CN113151057B - 一株抗菌肽的高产菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于饲料添加剂领域，具体涉及从土壤中分离得到一株产抗菌肽的枯草芽孢杆菌(Bacilus subtilis)，经过诱变与高通量筛选后，获得一株高产抗菌肽的枯草芽孢杆菌突变株。该菌发酵生产的抗菌肽具高产量和耐高温特性，将突变菌株产生的抗菌肽添加到饲料中进行喂食后，具有很好的抑菌、抗病和消炎的功效。
Description
技术领域
本发明提供一种枯草芽孢杆菌ZKKY010，经过发酵后能产生耐高温的抗菌肽，所述抗菌肽经过高温处理后仍然具有98％以上的抑菌能力，可以改善动物肠道健康。
背景技术
畜牧业发展的重要痛点就是为了防病、治病和促进动物生长，为此人们在饲料中添加了大量的抗生素，造成了耐药病原菌的产生和环境的污染，因此，农业部开始禁止在饲料添加抗生素。而寻找到能够替代抗生素的方法或者制剂成为研究的热点。
抗菌肽是一种具有抑制病原微生物功能的小分子肽，通常是由7-100个氨基酸组成的小分子多肽，是生物体天然免疫防御系统的重要组成部分，也是各种生物抵御入侵病原体的第一道防线，作为可从自然来源中提取并用于对抗抗生素耐药细菌的潜在候选物，具有广谱抗菌、无抗药性等优点。
发明内容
本发明的技术优势是提供一种枯草芽孢杆菌ZKKY010，经过发酵后能产生耐高温的抗菌肽，而且所述抗菌肽经过高温处理后仍然具有98％以上的抑菌能力，可以改善动物肠道健康。为开发饲料添加剂奠定了良好的基础。该菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号CGMCC NO.20464。
本发明的菌株筛选自下水道的土样和水体，经过放大培养，获得多种初筛菌株。挑选所述初筛菌株单菌落分别进行发酵培养后，以其发酵液实施抑菌圈法实验，以大肠杆菌为抑菌对象，筛选出初筛菌株中对大肠杆菌抑菌活性最强的菌株，为起始菌株。经过鉴定所述起始菌株为枯草芽孢杆菌。
将起始菌株进行诱变，产生诱变菌株。再以大肠杆菌为抑菌对象，筛选出诱变菌株中抑菌活性最高的菌株，即为本发明的枯草芽孢杆菌CGMCC NO.20464。
一种抗菌肽，利用枯草芽孢杆菌CGMCC NO.20464发酵产生。
一种枯草芽孢杆菌CGMCC NO.20464用于生产抗菌肽的应用。
一种饲料的生产方法，所述方法包含添加枯草芽孢杆菌CGMCC NO.20464的发酵物或枯草芽孢杆菌CGMCC NO.20464发酵产生的抗菌肽。
其中，所述添加的发酵物或发酵产生的抗菌肽占饲料总重的1-15％。添加形式不限于发酵液和/或发酵干粉。
一种饲料添加剂，所述饲料添加剂含有枯草芽孢杆菌CGMCC NO.20464的发酵物或枯草芽孢杆菌CGMCC NO.20464发酵产生的抗菌肽。
一种饲料，所述饲料添加含有占饲料总重1-15％的枯草芽孢杆菌CGMCC NO.20464或枯草芽孢杆菌CGMCC NO.20464发酵产生的抗菌肽。
作为优选，所述的发酵产生的抗菌肽，选自但不限于，发酵后的发酵液或发酵液低温干燥处理后的发酵粉。
另一优选，所述枯草芽孢杆菌CGMCC NO.20464的添加形式包含但不限于：干燥粉末、菌泥、冻干制剂及其他类似或适用本发明的形式。
一种抑菌剂，所述抑菌剂含有枯草芽孢杆菌CGMCC NO.20464的发酵物或枯草芽孢杆菌CGMCC NO.20464生产的抗菌肽。用于抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和/或真菌。
一种药物组合物，所述组合物的有效成分为枯草芽孢杆菌CGMCC NO.20464或由枯草芽孢杆菌CGMCC NO.20464生产的抗菌肽。
有益效果：本发明提供的枯草芽孢杆菌菌株ZKKY010具有耐高温和高产抗菌肽的特点。所产生的抗菌肽可以抑制革兰氏阳性或/和阴性菌，其独特性非常适于作为饲料的添加剂，而且产量高，成本低。
本发明所采用的枯草芽孢杆菌CGMCC NO.20464，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，该菌株的保藏编号为CGMCC NO.20464。其分类命名为Bacillus subtilis(枯草芽孢杆菌)；其保藏日期为2020年7月29日。
附图简要说明
图1显示枯草芽孢杆菌菌株ZKKY010(CGMCC NO.20464)抑制大肠杆菌结果。
图2显示枯草芽孢杆菌菌株ZKKY010(CGMCC NO.20464)抑制链球菌结果。
图3显示枯草芽孢杆菌菌株ZKKY010(CGMCC NO.20464)抑制金黄色葡萄球菌结果。
图4显示喂食含有抗菌肽的发酵液的饲料后病畜的疾病改善状况。
具体实施方式
1、菌种筛选：
菌株的筛选和鉴定：
1.1样品采集于河北省迁安市的长期高温的下水道中，采集点包括土样和水体，以采集袋装10g土样和5mL的离心管采集水体。共采集50个样品。
1.2将每一个样品在沸水中处理11min，处理结束以后取100微升样品涂布LB固体培养基上，37℃培养24h，进行放大，获得菌斑即为初筛菌株。
1.3将初筛菌株的单菌落接种LB液体培养基37℃发酵18h，离心收集上清液，滤纸法用固定大小的滤纸片蘸取上清液，以大肠杆菌为抑菌对象，筛选获得抑菌活性最高的菌株，为起始菌株。
1.4起始菌株鉴定采用微生物菌种鉴定Biology仪鉴定，鉴定结果为枯草芽孢杆菌。
2、常压室温等离子体(ARTP)诱变：
2.1将起始菌株活化后按1％(V/V)接种量接种于装有100mL LB液体培养基中，37℃170r/min培养16h至对数生长期，取1mL菌液加入含有9mL无菌水试管中，进行1:10稀释，混合均匀后，按上述操作顺序，逐步稀释至106～108cfu/mL，取1mL与1mL 10％甘油混合，作为菌悬液进行诱变。
2.2ARTP诱变：无菌条件下吸取菌悬液10μL均匀涂布于无菌金属载片表面，将金属载片放置在ARTP机中，以氦气作为工作气体，电源的功率为120w，照射距离为2mm，气流量为10L/min，对菌悬液进行处理，处理时长为120s，处理完成的金属载片放于1mL无菌水中进行洗脱并稀释涂板。
经过诱变以后的菌株通过步骤1.3获得抑菌效果表达最高的诱变菌株，即为本发明的枯草芽孢杆菌ZKKY010(CGMCC NO.20464)。
将获得的菌种ZKKY010接种LB液体培养基37℃发酵18h，离心收集上清液，滤纸法用固定大小的滤纸片蘸取上清液，分别以革兰氏阴性菌的大肠杆菌、革兰氏阳性菌的链球菌及金黄色葡萄球菌为抑菌对象进行抑菌效果测试。
其抑菌效果如图1-3。
3发酵
将上述筛选获得菌种，枯草芽孢杆菌ZKKY010(CGMCC NO.20464))，采用LB培养基在2吨发酵罐中37℃发酵18h。取100ml发酵液11000g离心15min除去菌体，用6M HCl将上清液调节到pH 2，然后静止过夜，11000g离心收集沉淀，加入甲醇后用NaOH中和至pH 7，获得抗菌肽粗提物。采用高效液相色谱(HPLC，Agilent 1100Series)分析，抗菌肽产量达到2.4-3.2g/L。
同时，发明人将步骤1.4的起始菌株经过上述发酵以后，测量其产生的抗菌肽产量为1.2g/L，说明经过ARTP诱变的菌株(枯草芽孢杆菌ZKKY010(CGMCC NO.20464))抗菌肽产量提高了2倍以上，请参考下表。
表、诱变前后抗菌肽产量比对
| 生产量(g/L) | |
| 起始菌株(枯草芽孢杆菌) | 1.2 |
| 诱变菌株(枯草芽孢杆菌ZKKY010(CGMCC NO.20464)) | 2.4-3.2 |
4高温处理抗菌肽
将枯草芽孢杆菌ZKKY010(CGMCC NO.20464)发酵所获得的抗菌肽置于100℃水浴中处理30min，选取大肠杆菌为抑菌对象，测评其高温处理前后所述枯草芽孢杆菌菌株ZKKY010(CGMCC NO.20464)发酵所获得的抗菌肽抑菌圈大小。结果表明，热处理后的抑菌圈大小为处理前的98％，说明经过热处理，抗菌肽抑菌活性损失较小。
5养殖实验
实验对象：选择由细菌感染引起的幼畜腹泻、隐性乳房炎、子宫炎和输卵管炎，共4组病畜。
实验组：将枯草芽孢杆菌菌株ZKKY010(CGMCC NO.20464)发酵液，按照总饲料重1-15％添加到基础日粮中，通过鼓风干燥喂食牲口。喂食1个月。
对照组：采用基础日粮饲喂食1个月。
结果：效果见图4，相比对照组，实验组疾病治疗的有效率及康复率分别在65％及55％以上。
对细菌感染引起的肠道疾病(幼畜腹泻)有90％以上的有效率及康复率。
Claims (9)
1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.20464。
2.一种权利要求1所述的枯草芽孢杆菌CGMCCNO.20464用于生产抗菌肽的用途。
3.一种饲料的生产方法，所述方法包括添加权利要求1的枯草芽孢杆菌的发酵物。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵物占饲料总重的1%-15%。
5.一种饲料添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂含有权利要求1的枯草芽孢杆菌的发酵物。
6.一种饲料，其特征在于，所述饲料含有权利要求5所述的饲料添加剂。
7.如权利要求6所述的饲料，其特征在于，如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的发酵物占所述饲料总重的1%-15%。
8.一种抑菌剂，其特征在于，所述抑菌剂含有权利要求1的枯草芽孢杆菌的发酵物。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的有效成分为权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的发酵物。
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| Publication number | Publication date |
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| CN113151057A (zh) | 2021-07-23 |
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