CN104745654B

CN104745654B - 一种制备尼莫克汀的方法及其生产菌株

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Publication number: CN104745654B
Application number: CN201410387346.1A
Authority: CN
Inventors: 王明康; 周贤龙
Original assignee: Mudanjiang Bioseen Biological Co ltd
Current assignee: Mudanjiang Bioseen Biological Co ltd
Priority date: 2013-12-27
Filing date: 2014-08-08
Publication date: 2017-09-22
Anticipated expiration: 2034-08-08
Also published as: CN104745654A

Abstract

本发明提供一种制备尼莫克汀的方法，所述方法是从保藏编号为CGMCC No.8731的蓝灰链霉菌(Streptomyces cyaneogriseus)BJX003的发酵液中制备尼莫克汀。本发明提供的蓝灰链霉菌菌株BJX003产尼莫克汀能力强，可达3000μg/mL发酵液。而且菌株BJX003经连续传5代后，产尼莫克汀的能力仍保持原有水平，表明其遗传稳定性好。采用本发明的菌株发酵制备尼莫克汀，大大提高了尼莫克汀的产率，操作简单、成本低廉、条件可控，适合于尼莫克汀的大规模生产。

Description

一种制备尼莫克汀的方法及其生产菌株

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，具体地说，涉及一种制备尼莫克汀的方法及其生产菌株。

背景技术

尼莫克汀(Nemadectin)由蓝灰链霉菌(Streptomyces cyaneogriseussp.noncyanogenus)发酵产生，是十六元大环内酯化合物，属于米尔贝霉素族(Milbemycin)抗生素。以尼莫克汀为基础半化学合成的莫西克汀(Moxidectin)，由于在C-23位引入＝N-OCH₃基团，因而亲脂性更强。莫西克汀与伊维菌素(Ivermectin)的作用机制基本相似，但比伊维菌素具有更高的活性。莫西克汀抗寄生虫的特点是：作用强烈，用量少，对人体安全、无毒害、不污染环境，只杀害虫，不杀害虫天敌，且不易产生抗药性。是目前最有前途的广谱、高效、新型、抗虫、无交叉感染的生物杀虫剂，被誉为当今活性最高的杀虫剂之一，是目前应用前景最广阔的抗虫抗生素，市场潜力巨大。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备尼莫克汀的方法及其生产菌株。

为了实现本发明目的，本发明的一种制备尼莫克汀的方法，其是从保藏编号为CGMCC No.8731的蓝灰链霉菌(Streptomyces cyaneogriseus)BJX003的发酵液中制备尼莫克汀。

前述方法包括以下步骤：

(1)发酵培养：将菌株BJX003的种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养，获得发酵液。接种量优选为5～15％(v/v)，所述种子液为培养至对数生长期的种子液。

(2)从发酵液中提取尼莫克汀。

发酵使用的培养基为：葡萄糖40-60g/L、乳糖20-50g/L、酵母粉20-50g/L、磷酸氢二钾1-3g/L、七水硫酸镁0.5-2g/L、氯化钠8.5-12.5g/L和碳酸钙10-30g/L，pH值7.2，以水配制。

优选地，发酵使用的培养基为：葡萄糖50g/L、乳糖35g/L、酵母粉35g/L、磷酸氢二钾2g/L、七水硫酸镁1.2g/L、氯化钠10g/L和碳酸钙20g/L，pH值7.2，以水配制。

发酵培养条件为：25-30℃，相对湿度50-60％，170-210rpm振荡培养192-240h。优选地，发酵培养条件为：28℃，190rpm振荡培养240h，旋转半径为50mm。

本发明还提供蓝灰链霉菌(Streptomyces cyaneogriseus)BJX003，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC No.8731，保藏日期2014年1月17日。

本发明的蓝灰链霉菌BJX003的孢子丝短，呈致密的2-3圈螺旋形，孢子卵圆形至短柱形，不易分开，表面光滑。在克氏一号合成培养基中气丝呈粉状，灰色至深灰色，基丝最初无色，后逐渐变蓝，没有可溶性色素。

该菌对D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-果糖、鼠李糖利用效果较好。不利用棉子糖、肌醇、D-甘露醇。可抑制金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌等。

本发明还提供用于PCR特异性检测蓝灰链霉菌BJX003的引物对，包括：

正向引物：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'

反向引物：5’-GGTACCTTGTTACGACTT-3'

利用上述引物对，可扩增出该菌的16S rDNA序列，其核苷酸序列如Seq ID No.1所示，大小为1289bp。

本发明提供的蓝灰链霉菌菌株BJX003产尼莫克汀能力强，可达3000μg/mL发酵液。而且菌株BJX003经连续传5代后，产尼莫克汀的能力仍保持原有水平，表明其遗传稳定性好。采用本发明的菌株发酵制备尼莫克汀，大大提高了尼莫克汀的产率，操作简单、成本低廉、条件可控，适合于尼莫克汀的大规模生产。

附图说明

图1为本发明蓝灰链霉菌BJX003的菌落形态。

图2为本发明蓝灰链霉菌BJX003的菌丝体形态。

图3为尼莫克汀标准品的色谱图。

图4为本发明菌株BJX003的发酵滤液中尼莫克汀的色谱图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中使用的材料及试剂来源：葡萄糖购自黑龙江省镜泊湖农业开发股份有限公司，氯化钠购自龙盐(牡丹江)盐业有限公司，碳酸钙购自河北省井陉县呈龙钙业有限公司，磷酸氢二钾及七水硫酸镁购自天津市东丽区天大化学制剂厂，琼脂购自青岛鲸海生物有限公司，酵母粉购自武穴市国邦生物工程有限公司。

实施例1尼莫克汀高产菌株BJX003的获得

一、菌株的获得及诱变

采用高通量初筛方法，具体如下：

发酵阶段：采用96孔深孔板，每孔中装培养基0.3mL。每孔接入菌种，28℃静置培养10天。所用培养基由可溶性淀粉50g/L、葡萄糖40g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、七水硫酸镁5g/L、氯化钠5g/L、碳酸钙1g/L和琼脂20g/L组成，以水配制。灭菌前以100g/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2。

提取阶段：将每孔用1mL甲醇浸泡，捣碎，取上清。

测定阶段：用酶标仪测定上清在240nm处的UV吸收值。

1、从土壤中分离菌株

取黑龙江省大庆市油田矿区的土壤，将土壤制成悬浮液，将土壤悬浮液接种于分离培养基中进行培养，挑取单菌落进行稀释划线分离纯化，获得纯培养菌株。分离培养基由可溶性淀粉50g/L、葡萄糖40g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、七水硫酸镁5g/L、氯化钠5g/L、碳酸钙1g/L和琼脂20g/L组成，pH值7.2，以水配制；115℃，灭菌20分钟。

初筛：获得的纯培养菌株进行摇瓶发酵培养，发酵液经8000rpm离心5分钟，上清液经0.45μm的微孔滤膜过滤获得发酵滤液。采用HPLC分析法检测发酵液中是否含有尼莫克汀。将能产生尼莫克汀的菌株分别进行如下系列诱变。

2、诱变

(1)紫外线复合链霉素诱变

取菌悬液10mL，加入无菌培养皿中，以30W的紫外照射仪在高于培养皿30cm处照射。设定照射时间分别为30s、60s。分离培养基灭菌后，加入终浓度0.2μg/mL、0.3μg/mL经过滤除菌的链霉素，铺制平皿，28℃培养10d。挑取单菌落按照上述方法进行高通量筛选、摇瓶复试。获得的高产菌株进行下一步诱变。

(2)N-离子注入

诱变处理及筛选方法是向2支长好的出发菌株斜面各加3ml无菌水，制成孢子悬液，合并加入一带有玻璃珠的三角瓶中，摇床振摇5min,过滤，用血球计数板计数。吸1ml涂布于直径为5cm的不锈钢片上，无菌状态下风干，将不锈钢片装入灭菌的牛皮纸袋内。

用氮离子注入处理不锈钢片上风干的孢子，注入能量715kev，注入束流013ΛA，面积25cm²。注入剂量分5组。

将经氮离子注入处理后的钢片放入灭菌的双碟中，加5ml无菌水，洗下孢子，稀释至10^-1～10^-5，每个稀释度分别吸0.1ml孢子液涂布于含有固体培养基的平皿上，28℃培养10天，挑选单菌落进行高通量筛选。筛选的尼莫克汀高产菌种通过摇瓶复试后，进行下一轮诱变。

(3)5-氟尿嘧啶

将菌株斜面接种于无有机氮源的饥饿培养基中，培养过夜，将菌株接种于含有不同浓度的5-氟尿嘧啶平皿中，5-氟尿嘧啶的终浓度分别为60μg/mL、80μg/mL的5-氟尿嘧啶平皿中。28℃培养10d。挑取单菌落进行高通量初筛、摇瓶复试。获得的高产菌株进行下一步诱变。

(4)微波复合链霉素诱变

以脉冲频率为2450MHz的650W家用微波炉，分别对平皿中菌悬液进行辐射处理。每次照射5s后使平皿冷却，再进行照射，并将照射时间累计，累计照射时间分别为90s、120s。分离培养基灭菌后，加入终浓度0.1μg/mL、0.2μg/mL经过滤除菌的链霉素，铺制平皿。28℃培养10d。挑取单菌落进行高通量初筛、摇瓶复试。获得的高产菌株进行下一步诱变。

(5)NTG(亚硝基胍)复合链霉素诱变

亚硝基胍(NTG)诱变：用0.2mol/L，pH6.0的磷酸盐缓冲液制备孢子悬液，分别用终浓度为2mg/mL、4mg/mL和8mg/mL的NTG处理单孢子悬液，于28℃振荡30min，用生理盐水离心洗涤孢子3次，经稀释后涂布于含终浓度0.1μg/mL、0.2μg/mL经过滤除菌的链霉素的平皿。28℃培养10d。挑取单菌落进行高通量初筛，摇瓶复试。从中筛选获得尼莫克汀的高产菌株。

经过上述系列方法，最终获得了尼莫克汀高产菌株BJX003。菌落形态如图1所示，菌丝体形态如图2所示。

二、菌株的鉴定

蓝灰链霉菌菌株BJX003为好氧放线菌，孢子丝短，呈致密的2-3圈螺旋形，孢子卵圆形至短柱形，不易分开，表面光滑。在克氏一号合成培养基中气丝呈粉状，灰色至深灰色，基丝最初无色，后逐渐变蓝，没有可溶性色素。

通过PCR扩增该菌的16S rDNA序列，PCR所用的特异性引物对为：

正向引物：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'

反向引物：5’-GGTACCTTGTTACGACTT-3'

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，产物大小为1289bp，测序结果如Seq IDNo.1所示。

以上生理生化特征表明，本发明得到的突变菌株为蓝灰链霉菌(Streptomycescyaneogriseus)，将其命名为BJX003，该菌株已于2014年1月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.8731。

实施例2利用蓝灰链霉菌BJX003发酵生产尼莫克汀

通过响应曲面法(Response surface methodology，RSM)优化高产菌株BJX003发酵培养条件。

斜面培养基组成：

可溶性淀粉50g/L、葡萄糖40g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、七水硫酸镁5g/L、氯化钠5g/L、碳酸钙1g/L和琼脂20g/L组成，pH值7.2，以水配制；115℃，灭菌20分钟。灭菌前以100g/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2。

种子培养基组成：葡萄糖10g/L、麦芽糊精为20g/L、豆饼粉15g/L、酵母粉10g/L、硫酸镁1g/L、磷酸氢二钾1g/L，以水配制。种子培养基的pH值为7.2，121℃，灭菌30min。

发酵培养基组成：葡萄糖50g/L、乳糖35g/L、酵母粉35g/L、磷酸氢二钾2g/L、七水硫酸镁1.2g/L、氯化钠10g/L和碳酸钙20g/L，以水配制。灭菌前调培养基pH至7.2。

(一)蓝灰链霉菌BJX003的发酵培养

1、斜面培养：

将蓝灰链霉菌BJX003接种到斜面培养基上，在28℃，环境相对湿度为50-60％条件下培养10-12天。

2、种子培养

挖取步骤一中得到的斜面菌苔1cm²，将其转接入盛有30mL灭菌的种子培养基的种子瓶中，在28℃，环境相对湿度为50-60％，转速180-200rpm，旋转半径50mm的条件下，振荡培养44-48小时(至对数生长期)，得到种子培养液。

3、发酵培养

发酵培养方法：取上述种子培养液按5％(v/v)的接种量接种于装有30mL灭菌的发酵培养基的三角瓶中，在28℃，湿度为55％，转速200rpm，旋转半径50mm的条件下，发酵培养240小时，得到发酵液。

(二)尼莫克汀的提取及产量检测

1、提取方法如下：

发酵液预处理：取1ml发酵液于离心管中，加入9ml甲醇，混合均匀后超声15分钟(超声功率200w)，于4000rpm离心15min，然后将上清液用0.22μm滤膜过滤，备用。

2、HPLC分析：

采用安捷伦1100型高效液相色谱仪，150mm×4.6mm(i·d)不锈钢柱，内填Reliasil Cl8型号为Wondasil的C18反相柱，柱温25℃，取上述滤液，进样量20μL；以磷酸缓冲盐(pH8.2)：甲醇(体积比15853)为流动相进行分离，流速1mL/min，利用UV检测器在波长240nm处检测并自动形成分离图谱。在此色谱条件下，尼莫克汀标准品的色谱图如图3所示。发酵滤液中尼莫克汀的色谱图如图4所示。

实验设3次重复，结果取平均数。核算得尼莫克汀产量为3258μg/mL。

实施例3菌株BJX003的遗传稳定性检测

将菌株BJX003进行斜面传代，共传5代，每代菌的培养方法均同实施例2中的描述，每代培养得到的蓝灰链霉菌均按照实施例2中所述方法进行发酵和提取，并计算菌株产生的尼莫克汀的能力。

实验设3次重复，结果取平均数。结果本发明菌株BJX003在5次传代后，生产能力仍能保持原来水平，表明菌株BJX003的遗传稳定性好。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种制备尼莫克汀的方法，其特征在于，从保藏编号为CGMCC No.8731的蓝灰链霉菌(Streptomyces cyaneogriseus)BJX003的发酵液中制备尼莫克汀。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵使用的培养基为：葡萄糖40-60g/L、乳糖20-50g/L、酵母粉20-50g/L、磷酸氢二钾1-3g/L、七水硫酸镁0.5-2g/L、氯化钠8.5-12.5g/L和碳酸钙10-30g/L，pH值7.2，以水配制。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，发酵使用的培养基为：葡萄糖50g/L、乳糖35g/L、酵母粉35g/L、磷酸氢二钾2g/L、七水硫酸镁1.2g/L、氯化钠10g/L和碳酸钙20g/L，pH值7.2，以水配制。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养条件为：25-30℃，相对湿度50-60％，170-210rpm振荡培养192-240h。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，发酵培养条件为：28℃，190rpm振荡培养240h。

6.蓝灰链霉菌(Streptomyces cyaneogriseus)BJX003，其保藏编号为CGMCC No.8731。

7.用于PCR特异性检测权利要求6所述蓝灰链霉菌BJX003的引物对，包括：

正向引物：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'

反向引物：5’-GGTACCTTGTTACGACTT-3'。