CN112586599A - 一种制备花生粕的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备花生粕的方法，属于动物饲料和生物工程的技术领域。以花生粕为主要原料，利用酶解与微生物发酵结合的方法，制备花生粕。制备得到的花生粕的精氨酸含量得到降低，有效平衡氨基酸的含量，并且产生多种酶类、功能性多肽、乳酸及乳酸盐等有益代谢产物，解决了花生粕氨基酸不平衡、适口性差、大分子蛋白多、消化率低等引起的营养价值不高的问题。同时还能提高花生粕的综合抗氧化性能，使得花生粕中的DPPH、羟自由基和超氧阴离子清除率以及铁还原力均得到提升，提高了花生粕利用价值，有利于减少动物体内自由基，提高动物体免疫力，提高饲料性价比和畜禽养殖效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备花生粕的方法，属于动物饲料和生物工程的技术领域。
背景技术
花生粕是花生经热榨脱油后的副产物，具有丰富的营养物质，其中蛋白质含量高达40％-50％，氨基酸种类齐全，是一种潜在的优质蛋白饲料。尽管花生粕具有较高的蛋白质含量，但氨基酸不平衡问题仍限制了其在动物养殖中的高效利用，如花生粕中精氨酸和赖氨酸比例高达3.45，精氨酸的过量摄入导致动物体内氨基酸拮抗作用的产生，抑制了动物限制性氨基酸(赖氨酸)的吸收，使其从尿液中大量流失，阻碍了动物的正常生长繁殖。与优质的蛋白饲料原料鱼粉和豆粕相比，花生粕的精氨酸与赖氨酸比例极度不平衡，且蛋氨酸含量过低，这是导致其蛋白质品质不佳的重要因素。花生粕多为大分子蛋白，小肽、氨基酸等易被消化吸收的物质含量少，造成其消化率低。
目前对于花生粕的研究主要集中在去除黄曲霉毒素、降低非淀粉多糖等方面，针对氨基酸不平衡方面未有解决方案。常用的饲料品质改善的生物技术处理方法有酶解法和微生物发酵法。前者是通过添加复合酶制剂，将大分子难吸收物质水解为小分子易吸收物质，后者则是通过微生物自身代谢的各种酶类对饲料进行酶解消化作用，但是两者都存在一定的弊端，如酶解过程会产生苦味物质、影响饲料适口性，而单一的微生物发酵，则蛋白酶分泌量少，酶解效率较低，无法满足生产需求。与两者不同的是，菌酶协同发酵过程中有益微生物如乳酸菌、酵母菌等会产生特殊的香味物质，其能够调和饲料中苦味物质，改善饲料的适口性；同时克服利用微生物单独发酵产酶不足的问题。此方法虽然能一定程度上降解饲料饼粕中的抗营养因子和有毒物质、提高饲料中营养物质，但是由于酶本身也是一种蛋白质，因此很容易被微生物产生的某些酶类分解，存在很大程度的损失。目前的研究虽然一定程度上提高了动物限制性氨基酸(如赖氨酸、蛋氨酸)所占百分比，但是并没有降低花生粕中过高的精氨酸含量，氨基酸拮抗反应仍然影响着家畜的正常生长代谢。
此外，饲料中一般还会添加人工合成的抗氧化剂，如乙氧基喹啉(EMQ)、二叔丁基羟基甲苯(BHT)、叔丁基羟基茴香醚(BHA)等，来增强动物的抗氧化性能，然而，这些人工合成的饲料抗氧化剂存在安全评估问题，有研究表明，高剂量乙氧基喹啉会导致生长育肥猪肝细胞损伤，长期饲喂鱼类EMQ甚至会使鱼体抗病能力降低。此外，由于BHT对机体的肝、脾、肺等均有不利影响。因此，寻找安全可靠的天然抗氧化剂具有十分重要的意义。
发明内容
抗氧化剂的添加增加了饲料成本，因此，制备一种具有氨基酸平衡和高抗氧化性的蛋白饲料具有重要意义。
针对现有的技术难点及存在的问题，本发明提供了一种先酶解后发酵的生物处理技术处理花生粕，利用酶解技术释放小分子肽和游离氨基酸，通过乳酸菌有效降解过量精氨酸的同时，将其他氨基酸转化为蛋氨酸、赖氨酸等动物限制性氨基酸，达到平衡花生粕氨基酸比例的目的，同时，促进乳酸及乳酸盐等有益代谢产物的积累，并提高饲料的天然高抗氧化性能，进而减少饲养成本、改善饲料品质、提高饲料营养价值、提高动物抗病能力。
本发明的目的是通过蛋白酶酶解结合短乳杆菌半固态发酵，提供一种平衡花生粕氨基酸的工艺方法。
本发明提供了一种制备花生粕的方法，将花生粕经酶解后，再利用短乳杆菌(Lactobacillus breris)发酵。
在本发明的一种实施方式中，所述酶解为先用纤维素酶和植酸酶酶解，再利用酸性蛋白酶酶解得到酶解液。
在本发明的一种实施方式中，所述底物质量分数为3-5％。
在本发明的一种实施方式中，所述酸性蛋白酶的酶活为2900-3200U/g底物，
在本发明的一种实施方式中，酶解温度为50-60℃。
在本发明的一种实施方式中，在pH 2.5-3.0下酶解4-6h。
在本发明的一种实施方式中，将酶解液利用短乳杆菌发酵40-50h。
在本发明的一种实施方式中，所述短乳杆菌为短乳杆菌CCTCC NO:M 2017140。
在本发明的一种实施方式中，将OD600为0.6-1.0的短乳杆菌菌液。
本发明提供了所述方法在制备花生粕中的应用。
有益效果：
(1)本发明所述工艺方法以蛋白酶酶解结合短乳杆菌半固态发酵的方式，先利用蛋白酶降解花生粕中难以被乳酸菌快速吸收利用的大分子蛋白，使之转化为小肽、游离氨基酸等易于消化吸收的小分子蛋白，极小部分营养物质被乳酸菌利用，大部分有机氮源仍然残留于酶解产物中，乳酸菌生长繁殖后高效吸收利用游离出的精氨酸，降低花生粕精氨酸含量，在平衡氨基酸的同时，产生多种酶类、功能性多肽、乳酸及乳酸盐等有益代谢产物。针对性地解决了花生粕氨基酸不平衡、适口性差、大分子蛋白多、消化率低等引起的营养价值不高的问题，同时还能提高花生粕的综合抗氧化性能。
(2)本发明方法使得花生粕粗蛋白含量由46.4％提高至50.6％，酸溶蛋白含量由2.3％提高至17.8％，酸溶蛋白占粗蛋白含量由5.9％提高至40.5％，肽转化率由5.9％提高至44.2％，大分子蛋白明显降解为小分子蛋白，精氨酸降解率为18.9％，蛋氨酸和赖氨酸含量分别提高了80.0％、42.9％，精氨酸与赖氨酸的含量比由3.8下降到2.2。花生粕作为植物源性蛋白饲料，整体蛋白品质得到极大改善。
(3)本发明方法使得花生粕的总酸含量由0.6％提高到4.7％，其中乳酸含量由0.9mg/g提高到14.6mg/g，乙酸含量由1.2mg/g提高到14.4mg/g，柠檬酸含量由1.4mg/g提高到12.8mg/g。复合有机酸含量的增加不仅能够抑制饲料中有害微生物的繁殖，还能够改善饲料的适口性。
(4)本发明方法使得花生粕的综合抗氧化性得到提高，对DPPH的清除率由87.4％提高至98.7％，对羟自由基的清除率由30.3％提高至83.3％，对超氧阴离子的清除率由81.3％提高至87.9％，对脂质体过氧化的抑制率由37.0％提高至40.5％，对铁还原力由1.4提高至2.8。以不同浓度维生素C同法制作DPPH、羟自由基和超氧阴离子清除率以及铁还原力的标准曲线，计算出经菌酶协同处理的花生粕，每克干物质的抗氧化能力分别相当于0.9、171.6、5.0和145.1mg维生素C。
具体实施方式
1、下述实施例中所用的菌株为短乳杆菌CCTCC NO:M 2017140，公开于公开号为CN106978371B的专利文献中。
2、MRS固体培养基：10g蛋白胨，5g酵母浸膏，10g牛肉浸膏，20g无水葡萄糖，5g无水乙酸钠，1mL吐温80，2g柠檬酸铵，2g三水合磷酸氢二钾，0.58g七水合硫酸镁，0.25g一水合硫酸锰，20g琼脂，定容至1L，pH调至5.0，加热溶解后，115℃蒸汽灭菌20min，倾倒平板。
3、种子培养基和扩大培养基组分均为：10g蛋白胨，5g酵母浸膏，10g牛肉浸膏，20g无水葡萄糖，5g无水乙酸钠，1mL吐温80，2g柠檬酸铵，2g三水合磷酸氢二钾，0.58g七水合硫酸镁，0.25g一水合硫酸锰，定容至1L，pH调至5.0，115℃蒸汽灭菌20min。
4、粗蛋白含量的测定：按照GB 5009.5-2016方法测定粗蛋白含量。
5、酸溶蛋白含量测定：按照GB/T 22492-2008方法测定酸溶蛋白含量。
6、肽含量测定：肽含量(g/100g)＝酸溶蛋白含量-游离氨基酸含量。
7、肽分子量测定：按照GB/T 22492-2008方法测定肽的相对分子质量分布。
8、精氨酸、赖氨酸、蛋氨酸含量测定：按照GB 5009.124-2016方法测定游离及水解氨基酸组成。
9、DPPH测定：将样品液稀释，取2mL稀释液加入2mL 0.2mmol/L的DPPH-无水乙醇溶液中，混合均匀，黑暗处放置30min，517nm处测定吸光值A0，2mL样品稀释液与2mL 95％乙醇水溶液混合，测定吸光值为A1，2mL 95％的乙醇与2mL DPPH-乙醇溶液混合，测定吸光值为A2。DPPH清除率按照下式计算：
10、羟自由基测定：
取1.00g冻干样品，加入20mL蒸馏水振荡1h，5000×g、4℃离心10min，样液适当稀释，取1mL样液、1mL硫酸亚铁溶液(9mmol/L，用前稀释)、1mL 0.30％H2O2溶液、1mL水杨酸-乙醇溶液(9mmol/L，用前稀释)混合，37℃静置0.5h，测定OD510为A样；将样液换成蒸馏水，其他条件不变，测定OD510为A空；样液、硫酸亚铁、水杨酸添加量不变，不加显色剂H2O2，测定OD510为A。清除率计算公式如下：
11、超氧阴离子清除率测定：
取2950μL Tris-HCL缓冲液(50mmol/L，pH8.20)于石英比色皿中，加入50μL邻苯三酚溶液(30mmol/L)，颠倒混合，计时5min，每隔30s读数一次A值(325nm)，作为空白对照。△A空＝A325nm300s-A325nm30s。样品溶液：取500μL样液与2450μL Tris-HCL缓冲液于比色皿，再加入50μL邻苯三酚溶液，混匀，计时5min，每隔30s读数一次A值，为样品组，△A样＝A325nm300s-A325nm30s。计算公式：
12、铁离子还原力测定：
分别取1.00g冷冻干燥后的花生粕样品，加入10mL水于摇床(100r/min)振荡1h以上，然后于5000×g、4℃离心10min，取1mL上清样品与2.5mL的磷酸缓冲液混合(0.2mol/L，pH6.6混合)，再加入1％铁氰化钾2.5mL。混合物于50℃恒温20min，迅速冷却，再加2.5mL10％三氯乙酸，3000×g离心分离10min，取上层清液2.5mL加蒸馏水2.5mL和0.1％三氯化铁0.5mL，反应10min，测A700。以试剂空白(蒸馏水作对照)。吸光度越高，说明反应混合物的还原性越强。所有测定重复3次。
13、脂质体过氧化抑制率测定：
取0.38g卵磷脂，100mL PBS缓冲液(0.1mol/L，pH7.40)冰浴搅拌，制备成乳白色悬浊液。取0.2mL卵黄悬液、1mL样品液、1mL FeSO4·7H2O溶液(20mmol/L)，PBS补足3mL；空白管将样品液替换为缓冲液，其他条件不变。溶液混合均匀后置于37℃水浴1h，取出后加入2mLTCA-TBA-HCL混合液，混匀，95℃水浴15min，迅速冷却，3000×g离心10min，取上清，于532nm波长处测定吸光值A样和空白吸光值A空。
14、复合有机酸测定：
取1.00g处理后的花生粕样品于50mL离心管，加入10mL蒸馏水于摇床200r/min震荡1h，4000×g、4℃离心15min取上清，再于10000×g离心5min，上清液经0.22μm滤膜过滤后置于液相瓶中用于下一步实验。色谱柱条件：Angilent TC-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：A(甲醇)，B(0.01mol/L KH2PO4溶液，pH2.85)；流速：0.8mL/min；检测波长：215nm；温度：20℃；进样量：20μL。根据出峰时间和峰面积和标准品(乳酸、乙酸、柠檬酸)比对，计算样品中各种有机酸的含量。
实施例1
(1)花生粕酶解液的制备
花生粕(花生粕完全粉碎过40目筛)与水按1:5(w/w)的比例混合，先分别加入0.1％的纤维素酶(购自白银赛诺生物科技有限公司)和植酸酶(由武汉新华扬生物股份有限公司提供)，50℃酶解1h，沸水浴灭酶10min，补足蒸馏水至250mL，再以酸性蛋白酶(由潍坊康地恩生物科技有限公司提供)，进行二次酶解，灭酶后，调节pH为5.5。
二次酶解条件优化，改变酸性蛋白酶酶解花生粕的条件，考察花生粕蛋白水解度的影响，具体为分别改变底物酶活、底物质量分数、酶解温度、酶解pH和酶解时间：
①底物质量分数为5％、酶解温度50℃，pH 3.0，时间4h，酶的添加量分别为290、580、870、1160、1450、1740、2030、2320、2610、2900、3200、3490、3780、4070、4360U/g底物，水解度分别为7.8％、9.8％、11.7％、13.1％、14.0％、15.8％、16.6％、16.9％、17.7％、18.2％、19.3％、18.0％、18.9％、18.4％、18.2％；
②酶的添加量为3200U/g底物，酶解温度50℃，pH 3.0，时间4h，底物质量分数分别为1％、3％、5％、7％、9％、11％、13％、15％、17％、19％、21％，水解度为17.8％、21.7％、22.9％、19.3％、21.4％、19.8％、19.7％、18.7％、16.7％、17.1％、16.3；
③酶的添加量为3200U/g底物，底物质量分数5％，酶解温度50℃、时间4h，酶解pH分别为2、2.5、3、3.5、4、4.5，水解度为18.3％、19.6％、20.9％、18.7％、17.2％、16.1％；
④酶的添加量为3200U/g底物、底物质量分数5％，pH 3.0、时间4h，酶解温度30、35、40、45、50、55、60℃，水解度为14.6％、15.7％、17.6％、18.7％、21.6％、22.0％、20.5％；
⑤酶的添加量为3200U/g底物，底物质量分数5％、酶解温度50℃、pH 3.0，酶解时间分别为1、2、3、4、5、6h，水解度分别为15.4％、17.6％、19.2％、20.9％、21.0％、21.2％。
从节能、环保、减成本考虑，最终选择酶解条件为酶的添加量为3200U/g底物、底物质量分数5％、酶解温度50℃、酶解pH 3.0和酶解时间4h。
(2)取步骤(1)制备的花生粕酶解液转移至500mL锥形瓶，121℃灭菌20min，冷却。
(3)短乳杆菌划线MRS固体平板培养基，37℃倒置培养12h，挑取单菌落于MRS种子培养基，37℃静置培养12h，再以2mL/100mL接种量接种到液体扩大培养基，37℃静置12h，作为发酵接种液。
(4)将步骤(3)中的发酵接种液(OD600为0.8)以5mL/100mL的接种量接种到步骤(2)中的冷却酶解液中，37℃静置发酵48h(每隔12h摇晃一次)。
(5)发酵结束后，将发酵好的花生粕冷冻干燥48h，粉碎，过40目筛，对发酵前后的花生粕进行各项成分测定。
具体结果见表1和表2，按照上述实例中微生物半固态发酵法制备的花生粕与未发酵的花生粕相比，营养特性与功能特性得到显著改善。首先，在蛋白酶的催化下，花生粕中大分子蛋白质降解为小分子的肽或是游离氨基酸，而经过乳酸菌发酵后的产物中含有挥发性酸和其他挥发物质，这些物质挥发，使花生粕蛋白得到一定浓缩作用，从而使粗蛋白含量由46.4％提高至50.1％，酸溶蛋白含量由2.4g/100g提高至17.8g/100g，相比于原始花生粕提高了15.4g/100g，大分子蛋白明显降解为小分子蛋白，肽分子量分布逐渐由5kDa以上的多肽转变为1kDa以下的小肽，小肽含量由原来的53.22％提高至70.72％。多肽由原来的1.6g/100g提高至15.7g/100g，精氨酸含量下降至4.3％，赖氨酸、蛋氨酸含量分别提高了42.9％、80.0％，精氨酸与赖氨酸的比降低至2.2，花生粕氨基酸不平衡问题得到明显缓解。其次，本发明利用先酶解后发酵的工艺方法，不仅提高了花生粕蛋白的水解度，而且去除了酶解过程产生的苦味肽的不良影响，乳酸菌发酵使得总酸含量由0.6％提高至4.7％，复合有机酸(如乳酸、乙酸、柠檬酸)含量均得到提升，一方面能够产生芳香气味，改善饲料适口性，另一方面降低动物肠道pH、抑制有害菌的生长、提高消化酶活性。
此外，按照上述实例中微生物半固态发酵法制备的花生粕与未发酵的花生粕相比，抗氧化效果显著改善。与未处理花生粕相比，菌酶协同处理后的花生粕对DPPH、羟自由基和超氧阴离子的清除率分别提高了12.9％、271.6％和8.1％，对铁离子的还原力提高了96.6％，对脂质体过氧化的抑制率提高了9.5％。经菌酶协同处理的花生粕，每克干物质对于DPPH、羟自由基、超氧阴离子的抗氧化能力分别相当于0.9、171.6和5.0mg维生素C，对于铁离子的还原力相当于145.1mg维生素C。其中，每克菌酶协同处理后的花生粕对羟自由基的清除率最强，比未处理的花生粕提高了2.6倍。
表1处理前后花生粕的性质
表2处理前后花生粕中有机酸的含量
| 乳酸含量(g/100g) | 乙酸含量(g/100g) | 柠檬酸含量(g/100g) | |
| 未处理 | 0.9 | 1.2 | 1.5 |
| 菌酶处理 | 14.6 | 14.4 | 12.8 |
对比例1
具体实施方式参见实施例1，区别在于，对花生粕仅进行酶解作用，制备得到的花生粕中粗蛋白含量为43.7％，酸溶蛋白含量为13.1％，酸溶蛋白占粗蛋白含量为30.0％，多肽含量达到11.1％，小于1kDa分子量的肽含量为61.6％。精氨酸含量未下降，蛋氨酸含量未增加，赖氨酸含量增加至1.5％，精氨酸与赖氨酸比例从3.8降低至3.5，总酸含量为1.9％，其中乳酸含量达到1.3mg/g，乙酸含量达到1.1mg/g，柠檬酸含量达到1.6mg/g。对DPPH、羟自由基和超氧阴离子的清除率分别为98.5％、59.3％和82.7％，对铁离子还原力为2.4，对脂质体过氧化抑制率为29.3％。
对比例2
具体实施方式参见实施例1，区别在于，对花生粕仅进行发酵作用，制备得到的花生粕结果是粗蛋白含量为48.8％，酸溶蛋白含量为10.9％，酸溶蛋白占粗蛋白含量为22.3％，多肽含量达到10.3％，小于1kDa分子量的肽含量为49.3％。精氨酸含量降低至5.1％，蛋氨酸含量增加至0.6％，赖氨酸含量增加至1.6％，精氨酸与赖氨酸比例从3.8降低至3.3，总酸含量为1.5％，其中乳酸含量达到1.6mg/g，乙酸含量达到4.8mg/g，柠檬酸含量达到6.6mg/g。对DPPH、羟自由基和超氧阴离子的清除率分别为78.9％、51.0％和83.3％，对铁离子还原力为1.9，对脂质体过氧化抑制率为37.7％。
对比例3
具体实施方式参见实施例1，区别在于，对花生粕仅进行不同种类酶的酶解作用，利用八种蛋白酶(酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶)对花生粕进行酶解预处理，这八种蛋白酶水解度分别为10.2％、6.5％、7.2％、7.0％、3.3％、4.6％、5.8％、5.5％，几种蛋白酶对花生粕的酶解能力为酸性蛋白酶＞中性蛋白酶＞胰蛋白酶＞碱性蛋白酶＞风味蛋白酶＞复合蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞胃蛋白酶；比较酶解产物气味，酸性蛋白酶酶解产物气味甘甜、芳香，碱性蛋白酶、胰蛋白酶酶解产物气味苦涩，中性蛋白酶酶解产物味臭。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种制备花生粕的方法，其特征在于，将花生粕经酶解后，再利用短乳杆菌(Lactobacillus breris)发酵。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解为先用纤维素酶和植酸酶酶解，再利用酸性蛋白酶酶解得到酶解液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述底物质量分数为3-11％。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述酸性蛋白酶的酶的添加量为2900-4360U/g底物。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，酶解温度为50-60℃。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在pH2.5-3.0下酶解4-6h。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将酶解液利用短乳杆菌发酵40-50h。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述短乳杆菌为短乳杆菌CCTCC NO:M2017140。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将OD600为0.6-1.0的短乳杆菌菌液。
10.权利要求1-9任一所述方法在制备花生粕中的应用。
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