CN108893496B - 一种同化甘油的酿酒酵母细胞高密度发酵工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种同化甘油的酿酒酵母细胞高密度发酵工艺，涉及生物技术、发酵工程领域，该工艺包括高密度发酵工艺和菌体收集工艺，该工艺制备的酿酒酵母菌体湿重能到达350g/L，本方法简便、易操作、原料市场供应充足、产品稳定、无污染，为酿酒酵母下游产品开发提供了工业化生产的技术条件。

Description

一种同化甘油的酿酒酵母细胞高密度发酵工艺
技术领域
本发明涉及生物技术、发酵工程领域，特别是涉及一种同化甘油的酿酒酵母细胞高密度发酵工艺。
背景技术
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，又称面包酵母或出芽酵母。酿酒酵母在人类生活生产中的应用由来已久，在传统意义上它不仅用于制作馒头等发酵食品，更广泛应用于酿酒，在现代生物学技术中也是应用颇多的细胞种类之一。由于酵母菌富含维生素B、蛋白质和多种酶，菌体可制成酵母片应用在医药上，治疗消化不良，并可从酵母菌中提取生产核酸类衍生物、辅酶A、细胞色素C、谷胱甘肽和多种氨基酸的原料。同时由于蛋白质含量较高，被现代养殖业用于饲料蛋白原料。
常规的酿酒酵母生产主要是利用麦芽汁固态发酵制备的，生产工艺粗放，生产周期长、产品较容易受到环境菌的污染，导致产品质量不佳等问题。随着现代发酵工程的发展，液态发酵技术的日趋成熟，被酿酒酵母工业化生产所利用。
发酵法制酒精有悠久的历史，但传统工艺生产效率低，能耗高造成成本过高。为了降低发酵法生产乙醇的成本，各国学者进行了大量的研究，提出了许多新的方法和工艺。其中高浓度发酵是其中的一个研究热点，高浓度发酵具有提高设备利用率和劳动生产率、降低管理费用、降低能耗和减轻酒糟处理负荷等优点，因此具有广阔的应用前景。但由于在高浓度发酵过程中，高渗透压和高酒精度毒性会造成酵母死亡，从而导致发酵缓慢，发酵不完全，甚至发酵停滞等现象。因此，高浓度酒精发酵的广泛应用受到一定程度限制。针对高浓度酒精发酵存在的上述问题，本发明提供了一套能够同化甘油的酿酒酵母高密度发酵工艺，旨在提高酿酒酵母生产技术水平。
发明内容
本发明的目的是提供一种同化甘油的酿酒酵母细胞高密度发酵工艺，以解决上述现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种同化甘油的酿酒酵母细胞高密度发酵工艺，包括高密度发酵工艺和菌体收集工艺，其中，
所述高密度发酵工艺包括：
种子活化：将酿酒酵母菌株接种于种子斜面培养基中进行种子培养，在28～30℃温度下静置培养活化24～48h；
种子传代：活化后，在种子斜面培养基中挑取少量菌苔接入种子培养基中，在28～30℃、180～200r/min条件下培养18～24h；
高密度发酵：将酿酒酵母菌株接入高密度发酵培养基中进行高密度发酵，接种量为8％～10％、通气量为7～21L/min、压力为0.01～0.015MPa、溶氧为30％～35％、pH值为4.0、搅拌转速为100～550r/min，在28～30℃条件下培养18～24h，制备出酿酒酵母发酵液；
所述菌体收集工艺包括：
将制备的发酵液，转入LD450三足式吊袋离心机中，1500～2000r/min离心15min后，收集吊袋中的菌体沉淀，将沉淀用无菌水洗涤、离心2～3次，收集菌体沉淀。
优选的，所述种子斜面培养基为液体培养基，其配方包含麦芽汁培养基130.1g/L、甘油5g/L、琼脂15g/L。
优选的，所述种子培养基为液体培养基，其配方包含麦芽汁培养基130.1g/L、甘油10g/L。
优选的，所述高密度发酵培养基为液体培养基，其配方包含85％磷酸8.9mL/L、硫酸钙0.31g/L、硫酸钾6.1g/L、七水合硫酸镁5.0g/L、氢氧化钾1.38g/L、甘油20g/L、PTM1微量元素溶液4.35mL/L。
优选的，所述种子活化过程中，装液量为容器体积的20％。
优选的，所述高密度发酵过程中，装液量为容器体积的70％。
优选的，所述酿酒酵母菌株购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，简称CICC，保藏编号为CICC1572，采购时间为2018年3月2日。
本发明公开了以下技术效果：
1、本发明所述的培养基适合上述同化甘油的酿酒酵母菌株的活化、传代、高密度发酵培养，培养基价格低廉、容易获得，不易污染。在本工艺条件下，菌体湿重达350g/L。
2、本发明所述的同化甘油的酿酒酵母高密度发酵工艺简单，容易掌握，产量较高，适合该酿酒酵母菌株的高密度快速生长，在本工艺条件下，菌体湿重达到350g/L。
3、本发明所述的酿酒酵母菌体收集方法，对发酵液的物理特性要求低，比转鼓离心机、板框、连续流离心机效率高，操作方法简便，菌体收集容易，减少了发酵液絮凝、稀释等工艺过程，降低了污染概率。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了进一步说明本发明一种同化甘油的酿酒酵母高密度发酵工艺，对本发明所述的酿酒酵母培养基、高密度发酵工艺、菌体收集方法，其具体实施方式、特征及功效详细说明如下：
本发明中所述的培养基中，除麦芽汁(产品编号：HB-4176-3)购自青岛海博生物技术有限公司外，其他试剂均为国产分析纯。
本发明中所述的一种能同化甘油的酿酒酵母菌株(Saccharomycescerevisiae)，所述酿酒酵母菌株购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，简称CICC，保藏编号为CICC1572，采购时间为2018年3月2日，保藏单位地址为：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼，中国工业微生物菌种保藏管理中心。
本发明所述的主要仪器设备，发酵罐为BIOteach-10L，购自上海宝兴生物工程有限公司，LD450三足式吊袋离心机，购自张家港市印氏离心机有限公司。
本发明所述的种子斜面培养基，按照麦芽汁琼脂培养基改良而来，其中麦芽汁培养基130.1g/L、甘油5g/L、琼脂15g/L，加蒸馏水至1L，经121℃高压湿热灭菌15min，然后降温至50～60℃时倒入试管中冷却备用。
本发明所述的种子培养基，按照麦芽汁培养基130.1g/L、甘油10g/L，加蒸馏水至1L，所用玻璃三角烧瓶分装，然后8层纱布封口，经121℃高压湿热灭菌15min，冷却后备用。
本发明所述的高密度发酵培养基，按照85％磷酸8.9mL/L、硫酸钙0.31g/L、硫酸钾6.1g/L、七水合硫酸镁5.0g/L、氢氧化钾1.38g/L、甘油20g/L，加蒸馏水至发酵罐中，经121℃高压湿热在位灭菌15min，冷却至30℃时，加入PTM1微量元素溶液4.35mL/L。
本发明所述的酿酒酵母菌株的活化方法为，将购置酿酒酵母冻干粉适量，在无菌条件下接种至种子斜面培养基上，在28～30℃，静置培养24～48h。
本发明所述的酿酒酵母菌株的传代培养方法为，活化后，然后挑取少量菌苔接入种子培养基中，在28～30℃、180～200r/min条件下培养18～24h。
本发明所述的酿酒酵母菌株的发酵工艺为：将种子接入高密度发酵培养基中，接种量为8％～10％、通气量为7～21L/min、压力为0.01～0.015MPa、溶氧为30％～35％、pH为4.0、搅拌转速为100～550r/min，在28～30℃条件下培养18～24h。
本发明所述的酿酒酵母菌体收集方法为：
将高密度发酵制备的酿酒酵母菌的培养物，转入LD450三足式吊袋离心机中，1500～2000r/min离心15min后，收集吊袋中的菌体沉淀，将沉淀用无菌水洗涤、离心2～3次，收集菌体沉淀。
本发明实施例所述的酿酒酵母发酵工艺制备的酿酒酵母菌体湿重能到达350g/L，本方法简便、易操作、原料市场供应充足、产品稳定、无污染，为酿酒酵母下游产品开发提供了工业化生产的技术条件。
实施例1
(1)配制培养基：
种子斜面培养基，称取麦芽汁培养基130.1g、甘油5g、琼脂15g，加蒸馏水至1L，经121℃高压湿热灭菌15min，然后降温至50℃时倒入试管中冷却备用。
种子培养基，称取麦芽汁培养基130.1g、甘油10g，加蒸馏水至1L，所用玻璃三角烧瓶分装，然后8层纱布封口，经121℃高压湿热灭菌15min，冷却后备用。
高密度发酵培养基，称取85％磷酸8.9mL、硫酸钙0.31g、硫酸钾6.1g、七水合硫酸镁5.0g、氢氧化钾1.38g、甘油20g，加蒸馏水至发酵罐中，经121℃高压湿热在位灭菌15min，冷却至30℃时，加入PTM1微量元素溶液4.35mL/L。
(2)高密度发酵及收集：
将酿酒酵母菌株接入高密度发酵培养基中进行高密度发酵，接种量为8％、通气量为7L/min、压力为0.01MPa、溶氧为30％、pH值为4.0、搅拌转速为100r/min，在28℃条件下培养18h，制备出酿酒酵母发酵液；
将制备的发酵液，转入LD450三足式吊袋离心机中，1500r/min离心15min后，收集吊袋中的菌体沉淀，将沉淀用无菌水洗涤、离心2次，收集菌体沉淀，菌体湿重达到337g/L。
实施例2
(1)配制培养基：
种子斜面培养基，称取麦芽汁培养基130.1g、甘油5g、琼脂15g，加蒸馏水至1L，经121℃高压湿热灭菌15min，然后降温至55℃时倒入试管中冷却备用。
种子培养基，称取麦芽汁培养基130.1g、甘油10g，加蒸馏水至1L，所用玻璃三角烧瓶分装，然后8层纱布封口，经121℃高压湿热灭菌15min，冷却后备用。
高密度发酵培养基，称取85％磷酸8.9mL、硫酸钙0.31g、硫酸钾6.1g、七水合硫酸镁5.0g、氢氧化钾1.38g、甘油20g，加蒸馏水至发酵罐中，经121℃高压湿热在位灭菌15min，冷却至30℃时，加入PTM1微量元素溶液4.35mL/L。
(2)高密度发酵及收集：
将酿酒酵母菌株接入高密度发酵培养基中进行高密度发酵，接种量为9％、通气量为14L/min、压力为0.0125MPa、溶氧为32.5％、pH值为4.0、搅拌转速为325r/min，在29℃条件下培养21h，制备出酿酒酵母发酵液；
将制备的发酵液，转入LD450三足式吊袋离心机中，1750r/min离心15min后，收集吊袋中的菌体沉淀，将沉淀用无菌水洗涤、离心3次，收集菌体沉淀，菌体湿重达到350g/L。
实施例3
(1)配制培养基：
种子斜面培养基，称取麦芽汁培养基130.1g、甘油5g、琼脂15g，加蒸馏水至1L，经121℃高压湿热灭菌15min，然后降温至60℃时倒入试管中冷却备用。
种子培养基，称取麦芽汁培养基130.1g、甘油10g，加蒸馏水至1L，所用玻璃三角烧瓶分装，然后8层纱布封口，经121℃高压湿热灭菌15min，冷却后备用。
高密度发酵培养基，称取85％磷酸8.9mL、硫酸钙0.31g、硫酸钾6.1g、七水合硫酸镁5.0g、氢氧化钾1.38g、甘油20g，加蒸馏水至发酵罐中，经121℃高压湿热在位灭菌15min，冷却至30℃时，加入PTM1微量元素溶液4.35mL/L。
(2)高密度发酵及收集：
将酿酒酵母菌株接入高密度发酵培养基中进行高密度发酵，接种量为10％、通气量为21L/min、压力为0.015MPa、溶氧为35％、pH值为4.0、搅拌转速为550r/min，在30℃条件下培养24h，制备出酿酒酵母发酵液；
将制备的发酵液，转入LD450三足式吊袋离心机中，2000r/min离心15min后，收集吊袋中的菌体沉淀，将沉淀用无菌水洗涤、离心3次，收集菌体沉淀，菌体湿重达到343g/L。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (3)

1.一种同化甘油的酿酒酵母细胞高密度发酵工艺，包括高密度发酵工艺和菌体收集工艺，其特征在于，
所述高密度发酵工艺包括：
种子活化：将酿酒酵母菌株接种于种子斜面培养基中进行种子培养，在28～30℃温度下静置培养活化24～48h；所述种子斜面培养基为液体培养基，其配方包含麦芽汁培养基130.1g/L、甘油5g/L、琼脂15g/L；
种子传代：活化后，在种子斜面培养基中挑取少量菌苔接入种子培养基中，在28～30℃、180～200r/min条件下培养18～24h；所述种子培养基为液体培养基，其配方包含麦芽汁培养基130.1g/L、甘油10g/L；
高密度发酵：将酿酒酵母菌株接入高密度发酵培养基中进行高密度发酵，接种量为8％～10％、通气量为7～21L/min、压力0.01～0.015MPa、溶氧为30％～35％、pH值为4.0、搅拌转速为100～550r/min，在28～30℃条件下培养18～24h，制备出酿酒酵母发酵液；所述高密度发酵培养基为液体培养基，其配方包含85％磷酸8.9mL/L、硫酸钙0.31g/L、硫酸钾6.1g/L、七水合硫酸镁5.0g/L、氢氧化钾1.38g/L、甘油20g/L、PTM1微量元素溶液4.35mL/L；
所述菌体收集工艺包括：
将制备的发酵液，转入LD450三足式吊袋离心机中，1500～2000r/min离心15min后，收集吊袋中的菌体沉淀，将沉淀用无菌水洗涤、离心2～3次，收集菌体沉淀。
2.根据权利要求1所述的一种同化甘油的酿酒酵母细胞高密度发酵工艺，其特征在于，所述种子活化过程中，装液量为容器体积的20％。
3.根据权利要求1所述的一种同化甘油的酿酒酵母细胞高密度发酵工艺，其特征在于，所述高密度发酵过程中，装液量为容器体积的70％。
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