CN106701860A - 一种用于制备莫西菌素的发酵培养基及方法 - Google Patents
一种用于制备莫西菌素的发酵培养基及方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106701860A CN106701860A CN201510409029.XA CN201510409029A CN106701860A CN 106701860 A CN106701860 A CN 106701860A CN 201510409029 A CN201510409029 A CN 201510409029A CN 106701860 A CN106701860 A CN 106701860A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cornstarch
- moxidectin
- conditions
- fermented
- added
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及微生物领域,具体提供了一种蓝灰链霉菌发酵培养基以及利用该培养基制备莫西菌素的方法。本发明通过向发酵培养基中添加适量乳糖或玉米淀粉、优化发酵培养基中各具体组分的选择,以及其他培养条件,提高了莫西菌素的产量。本发明莫西菌素的产量可高达2890μg/mL,且方案简单、成本低廉,适用于工业化大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域,本发明提供了一种蓝灰链霉菌发酵培养基以及利用该发酵培养基制备莫西菌素的方法。
背景技术
莫西菌素是一种链霉菌(Streptomyces.cyanneogrisensnoncyanogenus)发酵产生的半合成单一成分的大环内酯类抗生素,是尼莫克汀的衍生物。莫西菌素在有机溶剂中易溶,而在水中不溶。结构特点是C-23位上引入=N-OCH3基团,因此它的亲脂性较其他同类药高,比前体物抗虫谱广,驱杀寄生虫的能力强。与其他大环内酯类抗生虫寄药的不同之处在于,它是单一成分,有着更广谱的驱虫活性、长效和安全等特性,并且在极低剂量下就有很强的抗线虫和节肢动物等体内外寄生虫活性。
此类药物具有高效、毒副作用低、安全性高以及对环境影响小的特点,尤其在驱线虫和杀外寄生虫的方面有着优良效果,是目前最有前途的广谱、高效、新型、无交叉感染的生物杀虫剂,被誉为当今活性最高的杀虫剂之一。
目前,现有技术存在莫西菌素产量低、成本高昂的问题。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明旨在提供一种蓝灰链霉菌发酵培养基以及利用该发酵培养基制备莫西菌素的方法。
本发明所采用的菌株为蓝灰链霉菌(Streptomyces cyaneogriseus)BJX003,已于2014年1月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编100101),分类命名为蓝灰链霉菌(Streptomyces cyaneogriseus),保藏编号为:CGMCC No.8731。
蓝灰链霉菌BJX003孢子丝短,为相当紧密的2~3圈螺旋形。孢子卵圆形至短柱形,不易分开,表面光滑。
具体地,本发明提供了一种利用蓝灰链霉菌BJX003制备莫西菌素的方法,包含以下步骤:
步骤(1):将所述蓝灰链霉菌的种子液接种于含有乳糖或玉米淀粉的发酵培养基中进行发酵培养,得发酵液;
步骤(2):从所述发酵液中提取莫西菌素。
本发明发酵培养基中,乳糖或玉米淀粉的加入,可以与其他发酵培养及组分发生良好的协同作用,从而显著提高莫西菌素的产量。
本发明中所述步骤(1)中发酵培养基包含以下成分:葡萄糖40~60g/L、乳糖或玉米淀粉20~50g/L、酵母粉20~50g/L、磷酸氢二钾1~3g/L、七水硫酸镁0.5~2g/L、氯化钠8.5~12.5g/L和碳酸钙10~30g/L,余量为水;调节pH值至7.0~7.5,优选7.2。
本发明所述步骤(1)中玉米淀粉为玉米淀粉原料或经过酶解后的玉米淀粉原料;所述酶解步骤如下:取1000份玉米淀粉原料加入水中至完全溶解,得到玉米淀粉溶液,向所述玉米淀粉溶液中加入1~2份α-淀粉酶,在100~110℃条件下快速搅拌,酶解5~10min,冷却后加入1~2份糖化酶,50~60℃条件下酶解24~28h,即得。
本发明所采用的玉米淀粉价格低廉,且经过酶解处理后,充分发挥与其他组分的协同作用,从而显著提高莫西菌素的产量。
优选地,本发明所述步骤(1)中发酵培养基包含以下成分:葡萄糖40~60g/L、乳糖或玉米淀粉30~40g/L、酵母粉30~40g/L、磷酸氢二钾1~3g/L、七水硫酸镁1~1.5g/L、氯化钠9~11g/L和碳酸钙15~25g/L,余量为水。
本发明所述步骤(1)中发酵培养温度为25~30℃,相对湿度为50~60%,以170~210rpm转数振荡培养190~240h;优选地,发酵培养温度为28℃,在旋转半径50~80mm条件下,以190rpm转数振荡培养240h。
本发明所述蓝灰链霉菌的种子液接种量为5~10%。所述提取方式为浸提,提取剂为甲醇。
本发明发酵液以甲醇为提取剂,采用本领域常规浸提提取方法,以甲醇为提取剂的浸提过程可以将莫西菌素有效提取出来,且提取过程简单、提取率高、提取过程不影响药物有效成分的生理活性。
作为一个整体的技术方案,本发明优选采用以下步骤:
步骤(1):将所述蓝灰链霉菌BJX003的种子液接种于发酵培养基中进行发酵,接种量为5~10%;所述发酵培养基组分为:葡萄糖50g/L、玉米淀粉35g/L、酵母粉35g/L、磷酸氢二钾2g/L、七水硫酸镁1.2g/L、氯化钠10g/L和碳酸钙20g/L,余量为水;其中,玉米淀粉为经过酶解后的玉米淀粉原料;酶解步骤如下:取1000份玉米淀粉加入水中至完全溶解,得到玉米淀粉溶液,向所述玉米淀粉溶液中加入2份α-淀粉酶(酶活力100000U),在105℃条件下快速搅拌,酶解5min,冷却后加入2份糖化酶,60℃条件下酶解24h,即得;调节pH值至7.2;发酵培养温度为28℃,相对湿度为50%,在旋转半径50mm条件下,以190rpm转数振荡培养240h,得发酵液;
步骤(2):向所述发酵液中,加入甲醇浸提提取莫西菌素。
本发明所述发酵制备莫西菌素的方法,产量可达到2890μg/mL,产量可以与乳糖发酵工艺相媲美,但乳糖价格高昂,经核算成本发现,使用玉米淀粉发酵的工艺比乳糖发酵的工艺成本节约30%~35%。
本发明提供了一种发酵培养基,包含以下组分:葡萄糖40~60g/L、乳糖或玉米淀粉20~50g/L、酵母粉20~50g/L、磷酸氢二钾1~3g/L、七水硫酸镁0.5~2g/L、氯化钠8.5~12.5g/L和碳酸钙10~30g/L,余量为水;其中所述玉米淀粉为玉米淀粉原料或经过酶解后的玉米淀粉原料;所述酶解步骤如下:取1000份玉米淀粉原料加入水中至完全溶解,得到玉米淀粉溶液,向所述玉米淀粉溶液中加入1~2份α-淀粉酶,在100~110℃条件下快速搅拌,酶解5~10min,冷却后加入1~2份糖化酶,50~60℃条件下酶解24~28h,即得。
本发明发酵培养基可应用于莫西菌素的生产中。
本发明所采用的蓝灰链霉菌BJX003菌株遗传稳定性好,连续传代5次后其生产莫西菌素的能力仍保持原来水平。本发明采用玉米淀粉和乳糖来制备莫西菌素的方法,能够提高生产莫西菌素的产量,而且方法简单;尤其是采用玉米淀粉在保持产量的前提下,成本低廉。因此,本发明菌株及制备莫西菌素的方法适合于在莫西菌素的工业生产中推广应用。
本发明蓝灰链霉菌BJX003在驱虫药物中有良好应用。本发明的莫西菌素作为一种广谱驱虫药物,成分单一,有着更广谱的驱虫活性、长效和安全等特性,并且在极低剂量下就有很强的抗线虫和节肢动物等体内外寄生虫的药物活性。
本发明所述产品皆为市售,份数皆为重量份,接种量为体积比,浓度为质量浓度。
具体实施方式
本发明所采用的菌株为蓝灰链霉菌(Streptomyces cyaneogriseus)BJX003,已于2014年1月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编100101),分类命名为蓝灰链霉菌(Streptomyces cyaneogriseus),保藏编号为:CGMCC No.8731。
实施例中的产品均为市售产品,检测手段为本领域常规检测手段。
实施例1
本实施例具体提供了一种通过发酵蓝灰链霉菌BJX003制取莫西菌素的生产方法。包含以下步骤:
步骤(1):将所述蓝灰链霉菌的种子液接种于发酵培养基中进行发酵,接种量为5%,所述发酵培养基包含以下组分:葡萄糖50g/L、玉米淀粉35g/L、酵母粉35g/L、磷酸氢二钾2g/L、七水硫酸镁1.2g/L、氯化钠10g/L和碳酸钙20g/L,余量为水;其中,玉米淀粉为经过酶解后的玉米淀粉原料;酶解步骤如下:取1000份玉米淀粉加入水中至完全溶解,得到玉米淀粉溶液,向所述玉米淀粉溶液中加入2份α-淀粉酶(酶活力100000U),在105℃条件下快速搅拌,酶解5min,冷却后加入2份糖化酶,60℃条件下酶解24h,即得;调节pH值至7.2;发酵培养温度为28℃,相对湿度为50%,在旋转半径50mm条件下,以190rpm转数振荡培养240h,得发酵液;
步骤(2):从所述发酵液中提取莫西菌素,加入甲醇浸提提取莫西菌素,具体提取方法为:将1mL发酵液加入到装有9mL甲醇的具塞比色管中,用力混匀后超声20min,0.45μm滤膜过滤可得。
经检测,本实施例所制得莫西菌素产量为2890μg/mL。
实施例2
本实施例具体提供了一种通过发酵蓝灰链霉菌BJX003制取莫西菌素的生产方法。本实施例包含以下步骤:
步骤(1):将所述蓝灰链霉菌的种子液接种于发酵培养基中进行发酵,接种量为10%,所述发酵培养基包含以下组分:葡萄糖40g/L、乳糖20g/L、酵母粉20g/L、磷酸氢二钾1g/L、七水硫酸镁0.5g/L、氯化钠8.5g/L和碳酸钙10g/L,余量为水;调节pH值至7.5;发酵培养温度为28℃,相对湿度60%,在旋转半径80mm条件下,以210rpm转数振荡培养190h,得发酵液;
步骤(2):从发酵液中提取莫西菌素。
经检测,本实施例所制得莫西菌素产量为2810μg/mL。
实施例3
本实施例具体提供了一种通过发酵蓝灰链霉菌BJX003制取莫西菌素的生产方法。本实施例包含以下步骤:
步骤(1):将所述蓝灰链霉菌的种子液接种于发酵培养基中进行发酵,接种量为8%,所述发酵培养基中葡萄糖60g/L、乳糖50g/L、酵母粉50g/L、磷酸氢二钾3g/L、七水硫酸镁2g/L、氯化钠12.5g/L和碳酸钙30g/L;调节pH值至7.0;发酵培养温度为25℃,相对湿度55%,在旋转半径70mm条件下,以170rpm转数振荡培养220h,得发酵液;
步骤(2):从发酵液中采用甲醇以浸提方式提取莫西菌素。
经检测,本实施例所制得莫西菌素产量为2731μg/mL。
实施例4
本实施例提供了一种发酵培养基,包含以下组分:葡萄糖40g/L、乳糖或玉米淀粉20g/L、酵母粉20g/L、磷酸氢二钾1g/L、七水硫酸镁0.5g/L、氯化钠8.5g/L和碳酸钙10g/L,余量为水;其中所述玉米淀粉为玉米淀粉原料或经过处理的玉米淀粉,所述经过处理的玉米淀粉处理步骤如下:取1000份玉米淀粉原料加入水中至完全溶解,得到玉米淀粉溶液,向所述玉米淀粉溶液中加入1份α-淀粉酶,在100℃条件下快速搅拌,酶解5min后,加入1份糖化酶,50℃条件下酶解24h,即得。
步骤(2):从发酵液中采用甲醇以浸提方式提取莫西菌素。
经检测,本实施例所制得莫西菌素产量为2690μg/mL。
实施例5
本实施例提供了一种发酵培养基,包含以下组分:葡萄糖60g/L、乳糖或玉米淀粉50g/L、酵母粉50g/L、磷酸氢二钾3g/L、七水硫酸镁2g/L、氯化钠12.5g/L和碳酸钙30g/L,余量为水;其中所述玉米淀粉为玉米淀粉原料或经过处理的玉米淀粉,所述经过处理的玉米淀粉处理步骤如下:取1000份玉米淀粉原料加入水中至完全溶解,得到玉米淀粉溶液,向所述玉米淀粉溶液中加入2份α-淀粉酶,在110℃条件下快速搅拌,酶解10min后,加入2份糖化酶,60℃条件下酶解28h,即得。
步骤(2):从发酵液中采用甲醇以浸提方式提取莫西菌素。
经检测,本实施例所制得莫西菌素产量为2723μg/mL。
由于实施例1是最佳实施例,因此实施例2-5均低于实施例1。
对比例1
与实施例1相比,区别点仅在于,本对比例采用的蔗糖取代玉米淀粉或乳糖,其他条件均相同。
本对比例所制备得到的莫西菌素经检测,产量为1700μg/mL。
结果表明,发酵培养基中玉米淀粉或乳糖的加入,可以有效提升莫西菌素的收率。
对比例2
与实施例1相比,区别点仅在于,本对比例所采用的玉米淀粉用量为10g/L,其他条件均相同。
本对比例所制备得到的莫西菌素经检测,产量为2000μg/mL。
结果表明,玉米淀粉20~50g/L的用量范围,可以与发酵培养基的其他组分发生良好的协同作用,从而有效提升莫西菌素的收率。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种利用蓝灰链霉菌制备莫西菌素的方法,其特征在于,包含以下步骤:
步骤(1):将保藏编号为CGMCC No.8731的蓝灰链霉菌(Streptomyces cyaneogriseus)BJX003的种子液接种于含有乳糖或玉米淀粉的发酵培养基中进行发酵培养,得发酵液;
步骤(2):从所述发酵液中提取莫西菌素。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(1)中发酵培养基包含以下成分:葡萄糖40~60g/L、乳糖或玉米淀粉20~50g/L、酵母粉20~50g/L、磷酸氢二钾1~3g/L、七水硫酸镁0.5~2g/L、氯化钠8.5~12.5g/L和碳酸钙10~30g/L,余量为水;调节pH值至7.0~7.5,优选7.2。
3.如权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述步骤(1)中玉米淀粉为玉米淀粉原料或经过酶解后的玉米淀粉原料;所述酶解步骤如下:取1000份玉米淀粉原料加入水中至完全溶解,得到玉米淀粉溶液,向所述玉米淀粉溶液中加入1~2份α-淀粉酶,在100~110℃条件下快速搅拌,酶解5~10min,冷却后加入1~2份糖化酶,50~60℃条件下酶解24~28h,即得。
4.如权利要求2或3所述的方法,其特征在于,所述步骤(1)中发酵培养基包含以下成分:葡萄糖40~60g/L、乳糖或玉米淀粉30~40g/L、酵母粉30~40g/L、磷酸氢二钾1~3g/L、七水硫酸镁1~1.5g/L、氯化钠9~11g/L和碳酸钙15~25g/L,余量为水。
5.如权利要求1~4任一项所述的方法,其特征在于,所述步骤(1)中发酵培养温度为25~30℃,相对湿度为50~60%,以170~210rpm转数振荡培养190~240h;优选地,发酵培养温度为28℃,在旋转半径50~80mm条件下,以190rpm转数振荡培养240h。
6.如权利要求1~5任一项所述的方法,其特征在于,所述步骤(1)中蓝灰链霉菌的种子液接种量为5~10%。
7.如权利要求1~5任一项所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中提取方式为浸提,提取剂为甲醇。
8.如权利要求3所述的方法,包含以下步骤:
步骤(1):将所述蓝灰链霉菌BJX003的种子液接种于发酵培养基中进行发酵,接种量为5~10%;所述发酵培养基组分为:葡萄糖50g/L、玉米淀粉35g/L、酵母粉35g/L、磷酸氢二钾2g/L、七水硫酸镁1.2g/L、氯化钠10g/L和碳酸钙20g/L,调节pH值至7.2;发酵培养温度为28℃,相对湿度为50%,在旋转半径50mm条件下,以190rpm转数振荡培养240h,得发酵液;
步骤(2):向所述发酵液中,加入甲醇浸提提取莫西菌素。
9.一种发酵培养基,其特征在于,包含以下组分:葡萄糖40~60g/L、乳糖或玉米淀粉20~50g/L、酵母粉20~50g/L、磷酸氢二钾1~3g/L、七水硫酸镁0.5~2g/L、氯化钠8.5~12.5g/L和碳酸钙10~30g/L,余量为水;其中所述玉米淀粉为玉米淀粉原料或经过酶解后的玉米淀粉原料;所述酶解步骤如下:取1000份玉米淀粉原料加入水中至完全溶解,得到玉米淀粉溶液,向所述玉米淀粉溶液中加入1~2份α-淀粉酶,在100~110℃条件下快速搅拌,酶解5~10min,冷却后加入1~2份糖化酶,50~60℃条件下酶解24~28h,即得。
10.如权利要求9所述的培养基在莫西菌素生产中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510409029.XA CN106701860A (zh) | 2015-07-13 | 2015-07-13 | 一种用于制备莫西菌素的发酵培养基及方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510409029.XA CN106701860A (zh) | 2015-07-13 | 2015-07-13 | 一种用于制备莫西菌素的发酵培养基及方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN106701860A true CN106701860A (zh) | 2017-05-24 |
Family
ID=58898429
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201510409029.XA Withdrawn CN106701860A (zh) | 2015-07-13 | 2015-07-13 | 一种用于制备莫西菌素的发酵培养基及方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN106701860A (zh) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008005381A2 (en) * | 2006-07-06 | 2008-01-10 | Wyeth | Process for the preparation of moxidectin comprising a step of microbiologically mediated oxidation of 23 -hydroxy- ll- f28249 -alpha to 23-keto-ll-f28249-alpha |
CN101372492A (zh) * | 2007-06-29 | 2009-02-25 | 浙江海正药业股份有限公司 | 一种制备高纯度莫西克汀的方法 |
CN103664989A (zh) * | 2013-12-10 | 2014-03-26 | 河北宇泽化工科技有限公司 | 一种用尼莫克汀发酵液制备莫西克汀的方法 |
CN104745654A (zh) * | 2013-12-27 | 2015-07-01 | 牡丹江佰佳信生物科技有限公司 | 一种制备尼莫克汀的方法及其生产菌株 |
-
2015
- 2015-07-13 CN CN201510409029.XA patent/CN106701860A/zh not_active Withdrawn
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008005381A2 (en) * | 2006-07-06 | 2008-01-10 | Wyeth | Process for the preparation of moxidectin comprising a step of microbiologically mediated oxidation of 23 -hydroxy- ll- f28249 -alpha to 23-keto-ll-f28249-alpha |
CN101372492A (zh) * | 2007-06-29 | 2009-02-25 | 浙江海正药业股份有限公司 | 一种制备高纯度莫西克汀的方法 |
CN103664989A (zh) * | 2013-12-10 | 2014-03-26 | 河北宇泽化工科技有限公司 | 一种用尼莫克汀发酵液制备莫西克汀的方法 |
CN104745654A (zh) * | 2013-12-27 | 2015-07-01 | 牡丹江佰佳信生物科技有限公司 | 一种制备尼莫克汀的方法及其生产菌株 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
吉姆 等主编: "《兽医药理学与治疗学 第九版》", 30 June 2012, 中国农业出版社 * |
李继昌 等主编: "《兽医药理学》", 30 April 2014, 中国林业出版社 * |
李艳华 等主编: "《兽医药物分析实验教程》", 31 March 2015, 中国农业大学出版社 * |
诸志义 主编: "《生物合成药物学》", 30 September 2000, 化学工业出版社 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11459593B2 (en) | Dendrobium officinale endophytic fungus strain and extracellular polysaccharide produced thereby, and extraction method and application of extracellular polysaccharide | |
CN104531559B (zh) | 解淀粉芽孢杆菌Lh‑1及其应用 | |
CN104694446B (zh) | 一种多粘类芽孢杆菌jx‑13及其应用 | |
CN104342390B (zh) | 一种苜蓿中华根瘤菌株及其组合物与应用 | |
CN103642725A (zh) | 拮抗植物病原菌的生防菌株及其用途 | |
CN106754578B (zh) | 一株氯霉素降解菌株lms-cy及其生产的菌剂和应用 | |
CN108220071A (zh) | 一种羊肚菌黄酒的制备方法 | |
CN106434409A (zh) | 一株体外高效拮抗稻瘟病菌的水稻内生放线菌OsiLf‑2 | |
CN101831481A (zh) | 一种新的伊枯草菌素a及其同系物的制备方法 | |
CN103695358A (zh) | 一株海洋微小链霉菌及其在群体感应抑制方面的应用 | |
CN106434475B (zh) | 一株链霉菌属多糖降解菌及其培养方法与应用 | |
CN101961013B (zh) | 丰加霉素在防治番茄灰霉病中的应用 | |
CN104560766B (zh) | 一种游动放线菌菌株及其应用 | |
CN103374537B (zh) | 一种制备恩拉霉素的方法及其生产菌株 | |
CN104371957A (zh) | 一种短小芽孢杆菌活菌制剂及其固体发酵方法和应用 | |
CN104450835A (zh) | 一种新化合物的制备方法 | |
CN104531543A (zh) | 灰毛豆内生真菌tpl25及其在防治植物病害中的应用 | |
CN103911321A (zh) | 海水环境中氯氰菊酯和/或溴氰菊酯降解菌及其分离纯化和应用 | |
CN109182216A (zh) | 一株对多肉植物茎腐病具有抑制作用的海洋链霉菌scfj-05 | |
CN110157646A (zh) | 一株抑制真菌生长的乳酸菌及其在馒头制作中的应用 | |
CN105838658A (zh) | 一种提高乳酸菌在高盐条件下生物量的方法 | |
CN105255948A (zh) | 桦褐孔菌发酵液的制备方法以及该发酵液在制备降低血糖保健饮品中的应用 | |
CN109880746A (zh) | 一种座坚壳属真菌菌株及其应用 | |
CN104278070A (zh) | 一种提高桑黄液体发酵产物中麦角甾醇含量的方法 | |
CN106701860A (zh) | 一种用于制备莫西菌素的发酵培养基及方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20170524 |
|
WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |