CN112795561B - 一种利用磁性纳米粒子固定化细胞酶解鱿鱼内脏制备ace抑制肽的方法 - Google Patents

一种利用磁性纳米粒子固定化细胞酶解鱿鱼内脏制备ace抑制肽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种采用聚乙烯亚胺(PEI)修饰二氧化硅包裹的四氧化三铁(Fe3O4)磁性纳米微球，利用该纳米微球固定化枯草芽孢杆菌细胞酶解鱿鱼内脏下脚料制备ACE抑制肽的方法，该方法的步骤包括：制备鱿鱼内脏提取物干粉、磁性纳米微球的制备、菌株活化与培养、细胞固定化、酶解与分离、超滤和干燥。本发明的方法酶解效率高，酶解产物容易分离。固定化的细胞重复利用多次仍能达到好的蛋白水解度和ACE抑制活性，降低了方法的成分。所制备的多肽产物具有良好的ACE抑制活性，IC50值达0.109mg/mL。

Description

一种利用磁性纳米粒子固定化细胞酶解鱿鱼内脏制备ACE抑 制肽的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为利用磁性纳米粒子固定化细胞酶解鱿鱼内脏制备ACE抑制肽的方法。
背景技术
鱿鱼内脏是鱿鱼加工的主要副产物，占鱿鱼鲜重的20％以上。鱿鱼内脏下脚料水分含量高，组织酶活跃，很难储藏，加工后大部分被直接丢弃，或仅被简单加工成养殖用的饲料，不仅污染环境，还造成了资源的浪费。鱿鱼内脏是一类蛋白丰富的生物资源，含有丰富的蛋白质等营养成分，并且这些蛋白大多为容易降解的水溶性蛋白，因此鱿鱼内脏是制备生物活性肽的良好原料。目前，利用鱿鱼内脏下脚料制备生物活性肽主要有三种方法：酶解法、微生物发酵法和组织酶自溶法。酶解法是通过添加外源蛋白酶降解原料中的可溶性蛋白质释放生物活性肽(食品科技,2011,36(03):116-119，中国农学通报,2015,31(20):39-43)，但是添加外源属于一次性使用，无法回收再利用，使得成本较高，限制了这种方法在大规模制备上的应用。微生物发酵法是接种产蛋白酶和肽酶的微生物到原料液或在原料配制液中进行发酵，利用菌体产的蛋白酶和肽酶降解原料蛋白而获得活性肽(浙江海洋大学学报,2018,37(01):50-54)。发酵法具有水解效率高、成本低的优点，但是发酵的时间和周期较长，增加了工艺的复杂度。自溶水解法是利用鱿鱼内脏自身存在的组织蛋白酶对蛋白进行水解而释放活性肽(食品科学,2017,38(01):238-243)，该方法无需添加蛋白酶，成本低廉，但由于组织酶酶解性质不稳定，同时废弃物中常含有杂的微生物，在酶解过程中容易滋生，导致酶解产物不稳定，蛋白水解的效率低。
固定化细胞酶解是将高产蛋白酶的微生物细胞固定在支持介质上，在酶解过程中利用菌体细胞不断产生的蛋白水解酶水解底物蛋白，获得有生物活性的多肽序列。固定化细胞酶解不使用纯酶，而且菌体固定在介质上容易和上清液分离，并可以反复多次使用，极大地降低了过程操作的成本。此外，菌体细胞固定化以后能保护细胞免受剧烈搅拌等恶劣环境的影响，细胞的稳定性好，产酶的活力也得到了提高。目前，已有利用海藻酸钠、聚乙二醇和壳聚糖等材料通过包埋固定枯草芽孢杆菌细胞，酶解乳清蛋白制备ACE抑制肽和抗氧化肽的报道(International Journal of Peptide Research and Therapeutics,25(2),681-689.)。然而，传统的固定化方法如包埋法，存在包埋后传质的阻力大，特别是酶分泌到反应液中传质阻力大，介质可以负载的细胞生物量小，稳定性差，细胞与介质的结合易受到环境的影响等确定，限制了固定化技术在实际中的应用。
发明内容
本发明的目的在于，解决现有用酶解法制备鱿鱼内脏废弃物ACE抑制肽的技术中，采用添加外源酶酶解成本高，采用发酵法周期长、工艺复杂度高，组织酶自溶法操作稳定性不好等缺点。本发明开发了一种采用磁性纳米微球固定化菌种，酶解制备ACE抑制肽的方法，较传统的细胞固定化方法酶解效率更好，产物活性更高。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种利用磁性纳米粒子固定化细胞酶解鱿鱼内脏制备ACE抑制肽的方法，包括如下步骤：
A、原料的预处理：鱿鱼内脏与去离子水混合加热，去除块状鱼骨，绞碎、干燥、粉碎，获得鱿鱼内脏提取物细粉；
B、磁性纳米微球的制备：Fe3O4纳米微粒与乙醇混合，分散；之后加入脱气去离子水、氨水和硅酸四乙酯反应，用外加磁场分离，清洗、干燥，获得二氧化硅包裹的Fe3O4纳米微球，即Fe3O4@SiO2；所述Fe3O4@SiO2与脱气超纯水混合、分散，之后缓慢加入PEI，搅拌反应，用外加磁场分离，清洗、干燥，获得PEI修饰的Fe3O4@SiO2纳米微球，即PEI-Fe3O4@SiO2纳米微球；
C、菌株活化与培养：取芽孢杆菌进行摇床活化与培养，离心收集细胞，洗涤后获得菌体细胞；
D、细胞的磁性纳米颗粒固定化：所述PEI-Fe3O4@SiO2纳米微球溶于磷酸缓冲液中配制成悬液，分散加入所述菌体细胞，在摇床中吸附，利用外加磁场分离，清洗后获得固定化细胞；
E、鱿鱼内脏蛋白的酶解：所述鱿鱼内脏提取物细粉溶于蒸馏水，获得底物溶液，再加入所述固定化细胞进行酶解，酶解反应完后，用外加磁场分离所述固定化细胞，上清液进行灭酶处理，获得酶解上清液；
F、鱿鱼内脏酶解肽的分离提取：酶解上清液经过离心，去除未被酶解的成分，离心后上清液过滤，滤液经浓缩、冷冻干燥，获得鱿鱼内脏活性肽粉。
以超顺磁四氧化三铁(Fe3O4)作为主要基质的磁性纳米粒子具有饱和磁化强度和超顺磁性等优良的磁学性能，同时具有颗粒粒径小、比表而积大、对菌体细胞毒性小和生物相容性好等优点，在生物过程领域已被用于细胞的固定化中。通过不同性质的成分修饰后，可增加Fe3O4纳米粒子与菌体细胞表面结合的亲和性，极大地提高固定化效率。由于纳米粒子个体微小，在与细胞表面结合后，不会像传统固定化方法(如：包埋法等)一样对菌体酶的分泌造成影响，避免了传统固定化方法的缺点。在进行完生物过程后，可在外加磁场的作用下容易地实现固定化细胞与反应液的分离，简化了回收的工序同时也提高了重复利用的效率。
使用脱气去离子水、脱气超纯水作为磁性纳米粒子的分散反应体系，可以有效避免水中含有空气可能导致的Fe3O4氧化，保留纳米粒子优异的磁性能。
现有技术中，尚未有通过修饰后的二氧化硅包被Fe3O4磁性纳米粒子固定化枯草芽孢杆菌细胞酶解蛋白制备活性肽技术的报道。本发明先制备出聚乙烯亚胺(PEI)修饰的二氧化硅包被Fe3O4纳米微球，再采用该磁性纳米微球固定化枯草芽孢杆菌细胞，以及利用固定化的细胞酶解鱿鱼内脏废弃物蛋白制备ACE抑制肽。为充分利用鱿鱼加工下脚料这一蛋白丰富的生物资源，固定化的细胞可以多次反复利用，避免传统固定化方法的缺点，高效率和低成本制备具有ACE抑制活性的提供了新的有效的方法。
优选的，包括如下步骤：
A、原料的预处理：所述鱿鱼内脏与所述去离子水按1g：1～2ml的比例混合，于90～100℃加热20～30min后，去除块状鱼骨，之后在破碎匀浆机中绞碎，然后置于浅盘中在80～90℃条件下干燥18～20小时，收集干燥后的块状粉末，于粉碎机中磨成细粉，过60～80目筛，获得所述鱿鱼内脏提取物细粉；
B、磁性纳米微球的制备：所述Fe3O4纳米微粒与所述乙醇按1g：200～300mL混合，超声波分散1～2小时；之后按体积比30～35:15～20:1～2加入所述脱气去离子水、所述氨水和所述硅酸四乙酯，所述Fe3O4纳米微粒与所述脱气去离子水的比例为1g：30～35ml，在40～45℃条件下搅拌反应8～10小时，用外加磁场分离，去离子水和乙醇交替清洗纳米颗粒3～5次，室温条件下在真空干燥，获得所述Fe3O4@SiO2；所述Fe3O4@SiO2与所述超纯水按1g：200～300mL混合，超声分散1～2小时，之后缓慢加入所述PEI，所述Fe3O4@SiO2与所述PEI的质量比为1:0.1～0.2，于30～35℃搅拌下反应6～10小时，用外加磁场分离，用去离子水清洗至pH中性，再次悬浮于去离子水中，超声分散后，于室温条件下在真空干燥，获得所述PEI-Fe3O4@SiO2纳米微球；
C、菌株活化与培养：取所述芽孢杆菌采用1％接种量接种于培养基，于37～40℃、200～250r/min摇床活化24～30小时；活化后的培养物按2％的接种量接种于培养基中，于37～40℃、120～150r/min摇床培养16～24小时，在转速8000～9000rpm、温度3～4℃离心收集细胞，用无菌生理盐水洗涤2～3次后备用，获得所述菌体细胞；
D、细胞的磁性纳米颗粒固定化：称取所述PEI-Fe3O4@SiO2纳米微球溶于20～25mMpH7.5的磷酸缓冲液中配制成0.2～0.3g/L的悬液，于30～35℃水浴中超声波分散5～10min；按细胞湿重与所述PEI-Fe3O4@SiO2纳米微球比例为0.5～2mg/mg，加入所述菌体细胞，在25～30℃摇床中120～150r/min吸附1～2小时；利用外加磁场分离，用灭菌的培养基清洗2～3遍，获得所述固定化细胞，于3～4℃保存待用；
E、鱿鱼内脏蛋白的酶解：所述鱿鱼内脏提取物细粉溶于蒸馏水配制成10～20g/L水溶液，调节pH至8.0～9.0，获得所述酶解液；按1L酶解液中加入1～5g所述固定化细胞，于40～50℃，120～150rpm搅拌条件下，酶解6～8小时，酶解过程中维持pH在8.0～9.0；酶解反应完后，用外加磁场分离所述固定化细胞，上清液于80～95℃条件下灭酶处理15～20min，获得酶解上清液；
F、鱿鱼内脏酶解肽的分离提取：所述酶解上清液经5000～5500rpm离心，去除未被酶解的成分，离心后上清液用截留分子量为1kDa的超滤膜过滤，滤液经低温减压浓缩后，冷冻干燥，获得所述鱿鱼内脏活性肽粉。
优选的，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌，使用前保藏于-20℃的甘油管中。
优选的，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌CMCC63501。
即可以理解为，本发明所述的方法中所使用的枯草芽孢杆菌菌株并不限于CMCC63501，即常规产生碱性蛋白酶、氨基肽酶能力的其他枯草芽孢杆菌菌株均可实现该技术方案。
优选的，步骤A中，采用共沉淀法制备所述Fe3O4纳米微粒。
优选的，所述共沉淀法包括：将21.6～25g六水合三氯化铁与8～10g四水合氯化亚铁溶解在100～120mL的去离子水中，在氮气的保护下逐渐升温至60～70℃，恒温搅拌3～4小时；然后加入浓度为25％的氨水80～85mL，升温至80～85℃反应2～3小时，停止搅拌冷却至室温，静置待上清液澄清；用外加磁场分离磁性微粒，采用去离子水清洗微粒至pH中性，然后用磁场分离微粒，重复三次，然后再用无水乙醇替代去离子水清洗两次；于室温条件下在真空干燥机中干燥，得到所述Fe3O4纳米微粒。
优选的，步骤E中，采用滴加2～2.5M氢氧化钠的方式维持和调节pH。
优选的，所述培养基包括：葡萄糖2～3g/L，酪蛋白0.5～1g/L，蛋白胨0.5～1g/L，吐温80 1～2g/L，氯化钠5～8g/L，磷酸氢二钾2～3g/L。
优选的，所述培养基的pH为7.5～8.0，使用前在121～125℃灭菌15～20分钟。
与现有技术相比较，实施本发明，具有如下有益效果：
1.本发明描述的利用鱿鱼内脏下脚料制备ACE抑制肽方法，采用预先对内脏进行处理，去除不溶性成分后干燥破碎制成细粉，在进行酶解反应时再根据需要配制成适当浓度的底物溶液，避免了新鲜鱿鱼内脏含水量高、不易贮藏、收集后需立即处理的缺点，提高了工艺的适用性和灵活度。
2.本发明描述的方法采用具备产碱性蛋白酶、氨基肽酶能力的枯草芽孢杆菌作为被固定化的细胞，由于菌体能够产生几种蛋白酶和肽酶，对底物蛋白的降解更彻底和完全，与酶解法中加入一种或两种的纯蛋白酶相比，有效地降低了过程的成本，提高了酶解效率。
3.本发明描述的方法采用固定化的方法将细胞固定在基质上，然后进行酶解过程(8小时)。与直接接种菌体到底物溶液的发酵法相比，过程的时间更短(发酵法需24h(浙江海洋大学学报,2018,37(01):50-54.))。此外，本发明的方法无需对底物溶液进行灭菌，避免了发酵法需进行底物溶液热灭菌，导致的料液中蛋白的破坏和损失。
4.本发明描述的方法采用制备Fe3O4磁性纳米粒子，然后通过反应制备二氧化硅包裹的Fe3O4纳米微球(Fe3O4@SiO2)，再采用PEI进行表面修饰制备PEI修饰的Fe3O4@SiO2纳米微球。通过修饰后的纳米磁性微球对细胞有良好的吸附效率，使得固定化的效率高和稳定性好。而通常使用的固定化介质如海藻酸钠、聚乙二醇和壳聚糖等材料存在传质阻力大，生物负载量小，稳定性差等缺点。采用磁性纳米粒子作为固定化载体具有颗粒粒径小，比表面积大，生物载量高的优点，并且容易分离，仅使用外加的磁场便能和酶解液分离。
5.本发明描述的利用磁性纳米粒子固定化的细胞，重复使用多次仍能保持较好的蛋白水解活性，具有节约成本，简化过程工艺，重复再利用效率高的特点。从实施例中的结果表明，固定化细胞重复使用8次，仍然能获得较好的蛋白水解度和ACE抑制活性。
6.本发明描述的方法制备鱿鱼内脏下脚料小分子多肽，具有酶解效率高和产物活性好的优点。所获得的分子量小于1KDa的多肽含量达91.05％，经超滤冻干得到肽粉ACE抑制活性达0.109mg/mL，抑制活性高于其他方法制备的鱿鱼内脏多肽(海洋与湖沼,2015,46(05):1175-1179，食品科技,2011,36(03):116-119)。
附图说明
图1为本申请磁性纳米微球固定化细胞与游离细胞酶解过程的水解度DH与ACE抑制活性图；
图2为本申请采用磁性微球固定化和采用海藻酸钠、聚乙二醇、壳聚糖固定化的效果对比图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。其中，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CMCC63501，根据保藏号，在公共保藏机构购得。
实施例1
本实施说明采用纳米磁性微球固定化细胞与游离细胞相比，制备鱿鱼内脏活性肽的方法及有益效果。
具体实施步骤如下：
第一步：鱿鱼内脏500g与500mL去离子水混合，于100℃加热30min后，去除块状鱼骨，加热后的浆液在破碎匀浆机中绞碎，然后置于浅盘中在80℃条件下干燥18小时，收集干燥后的块状粉末，于粉碎机中磨成细粉，过60目筛，得到鱿鱼内脏提取物细粉。
第二步：采用共沉淀法制备磁性四氧化三铁(Fe3O4)纳米微粒：将21.6g六水合三氯化铁与8g四水合氯化亚铁溶解在100mL的去离子水中，在氮气的保护下逐渐升温至60℃，恒温搅拌3小时。然后加入浓度为25％的氨水80mL，升温至80℃反应2小时，停止搅拌冷却至室温，静置待上清液澄清。用外加磁场分离磁性微粒，采用去离子水清洗微粒至pH中性，然后用磁场分离微粒，重复三次，然后再用无水乙醇替代去离子水清洗两次。于室温条件下在真空干燥机中干燥，得到磁性Fe3O4纳米微粒。
第三步：取1g Fe3O4纳米微粒与200mL乙醇混合，超声波分散1小时。然后加入30mL的脱气去离子水，20mL的氨水和2mL的硅酸四乙酯(TEOS)，在40℃条件下搅拌反应8小时，用外加磁场分离纳米课题，去离子水和乙醇交替清洗纳米颗粒3次，室温条件下在真空干燥，得到二氧化硅包裹的Fe3O4纳米微球(Fe3O4@SiO2)。取0.5g Fe3O4@SiO2与100mL超纯水混合，超声分散1小时，然后缓慢加入100mg分子量为10kDa的聚乙烯亚胺(PEI)，于30℃温和搅拌下反应10小时。用外加磁场分离磁性微球，用去离子水清洗至pH中性，再次悬浮于去离子水中，超声分散后，于室温条件下在真空干燥，得到PEI修饰的Fe3O4@SiO2纳米微球。
第四步：保藏于-20℃的甘油管菌株采用1％接种量接种于培养基，于37℃、200r/min摇床培养24小时。活化后的培养物按2％的接种量接种于培养基中，于37℃、120r/min摇床培养24小时，8000rpm、4℃离心收集细胞，用无菌生理盐水洗涤两次后备用。
第五步：称取制备的纳米微球溶于20mmol/L pH7.5的磷酸缓冲液中配制成0.2g/L的悬液，于30℃水浴中超声波分散5min。按细胞湿重与纳米微球比例为1.5mg/mg，加入离心洗涤后的菌体细胞，在25℃摇床中120r/min吸附2小时。利用外加磁场分离纳米微球，用灭菌的培养基清洗两遍，制备好的固定化细胞于4℃保存待用。
第六步：鱿鱼内脏提取物细粉溶于蒸馏水配制成20g/L水溶液，用2mol/L氢氧化钠调节pH至8.0。按1L酶解液中加入3g纳米微球固定化细胞，游离细胞对照试验中加入与固定化细胞等体积培养基培养获得的离心分离后的湿细胞。分别于45℃，120rpm搅拌条件下酶解，酶解过程中滴加2mol/L氢氧化钠以维持pH在8.0。每隔1小时取样测定ACE抑制活性和水解度DH％，结果如图1所示。
从图1可以看出，0-4小时，固定化细胞的水解度和游离细胞的较接近，ACE抑制活性略低于游离细胞；4-8小时后，固定化细胞的水解度显著高于游离细胞的处理，ACE活性也高于游离细胞。本结果表明，通过磁性微球固定后，细胞的蛋白水解活性未受到影响，甚至比使用游离细胞时蛋白水解活性更好，在水解后期获得的酶解产物获得了更高的ACE抑制活性。
第七步：采用酶解8小时的酶解液，用外加磁场分离纳米微球细胞，游离细胞处理中用离心分离游离细胞，上清液分别于95℃条件下灭酶处理15min。酶解上清液经5000rpm离心，去除未被酶解的成分，分别测定固定化细胞和游离细胞酶解上清液中多肽的分子量分布，结果如表1所示。
表1固定化细胞和游离细胞酶解上清液多肽的分子量分布
Figure BDA0002914134600000081
从表1可以看出，固定化细胞方法得到的酶解上清液中小于1KDa分子量的多肽组分高于采用游离细胞处理的酶解液，说明固定化细胞有利于得到分子量小于1KDa的小分子活性肽。
第八步：离心后上清液用截留分子量为1kDa的超滤膜过滤，滤液经低温减压浓缩后，冷冻干燥得到鱿鱼内脏活性肽粉。本实施例描述的方法得到的鱿鱼内脏活性肽粉有如下指标：
每100g鱿鱼内脏提取物干粉可得到活性肽粉12.63g，所制备活性肽粉的蛋白质含量(以干基计，N×6.25)92.35％，肽含量(以干基计)90.57％，IC50值达0.109mg/mL。
本实施例描述的方法过程中各项检测数据的检测方法如下：
1、ACE抑制活性采用高效液相色谱法(HPLC)法测定：
ACE酶溶于含有50mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)及300mmol/L NaCl缓冲溶液中至终浓度为0.1U/mL，底物马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)溶于含有50mmol/L HEPES及300mmol/L NaCl缓冲溶液中至终浓度为5mmol/L。反应体系总体积100μL，40μL反应缓冲液(50mmol/L HEPES及300mmol/L NaCl)和40μL待测样品混合后，于37℃下保温5min，然后依次加入10μL 5mmol/L底物HHL和10μL 0.1U/mL ACE，混匀后37℃下反应30min，加入250μL1mol/L HCl终止反应，采用HPLC法测定酶反应产生的HA。用蒸馏水替代样品作空白对照。HPLC检测条件：流动相组成：0.2％(v/v)TFA溶于含有23％(v/v)乙腈的水溶液中。流速为1mL/min，上样量10μL，检测波长为228nm，检测柱温为25℃。采用228nm检测时，反应产物HA和未反应完的底物HHL均有吸收峰，在本色谱条件下两吸收峰能很好地分离。IC50值定义为在测定条件下抑制50％ACE酶活所需抑制物的浓度。
2、水解度DH％采用邻苯二甲醛(OPA)法测定：
水解度(DH)根据邻苯二醛(OPA)法(Nielsen P M.Journal of Food Science,2010,66(5):642-646.)测定水解释放的α-氨基含量。α-氨基含量用标准曲线对应的丝氨酸浓度表示。以酶解样品测定的α-氨基含量与底物蛋白完全酸水解后测定的α-氨基含量的百分比表示水解度DH％。
3、活性肽的分子量分布采用高效体积排阻色谱注方法测定：
色谱柱:TSKgel G2000 SWXL 300mm×7.8mm凝胶柱，流动相组成：乙睛:水:三氟乙酸(体积比)＝40:59.95:0.05，检测波长：220nm，流速:0.5mL/min，柱温：30℃，进样体积：10μL。冷冻干燥的样品配制成0.2mg/mL的溶液，过0.22μm滤膜后上样，在上述色谱条件下进样分析。根据相对分子质量校正曲线方程对样品的色谱图及其数据进行计算处理，采用峰面积归一化法计算各相对分子质量范围内多肽的相对百分比之和。
4、细胞吸附率的测定
采用分光光度法测定菌悬液在600nm下的吸光度(OD600nm)表示菌体浓度。细胞吸附率＝(原始悬浮液中的细菌细胞的OD值-加入磁性微球吸附后悬浮液中的细菌细胞的OD值)/原始悬浮液中的细菌细胞的OD值。
5、蛋白质含量采用凯氏定氮法测定。
肽含量采用GB/T 22492-2008附录B的方法测定。
实施例2
具体实施步骤如下：
第一步：鱿鱼内脏500g与1000mL去离子水混合，于90℃加热20min后，去除块状鱼骨，加热后的浆液在破碎匀浆机中绞碎，然后置于浅盘中在90℃条件下干燥20小时，收集干燥后的块状粉末，于粉碎机中磨成细粉，过80目筛，得到鱿鱼内脏提取物细粉。
第二步：采用共沉淀法制备磁性四氧化三铁(Fe3O4)纳米微粒：将25g六水合三氯化铁与10g四水合氯化亚铁溶解在120mL的去离子水中，在氮气的保护下逐渐升温至60℃，恒温搅拌3小时。然后加入浓度为25％的氨水80mL，升温至80℃反应2小时，停止搅拌冷却至室温，静置待上清液澄清。用外加磁场分离磁性微粒，采用去离子水清洗微粒至pH中性，然后用磁场分离微粒，重复三次，然后再用无水乙醇替代去离子水清洗两次。于室温条件下在真空干燥机中干燥，得到磁性Fe3O4纳米微粒。
第三步：取1g Fe3O4纳米微粒与300mL乙醇混合，超声波分散2小时。然后加入35mL的脱气去离子水，15mL的氨水和1mL的硅酸四乙酯(TEOS)，在45℃条件下搅拌反应10小时，用外加磁场分离纳米课题，去离子水和乙醇交替清洗纳米颗粒5次，室温条件下在真空干燥，得到二氧化硅包裹的Fe3O4纳米微球(Fe3O4@SiO2)。取0.5g Fe3O4@SiO2与150mL超纯水混合，超声分散2小时，然后缓慢加入200mg分子量为10kDa的聚乙烯亚胺(PEI)，于35℃温和搅拌下反应6小时。用外加磁场分离磁性微球，用去离子水清洗至pH中性，再次悬浮于去离子水中，超声分散后，于室温条件下在真空干燥，得到PEI修饰的Fe3O4@SiO2纳米微球。
第四步：保藏于-20℃的甘油管菌株采用1％接种量接种于培养基，于40℃、250r/min摇床培养30小时。活化后的培养物按2％的接种量接种于培养基中，于40℃、120r/min摇床培养16小时，9000rpm、4℃离心收集细胞，用无菌生理盐水洗涤两次后备用。
第五步：称取制备的纳米微球溶于25mmol/L pH7.5的磷酸缓冲液中配制成0.3g/L的悬液，于35℃水浴中超声波分散10min。按细胞湿重与纳米微球比例为0.5mg/mg，加入离心洗涤后的菌体细胞，在30℃摇床中150r/min吸附1小时。利用外加磁场分离纳米微球，用灭菌的培养基清洗两遍，制备好的固定化细胞于3℃保存待用。
第六步：鱿鱼内脏提取物细粉溶于蒸馏水配制成10g/L水溶液，用2.5mol/L氢氧化钠调节pH至9.0。按1L酶解液中加入1g纳米微球固定化细胞，于50℃，150rpm搅拌条件下酶解，酶解过程中滴加2.5mol/L氢氧化钠以维持pH在9.0。
第七步：采用酶解8小时的酶解液，用外加磁场分离纳米微球细胞，上清液于80℃条件下灭酶处理20min。酶解上清液经5500rpm离心，去除未被酶解的成分。
第八步：离心后上清液用截留分子量为1kDa的超滤膜过滤，滤液经低温减压浓缩后，冷冻干燥得到鱿鱼内脏活性肽粉。本实施例描述的方法得到的鱿鱼内脏活性肽粉采用同实施例1的检测方法检测，有如下指标：
每100g鱿鱼内脏提取物干粉可得到活性肽粉12.56g，所制备活性肽粉的蛋白质含量(以干基计，N×6.25)91.36％，肽含量(以干基计)90.83％，IC50值达0.108mg/mL。
实施例3
本实施例分别采用磁性微球固定化和采用海藻酸钠、聚乙二醇、壳聚糖等常用介质固定化方法，研究对蛋白水解率、ACE抑制活性的影响。
磁性微球固定化同实施例1所述，采用海藻酸钠、聚乙二醇、壳聚糖等常用介质固定化参考文献(International Journal of Peptide Research and Therapeutics,25(2),681-689.)的方法实施，固定化后的细胞按照与实施1中描述的酶解过程相同的操作进行酶解8小时，采用同实施例1的检测方法取样测定蛋白水解率和ACE抑制活性，结果如图2所示。
从图2可以看出，采用磁性微球固定化后的蛋白水解度显著高于采用海藻酸钠、聚乙二醇、壳聚糖等常用介质的固定化，所得产物的ACE抑制活性也更好。本实施例的结果表明，本发明描述的磁性微球固定化比通常采用的固定化方法，蛋白水解效率好，产物的ACE抑制活性好。
实施例4
本实施例说明分别采用和不采用PEI修饰的Fe3O4纳米磁性微球对枯草芽孢杆菌细胞固定化的影响，进行对比。
采用Fe3O4纳米粒子、二氧化硅包裹的Fe3O4纳米微球(Fe3O4@SiO2)、PEI修饰的Fe3O4@SiO2纳米微球，如实施例1中所描述的方法进行细胞固定化，采用同实施例1的检测方法测定细胞在基质上的吸附率，结果如表2所示。
表2 PEI修饰对Fe3O4纳米磁性微球固定化的影响
细胞的吸附率％
Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub> 19.5
Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>@SiO<sub>2</sub> 43.4
PEI修饰的Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>@SiO<sub>2</sub> 92.3
从表2中可以看出，通过PEI的修饰后，磁性纳米微球对细胞的固定化效果显著提升，吸附率从原本的19.5％提升达到92.3％，表明本发明所采用的制备纳米磁性微球的方法能高效地固定化枯草芽孢杆菌细胞。
实施例5
本实施例说明重复利用纳米磁性微球固定化细胞连续批次制备鱿鱼内脏活性肽的方法和步骤，探究纳米磁性微球固定化细胞的重复利用性。
原料的预处理、磁性纳米微球的制备、菌株和活化与培养、细胞的磁性纳米颗粒固定化同实施例1。提取物细粉溶于水配制成20g/L pH8.0的溶液200mL，然后加入0.6g纳米微球固定化细胞，在45℃，120rpm搅拌条件下酶解8小时，酶解过程不断滴加2mol/L氢氧化钠维持pH 8.0。通过外加磁场分离纳米微球细胞与酶解液，酶解液测定水解度DH％和ACE抑制的IC50值。分离的纳米微球细胞加入到新配的20g/L pH8.0的提取物细粉溶液200mL，在45℃，120rpm搅拌条件下进行第二次酶解反应，依此重复8个批次。每次酶解液的水解度DH％和IC50值测定结果如表3。
表3固定化细胞重复利用连续酶解的结果
批次 水解度％ IC<sub>50</sub>mg/mL
1 40.9 0.136
2 39.5 0.212
3 41.9 0.163
4 42.6 0.195
5 41.9 0.135
6 39.5 0.126
7 39.6 0.138
8 40.4 0.135
表3的结果显示，固定化细胞重复利用8次，仍能保持稳定的蛋白水解活性，达到和初次使用时相近的水解度，酶解产物的ACE抑制活性也没有出现降低。表明在固定化细胞完成后，一次固定化可以适用于多次规模化的连续生产，并大大节约了成本。在菌株存在于固定化细胞中，鱿鱼内脏为原料，产酶和底物蛋白水解同步发生、互相促进，蛋白水解率得到大幅度提升，获得更多高活性的ACE抑制肽。
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (7)

1.一种利用磁性纳米粒子固定化细胞酶解鱿鱼内脏制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、原料的预处理：鱿鱼内脏与去离子水混合加热，去除块状鱼骨，绞碎、干燥、粉碎，获得鱿鱼内脏提取物细粉；
B、磁性纳米微球的制备：Fe3O4纳米微粒与乙醇混合，分散；之后加入脱气去离子水、氨水和硅酸四乙酯反应，用外加磁场分离，清洗、干燥，获得二氧化硅包裹的Fe3O4纳米微球，即Fe3O4@SiO2；所述 Fe3O4@SiO2与脱气超纯水混合、分散，之后缓慢加入PEI，搅拌反应，用外加磁场分离，清洗、干燥，获得PEI修饰的Fe3O4@SiO2纳米微球，即PEI-Fe3O4@SiO2纳米微球；
C、菌株活化与培养：取芽孢杆菌进行摇床活化与培养，离心收集细胞，洗涤后获得菌体细胞；
D、细胞的磁性纳米颗粒固定化：所述PEI-Fe3O4@SiO2纳米微球溶于磷酸缓冲液中配制成悬液，分散加入所述菌体细胞，在摇床中吸附，利用外加磁场分离，清洗后获得固定化细胞；
E、鱿鱼内脏蛋白的酶解：所述鱿鱼内脏提取物细粉溶于蒸馏水，获得底物溶液，再加入所述固定化细胞进行酶解，酶解反应完后，用外加磁场分离所述固定化细胞，上清液进行灭酶处理，获得酶解上清液；
F、鱿鱼内脏酶解肽的分离提取：酶解上清液经过离心，去除未被酶解的成分，离心后上清液过滤，滤液经浓缩、冷冻干燥，获得鱿鱼内脏活性肽粉；
具体包括如下步骤：
A、原料的预处理：所述鱿鱼内脏与所述去离子水按1g：1~2ml的比例混合，于90~100℃加热20~30min后，去除块状鱼骨，之后在破碎匀浆机中绞碎，然后置于浅盘中在80~90℃条件下干燥18~20小时，收集干燥后的块状粉末，于粉碎机中磨成细粉，过60~80目筛，获得所述鱿鱼内脏提取物细粉；
B、磁性纳米微球的制备：所述Fe3O4纳米微粒与所述乙醇按1g：200~300mL混合，超声波分散1~2小时；之后按体积比30~35:15~20:1~2加入所述脱气去离子水、所述氨水和所述硅酸四乙酯，所述Fe3O4纳米微粒与所述脱气去离子水的比例为1g：30~35ml，在40~45℃条件下搅拌反应8~10小时，用外加磁场分离，去离子水和乙醇交替清洗纳米颗粒3~5次，室温条件下在真空干燥，获得所述Fe3O4@SiO2；所述 Fe3O4@SiO2与所述超纯水按1g：200~300mL混合，超声分散1~2小时，之后缓慢加入所述PEI ，所述 Fe3O4@SiO2与所述PEI的质量比为1:0.2 ~0.4，于30~35℃搅拌下反应6~10小时，用外加磁场分离，用去离子水清洗至pH中性，再次悬浮于去离子水中，超声分散后，于室温条件下在真空干燥，获得所述PEI-Fe3O4@SiO2纳米微球；
C、菌株活化与培养：取所述芽孢杆菌采用1%接种量接种于培养基，于37~40℃、200~250r/min摇床活化24~30小时；活化后的培养物按2%的接种量接种于培养基中，于37~40℃、120~150 r/min摇床培养16~24小时，在转速8000 ~9000rpm、温度3~4℃离心收集细胞，用无菌生理盐水洗涤2~3次后备用，获得所述菌体细胞；
D、细胞的磁性纳米颗粒固定化：称取所述PEI-Fe3O4@SiO2纳米微球溶于20 ~25mMpH7.5 的磷酸缓冲液中配制成 0.2 ~0.3g/L的悬液，于30~35℃水浴中超声波分散5~10min；按细胞湿重与所述PEI-Fe3O4@SiO2纳米微球比例为0.5~2 mg/mg，加入所述菌体细胞，在25~30℃摇床中120~150 r/min 吸附1~2小时；利用外加磁场分离，用灭菌的培养基清洗2~3遍，获得所述固定化细胞，于3~4℃保存待用；
E、鱿鱼内脏蛋白的酶解：所述鱿鱼内脏提取物细粉溶于蒸馏水配制成10~20g/L水溶液，调节pH 至8.0~9.0，获得酶解液；按1L 酶解液中加入1~5 g 所述固定化细胞，于40~50℃，120~150rpm搅拌条件下，酶解6~8小时，酶解过程中维持pH 在8.0~9.0；酶解反应完后，用外加磁场分离所述固定化细胞，上清液于80~95℃条件下灭酶处理15~20min，获得酶解上清液；
F、鱿鱼内脏酶解肽的分离提取：所述酶解上清液经5000~5500rpm 离心，去除未被酶解的成分，离心后上清液用截留分子量为1 kDa的超滤膜过滤，滤液经低温减压浓缩后，冷冻干燥，获得所述鱿鱼内脏活性肽粉；
所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌CMCC63501。
2.根据权利要求1所述利用磁性纳米粒子固定化细胞酶解鱿鱼内脏制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，所述芽孢杆菌使用前保藏于-20℃的甘油管中。
3.根据权利要求1所述利用磁性纳米粒子固定化细胞酶解鱿鱼内脏制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，步骤B中，采用共沉淀法制备所述Fe3O4纳米微粒。
4.根据权利要求3所述利用磁性纳米粒子固定化细胞酶解鱿鱼内脏制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，所述共沉淀法包括：将21.6~25g六水合三氯化铁与8~10g四水合氯化亚铁溶解在100~120mL的去离子水中，在氮气的保护下逐渐升温至60~70℃，恒温搅拌3~4小时；然后加入浓度为25% 的氨水80~85mL，升温至80~85℃反应2~3小时，停止搅拌冷却至室温，静置待上清液澄清；用外加磁场分离磁性微粒，采用去离子水清洗微粒至pH中性，然后用磁场分离微粒，重复三次，然后再用无水乙醇替代去离子水清洗两次；于室温条件下在真空干燥机中干燥，得到所述Fe3O4纳米微粒。
5.根据权利要求1所述利用磁性纳米粒子固定化细胞酶解鱿鱼内脏制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，步骤E中，采用滴加2~2.5M 氢氧化钠的方式维持和调节pH。
6.根据权利要求1所述利用磁性纳米粒子固定化细胞酶解鱿鱼内脏制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，所述培养基包括：葡萄糖2~3g/L，酪蛋白0.5 ~1g/L，蛋白胨0.5~1 g/L，吐温80 1~2g/L，氯化钠5~8g/L，磷酸氢二钾2~3g/L。
7.根据权利要求1所述利用磁性纳米粒子固定化细胞酶解鱿鱼内脏制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，所述培养基的pH为7.5~8.0，使用前在121~125℃灭菌15~20分钟。
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