合是采用电融合方式。
本发明的维生素K2高产菌株，与现有技术相比，以纳豆芽孢杆菌BS-5为出发菌株，经过紫外和亚硝基弧的复合诱变处理，筛选得到突变株BS-53，突变株BS-53与维生素K2产量低但生长速度快的纳豆芽孢杆菌CICC10262进行原生质体融合，通过平板筛选获得融合子，融合子经过发酵性能实验筛选获得；具有双亲优良特性，即同时具有MK高产和生长速度快的双重功效，为实现MK高产提供了有效措施，具有重要的科学意义和应用价值，实现本发明的目的。
本发明的特点可参阅本案图式及以下较好实施方式的详细说明而获得清楚地了解。
附图说明
图1为本发明的维生素K2高产菌株的技术原理图；
图2为突变体BS-53原生质体的示意图；
图3为纳豆芽孢杆菌CICC10262原生质体的示意图；
图4为突变体BS-53原生质体和纳豆芽孢杆菌CICC10262原生质体的电融合过程的示意图；
图5为突变体BS-53和本发明的维生素K2高产菌株不同时间menD基因表达量变化的示意图；
图6为BS-53和本发明的维生素K2高产菌株不同时间menB基因表达量变化的示意图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。
如图1所示，本发明的维生素K2高产菌株，它由纳豆芽孢杆菌BS-5的突变体BS-53原生质体与纳豆芽孢杆菌CICC10262原生质体融合后筛选获得。
在本发明中，所述突变体BS-53是由纳豆芽孢杆菌BS-5菌株经过紫外和亚硝基弧复合诱变获得。
所述纳豆芽孢杆菌BS-5菌株是合肥工业大学食品学院微生物实验室提供的，所述纳豆芽孢杆菌CICC10262由中国微生物菌种保藏管理中心提供。
所述纳豆芽孢杆菌BS-5菌株是一种从自然界中分离的可以产MK的革兰氏枯草芽孢杆菌，但是产量比较低；纳豆芽孢杆菌CICC10262是一种MK产量低但生长速度快的菌株；纳豆芽孢杆菌BS-53是纳豆芽孢杆菌BS-5菌株诱变处理后MK产量高但生长速度慢的菌株。
在本发明中，所述突变体BS-53原生质体与纳豆芽孢杆菌CICC10262原生质体之间的融合是采用电融合方式。
具体工程如下：
第一步：菌种活化
菌种BS-5和纳豆芽孢杆菌CICC10262复壮后，接种于斜面固体培养基上，37℃恒温培养18-24h，置于4℃保存。
第二步：种子培养
活化菌种接入液体培养基中（30/250ml），37℃，120r/min恒温培养48h。取种子培养液，按5%的接种量（v/v）接入到液体培养基中（30/250ml），37℃，120r/min恒温培养。
第三步：BS-5菌株的紫外诱变
BS-5菌对数生长早期的菌悬液，于3500r/min离心收集菌体，用灭菌生理盐水洗涤菌体2-3次后，制成细胞浓度为1×108个/mL的菌悬液。
在超净工作台上，吸取15mL菌悬液于直径9cm的无菌培养皿中，调整培养皿至紫外灯（20W）的垂直距离为30cm。在紫外灯下照射45s后，连续处理两代，将菌液涂布于抗性平板，37℃恒温培养箱中避光培养24h，筛选得到BS-52菌。
第四步：BS-5菌株的紫外诱变
取BS-52菌悬液9ml，加入亚硝基弧溶液1ml,使其在菌悬液中的终浓度达到100ug/ml，置于37℃恒温振荡30min，取出菌悬液8000r/min离心10min，弃去上清液，用生理盐水洗涤2-3次，再用10ml液体培养基悬浮菌体，于37℃培养24h。制备的菌悬液，适当稀释，取0.1ml涂布抗性平板，37℃恒温培养箱中避光培养24h，筛选得到BS-53菌。
第五步：BS-53菌和CICC10262原生质体制备（参见图2和图3）
将2％活化菌株CICC10262接种到20mL新鲜完全培养基中，37℃振荡培养至对数生长前期，加入青霉素0.6U/mL继续培养约2h，取菌液，离心10min，弃去上清液，用磷酸缓冲液洗2次，再悬浮于高渗缓冲液（SMM）中。加入溶菌酶1.0mg/mL于37℃保温1h，每隔一段时间在倒置显微镜下观察是否有原生质体生成，当镜检有90%的原生质体形成时，3000r/mim离心10min，弃上清液，沉淀用高渗缓冲液（SMM）洗涤2次以除酶，最终悬浮于SMM中。
将2％活化菌株BS-53菌接种到20mL新鲜完全培养基中，37℃振荡培养至对数生长前期，加入青霉素2U/mL继续培养约2h，取菌液，离心10min，弃去上清液，用磷酸缓冲液洗2次，再悬浮于高渗缓冲液（SMM）中。加入溶菌酶1.4mg/mL于37℃保温40min，每隔一段时间在倒置显微镜下观察是否有原生质体生成，当镜检有90%的原生质体形成时，3000r/mim离心10min，弃上清液，沉淀用SMM洗涤2次，悬浮于SMM中。
第六步：原生质体电融合（参见图4）
BS-53菌（热灭活法）和CICC10262菌株（紫外灭活法）分别经过灭活后，取两亲本灭活原生质体悬液各2ml，以1：1等量混合于灭菌离心管中，用SMM离心洗涤2次（3500r/min，10min），并用电击缓冲液离心洗涤一次，之后悬浮于电击液中，调整原生质体浓度为108个/ml。用无菌移液器取少量混合悬液注入1cm的融合电极小室中，置于倒置显微镜下，之后接通电融合仪，先接通成串电压和电流，调整电压的大小，当电极小室中的原生质体在电压的作用下逐渐形成串珠状时，维持电压几分钟，使其形成稳定的串珠状。再接通直流融合电压，直流脉冲可瞬间可逆击穿相邻的原生质体膜，从而触发相邻原生质体的融合。将融合小室取出，放入超净工作台内，静置约5-10min，将电融合液用微量移液器接种于再生培养基上，于37℃培养4d，并从再生培养基上分离融合子。
第七步：融合子的筛选
选择再生平板上生长速度快、菌落直径大的单菌落，进行维生素K2高产菌株的初步筛选；淘汰菌落偏小、生长速度慢、易老化的菌落。
将初筛菌株接种于液体复筛培养基中，37℃，200r/min培养4d，以MK产量作为筛选指标，同时以出发菌株作为对照，进一步筛选即可获得本发明的维生素K2高产菌株（参见图5和图6）。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (4)
1.一种维生素K2高产菌株，其特征在于，它由纳豆芽孢杆菌BS-5的突变体BS-53原生质体与纳豆芽孢杆菌CICC10262原生质体融合后筛选获得。
2.如权利要求1所述的维生素K2高产菌株，其特征在于，所述突变体BS-53是由纳豆芽孢杆菌BS-5菌株经过紫外和亚硝基弧复合诱变获得。
3.如权利要求1所述的维生素K2高产菌株，其特征在于，所述纳豆芽孢杆菌BS-5菌株是合肥工业大学食品学院微生物实验室提供的，所述纳豆芽孢杆菌CICC10262由中国微生物菌种保藏管理中心提供。
4.如权利要求1所述的维生素K2高产菌株，其特征在于，所述突变体BS-53原生质体与纳豆芽孢杆菌CICC10262原生质体之间的融合是采用电融合方式。
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