CN112301081B - 一种酶催化合成苯丙氨酸寡肽-赖氨酸寡肽共聚物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶催化合成苯丙氨酸寡肽‑赖氨酸寡肽共聚物的方法，属于材料科学领域。本发明使用蛋白酶为催化剂催化合成酪氨酸寡肽和苯丙氨酸寡肽，然后在固定化蛋白酶的催化下在壬烷/二甲亚砜混合溶剂中将赖氨酸寡肽、苯丙氨酸寡肽进行聚合，制备得到苯丙氨酸寡肽‑赖氨酸寡肽共聚物。本发明的苯丙氨酸寡肽‑赖氨酸寡肽共聚物的产率达到45～75％。该方法涉及的苯丙氨酸寡肽‑赖氨酸寡肽共聚物的合成催化剂为固定化酶，具有反应条件温和、环境更友好、副反应少等优点，而且避免了繁琐的保护和去保护步骤。
Description
技术领域
本发明涉及苯丙氨酸寡肽-赖氨酸寡肽共聚物的合成方法，具体涉及一种酶催化合成苯丙氨酸寡肽-赖氨酸寡肽共聚物的方法，属于材料科学领域。
背景技术
人工聚肽是以天然氨基酸为单体进行聚合反应，通过酰胺键而形成的聚氨基化合物，性质与天然肽、聚氨基酸和蛋白质类似。由人工聚肽形成的材料具有良好的生物亲和性和可降解性。聚肽或其改性低聚物表现出自组装、液晶行为等独特结构性质，具有较强可塑性，在生物、医药和天然高分子材料领域具有很大的应用潜力。
聚苯丙氨酸具有很强的疏水疏油性，通过赖氨酸聚肽的修饰，可提高聚苯丙氨酸的亲水性，从而用于药物输送、功能材料、食品和化妆品等领域。赖氨酸聚肽的研究在国外特别是在日本已比较成熟，我国刚刚起步。它是一种天然的生物代谢产品，具有很好的杀菌能力和热稳定性，是具有优良防腐性能和巨大商业潜力的生物防腐剂。在日本，赖氨酸聚肽已被批准作为防腐剂添加于食品中，广泛用于方便米饭、湿熟面条、熟菜、海产品、酱类、酱油、鱼片和饼干的保鲜防腐中。同时研究还发现赖氨酸聚肽和其他天然抑菌剂配合使用，有明显的协同增效作用，可以提高其抑菌能力。
氨基酸聚合法有固相法、NCA法和酶催化法。与其它聚合方法相比，酶催化法具有反应条件温和、环境更友好、副反应少等优点，而且避免了繁琐的保护和去保护步骤。
发明内容
本发明的目的在于针对化学法合成寡肽中存在的不足之处，提供一种反应条件温和、环境更友好的酶法制备寡肽的方法。
本发明的第一个目的是提供一种固定化酶催化合成苯丙氨酸寡肽-赖氨酸寡肽共聚物的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)合成赖氨酸寡肽和苯丙氨酸寡肽；
(2)制备苯丙氨酸寡肽-赖氨酸寡肽共聚物，包括：在壬烷/二甲亚砜混合溶剂中加入步骤(1)得到的赖氨酸寡肽、苯丙氨酸寡肽以及固定化蛋白酶，在30～70℃下反应10～24h，反应结束后，加入六氟异丙醇，过滤取滤液，将滤液干燥后，加入无水乙醇浸泡6-12小时，离心，去除上清液，再加入预热后的丙酮直至全部溶解，将所得溶液在-4-0℃静置8-12小时，减压抽滤，所得沉淀即为苯丙氨酸寡肽-赖氨酸寡肽共聚物。
在本发明的一种实施方式中，所述壬烷/二甲亚砜混合溶剂中壬烷和二甲亚砜的体积比为3:7～1:9。
在本发明的一种实施方式中，所述赖氨酸寡肽和苯丙氨酸寡肽的添加量与壬烷/二甲亚砜混合溶剂的质量g体积mL比为1:1～4，其中，赖氨酸寡肽与苯丙氨酸寡肽的质量比为1:0.8～1:1.2。
在本发明的一种实施方式中，固定化蛋白酶的加入量为0.1～0.5U/g底物，所述底物为赖氨酸寡肽和苯丙氨酸寡肽。
在本发明的一种实施方式中，所述干燥优选真空干燥，操作参数为在20-50℃下真空干燥3-12小时。
在本发明的一种实施方式中，所述离心为在5000～10000rpm离心3～6分钟。
在本发明的一种实施方式中，所述合成赖氨酸寡肽的方法包括：在磷酸缓冲液中加入L-赖氨酸甲酯盐酸盐和蛋白酶，反应混合物在20～50℃下反应6～12小时，反应结束后，在反应混合物中加入冰乙醇，离心取沉淀，并用冰乙醇洗涤，再次离心取沉淀，冷冻干燥后得到赖氨酸寡肽。
在本发明的一种实施方式中，所述合成赖氨酸寡肽的方法中，所述蛋白酶为菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶中的任一种。
在本发明的一种实施方式中，所述磷酸缓冲液为0.1～0.2M的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，磷酸缓冲液的pH值为7.0～8.5；所述L-赖氨酸甲酯盐酸盐和磷酸缓冲液的质量g体积mL比为1:0.8～5。
在本发明的一种实施方式中，所述合成赖氨酸寡肽的方法中，所述蛋白酶的加入量为2～10U/gL-赖氨酸甲酯盐酸盐。
在本发明的一种实施方式中，所述冰乙醇的温度为0℃。
在本发明的一种实施方式中，所述合成赖氨酸寡肽的方法在恒温振荡器中(300rpm)中进行。
在本发明的一种实施方式中，所述合成苯丙氨酸寡肽的方法包括：在磷酸缓冲液中加入L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐、叔丁醇和蛋白酶，反应混合物在20～50℃下反应6～12小时，反应结束后，离心取沉淀，用0℃冰乙醇洗涤，离心取沉淀，冷冻干燥后得到苯丙氨酸寡肽。
在本发明的一种实施方式中，所述合成苯丙氨酸寡肽的方法中，蛋白酶为菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶中的任一种。
在本发明的一种实施方式中，所述合成苯丙氨酸寡肽的方法中，磷酸缓冲液为0.1～0.2M的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，磷酸缓冲液的pH值为7.0～8.5，所述L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐和磷酸缓冲液的质量g体积mL比为1:0.8～5。
在本发明的一种实施方式中，所述合成苯丙氨酸寡肽的方法中，叔丁醇与磷酸缓冲液的体积比为1:9～5:5。
在本发明的一种实施方式中，所述合成苯丙氨酸寡肽的方法中，所述蛋白酶的加入量为2～10U/gL-苯丙氨酸甲酯盐酸盐。
在本发明的一种实施方式中，所述固定化酶通过以下方法制备：将蛋白酶用磷酸缓冲液配置成质量百分比为5～20％的蛋白质溶液，在蛋白质溶液中加入大孔树脂后搅拌反应4～8h，反应结束后将反应液在3000～15000rpm离心5～10分钟，收集沉淀冷冻干燥，即可制备得到固定化酶。
在本发明的一种实施方式中，所述固定化酶的制备过程中，蛋白酶为菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶中的任一种。
在本发明的一种实施方式中，所述固定化酶的制备过程中，磷酸缓冲液为0.1～0.2M的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，磷酸缓冲液的pH值为5.5～8.5。
在本发明的一种实施方式中，所述固定化酶的制备过程中，所述大孔树脂包括HPD300、HPD500、HDP600、HPD700、AB-8、AB-7中的任一种。
在本发明的一种实施方式中，所述固定化酶的制备过程中，所述缓冲溶液中蛋白质与大孔树脂的质量比为1:5～1:10。
在本发明的一种实施方式中，所述苯丙氨酸寡肽-赖氨酸寡肽共聚物的产率为45～75％。
本发明的第二个目的是提供上述方法制备得到的苯丙氨酸寡肽-赖氨酸寡肽共聚物。
在本发明的一种实施方式中，所述苯丙氨酸寡肽-赖氨酸寡肽共聚物的取代度为1.01～1.1。
本发明的第三个目的是提供上述方法在药物输送、功能材料、食品和化妆品等领域的应用。
本发明与现有技术相比，主要具有以下优点：
本发明赖氨酸寡肽和苯丙氨酸寡肽均通过酶催化的方式合成，反应条件温和、环境更友好、副反应少。且本发明制备得到的苯丙氨酸寡肽-赖氨酸寡肽共聚物通过固定化酶催化的方法合成，避免了繁琐的保护和去保护步骤，条件温和、无污染，产率最高达75％。
具体实施方式
共聚物的取代度的检测方法：利用1H NMR检测，具体检测方法如下：使用AVANCEⅢHD-400MHz核磁共振谱仪，以CF3COOD为溶剂，四甲基硅烷(TMS)为内标，在室温下测定共聚物的1HNMR谱图。
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)赖氨酸寡肽的合成
在5.0mL、0.1M、pH7.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(南昌雨露实验器材有限公司生产)中加入2g的L-赖氨酸甲酯盐酸盐(国药集团化学试剂有限公司)和10U胰蛋白酶(上海沃凯生物技术有限公司)。反应混合物置于恒温振荡器中(300rpm)在20℃下反应8小时。反应结束后，在反应混合物中加入100mL预先冷却至0℃冰乙醇，在10000rpm下离心3分钟，取沉淀，用100mL预先冷却至0℃冰乙醇的洗涤三次，在10000rpm下离心3分钟，沉淀冷冻干燥后得到赖氨酸寡肽。
(2)苯丙氨酸寡肽的合成
在8.0mL、0.15M、pH7.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(南昌雨露实验器材有限公司生产)中加入5g的L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐(国药集团化学试剂有限公司)、叔丁醇(国药集团化学试剂有限公司)和15U中性蛋白酶(上海沃凯生物技术有限公司)。叔丁醇与磷酸缓冲液的体积比为1:9。反应混合物置于恒温振荡器中(300rpm)在30℃下反应12小时。反应结束后，将反应混合物在在10000rpm下离心3分钟，取上清液加入100mL预先冷却至0℃冰乙醇，在10000rpm下离心3分钟，沉淀冷冻干燥后得到苯丙氨酸寡肽。
(3)固定化酶的制备
将菠萝蛋白酶(上海沃凯生物技术有限公司)用0.1M、pH7.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(南昌雨露实验器材有限公司生产)配置成质量百分比为5％的蛋白质溶液。在蛋白质溶液中加入HPD500大孔树脂(沧州宝恩吸附材料科技有限公司)，然后在室温下搅拌反应4小时。缓冲溶液中蛋白质与大孔树脂的质量比为1:5。反应结束后将反应液在5000rpm离心5分钟，收集沉淀冷冻干燥，即为固定化酶。
(4)苯丙氨酸寡肽-赖氨酸寡肽共聚物的制备
在15mL壬烷(国药集团化学试剂有限公司)/二甲亚砜(国药集团化学试剂有限公司)混合溶剂中加入10g的赖氨酸寡肽、苯丙氨酸寡肽和5U固定化蛋白酶，其中，壬烷/二甲亚砜混合溶剂中壬烷与二甲亚砜的体积比为3:7，赖氨酸寡肽与苯丙氨酸寡肽1:0.8。反应混合物在50℃下反应10小时。反应结束后，在反应混合物中加入20mL六氟异丙醇(国药集团化学试剂有限公司)，过滤，将滤液在30℃下真空干燥6小时后，加入50mL无水乙醇浸泡12小时，离心(10000rpm)3分钟，去除上清液，加入预热到40℃的丙酮直至全部溶解。将所得溶液在0℃静置8小时，减压抽滤，所得沉淀为苯丙氨酸寡肽-赖氨酸寡肽共聚物，产率为55％。通过1H NMR手段检测苯丙氨酸寡肽-赖氨酸寡肽共聚物的取代度，为1.01。
实施例2
(1)赖氨酸寡肽的合成在8.0mL、0.15M、pH8.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(南昌雨露实验器材有限公司生产)中加入6g的L-赖氨酸甲酯盐酸盐(国药集团化学试剂有限公司)和15U胰蛋白酶(上海沃凯生物技术有限公司)。反应混合物置于恒温振荡器中(300rpm)在40℃下反应12小时。反应结束后，在反应混合物中加入100mL预先冷却至0℃冰乙醇，在10000rpm下离心3分钟，取沉淀，用100mL预先冷却至0℃冰乙醇的洗涤三次，在10000rpm下离心3分钟，沉淀冷冻干燥后得到赖氨酸寡肽。
(2)苯丙氨酸寡肽的合成在10.0mL、0.2M、pH7.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(南昌雨露实验器材有限公司生产)中加入4g的L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐(国药集团化学试剂有限公司)、叔丁醇(国药集团化学试剂有限公司)和20U中性蛋白酶(上海沃凯生物技术有限公司)。叔丁醇与磷酸缓冲液的体积比为5:5。反应混合物置于恒温振荡器中(300rpm)在50℃下反应10小时。反应结束后，将反应混合物在在10000rpm下离心3分钟，取上清液加入100mL预先冷却至0℃冰乙醇，在10000rpm下离心3分钟，沉淀冷冻干燥后得到苯丙氨酸寡肽。
(3)固定化酶的制备将菠萝蛋白酶(上海沃凯生物技术有限公司)用0.2M、pH8.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(南昌雨露实验器材有限公司生产)配置成质量百分比为20％的蛋白质溶液。在蛋白质溶液中加入HPD700大孔树脂(沧州宝恩吸附材料科技有限公司)，然后在室温下搅拌反应8小时。缓冲溶液中蛋白质与大孔树脂的质量比为1:10。反应结束后将反应液在4000rpm离心10分钟，收集沉淀冷冻干燥，即为固定化酶。
(4)苯丙氨酸寡肽-赖氨酸寡肽共聚物的制备在20mL壬烷(国药集团化学试剂有限公司)/二甲亚砜(国药集团化学试剂有限公司)混合溶剂中加入20g的赖氨酸寡肽、苯丙氨酸寡肽和10U固定化蛋白酶。壬烷/二甲亚砜混合溶剂中壬烷与二甲亚砜的体积比为1:9。赖氨酸寡肽与苯丙氨酸寡肽1:1.2。反应混合物在70℃下反应15小时。反应结束后，在反应混合物中加入20mL六氟异丙醇(国药集团化学试剂有限公司)，过滤，将滤液在30℃下真空干燥6小时后，加入50mL无水乙醇浸泡12小时，离心(10000rpm)3分钟，去除上清液，加入预热到40℃的丙酮直至全部溶解。将所得溶液在-1℃静置10小时，减压抽滤，所得沉淀为苯丙氨酸寡肽-赖氨酸寡肽共聚物，产率为65％。通过1H NMR手段检测苯丙氨酸寡肽-赖氨酸寡肽共聚物的取代度，为1.05。
实施例3
(1)赖氨酸寡肽的合成在10.0mL、0.15M、pH8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(南昌雨露实验器材有限公司生产)中加入4g的L-赖氨酸甲酯盐酸盐(国药集团化学试剂有限公司)和15U胰蛋白酶(上海沃凯生物技术有限公司)。反应混合物置于恒温振荡器中(300rpm)在30℃下反应12小时。反应结束后，在反应混合物中加入100mL预先冷却至0℃冰乙醇，在10000rpm下离心3分钟，取沉淀，用100mL预先冷却至0℃冰乙醇的洗涤三次，在10000rpm下离心3分钟，沉淀冷冻干燥后得到赖氨酸寡肽。
(2)苯丙氨酸寡肽的合成在10.0mL、0.2M、pH8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(南昌雨露实验器材有限公司生产)中加入3g的L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐(国药集团化学试剂有限公司)、叔丁醇(国药集团化学试剂有限公司)和20U菠萝蛋白酶(上海沃凯生物技术有限公司)。叔丁醇与磷酸缓冲液的体积比为5:5。反应混合物置于恒温振荡器中(300rpm)在30℃下反应12小时。反应结束后，将反应混合物在在10000rpm下离心3分钟，取上清液加入100mL预先冷却至0℃冰乙醇，在10000rpm下离心3分钟，沉淀冷冻干燥后得到苯丙氨酸寡肽。
(3)固定化酶的制备将木瓜蛋白酶(上海沃凯生物技术有限公司)用0.15M、pH6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(南昌雨露实验器材有限公司生产)配置成质量百分比为10％的蛋白质溶液。在蛋白质溶液中加入AB-8大孔树脂(沧州宝恩吸附材料科技有限公司)，然后在室温下搅拌反应6小时。缓冲溶液中蛋白质与大孔树脂的质量比为1:8。反应结束后将反应液在1000rpm离心10分钟，收集沉淀冷冻干燥，即为固定化酶。
(4)苯丙氨酸寡肽-赖氨酸寡肽共聚物的制备在20mL壬烷(国药集团化学试剂有限公司)/二甲亚砜(国药集团化学试剂有限公司)混合溶剂中加入20g的赖氨酸寡肽、苯丙氨酸寡肽和10U固定化蛋白酶。壬烷/二甲亚砜混合溶剂中壬烷与二甲亚砜的体积比为2:8。赖氨酸寡肽与苯丙氨酸寡肽1:1。反应混合物在70℃下反应24小时。反应结束后，在反应混合物中加入20mL六氟异丙醇(国药集团化学试剂有限公司)，过滤，将滤液在30℃下真空干燥6小时后，加入50mL无水乙醇浸泡12小时，离心(10000rpm)3分钟，去除上清液，加入预热到40℃的丙酮直至全部溶解。将所得溶液在-4℃静置10小时，减压抽滤，所得沉淀为苯丙氨酸寡肽-赖氨酸寡肽共聚物，产率为75％。通过1H NMR手段检测苯丙氨酸寡肽-赖氨酸寡肽共聚物的取代度，为1.0。
对比例1
当省略实施例1中步骤(3)，即蛋白酶未经过固定化直接加入到步骤(4)中，其余操作方法和实施例1相同。反应结束后，在反应混合物中加入20mL六氟异丙醇(国药集团化学试剂有限公司)，过滤，将滤液在30℃下真空干燥6小时后，加入50mL无水乙醇浸泡12小时，离心(10000rpm)3分钟后，无沉淀，即得不到苯丙氨酸寡肽-赖氨酸寡肽产品。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (7)
1.一种固定化酶催化合成苯丙氨酸寡肽-赖氨酸寡肽共聚物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）合成赖氨酸寡肽和苯丙氨酸寡肽；
（2）制备苯丙氨酸寡肽-赖氨酸寡肽共聚物，包括：在壬烷/二甲亚砜混合溶剂中加入步骤（1）得到的赖氨酸寡肽、苯丙氨酸寡肽以及固定化酶，在50~70℃下反应10~24 h，反应结束后，在反应混合物中加入六氟异丙醇，过滤取滤液，将滤液干燥后，加入无水乙醇浸泡12小时，离心，去除上清液，再加入预热后的丙酮直至全部溶解，将所得溶液在0℃静置过夜，减压抽滤，所得沉淀即为苯丙氨酸寡肽-赖氨酸寡肽共聚物；所述固定化酶通过以下方法制备：将蛋白酶用磷酸缓冲液配置成质量百分比为5~20%的蛋白质溶液，在蛋白质溶液中加入大孔树脂后搅拌反应4～8 h，反应结束后将反应液在1000~5000rpm离心5~10分钟，收集沉淀冷冻干燥，即可制备得到固定化酶；其中，所述固定化酶的制备过程中，所述蛋白酶为菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶中的任一种；所述大孔树脂为HPD500、HPD700、AB-8中的任一种。
2.根据权利要求1所述的一种固定化酶催化合成苯丙氨酸寡肽-赖氨酸寡肽共聚物的方法，其特征在于，所述赖氨酸寡肽和苯丙氨酸寡肽的添加量与壬烷/二甲亚砜混合溶剂的质量g体积mL比为1:1~4，其中，赖氨酸寡肽与苯丙氨酸寡肽的质量比为1:0.8~1:1.2。
3.根据权利要求1或2所述的一种固定化酶催化合成苯丙氨酸寡肽-赖氨酸寡肽共聚物的方法，其特征在于，固定化酶的加入量为0.1~0.5 U/g底物，所述底物为赖氨酸寡肽和苯丙氨酸寡肽。
4.根据权利要求1所述的一种固定化酶催化合成苯丙氨酸寡肽-赖氨酸寡肽共聚物的方法，其特征在于，所述合成赖氨酸寡肽的方法包括：在磷酸缓冲液中加入L-赖氨酸甲酯盐酸盐和蛋白酶，反应混合物在20～50℃下反应6～12小时，反应结束后，在反应混合物中加入冰乙醇，离心取沉淀，并用冰乙醇洗涤，再次离心取沉淀，冷冻干燥后得到赖氨酸寡肽。
5.根据权利要求1所述的一种固定化酶催化合成苯丙氨酸寡肽-赖氨酸寡肽共聚物的方法，其特征在于，所述合成苯丙氨酸寡肽的方法包括：在磷酸缓冲液中加入L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐、叔丁醇和蛋白酶，反应混合物在20～50℃下反应6～12小时，反应结束后，离心取上清液，在上清液中加入0℃冰乙醇，离心取沉淀，冷冻干燥后得到苯丙氨酸寡肽。
6.根据权利要求1所述的一种固定化酶催化合成苯丙氨酸寡肽-赖氨酸寡肽共聚物的方法，其特征在于，所述缓冲溶液中蛋白质与大孔树脂的质量比为1:5～1:10。
7.权利要求1~6任一所述的一种固定化酶催化合成苯丙氨酸寡肽-赖氨酸寡肽共聚物的方法在制备功能材料、食品或化妆品中的应用。
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4284721A (en) * | 1979-04-03 | 1981-08-18 | Sagami Chemical Research Center | Method for manufacturing dipeptides |
| US5002872A (en) * | 1989-05-10 | 1991-03-26 | W. R. Grace & Co.-Conn. | Enzyme mediated coupling reactions |
| CN102181422A (zh) * | 2011-03-08 | 2011-09-14 | 天津大学 | 大孔载体“同步法”共价交联-固载木瓜蛋白酶聚体及方法 |
| CN108588153A (zh) * | 2018-03-27 | 2018-09-28 | 苏州芙来沃生物科技有限公司 | 一种氨基酸型表面活性剂的酶催化制备方法 |
| CN110563939A (zh) * | 2019-10-17 | 2019-12-13 | 江南大学 | 酶催化制备苯丙氨酸寡肽-单甲氧基聚乙二醇共聚物的方法 |
| CN110669810A (zh) * | 2019-10-17 | 2020-01-10 | 江南大学 | 一种酶催化制备赖氨酸寡肽及其单甲氧基聚乙二醇修饰的方法 |
-
2020
- 2020-10-26 CN CN202011155251.9A patent/CN112301081B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4284721A (en) * | 1979-04-03 | 1981-08-18 | Sagami Chemical Research Center | Method for manufacturing dipeptides |
| US5002872A (en) * | 1989-05-10 | 1991-03-26 | W. R. Grace & Co.-Conn. | Enzyme mediated coupling reactions |
| CN102181422A (zh) * | 2011-03-08 | 2011-09-14 | 天津大学 | 大孔载体“同步法”共价交联-固载木瓜蛋白酶聚体及方法 |
| CN108588153A (zh) * | 2018-03-27 | 2018-09-28 | 苏州芙来沃生物科技有限公司 | 一种氨基酸型表面活性剂的酶催化制备方法 |
| CN110563939A (zh) * | 2019-10-17 | 2019-12-13 | 江南大学 | 酶催化制备苯丙氨酸寡肽-单甲氧基聚乙二醇共聚物的方法 |
| CN110669810A (zh) * | 2019-10-17 | 2020-01-10 | 江南大学 | 一种酶催化制备赖氨酸寡肽及其单甲氧基聚乙二醇修饰的方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Amphiphilic bromelain-synthesized oligo-phenylalanine grafted with methoxypolyethylene glycol possessing stabilizing thermo-responsive emulsion properties;Feng Wang等;《J Colloid Interface Sci》;20181122;全文 * |
| Effect of dual-drug-releasing micelle-hydrogel composite on wound healing in vivo in full-thickness excision wound rat model;Monika Patel等;《J Biomed Mater Res A》;20190218;第107卷(第5期);第1095页左栏第2段 * |
| L-苯丙氨酸聚肽的酶催化合成;刘严华等;《化学通报》;20180418;第81卷(第4期);全文 * |
| Preparation, Characterization,and Biological Evaluation of Poly(Glutamic Acid)-b-Polyphenylalanine Polymersomes;Evgenia Vlakh等;《Polymers (Basel)》;20160602;第8卷(第6期);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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