CN110150478A - 一种降低奶牛乳房炎发病率的饲料添加剂及其制备方法与应用 - Google Patents

一种降低奶牛乳房炎发病率的饲料添加剂及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种降低奶牛乳房炎发病率的饲料添加剂及其制备方法与应用。一种降低奶牛乳房炎发病率的饲料添加剂，有效成分包括枯草芽孢杆菌和家蚕抗菌肽；所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bsbc01，于2019年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物学中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏编号CGMCC NO.17239，有效活菌含量≥109cfu/g；家蚕抗菌肽含量≥150000U/g。本发明所述的饲料添加剂中，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bsbc01与家蚕抗菌肽复配后，家蚕抗菌肽可以显著提高枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bsbc01的抗逆性，极大提高了饲料添加剂的作用效果。

Description

一种降低奶牛乳房炎发病率的饲料添加剂及其制备方法与 应用
技术领域
本发明涉及一种降低奶牛乳房炎发病率的饲料添加剂及其制备方法与应用，属于微生物技术领域。
背景技术
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，是芽孢杆菌属的一种，CAS号68038-70-0。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系，故常作选育核苷生产菌的亲株或制取5'-核苷酸酶的菌种。
中国专利文献CN109161506A(申请号201811098313.X)公开了一株枯草芽孢杆菌及其应用，涉及生物防治植物病害领域。该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Yt1004，保藏编号为CGMCC No.14672。本发明还公开了含有上述菌株的生物防治制剂及其制备方法。该微生物制剂可以作为生物农药或生物肥料防治作物根结线虫病害，包括黄瓜根结线虫、西红柿根结线虫、大姜根结线虫、甜瓜根结线虫等一种或几种。
乳房炎是奶牛养殖过程中的常见疾病之一，在养殖过程中的发病率高达40％，该疾病可以使奶牛产奶量下降15％-20％，是威胁奶牛业健康发展的主要疾病。据研究，临床性乳房炎与体细胞呈相关性R＝0.5-0.7，因此各国测定体细胞作为检测乳房炎的指标并作为奶牛乳房炎抗性的选种依据。据Shook等报道奶牛日产量与隐性乳房炎发病程度呈极显著负相关。传统的预防和防治方法主要是通过抗病育种，此外，随着兽药学的发展，使用抗生素等药物预防和治疗乳房炎也成为目前主要预防和防治的方法之一。
但随着食品安全标准的提高，药物残留已成为影响奶制品品质的重要指标之一。因此，在降低奶牛乳房炎发病率的同时，积极开发低残留的生物制剂，成为该领域目前的主要研究热点。
中国专利文献CN101253934A(申请号200810103485.1)公开了一种奶牛饲料用复合微生物添加剂，该微生物添加剂含有纳豆枯草芽孢杆菌、屎肠球菌和酿酒酵母菌的发酵产物混合物，细菌总数为109cfu/g以上。本发明所述的复合微生物制剂，三种微生物产生协同作用，经过长期反复的动物实验显示，可以显著提高饲喂奶牛的产奶量，且产奶中乳脂率有显著提高，乳蛋白产量也显著增高，奶牛泌乳期体细胞数明显下降，可以使奶牛患乳房炎和隐形乳房炎的发病几率减少，奶牛机体的自身免疫能力明显增强。
该菌剂中利用枯草芽孢杆菌是好氧菌的特性，快速消耗奶牛肠道中的游离氧，从而形成低氧环境，有利于厌氧益生菌的生长，达到改善奶牛肠道菌群结构，提升奶牛免疫力的效果。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种降低奶牛乳房炎发病率的饲料添加剂及其制备方法与应用。
本发明技术方案如下：
一种降低奶牛乳房炎发病率的饲料添加剂，有效成分包括枯草芽孢杆菌和家蚕抗菌肽；
所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bsbc01，于2019年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物学中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏编号CGMCC NO.17239，有效活菌含量≥109cfu/g；
家蚕抗菌肽含量≥150000U/g。
所述家蚕抗菌肽的制备为本领域的现有技术，如可参考中国专利文献CN101519442A(申请号200910116463.3)中说明书例2中记载的方法从家蚕中提取。
上述饲料添加剂的制备方法，步骤如下：
(1)将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bsbc01划线接种于LB固体培养基平板上37℃活化培养24h，制得活化菌株；
(2)将步骤(1)制得的活化菌株接种于LB液体培养基中，37℃、180rpm振荡培养18h，制得种子液；
(3)将步骤(2)制得的种子液按体积百分比5～8％的接种量接种到液体培养基中，37℃培养8h，制得初级发酵液；
(4)将步骤(3)制得的初级发酵液按体积百分比5～8％的接种量接种到发酵培养基中，37℃培养24h，制得发酵液，经干燥，制得菌粉；
(5)制备家蚕抗菌肽；
(6)将步骤(4)制得的菌粉与步骤(5)制得的家蚕抗菌肽混合，即得。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，液体培养基组分如下：
玉米粉2％，豆饼粉3％，麸皮2％，柠檬酸钠0.5％，KH2PO4 0.03％，K2HPO4 0.01％，CaCl2 0.01％，余量水，pH7.0～7.2。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，所述发酵培养基每升组分如下：
玉米粉2％，豆饼粉3％，麸皮2％，柠檬酸钠0.5％，KH2PO4 0.03％，K2HPO4 0.01％，CaCl2 0.01％，余量水，pH7.0～7.2。
根据本发明优选的，所述步骤(5)，具体步骤如下：
(i)取待提取五龄家蚕蚕体，经冷冻、捣碎、匀浆；然后与等体积质量百分比浓度为5％的乙酸溶液混合，4℃条件下搅拌过夜，然后隔水煮沸15min，冷却，制得待分离溶液；
(ii)将步骤(i)制得的待分离溶液，在4℃条件下、8000rpm离心30min，取上清液；将离心分离的沉淀物再与等体积量的质量百分比浓度为5％的乙酸混合，4℃搅拌、浸提过夜，8000rpm离心30min，取上清，合并两次上清液，调整pH值，离心，弃沉淀，上清液冷冻干燥，即得。
一种具有防治奶牛乳房炎的保健饲料，在日常饲料中按饲料添加剂：日常饲料质量比1：(150～250)比例添加上述的饲料添加剂，即得。
有益效果
1、本发明首次采用一株从青藏高原养殖区筛选获得的枯草芽孢杆菌与家蚕抗菌肽复配后作为奶牛的饲料添加剂，由于该菌株具有优异的低氧耐受性，与家蚕抗菌肽在奶牛肠道内共同作用，在防止腹泻、调节肠道菌群、提高营养吸收的同时，可以显著提高动物免疫力、降低奶牛罹患乳房炎的几率；
2、本发明所述的饲料添加剂中，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bsbc01与家蚕抗菌肽复配后，家蚕抗菌肽可以显著提高枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bsbc01的抗逆性，极大提高了饲料添加剂的作用效果。
附图说明
图1是实施例1所述不同菌株在低氧环境条件下生长的结果照片；
图2是实施例3所述在相同条件下施用本申请菌株和枯草芽孢杆菌CMCC63501后，利用麦康凯琼脂培养基定向分离畜牧动物肠道病害菌的培养结果照片；
图中：左图为施用枯草芽孢杆菌CMCC63501结果图；右图为施用本申请所述枯草芽孢杆菌结果图；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实施例中所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bsbc01，于2019年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物学中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏编号CGMCC NO.17239。
实施例1
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bsbc01的分离
取自青藏高原牦牛散养区土壤，将样品进行10倍梯度稀释，分别涂布在固体LB培养基和固体TSB培养基上进行培养，48小时后将长出的单菌落转接至液体培养基，继续培养24小时。涂布至固体LB培养基进行纯培养。
随机选取1000个单克隆进行抑菌杀菌实验检测。用到的致病菌种属为：胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)，胡萝卜果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa PAO1)，水稻致病菌布克氏菌(Burkholderiaglumae)，水稻谷枯病菌(Burkholdria glumae)，解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)，玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii ssp.stewartii)；其中具有窄谱杀菌活性的菌株共39株，具广谱杀菌活性的菌株12株，将具有最强抑菌杀菌活性的1株菌株进行测序，定名为枯草芽孢杆菌Bsbc。
通过分析芽孢杆菌Bsbc生长特性结果可知，在耐盐性方面，Bsbc的耐盐性较强，在NaCl的质量百分比含量为12％的培养基条件下生长良好，在生长温度方面Bsbc能耐受低温及高温环境，可以在4℃～45℃条件下生长；在耐酸碱性方面，可以适应pH在5.5～9.0的生长环境，金属离子对Bsbc的生长影响不大。需要特别指出的优势是，Bsbc低氧耐受特性尤为突出，利用微需氧产气袋对Bsbc与之前已报道的枯草芽孢杆菌ATCC 6633和CMCC 63501(与背景技术中提及的Yt1004同源性为100％)进行比较，进行低氧环境下(11000Pa，正常大气氧分压的50％)，经LB培养基培养48小时进行活力检测，结果显示Bsbc在低氧环境下的生存率是对照组的3.6倍，杀菌能力是对照组的3.3倍。
随后对Bsbc进行紫外随机紫外诱变，然后在低氧环境下筛选抗低氧环境突变株，获得突变株Bsbc01，与野生菌株进行比较，结果显示Bsbc01在低氧环境下的生存率是野生型菌株的2倍，杀菌能力是野生型菌株的1.8倍。低氧环境下培养48小时后，菌株生存能力比较结果如图1所示。
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bsbc01于2019年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号GCMCC No.17239。
实施例2
一种饲料添加剂的制备方法，步骤如下：
(1)将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bsbc01划线接种于LB固体培养基平板上37℃活化培养24h，制得活化菌株；
(2)将步骤(1)制得的活化菌株接种于LB液体培养基中，37℃、180rpm振荡培养18h，制得种子液；
(3)将步骤(2)制得的种子液按体积百分比5～8％的接种量接种到液体培养基中，37℃培养8h，制得初级发酵液；
(4)将步骤(3)制得的初级发酵液按体积百分比5～8％的接种量接种到发酵培养基中，37℃培养24h，制得发酵液，经干燥，制得菌粉；
(5)制备家蚕抗菌肽，具体步骤如下：
(i)取待提取五龄家蚕蚕体，经冷冻、捣碎、匀浆；然后与等体积质量百分比浓度为5％的乙酸溶液混合，4℃条件下搅拌过夜，然后隔水煮沸15min，冷却，制得待分离溶液；
(ii)将步骤(i)制得的待分离溶液，在4℃条件下、8000rpm离心30min，取上清液；将离心分离的沉淀物再与等体积量的质量百分比浓度为5％的乙酸混合，4℃搅拌、浸提过夜，8000rpm离心30min，取上清，合并两次上清液，调整pH值，离心，弃沉淀，上清液冷冻干燥，即得；
(6)将步骤(4)制得的菌粉与步骤(5)制得的家蚕抗菌肽混合，即得。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，液体培养基组分如下：
玉米粉2％，豆饼粉3％，麸皮2％，柠檬酸钠0.5％，KH2PO4 0.03％，K2HPO4 0.01％，CaCl2 0.01％，余量水，pH7.0～7.2。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，所述发酵培养基每升组分如下：
玉米粉2％，豆饼粉3％，麸皮2％，柠檬酸钠0.5％，KH2PO4 0.03％，K2HPO4 0.01％，CaCl2 0.01％，余量水，pH7.0～7.2。
对比例1
如实施例2所述的制备方法，不同之处在于，采用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)CMCC63501替换枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bsbc01。
对比例2
如实施例2所述的制备方法，不同之处在于，采用细菌抗菌肽杆菌肽(Bacitracin)替换家蚕抗菌肽。细菌抗菌肽杆菌肽(Bacitracin)被证明同样具有良好的杀菌效果。杆菌肽，分子式为C66H103N17O16S，类白色或淡黄色的粉末；无臭，味苦；有引湿性；易被氧化剂破坏，在溶液中能被多种重金属盐类沉淀。本品在水中易溶，在乙醇中溶解，在丙酮、氯仿或乙醚中不溶。临床上抗菌谱与青霉素相似，对革兰阳性细菌和阴性球菌、肺炎双球菌、葡萄球菌、淋球菌、脑膜炎双球菌及螺旋体等均有杀菌作用。
实施例3
一种具有防治奶牛乳房炎的保健饲料，在日常饲料中分别按饲料添加剂：日常饲料质量比1：200的比例分别添加对比例1～2与实施例2中的饲料添加剂；分别标记为样品1～3。
实验例1
实验场所：山东某大型牧场，对200头奶牛进行实验测试；
日常饲料：青干草，农作物副产品，甜菜渣、饴糖渣等常用饲料。
实验过程：将200头2～3龄处于产奶期的奶牛分成四个实验组，分别按奶牛饲养的统一标准饲喂样品1～3及日常饲料50天时间；
分别在第50天对不同实验组的奶牛产奶情况进行检测，并对奶中乳脂率、乳蛋白率和乳糖指标进行检测，经检测，实验结果如表1所示：
表1
组别 乳脂率(％) 乳蛋白率(％) 乳糖(％) 产奶量(％) 饲养成本(％)
样品1 3.81 3.1 4.79 112 113
样品2 3.79 3.1 4.72 118 116
样品3 3.89 3.3 4.87 126 105
日常饲料 3.73 2.9 4.71 100 100
通过表1的数据可以看出，样品1(对比例1)和样品2(对比例2)与样品3(实施例2)相比，将菌株或抗菌肽替换为具有类似功能的替代品后，均导致产奶量及奶的品质出现明显下降，这说明本申请中所述的菌株与家蚕抗菌肽之间在提高奶产量和品质方面具有特异性，是类似同类物质所无法替代的。
实验例2
经对上述施用产品后的畜牧动物进行肠道菌群分离，并进行实验室培养，培养条件分别为LB培养基、麦康凯琼脂培养基、MA培养基、TSB培养基，培养温度分别为37℃，32℃，30℃，培养时间为48小时，分析菌群多样性。同时，进行高通量及肠道宏基因组测序，将测序后的结果进行比对分析，发现本品能够显著降低肠道病害菌大肠杆菌和铜绿假单胞菌的比率，两者在肠道内的丰度分别降低了38.2％和26.1％，提高了有益菌枯草芽孢杆菌，肠道乳酸菌的比率，两者在肠道内的丰度分别提高了12.8％和22.6％。其中，病害大肠杆菌的抑菌效果最为明显，显著高于相同条件下施用现有常规枯草芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌CMCC63501)的效果，结果如图2所示。
对实验例1实验后的畜牧动物进行肠道菌群分离，并进行实验室培养，培养条件分别为LB培养基、麦康凯琼脂培养基、MA培养基、TSB培养基，培养温度分别为37℃，32℃，30℃，培养时间为48小时，分析菌群多样性；结果如表2所示：
表2
对实验例1实验后的畜牧动物肠道分离后的菌群进行高通量及肠道宏基因组测序，将测序后的结果进行比对分析，结果如表3所示：
表3
组别 肠道病害菌占比(根据16S丰度统计病害菌比例)
样品1 43％
样品2 36％
样品3 19％
通过表2和表3的数据可以看出，样品1(对比例1)和样品2(对比例2)与样品3(实施例2)相比，将菌株或抗菌肽替换为具有类似功能的替代品后，均导致肠道病害菌占比显著升高，这说明本申请中所述的菌株与家蚕抗菌肽之间在抑制肠道病害菌方面具有特异性，是类似同类物质所无法替代的。
实验例3
分别将实施例2和对比例1～2制得的饲料添加剂置于不同pH液体中处理30min，温度为37℃，结果如下所示：在pH1.0的环境下，实施例2中的饲料添加剂中，有益菌存活率为80.2％，对比例1中有益菌存活率为65.2％，对比例2中的有益菌存活率为63.8％。在pH10.0的环境下，实施例2中的饲料添加剂中，有益菌存活率为56.2％，对比例1中有益菌存活率为43.5％，对比例2中的有益菌存活率为49.3％。
分别将实施例2和对比例1～2制得的饲料添加剂置于温度为50℃处理30min，检测成活率，结果如下所示：实施例2中的饲料添加剂中，有益菌存活率为51.2％，对比例1中有益菌存活率为43.2％，对比例2中的有益菌存活率为45.0％。
分别将实施例2和对比例1～2制得的饲料添加剂置于真实胃液中(pH1.0)处理60min，检测成活率，结果如下所示：实施例2中的饲料添加剂中有益菌存活率为89.3％，对比例1中有益菌存活率为67.2％，对比例2中的有益菌存活率为75.8％。

Claims (6)

1.一种降低奶牛乳房炎发病率的饲料添加剂，有效成分包括枯草芽孢杆菌和家蚕抗菌肽；
所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bsbc01，于2019年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物学中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏编号CGMCC NO.17239，有效活菌含量≥109cfu/g；
家蚕抗菌肽含量≥150000U/g。
2.如权利要求1所述的饲料添加剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bsbc01划线接种于LB固体培养基平板上37℃活化培养24h，制得活化菌株；
(2)将步骤(1)制得的活化菌株接种于LB液体培养基中，37℃、180rpm振荡培养18h，制得种子液；
(3)将步骤(2)制得的种子液按体积百分比5～8％的接种量接种到液体培养基中，37℃培养8h，制得初级发酵液；
(4)将步骤(3)制得的初级发酵液按体积百分比5～8％的接种量接种到发酵培养基中，37℃培养24h，制得发酵液，经干燥，制得菌粉；
(5)制备家蚕抗菌肽；
(6)将步骤(4)制得的菌粉与步骤(5)制得的家蚕抗菌肽混合，即得。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，液体培养基组分如下：
玉米粉2％，豆饼粉3％，麸皮2％，柠檬酸钠0.5％，KH2PO4 0.03％，K2HPO4 0.01％，CaCl20.01％，余量水，pH7.0～7.2。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述发酵培养基每升组分如下：
玉米粉2％，豆饼粉3％，麸皮2％，柠檬酸钠0.5％，KH2PO4 0.03％，K2HPO4 0.01％，CaCl20.01％，余量水，pH7.0～7.2。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)，具体步骤如下：
(i)取待提取五龄家蚕蚕体，经冷冻、捣碎、匀浆；然后与等体积质量百分比浓度为5％的乙酸溶液混合，4℃条件下搅拌过夜，然后隔水煮沸15min，冷却，制得待分离溶液；
(ii)将步骤(i)制得的待分离溶液，在4℃条件下、8000rpm离心30min，取上清液；将离心分离的沉淀物再与等体积量的质量百分比浓度为5％的乙酸混合，4℃搅拌、浸提过夜，8000rpm离心30min，取上清，合并两次上清液，调整pH值，离心，弃沉淀，上清液冷冻干燥，即得。
6.一种具有防治奶牛乳房炎的保健饲料，在日常饲料中按饲料添加剂：日常饲料质量比1：(150～250)比例添加权利要求1所述的饲料添加剂，即得。
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