CN105255741B

CN105255741B - 一株高产糖化酶的黑曲霉突变菌株及其工业发酵技术

Info

Publication number: CN105255741B
Application number: CN201510677280.4A
Authority: CN
Inventors: 王兴吉; 韩龙; 郭庆文; 佟新伟
Original assignee: Shandong Lonct Enzymes Co ltd
Current assignee: Shandong Lonct Enzymes Co ltd
Priority date: 2015-10-19
Filing date: 2015-10-19
Publication date: 2018-12-07
Anticipated expiration: 2035-10-19
Also published as: CN105255741A

Abstract

本发明提供一株高产糖化酶的黑曲霉(Aspergillus niger)GA‑179。该菌株通过多轮原生质体电融合育种选育获得，保藏编号为CGMCC No.10788。经发酵条件优化，平均发酵酶活力可达到87000‑90000u/mL，比原始菌株提高了99.3％。且该菌株本菌种生长迅速，在进行发酵时，与其他同类菌株相比，对数期由原先的90h左右，缩短至50h左右，发酵周期缩短，大大降低了生产成本。此外，由于比活力的提高，也可相应的降低酒精、淀粉糖、酿造等行业的应用成本。

Description

一株高产糖化酶的黑曲霉突变菌株及其工业发酵技术

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一株高产糖化酶的黑曲霉突变菌株及工业发酵技术。

背景技术：

糖化酶(Glucoamylase EC3.2.1.3)是葡萄糖淀粉酶的简称(缩写为GA或G)，是由微生物分泌产生的，具有外切酶活性的胞外酶，催化淀粉从非还原端水解α-1,4糖苷键逐个释放出单个β-D-葡萄糖。此外，还能水解α-1,6糖苷键和α-1,3糖苷键，能将支链淀粉彻底水解为葡萄糖，是水解淀粉的主要酶类，现已被广泛的应用于白酒、酒精、食醋、氨基酸、有机酸和抗生素等发酵工业。

糖化酶在微生物中的分布很广，在工业中应用的糖化酶主要是从黑曲霉、米曲霉、根霉等丝状真菌和酵母中获得，从细菌中也分离到稳定的糖化酶，人的唾液、动物的胰腺中也含有糖化酶。不同来源的糖化酶其结构和功能有一定的差异，对生淀粉的水解作为的活力也不同，真菌产生糖化酶对生淀粉具有较好的水解作用。

几十年来我国科研工作者为提高糖化酶的酶活进行了不懈努力，如中国专利CN104357335 A公布了一株以黑曲霉为原始菌株，通过诱变与筛选获得的产糖化酶的菌株-黑曲霉CGMCC 8641，该菌株发酵产酶酶活最高可达4219U/mL；专利号为ZL200610102056.3的发明专利公开了一株高产糖化酶的黑曲美突变株IN7-31，保藏号为CGMCC 1818，该突变株糖化酶活力是出发菌株的3.5倍，其制得的麸曲糖化酶活力可达7000-12000U/g,液态糖化酶制剂酶活力可达2200-4200U/mL，同时该菌株还具有产酶速度快，无霉腐味等特点。

尽管这些研究也已经达到了很高的水平，但是利用诱变、DNA重组技术或其他方法获得优良菌株，提高糖化酶基因在受体菌中的表达水平，进一步优化糖化酶的发酵和提取工艺以及保存条件，仍然是糖化酶在各行业领域进行大规模应用的重要前提。

发明内容：

本发明的目的在于提供一株高产糖化酶的黑曲霉突变株及其工业发酵方法。

本发明中所述的高产糖化酶的黑曲霉菌株具体为黑曲霉(Aspergillus niger)GA-179,该菌株已于2015年5月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 10788。

本发明所述黑曲霉突变菌株CGMCC 10788是通过黑曲霉G131和黑曲霉G285进行多轮原生质体电融合育种选育获得。黑曲霉G131在实验室条件下液体发酵最高酶活为61250u/mL，黑曲霉G285在同等条件下发酵最高活力为43820u/mL，突变株CGMCC 10788液体发酵酶活达到80130u/mL，经发酵条件优化后，液体发酵平均产酶活力在87000-90000u/mL，本菌种所产糖化酶的使用温度范围为58℃-60℃，酶的使用pH范围为4.0-4.2。

黑曲霉G131是经紫外诱变筛选到的高产糖化酶菌株，其发酵酶活较原始菌提高了39.8％，黑曲霉G285是原始菌在传代过程中分离纯化得到的，其生长表型为菌丝型，不产孢子，液体培养其菌丝短细，发酵液混合均匀，物料、溶氧传递效果良好，为了得到一株适合液体发酵的高产糖化酶菌株，对两株菌先进行紫外灭活后再进行多轮电融合选育，直到选育出一株不产孢子、高产糖化酶的菌株CGMCC 10788，本菌种的最适生长温度为34℃，生长所需的PH范围为4.5-5.0。

所述黑曲霉菌株CGMCC 10788所产糖化酶活力达到87000-90000u/mL。

所述黑曲霉突变菌株CGMCC 10788工业发酵糖化酶的方法主要包括如下步骤：

1)种瓶制备：刮取试管斜面的菌苔接入察氏种瓶中，34℃，200rpm，发酵5d，发酵结束后将种子液收集到3L的无菌瓶中，得到种子罐的种瓶；

2)种子罐培养：将种瓶接种到察氏种子罐中，34℃，180-300rpm，发酵48h；

3)发酵罐培养：在无菌条件下，按照8％的接种量，将种子罐发酵液压入发酵罐，进行发酵罐培养。34℃，180-300rpm，发酵至60h后控制溶氧20％-30％，75h开始补料，发酵至菌体自溶严重，酶活无明显提高时放罐；

4)提取与精制：发酵液加入100ppm聚丙烯酰胺和3％珍珠岩进行絮凝和板框压滤，然后进行超滤浓缩，最后加入防腐剂和保护剂配兑并用硅藻土过滤除菌，得到糖化酶成品酶制剂；

发酵培养基质量体积百分百组成如下：玉米粉10％-12％，豆饼粉2.5％-3％，麸皮1％-2％，氯化钙0.03％，硫酸铵1％-1.5％，玉米浆2％-3％，pH4.5；

补料培养基质量体积百分百组成如下：玉米淀粉20％，玉米浆2％，硫酸铵0.5％，pH4.5。

有益效果：

1、本发明通过对原始菌株进行诱变提高酶活后，对两株不同表型的黑曲霉进行原生质体融合筛选，再经过培养基优化和发酵工艺条件优化，建立了液体发酵糖化酶的方法，发酵活力在87000-90000u/ml，比原始菌株提高了99.3％左右；本菌种所产糖化酶的使用温度范围为58℃-60℃，酶的使用pH范围为4.0-4.2，与本技术领域的其他菌株所产糖化酶相比，本酶的比活力提高了120％左右，由于比活力的提高，也可相应的降低酒精、淀粉糖、酿造等行业的应用成本。

2、本菌种的最适生长温度为34℃，生长所需的pH范围为4.5-5.0，发酵中期阶段的PMV一直维持在60％左右；与其他同类菌株相比，对数期由原先的90h左右，缩短至50h左右，且整个发酵期间，发酵液的酶活水平和增长速度明显高于较其他菌株，在相同的发酵时间内，生产更多的酶，大大降低了生产成本。

附图说明：

图1不同菌株的发酵水平

图2标准曲线

图3发酵过程生物量变化曲线

图4发酵过程酶活力变化曲线

具体实施方式：

以下通过具体实施例对本发明做更详细的说明，具体实施案例仅为举例说明，不作为对本发明实施范围的限定。

实施例1 菌株的诱变选育

1)原生质体的制备

取两株出发菌株的新鲜斜面，用无菌水洗脱菌体，转移至装有玻璃珠的三角瓶中，置于摇床振荡30min使菌体分散，离心收集菌体，用0.6M山梨醇渗透压稳定剂(0.1M柠檬酸缓冲+0.6M山梨醇+0.01M EDTA)悬浮，离心洗涤后收集用渗透压稳定剂悬浮，置冰中备用。然后加入溶菌酶1.2％、蜗牛酶0.8％、纤维素酶0.8％，在30℃进行酶解6小时，制得原生质体备用，其中原生质体制备率和再生率的计算方法如下：在普通培养基培养并计菌落数为A；将原生质体悬浮液稀释一定倍数，在普通培养基培养并计菌落数为B；在高渗再生培养基培养并计菌落数为C。

原生质体制备率＝(A-B)/A*100％＝89％

原生质体再生率＝(C-B)/(A-B)*100％＝33％

普通培养基：蔗糖30g，蛋白胨10g，牛肉膏5g，淀粉10g，琼脂20g，水1000mL；

再生培养基：蔗糖30g，蛋白胨10g，牛肉膏5g，淀粉10g，氯化钠35g，琼脂20g，水1000mL。

2)原生质体电融合

将制得的两株菌的原生质体稀释到浓度为10⁶个/mL，各取5mL分别置于2个平板上，在超净工作台中，于15W紫外灯30cm处照射15min，将紫外灭活的两亲本菌株的原生质体悬液用0.6mol/L的山梨醇溶液洗涤2次后分别悬于电击液中，然后将两亲本菌株的原生质体混合均匀，进行电融合操作，选用方波脉冲，条件为低压：120v；脉冲宽度：100ms；脉冲个数：10；脉冲间隔时间：8s；高压：3000v；脉冲宽度：0.5ms：脉冲个数：3；脉冲间隔时间：6s，电融合结束后，将融合液经稀释后接种在再生培养基上，34℃培养5天，计算HC值。重复多次实验后从中选出5株不产孢子且HC(HC＝水解圈直径/菌落直径)值高的新菌株，分别是GA-13、GA-45、GA-108、GA-179、GA-205。

3)摇瓶发酵筛选

将选出的5株菌进行摇瓶发酵，淀粉5％，大豆蛋白4％，麸皮0.5％，硝酸钠0.3％，磷酸二氢钾0.4％，玉米浆1.2％。培养温度34℃，培养时间5d，培养结束后测发酵液中糖化酶活力，5株菌摇瓶实验结果如下：

菌株	发酵活力(u/mL)
		GA-13	73020
GA-45	76870
		GA-108	78230
GA-179	80130
		GA-205	75420

4)生产菌株的表型特征

根据摇瓶实验结果，选GA-179为生产菌株，进行发酵工艺优化。GA-179表型特征为：平板菌落致密呈灰白色，无孢子，镜检为中间有隔膜的菌丝片段。

实施例2 GA-179液体发酵生产糖化酶及其提取

2)种子罐培养：将种瓶接种到种子罐中，34℃，250rpm，发酵48h，种子培养基为察氏培养基；

3)发酵产糖化酶

发酵罐培养基配方：玉米粉10％-12％，豆饼粉2.5％-3％，麸皮1％-2％，氯化钙0.03％，硫酸铵1％-1.5％，玉米浆2％-3％，pH4.5；

补料配方：玉米淀粉20％，玉米浆2％，硫酸铵0.5％，pH4.5；

培养条件：接种量8％，34℃，250rpm，发酵至60h后控制溶氧25％，75h开始补料，补料控制pH 4.8，培养周期130h。

下表是5批次60m³发酵罐的发酵周期和发酵酶活力，平均发酵活力在87005u/mL。

批次	发酵周期(h)	发酵活力(u/mL)
			1	132	87035
2	135	86960
			3	140	86541
4	133	87352
			5	135	87138

2)发酵液提取与精制

发酵液加入100ppm聚丙烯酰胺和3％珍珠岩进行絮凝和板框压滤，然后进行超滤浓缩，最后加入防腐剂和保护剂配兑并用硅藻土过滤除菌，得到糖化酶成品酶制剂。

实施例3 糖化酶酶活测定方法

1)酶活定义：1g固体酶粉(或1ml液体酶)，于40℃、pH值为4.6的条件下，1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖，即为1个酶活力单位，以u/g(u/mL)表示。

2)原理

糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定，计算酶活力。

3)试剂和溶液

①乙酸－乙酸钠缓冲溶液(pH为4.6)：称取乙酸钠(CH₃COONa·3H₂O)6.7g，溶于水中，加冰乙酸(CH₃COOH)2.6ml，用水定容至1000ml。配好后用pH计校正。

②硫代硫酸钠标准溶液(Na₂S₂O₃，0.05mol/L)

③碘溶液(0.1mol/L)

④氢氧化钠溶液(NaOH，0.1mol/L)

⑤200g/L可溶性氢氧化钠溶液

⑥硫酸溶液(2mol/L)

⑦20g/L可溶性淀粉溶液。

⑧10g/L淀粉指示液

4)仪器和设备

恒温水浴锅、秒表、比色管、玻璃仪器。

5)步骤

①待测酶液的制备称取酶粉1～2g，精确至0.0002g(或吸取液体酶1.00ml)，先用少量的乙酸缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，将上清液小心倾入容量瓶中。沉渣部分再加入少量缓冲液，如此捣研3～4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度(估计酶活力在100～250u/ml范围内)，摇匀。通过4层纱布过滤，滤液供测定用。

②测定于甲、乙两支50ml比色管中，分别加入可溶性淀粉25ml及缓冲液5ml，摇匀后，于40℃恒温水浴中预热5min。在甲管(样品)中加入待测酶液2ml，立刻摇匀，在此温度下准确反应30min，立刻各加入氢氧化钠溶液0.2ml，摇匀，将两管取出迅速冷却，并于乙管(空白)中补加待测酶液2ml，吸取上述反应液与空白液5ml，分别置于碘量瓶中，准确加入碘溶液10ml，再加氢氧化钠溶液15ml，摇匀，密塞，于暗处反应15min。取出，加硫酸溶液2ml，立即用硫代硫酸钠标准溶液滴定，直至蓝色刚好消失为其终点。

③计算

X＝(A－B)c×90.05×32.2/5×1/2×n×2＝579.9×(A－B)c×n

式中X——样品的酶活力(u/g或u/mL)

A——空白消耗硫代硫酸钠溶液的体积(mL)

B——样品消耗硫代硫酸钠溶液的体积(mL)

c——硫代硫酸钠溶液的浓度(mol/L)

90.05——与1mL硫代硫酸钠标准溶液(1mol/L)相当的以克表示的葡萄糖的质量

32.2——反应液的总体积(mL)

5——吸取反应液的体积(mL)

1/2——吸取酶液2mL，换算为1mL

n——稀释倍数

2——反应30min，换算成1h的酶活力系数所得的结果表示至整数

实施例4 发酵产品中比活力的测定

1)原理

考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。

2)溶液的配置

称取G25010mg充分溶于5mL 95％乙醇中，再加入10mL85％磷酸溶解，最后蒸馏水定容至100mL，过滤后置棕色瓶中保存备用，有效期1个月。在使用过程每次都要做标准曲线。

3)试剂及器材

考马斯亮蓝G-250，酒精，磷酸，超纯水，150微克/mlBSA，容量瓶，试管，移液器，枪头，分光光度计。

4)实验步骤

制作标准曲线，取6支试管按下表操作，以150μg/mL BSA蛋白溶液作标准溶液，即得浓度依次为0、30、60、90、120、150μg/mL BSA蛋白溶液，然后将1-6号室温放置2分钟后，于595nm测其紫外吸光度，以蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

编号

1

2

3

4

5

6

BSA标准液(ml)	0	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5
							纯水(ml)	0.5	0.4	0.3	0.2	0.1	0
G250溶液(ml)	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5
							浓度(微克/毫升)	0	30	60	90	120	150

样品浓度检测，样品稀释适当倍数，使其蛋白浓度在标准曲线线性范围内，每个样品0.5mL加入2.5mL考马斯亮蓝溶液，然后在595nm处测其紫外吸光值，最后在标准曲线中查出待测样品浓度。

5)实验结果

测定用的标准曲线图2所示，测定结果如下，从结果可看出，与本技术领域的其他菌株所产糖化酶相比，本酶的比活力提高了120％左右。

	液体中每毫克蛋白的比活力(万U/mg)
		市售同类产品1	0.619
市售同类产品2	0.703
		本菌株产品	1.450

实施例5 发酵过程生长情况的测定

发酵过程中，每隔12h取一次发酵液，并用10ml的离心管，5000转/分离心10分钟，测定沉淀物质占整个溶液的百分比即为PMV值，画出PMV值的变化曲线如下所示，从图3中可看出，本菌种生长迅速，在发酵过程中，与其他同类菌株相比，对数期由原先的90h左右，缩短至50h左右。

实施例6 发酵液发酵过程中酶活水平的变化

发酵过程中，每隔24h取一次发酵液，并按照实例3的方法测定发酵液的酶活水平，绘制的发酵过程发酵液酶活水平变化如下所示，从图4可看出整个发酵期间，发酵液的酶活水平和增长速度明显高于较其他同类菌株，在相同的发酵时间内，生产更多的酶，大大降低了生产成本。

Claims

1.一株高产糖化酶的黑曲霉突变株，其特征在于，所述菌株具体为黑曲霉(Aspergillus niger)GA-179，保藏编号CGMCC No.10788。

2.如权利要求1所述的一株高产糖化酶的黑曲霉突变株，其特征在于，所述菌株液体发酵平均产糖化酶酶活力为87000-90000U/mL。

3.利用权利要求1所述黑曲霉制备糖化酶的方法，包括如下步骤：

(1)种瓶制备：刮取GA-179试管斜面的菌苔接入察氏种瓶中，34℃，200rpm，发酵5d，发酵结束后将种子液收集到3L的无菌瓶中，得到种子罐的种瓶；

(2)种子罐培养：将种瓶接种到察氏种子罐中，34℃，180-300rpm，发酵48h；

(3)发酵罐培养：在无菌条件下，按照8％的接种量，将种子罐发酵液压入发酵罐，进行发酵罐培养，34℃，180-300rpm，发酵至60h后控制溶氧20％-30％，75h开始补料，发酵至菌体自溶严重，酶活无明显提高时放罐；

(4)提取与精制：发酵液加入100ppm聚丙烯酰胺和3％珍珠岩进行絮凝和板框压滤，然后进行超滤浓缩，最后加入防腐剂和保护剂配兑并用硅藻土过滤除菌，得到糖化酶成品酶制剂；

发酵罐培养所用的发酵培养基质量体积百分比组成如下：玉米粉10％-12％，豆饼粉2.5％-3％，麸皮1％-2％，氯化钙0.03％，硫酸铵1％-1.5％，玉米浆2％-3％，pH4.5；

补料所用的补料培养基质量体积百分比组成如下：玉米淀粉20％，玉米浆2％，硫酸铵0.5％，pH4.5。