CN107815477A - 一种发酵生产莫西菌素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种发酵生产莫西菌素的方法，包括在发酵过程中向发酵液中补加玉米淀粉，以改善发酵液中碳源，提高莫西菌素的发酵水平。本发明方法简便易行，采用本发明方法可使莫西菌素的产量从低于3000ug/mL提高到3500ug/mL左右。

Description

一种发酵生产莫西菌素的方法
技术领域
本发明涉及一种发酵生产莫西菌素的方法，属于发酵技术领域。
背景技术
莫西菌素(Moxidectin，Cas 113507-06-5)是一种链霉菌(Streptomyces.cyanneogrisens noncyanogenus)发酵产生的半合成单一成分的大环内酯类抗生素，是尼莫克汀的衍生物。莫西菌素在有机溶剂中易溶，而在水中不溶。它单一成分，有着更广谱的驱虫活性、长效和安全等特性，并且在极低剂量下就有很强的抗线虫和节肢动物等体内外寄生虫活性。它具有高效、毒副作用低、安全性高以及对环境影响小的特点，是目前最有前途的广谱、高效、新型、无交叉感染的生物杀虫剂，被誉为当今活性最高的杀虫剂之一。目前，现有技术存在莫西菌素产量低、成本高昂的问题。
发明内容
本发明目的在于提供一种发酵生产莫西菌素的方法，以解决现有发酵生产莫西菌素产量不高的问题。
为实现本发明目的，本发明一种发酵生产莫西菌素的方法，在发酵过程中向发酵液中补加玉米淀粉，以改善发酵液中碳源，提高莫西菌素的发酵水平。
若无特殊指明，本发明所述发酵均为液体发酵。
本发明既可以一次性补加玉米淀粉，也可以流加玉米淀粉。但以一次性补加玉米淀粉效果更好，发酵液中莫西菌素的含量更高，且一次性补加玉米淀粉淀粉方法还大大降低了发酵罐污染的几率。
优选地，补加至发酵液中玉米淀粉的浓度为15-40g/L，进一步优选为25g/L。
优选地，在发酵开始第120h后补加玉米淀粉。
进一步优选地，在发酵开始第120-125h一次性补加玉米淀粉。
优选地，发酵条件包括：温度26-30℃，转速200-250rpm，通气比1:0.3-0.7，罐压0.03-0.04MPa，溶氧控制在40％以上，发酵周期为250-300hr；
进一步优选地，发酵条件包括：温度28℃，转速200rpm，通气比1:0.5，罐压0.03MPa，溶氧控制在40％，发酵周期为280hr。
优选地，所述发酵培养基包括如下组分：葡萄糖40-60g/L、乳糖或玉米淀粉20-50g/L、酵母粉20-50g/L、磷酸氢二钾1-3g/L、七水硫酸镁0.5-2g/L、氯化钠8.5-12.5g/L、碳酸钙10-30g/L；灭菌前pH值7.0-7.5。
进一步优选地，所述发酵培养基包括如下组分：葡萄糖50g/L、乳糖或玉米淀粉35g/L、酵母粉35g/L、磷酸氢二钾2g/L、七水硫酸镁1g/L、氯化钠10g/L、碳酸钙20g/L；灭菌前pH值7.2。
具体地，本发明发酵生产莫西菌素的方法包括以下步骤：
1)斜面培养
将蓝灰链霉菌在无菌条件下接种于固体斜面培养基上，于28℃培养10-12天；
2)种子培养
将步骤1)制得的斜面菌种无菌条件下转接入灭菌的种子培养基中，在28℃、220rpm的条件下，振荡培养25-28h，得到种子培养液；
3)发酵培养
将步骤2)制得的种子培养液接种于发酵培养基中，发酵培养至120-125h，一次性补加玉米淀粉，继续发酵至结束，得到发酵液。
其中，步骤1)所述斜面培养基包括如下成分：可溶性淀粉50g/L、葡萄糖40g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、七水硫酸镁5g/L、氯化钠5g/L、碳酸钙1g/L、琼脂20g/L，pH值7.2，以水配制；115℃，灭菌20分钟。灭菌前以100g/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2。
其中，步骤3)种子培养液的接种量一般为5-15％(v/v)，优选为10％(v/v)。
为更好地提高莫西菌素的产量，可以在步骤2)种子培养过程中补加适量的玉米淀粉；所述种子培养基中玉米淀粉的浓度为15-40g/L，进一步优选为25g/L。
可以将玉米淀粉或玉米淀粉溶液无菌处理后添加到所述发酵培养基、种子培养基中。所述无菌处理包括本领域常规方法，例如高温灭菌。
优选地，所用种子培养基包括如下组分：葡萄糖8-15g/L、麦芽糊精10-25g/L、豆饼粉10-15g/L、酵母粉5-10g/L、硫酸镁0.5-2g/L、磷酸氢二钾0.5-2g/L；pH值为7.0-7.2；进一步优选地，所用种子培养基包括如下组分：葡萄糖10g/L、麦芽糊精20g/L、豆饼粉15g/L、酵母粉10g/L、硫酸镁1g/L、磷酸氢二钾1g/L；pH值为7.2。
如无特殊说明，本发明所述发酵培养基、种子培养基均以水配制。
本发明所述发酵培养基、种子培养基可用本领域常规方法进行灭菌，一般可于121℃，灭菌30min。
本发明方法可用蓝灰链霉菌(Streptomyces cyaneogriseus)进行发酵。所述蓝灰链霉菌可用本领域市售可得的常规菌种。
优选地，本发明所采用的菌株为蓝灰链霉菌(Streptomyces cyaneogriseus)BJX003；该菌株已于2014年1月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为蓝灰链霉菌(Streptomyces cyaneogriseus)，保藏编号为：CGMCCNo.8731；该菌株已在中国专利CN104745654A中公开。
本发明有益效果：
1)在蓝灰链霉菌发酵生产莫西菌素的过程中，适量补加玉米淀粉可为发酵过程提供充足的碳源；发酵中后期，蓝灰链霉菌对碳源的利用能力增强，此时补加适量玉米淀粉即可为发酵过程提供充足的碳源，又不至于因玉米淀粉添加过早、碳源太丰富而抑制蓝灰链霉菌的生长。
2)研究发现，葡萄糖浆、糖蜜等碳源的补加效果均不如玉米淀粉。原因可能是玉米淀粉为多糖，更有利于蓝灰链霉菌的利用，从而提高莫西菌素的产量。
3)本发明方法简便易行，采用本发明方法可使莫西菌素的产量从低于3000ug/mL提高到3500ug/mL左右。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
以下采用的菌株为蓝灰链霉菌(Streptomyces cyaneogriseus)BJX003，保藏编号为CGMCC No.8731。
以下莫西菌素的检测方法包括：
1)取1mL发酵液于离心管中，加入9mL甲醇，混合均匀后超声15分钟(超声功率200w)，于4000rpm离心15min，然后将上清液用0.22μm滤膜过滤，备用。
2、HPLC分析：采用安捷伦1100型高效液相色谱仪，150mm×4.6mm(i〃d)不锈钢柱，内填Reliasil Cl8型号为Wondasil的C18反相柱，柱温25℃，取上述滤液，进样量20μL；以磷酸缓冲盐(pH8.2)：甲醇(体积比15:85)为流动相进行分离，流速1mL/min，利用UV检测器在波长240nm处检测并自动形成分离图谱。
实施例1
一种发酵生产莫西菌素的方法，包括以下步骤：
1)斜面培养
将蓝灰链霉菌在无菌条件下接种于固体斜面培养基上，于28℃培养10-12天；
其中，所述斜面培养基包括如下成分：可溶性淀粉50g/L、葡萄糖40g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、七水硫酸镁5g/L、氯化钠5g/L、碳酸钙1g/L、琼脂20g/L，pH值7.2，以水配制；115℃，灭菌20分钟。灭菌前以100g/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2。
2)种子培养
将步骤1)制得的斜面菌种无菌条件下转接入灭菌的种子培养基中，在28℃、220rpm的条件下，振荡培养25-28h，得到种子培养液；
其中，所述种子培养基包括如下成分：葡萄糖10g/L、麦芽糊精20g/L、豆饼粉15g/L、酵母粉10g/L、硫酸镁1g/L、磷酸氢二钾1g/L；pH值为7.2。121℃，灭菌30分钟。
3)发酵培养
将步骤2)制得的种子培养液接种于发酵培养基中，接种量为10％(v/v)；发酵培养至120h一次性补加玉米淀粉，至发酵液中玉米淀粉浓度为25g/L，继续发酵至结束，得到发酵液。
其中，所述发酵培养基包括如下组分：葡萄糖50g/L、乳糖35g/L、酵母粉35g/L、磷酸氢二钾2g/L、七水硫酸镁1g/L、氯化钠10g/L、碳酸钙20g/L；灭菌前pH值7.2。121℃，灭菌30分钟。
其中，发酵条件包括：温度28℃，转速200rpm，通气比1:0.5，罐压0.03MPa，溶氧控制在40％，发酵周期为280hr。
经检测，发酵液中莫西菌素的含量为3500ug/mL。
实施例2
一种发酵生产莫西菌素的方法，与实施例1的区别仅在于步骤3)发酵培养方法不同。本实施例步骤3)发酵培养方法如下：
将步骤2)制得的种子培养液接种于发酵培养基中，接种量为5％(v/v)；发酵培养至125h一次性补加玉米淀粉，至发酵液中玉米淀粉浓度为40g/L，继续发酵至结束，得到发酵液。
其中，所述发酵培养基包括如下组分：葡萄糖40g/L、乳糖20g/L、酵母粉20g/L、磷酸氢二钾1g/L、七水硫酸镁0.5g/L、氯化钠8.5g/L、碳酸钙10g/L；灭菌前pH值7.0。121℃，灭菌30分钟。
其中，发酵条件包括：温度26℃，转速200rpm，通气比1:0.3，罐压0.03MPa，溶氧控制在40％以上，发酵周期为300hr。
经检测，发酵液中莫西菌素的含量为3142ug/mL。
实施例3
一种发酵生产莫西菌素的方法，与实施例1的区别仅在于步骤3)发酵培养方法不同。本实施例步骤3)发酵培养方法如下：
将步骤2)制得的种子培养液接种于发酵培养基中，接种量为15％(v/v)；发酵培养至120h一次性补加玉米淀粉，至发酵液中玉米淀粉浓度为15g/L，继续发酵至结束，得到发酵液。
其中，所述发酵培养基包括如下组分：葡萄糖60g/L、玉米淀粉50g/L、酵母粉50g/L、磷酸氢二钾3g/L、七水硫酸镁2g/L、氯化钠12.5g/L、碳酸钙30g/L；灭菌前pH值7.5。121℃，灭菌30分钟。
其中，发酵条件包括：温度30℃，转速250rpm，通气比1:0.7，罐压0.04MPa，溶氧控制在40％以上，发酵周期为250hr。
经检测，发酵液中莫西菌素的含量为3080ug/mL。
对比例1
与实施例1的区别仅在于步骤3)发酵过程中不补加玉米淀粉。
经检测，发酵液中莫西菌素的含量为2850ug/mL。
对比例2
与实施例2的区别仅在于步骤3)发酵过程中不补加玉米淀粉。
经检测，发酵液中莫西菌素的含量为2477ug/mL。
对比例3
与实施例3的区别仅在于步骤3)发酵过程中不补加玉米淀粉。
经检测，发酵液中莫西菌素的含量为2058ug/mL。
对比例4
与实施例1的区别仅在于步骤3)发酵过程中将补加玉米淀粉替换为补加等重量的葡萄糖浆。
经检测，发酵液中莫西菌素的含量为2947ug/mL。
对比例5
与实施例1的区别仅在于步骤3)发酵过程中将补加玉米淀粉替换为补加等重量的糖蜜。
经检测，发酵液中莫西菌素的含量为2873ug/mL。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种发酵生产莫西菌素的方法，其特征在于，包括在发酵过程中向发酵液中补加玉米淀粉。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括在发酵过程中向发酵液中一次性补加玉米淀粉，或流加玉米淀粉；
优选地，补加至发酵液中玉米淀粉的浓度为15-40g/L，进一步优选为25g/L。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在发酵开始第120h后补加玉米淀粉；进一步优选地，在发酵开始第120-125h一次性补加玉米淀粉。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，发酵条件包括：温度26-30℃，转速200-250rpm，通气比1:0.3-0.7，罐压0.03-0.04MPa，溶氧控制在40％以上，发酵周期为250-300hr；
优选地，发酵条件包括：温度28℃，转速200rpm，通气比1:0.5，罐压0.03MPa，溶氧控制在40％，发酵周期为280hr。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括如下组分：葡萄糖40-60g/L、乳糖或玉米淀粉20-50g/L、酵母粉20-50g/L、磷酸氢二钾1-3g/L、七水硫酸镁0.5-2g/L、氯化钠8.5-12.5g/L、碳酸钙10-30g/L；灭菌前pH值7.0-7.5；
优选地，所述发酵培养基包括如下组分：葡萄糖50g/L、乳糖或玉米淀粉35g/L、酵母粉35g/L、磷酸氢二钾2g/L、七水硫酸镁1g/L、氯化钠10g/L、碳酸钙20g/L；灭菌前pH值7.2。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)斜面培养
将蓝灰链霉菌在无菌条件下接种于固体斜面培养基上，于28℃培养10-12天；
2)种子培养
将步骤1)制得的斜面菌种无菌条件下转接入灭菌的种子培养基中，在28℃、220rpm的条件下，振荡培养25-28h，得到种子培养液；
3)发酵培养
将步骤2)制得的种子培养液接种于发酵培养基中，发酵培养至120-125h，一次性补加玉米淀粉，继续发酵至结束，得到发酵液。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述种子培养基包括如下组分：葡萄糖8-15g/L、麦芽糊精10-25g/L、豆饼粉10-15g/L、酵母粉5-10g/L、硫酸镁0.5-2g/L、磷酸氢二钾0.5-2g/L；pH值为7.0-7.2；
优选地，所述种子培养基包括如下组分：葡萄糖10g/L、麦芽糊精20g/L、豆饼粉15g/L、酵母粉10g/L、硫酸镁1g/L、磷酸氢二钾1g/L；pH值为7.2。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，用于发酵生产莫西菌素的菌种为蓝灰链霉菌(Streptomyces cyaneogriseus)；优选为蓝灰链霉菌(Streptomycescyaneogriseus)BJX003，保藏编号CGMCC No.8731。
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