CN108588153A - 一种氨基酸型表面活性剂的酶催化制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出的氨基酸型表面活性剂的酶催化制备方法，包括以下步骤：第一步：制备200～600nm磁性壳聚糖微球；第二步：以磁性壳聚糖微球为载体固化木瓜蛋白酶，获得固定化酶；第三步：以固定化酶为催化剂，催化月桂酰谷氨酸和赖氨酸缩合形成肽键，合成肽类双分子亲油亲水表面活性剂。该制备方法具有如下优点：(1)采用离子凝胶法制备得到磁性壳聚糖微球，使用壳聚糖包裹磁性微球，成本较低，反应温和，能够较大程度保持酶活，酶活在60％～99％，也利于提高酶活回收率；(2)以磁性壳聚糖微球作为载体，戊二醛为交联剂，固化木瓜蛋白酶，合成的固定化酶具有立体专一性和高效催化活性；(3)以固定化酶催化合成Pecllicer LB‑10的反应条件温和；纯化较简单，便于工业化生产。

Description

一种氨基酸型表面活性剂的酶催化制备方法
技术领域
本发明涉及表面活性剂的制备方法，具体涉及一种氨基酸型表面活性剂的酶催化制备方法。
背景技术
氨基酸型表面活性剂作为一种生物表面活性剂，由于其原料价格便宜，毒 性低，生物降解性好、生态相容性高，抗菌以及抗蚀、抗疾病等性能，因此， 它在食品、化工产品以及医疗等领域得到广泛的应用。
肽类双分子亲油亲水表面活性剂(Pellicer LB-10)由日本旭化成公司首次研发，并在日本高端化妆品市场开始应用，作为一种新型的氨基酸型表面活性剂， 其特点是在不改变基础配方的前提下改善肤感，易铺展，渗透快，该产品更重 要的是具有低刺激性、低毒性、柔和性、抗菌性、缓蚀防锈性、生物降解性及 对人体较好的亲和性，另外，很多研究表明该产品在防止过敏性皮肤病和一直 黑色素褐斑方面也表现出很好的药用价值。
到目前为止该类表面活性剂作为一种新颖的美容原料以每年23％左右的增 长率快速增长，市场需求不断扩大。在美国、韩国等国家更以每年35％左右的 增长率迅速发展。Pellicer LB-10的分子式如下：
Pellicer LB-10化学式
木瓜蛋白酶(Papain)是一种重要的植物来源蛋白酶，应用范围非常广泛。 它不仅能够催化蛋白质的水解，在特定条件下还具有酰胺酶活力、酯酶活力、 转氨酶活力、转酯酶活力和海因酶活力等诸多活性。木瓜蛋白酶能水解抗体制 备Fab片段，合成肽、酯氨基酸类表面活性剂，已广泛应用于食品、生物、化 工、洗涤剂、医药、化妆品等领域。目前，磁性纳米颗粒载体固定化酶因具有 超顺磁性，较大比表面积，外加磁场易分离等优点备受关注。
目前国内对于肽类双分子亲油亲水表面活性剂(Pellicer LB-10)还处于研发 阶段，其生产主要集中在日本和欧美一些发达国家，生产方法主要是利用化学 合成法，原料主要为月桂酰谷氨酸和赖氨酸，采用缩合剂完成肽链的构建，合 成Pellicer LB-10，但该法的主要缺点是反应的区域选择性较差、产率低、后期 纯化处理繁琐，污染环境、耗能高、合成的产品颜色较深、产品纯度低等。
因此，需要亟待开发一种绿色环保、便于工业生产的Pellicer LB-10制备工 艺。
发明内容
本发明的目的在于提供一种氨基酸型表面活性剂的制备方法，包括木瓜蛋 白酶的固化以及酶催化制备肽类双分子亲油亲水表面活性剂Pellicer LB-10的方 法，具有成本低、酶活高、催化效果好且绿色环保的优点。
为实现上述目的，本发明提出的氨基酸型表面活性剂的酶催化制备方法， 包括以下步骤：
第一步：制备200～600nm磁性壳聚糖微球；
第二步：以磁性壳聚糖微球为载体固化木瓜蛋白酶，获得固定化酶；
第三步：以固定化酶为催化剂，催化月桂酰谷氨酸和赖氨酸缩合形成肽键， 合成肽类双分子亲油亲水表面活性剂，反应方程式如下：
优选地，在所述氨基酸型表面活性剂的酶催化制备方法中，在第一步中， 制备磁性壳聚糖微球包括以下步骤：
步骤一：以体积分数为1％的醋酸溶液溶解壳聚糖，配置成浓度为4mg/mL 的壳聚糖溶液，并用2mol/L的NaOH溶液将壳聚糖溶液PH调节为4.5；
步骤二：取粒径140nm的Fe3O4 50mg超声分散于2mg/mL的三聚磷酸钠溶 液中；
步骤三：将步骤二中已分散有Fe3O4的三聚磷酸钠溶液中逐滴加入至壳聚糖 溶液中，并保持搅拌至形成凝胶微球；壳聚糖溶液和三聚磷酸钠的体积比为 1:1～3:1；
步骤四：用磁铁对凝胶微球进行收集、洗涤后冷冻干燥，获得磁性壳聚糖 微球。
优选地，在所述氨基酸型表面活性剂的酶催化制备方法中，在第二步中， 以磁性壳聚糖微球为载体固化木瓜蛋白酶包括以下步骤：
步骤一：将磁性壳聚糖微球分散在PH为6.0的磷酸缓冲液中；
步骤二：使用戊二醛作为交联剂，戊二醛占磁性壳聚糖微球磷酸缓冲液总 体积的1％～5％，在30℃、速率200r/min下震荡60min，交联结束后，用去离 子水洗涤3次，去除多余戊二醛；
步骤三：加入木瓜蛋白酶溶液，木瓜蛋白酶与磁性壳聚糖微球的质量比为1： 20～50，在30℃、速率200r/min下震荡30min，洗涤后冷冻干燥得到固定化酶 产品。
优选地，在所述氨基酸型表面活性剂的酶催化制备方法中，在第三步催化 合成肽类双分子亲油亲水表面活性剂中，固定化酶与赖氨酸质量比5:2，赖氨酸 和月桂酰谷氨酸摩尔比为1:3；催化反应条件为PH为6～7，温度为25℃～55℃， 搅拌速度为100r/min的恒温进行催化反应24h。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)采用离子凝胶法制备得到磁性壳聚糖微球，使用壳聚糖包裹磁性微球， 成本较低，反应温和，能够较大程度保持酶活，酶活在60％～99％，也利于提高 酶活回收率，固化效果好，便于操作；
(2)以磁性壳聚糖微球作为载体，戊二醛为交联剂，固化木瓜蛋白酶，合 成的固定化酶具有立体专一性和高效催化活性。
(3)以固定化酶催化合成Pecllicer LB-10的反应条件安全、温和；后续产 物纯化较简单，便于工业化生产。
具体实施方式
下面将对本发明的氨基酸型表面活性剂的制备方法进行更详细的描述，其 中表示了本发明的优选实施例，应该理解本领域技术人员可以修改在此描述的 本发明，而仍然实现本发明的有利效果。因此，下列描述应当被理解为对于本 领域技术人员的广泛知道，而并不作为对本发明的限制。
本发明提出了一种氨基酸型表面活性剂的制备方法，包括以下步骤：
第一步：制备200～600nm磁性壳聚糖微球；
第二步：以磁性壳聚糖微球为载体固化木瓜蛋白酶，获得固定化酶；
第三步：以固定化酶为催化剂，催化月桂酰谷氨酸和赖氨酸缩合形成肽键， 合成肽类双分子亲油亲水表面活性剂，反应方程式如下：
在第一步中，制备磁性壳聚糖微球包括以下步骤：
步骤一：以体积分数为1％的醋酸溶液溶解壳聚糖，配置成浓度为4mg/mL 的壳聚糖溶液，并用2mol/L的NaOH溶液将壳聚糖溶液PH调节为4.5；
步骤二：取粒径140nm的Fe3O450mg超声分散于2mg/mL的三聚磷酸钠溶 液中；
步骤三：将步骤二中已分散有Fe3O4的三聚磷酸钠溶液中逐滴加入至壳聚糖 溶液中，并保持搅拌至形成凝胶微球；壳聚糖溶液和三聚磷酸钠的体积比为 1:1～3:1；
步骤四：用磁铁对凝胶微球进行收集、洗涤后冷冻干燥，获得磁性壳聚糖 微球。
在第二步中，以磁性壳聚糖微球为载体固化木瓜蛋白酶包括以下步骤：
步骤一：将磁性壳聚糖微球分散在PH为6.0的磷酸缓冲液中；
步骤二：使用戊二醛作为交联剂，戊二醛占磁性壳聚糖微球磷酸缓冲液总 体积的为1％～5％，在30℃、速率200r/min下震荡60min，交联结束后，用去 离子水洗涤3次，去除多余戊二醛；
步骤三：加入木瓜蛋白酶溶液，木瓜蛋白酶与磁性壳聚糖微球的质量比为1： (20～50)，在30℃、速率200r/min下震荡30min，洗涤后冷冻干燥得到固定 化酶产品。
在第三步催化合成肽类双分子亲油亲水表面活性剂中，固定化酶与赖氨酸 质量比5:2，赖氨酸和月桂酰谷氨酸摩尔比为1:3；催化反应条件为PH为6～7， 温度为25℃～55℃，搅拌速度为100r/min的恒温进行催化反应24h。
实施例1
磁性壳聚糖微球的制备
壳聚糖(cs)溶液中质子化氨基与三聚磷酸钠(TPP)中的磷酸基团问通过静电 作用相互吸引，使壳聚糖分子长链折叠团聚呈小微粒，形成壳聚糖凝胶微球。 通过优化，以体积分数为1％的醋酸溶液溶解和配制成质量浓度为4mg/mL cs 溶液，用2mol/L NaOH溶液调节pH为4.5。取粒径140nm的Fe3O450mg先超声 分散于TPP溶液中。用5mL注射器缓慢将2mg/mLTPP溶液逐滴加入CS溶液， 保持搅拌20min，CS和TPP的体积比为1:1～3:1。随着CS与TPP形成凝胶微 球，纳米Fe3O4被包裹其中，从而形成壳聚糖包裹的磁性微球。用强磁铁块进 行收集、洗涤3次，并冷冻干燥。
实施例2
将200mg磁性壳聚糖凝胶微球分散在4ml pH6.0的磷酸缓冲溶液中，加入 40μl戊二醛，在30℃、速率200r/min下震荡60min，交联结束后，用去离子水 洗涤3次，去除多余戊二醛；加入用磷酸缓冲液(PH＝7.0)配制质量浓度为1mg/ml 的木瓜蛋白酶(Sigma P3250)溶液6ml，在30℃、速率200r/min下震荡30min， 洗涤后冷冻干燥得到固定化酶产品。固定化酶蛋白回收率R1为42.85±1.02％， 固定化酶酶活回收率R2为89.14±4.26％
实施例3
将200mg磁性壳聚糖凝胶微球分散在4ml pH6.0的磷酸缓冲溶液中，加入 80μl戊二醛，在30℃、速率200r/min下震荡60min，交联结束后，用去离子水 洗涤3次，去除多余戊二醛；加入用磷酸缓冲液(PH＝7.0)配制质量浓度为1mg/ml 的木瓜蛋白酶(Sigma P3250)溶液6ml，在30℃、速率200r/min下震荡30min， 洗涤后冷冻干燥得到固定化酶产品。固定化酶蛋白回收率R1为59.45±1.98％， 固定化酶酶活回收率R2为77.32±3.96％。
实施例4
将200mg磁性壳聚糖凝胶微球分散在4ml pH6.0的磷酸缓冲溶液中，加入 120μl戊二醛，在30℃、速率200r/min下震荡60min，交联结束后，用去离子 水洗涤3次，去除多余戊二醛；加入用磷酸缓冲液(PH＝7.0)配制质量浓度为 1mg/ml的木瓜蛋白酶(Sigma P3250)溶液6ml，在30℃、速率200r/min下震荡 30min，洗涤后冷冻干燥得到固定化酶产品。固定化酶蛋白回收率R1为 62.47±2.05％，固定化酶酶活回收率R2为62.41±5.16％。
实施例5
将200mg磁性壳聚糖凝胶微球分散在4ml pH6.0的磷酸缓冲溶液中，加入 200μl戊二醛，在30℃、速率200r/min下震荡60min，交联结束后，用去离子 水洗涤3次，去除多余戊二醛；加入用磷酸缓冲液(PH＝7.0)配制质量浓度为 1mg/ml的木瓜蛋白酶(Sigma P3250)溶液6ml，在30℃、速率200r/min下震荡 30min，洗涤后冷冻干燥得到固定化酶产品。固定化酶蛋白回收率R1为 52.13±1.65％，固定化酶酶活回收率R2为50.14±4.56％。
戊二醛不同加入量对固定化酶蛋白回收率R1和固定化酶酶活回收率R2的 影响如表1
戊二醛加入量 固定化酶蛋白回收率R1 固定化酶酶活回收率R2
1％ 42.85±1.02％ 89.14±4.26％
2％ 59.45±1.98％ 77.32±3.96％
3％ 62.47±2.05％ 62.41±5.16％
5％ 52.13±1.65％ 50.14±4.56％
在表1中，m(磁性壳聚糖凝胶微球)＝200mg，m(木瓜蛋白酶)＝6mg；戊二 醛1％，磷酸缓冲溶液PH＝6.0，4ml；反应条件：30℃、速率200r/min。(注： 除戊二醛加入量不同反应物配比及反应条件均与实施例2相同)
木瓜蛋白酶与磁性壳聚糖微球添加质量比对固定化酶蛋白回收率R1和固定 化酶酶活回收率R2的影响如表2
在表2中，C(磁性壳聚糖凝胶微球)＝50mg/ml(每1ml磷酸缓冲液中加入 50mg的磁性壳聚糖凝胶微球)，m(木瓜蛋白酶)＝6mg；戊二醛2％，磷酸缓冲 溶液PH＝6.0；反应条件：30℃、速率200r/min。(注：除磁性壳聚糖凝胶微 球入量不同反应物配比及反应条件均与实施例3相同)
实施例6
30mg木瓜蛋白酶固定化酶溶于pH 7.0磷酸缓液中，加入12mg赖氨酸和 96mg月桂酸谷氨酸钠的摩尔比为1:3，于37℃，PH为7.0，100r/min的恒温水 浴锅中进行催化反应24h。反应结束后磁铁收集固定化酶，收集反应液，利用 高效液相色谱仪(岛津LC2010)测定Pellicer LB-10、赖氨酸、月桂酸谷氨酸钠浓 度。测得得到Pellicer LB-10浓度为2.524g.L-1。
实施例7
30mg木瓜蛋白酶固定化酶溶于pH 7.0磷酸缓液中，加入12mg赖氨酸和 96mg月桂酸谷氨酸钠的摩尔比为1:3，于37℃，PH为6.0，100r/min的恒温水 浴锅中进行催化反应24h。反应结束后磁铁收集固定化酶，收集反应液，利用 高效液相色谱仪(岛津LC2010)测定Pellicer LB-10、赖氨酸、月桂酸谷氨酸钠浓 度。测得得到Pellicer LB-10浓度为1.937g.L-1。
实施例8
30mg木瓜蛋白酶固定化酶溶于pH 7.0磷酸缓液中，加入12mg赖氨酸和 96mg月桂酸谷氨酸钠的摩尔比为1:3，于25℃，PH为6.0，100r/min的恒温水 浴锅中进行催化反应24h。反应结束后磁铁收集固定化酶，收集反应液，利用 高效液相色谱仪(岛津LC2010)测定Pellicer LB-10、赖氨酸、月桂酸谷氨酸钠浓 度。测得得到Pellicer LB-10浓度为1.087g.L-1。
实施例9
30mg木瓜蛋白酶固定化酶溶于pH 7.0磷酸缓液中，加入12mg赖氨酸和 96mg月桂酸谷氨酸钠的摩尔比为1:3，于45℃，PH为6.0，100r/min的恒温水 浴锅中进行催化反应24h。反应结束后磁铁收集固定化酶，收集反应液，利用 高效液相色谱仪(岛津LC2010)测定Pellicer LB-10、赖氨酸、月桂酸谷氨酸钠浓 度。测得得到Pellicer LB-10浓度为1.865g.L-1。
实施例10
30mg木瓜蛋白酶固定化酶溶于pH 7.0磷酸缓液中，加入12mg赖氨酸和 96mg月桂酸谷氨酸钠的摩尔比为1:3，于55℃，PH为6.0，100r/min的恒温水 浴锅中进行催化反应24h。反应结束后磁铁收集固定化酶，收集反应液，利用 高效液相色谱仪(岛津LC2010)测定Pellicer LB-10、赖氨酸、月桂酸谷氨酸钠浓 度。测得得到Pellicer LB-10浓度为1.324g.L-1。
在本发明中，固定化酶蛋白回收率和固定化酶酶活回收率以及Pellicer LB-10生成量的测定方法如下：
(1)蛋白酶酶活的测定
蛋白酶酶活定义：在PH＝7.0和37℃条件下，1min内每毫克木瓜蛋白酶分 解酪蛋白(Casein)产生1微摩尔酪氨酸作为一个活力单位(U).具体步骤如下：向 5ml浓度为1mg/ml游离酶液(或者30mg固化酶，采用考马斯亮蓝法(Bradford) 测定蛋白浓度)中加加入5ml激活剂(2mmol/L的L-半胱氨酸和1mmol/L)的乙二 胺四乙酸在pH 7.0磷酸缓冲液中的混合液)，至于37℃水浴中10min，然后向混 合液中加入5ml浓度为5g/L的底物酪蛋白溶液，反应5min后加入5ml 5％的三 氯乙酸溶液终止反应，离心分离后用美国Thermo Evolution 600紫外分光光度计 在275nm处测定酪氨酸的浓度，根据酪氨酸标准曲线，计算得到游离酶和固定 化酶的活力。
酶活回收率(recovery rate of enzyme activity,RRA)，其计算公式如下：
蛋白回收率(recovery rate of enzyme concentration,RRC)，其计算公式如下：
(2)Pellicer LB-10生成量
酶催化反应结束后磁铁收集固定化酶，收集反应液，利用高效液相色谱仪(岛 津LC2010)测定Pellicer LB-10、赖氨酸、月桂酸谷氨酸钠浓度。取少量上清液 过滤后利用高效液相色谱测定。色谱条件为：色谱柱为C18柱，柱温箱温度为 30℃；流动相为20％甲醇，流速为0.6mL/min；紫外检测器，检测波长为280nm， 进样量为10微摩尔。用缓冲液冲洗固定化酶，再加入相同反应体系重复上述过 程。测量每次得到Pellicer LB-10量。
综上，在本发明实施例提供的氨基酸型表面活性剂的制备方法中，具有以 下优点：
(1)采用离子凝胶法制备得到磁性壳聚糖微球，使用壳聚糖包裹磁性微球， 成本较低，反应温和，能够较大程度保持酶活，酶活在60％～99％，也利于提高 酶活回收率，固化效果好，便于操作；
(2)以磁性壳聚糖微球作为载体，戊二醛为交联剂，固化木瓜蛋白酶，合 成的固定化酶具有立体专一性和高效催化活性。
(3)以固定化酶催化合成Pecllicer LB-10的反应条件安全、温和；后续产 物纯化较简单，便于工业化生产。
上述仅为本发明的优选实施例而已，并不对本发明起到任何限制作用。任何 所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的技术方案的范围内，对本发明揭 露的技术方案和技术内容做任何形式的等同替换或修改等变动，均属未脱离本 发明的技术方案的内容，仍属于本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种氨基酸型表面活性剂的酶催化制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步：制备200～600nm磁性壳聚糖微球；
第二步：以磁性壳聚糖微球为载体固化木瓜蛋白酶，获得固定化酶；
第三步：以固定化酶为催化剂，催化月桂酰谷氨酸和赖氨酸缩合形成肽键，合成肽类双分子亲油亲水表面活性剂，反应方程式如下：
2.根据权利要求1所述的氨基酸型表面活性剂的酶催化制备方法，其特征在于，在第一步中，制备磁性壳聚糖微球包括以下步骤：
步骤一：以体积分数为1％的醋酸溶液溶解壳聚糖，配置成浓度为4mg/mL的壳聚糖溶液，并用2mol/L的NaOH溶液将壳聚糖溶液PH调节为4.5；
步骤二：取粒径140nm的Fe3O4 50mg超声分散于2mg/mL的三聚磷酸钠溶液中；
步骤三：将步骤二中已分散有Fe3O4的三聚磷酸钠溶液中逐滴加入至壳聚糖溶液中，并保持搅拌至形成凝胶微球；壳聚糖溶液和三聚磷酸钠的体积比为1:1～3:1；
步骤四：用磁铁对凝胶微球进行收集、洗涤后冷冻干燥，获得磁性壳聚糖微球。
3.根据权利要求1所述的氨基酸型表面活性剂的酶催化制备方法，其特征在于，在第二步中，以磁性壳聚糖微球为载体固化木瓜蛋白酶包括以下步骤：
步骤一：将磁性壳聚糖微球分散在PH为6.0的磷酸缓冲液中；
步骤二：使用戊二醛作为交联剂，戊二醛占磁性壳聚糖微球磷酸缓冲液总体积的为1％～5％，在30℃、速率200r/min下震荡60min，交联结束后，用去离子水洗涤3次，去除多余戊二醛；
步骤三：加入木瓜蛋白酶溶液，木瓜蛋白酶与磁性壳聚糖微球的质量比为1：20～50，在30℃、速率200r/min下震荡30min，洗涤后冷冻干燥得到固定化酶产品。
4.根据权利要求1所述的氨基酸型表面活性剂的酶催化制备方法，其特征在于，在第三步催化合成肽类双分子亲油亲水表面活性剂中，固定化酶与赖氨酸质量比5:2，赖氨酸和月桂酰谷氨酸摩尔比为1:3；催化反应条件为PH为6～7，温度为25℃～55℃，搅拌速度为100r/min的恒温进行催化反应24h。
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