CN107082796B - 一种提纯蛋白酶解物中小分子多肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提纯蛋白酶解物中小分子多肽的方法，属于分离提纯技术领域。该方法是将将蛋白酶解物样品干燥后，利用三氟甲磺酸切割结合多糖的多肽，采用氯甲酸叔丁酯法将多肽的氨基端衍生化，用乙酸乙酯萃取衍生化的多肽后进行去衍生化处理，得到纯化多肽。它此方法的优点在于：1、此方法提纯后，多糖的含量大幅度降低。2、本发明在整个过程中多肽的结构未得到破坏。3、本发明分离出的肽纯度高，不含盐。4、提纯后的肽具有较强的生物学活性。
Description
技术领域
本发明涉及分离提纯技术领域，特别是指一种提纯蛋白酶解物中小分子多肽的方法。
背景技术
多糖普遍存在于动物、植物及微生物中，种类繁多，功能广泛。常规的蛋白资源，如大豆蛋白、大米蛋白和谷朊粉等，一般均含有较多的多糖，其中一部分多糖以游离多糖的形式存在，另一部分多糖则与蛋白结合，糖链和肽链中的氨基酸残基通过共价连接，形成糖蛋白。糖蛋白中的糖链可分为2大类，N-连接的糖链和O-连接的糖链，N-糖链连接在Asn-X-Thr/Ser序列中，其中的X为脯氨酸以为的任意氨基酸残基，O-糖链的结构比N-糖链简单，连接位点为N-糖链多，常出现在丝氨酸、苏氨酸、羟赖氨酸、羟脯氨酸等氨基酸残基。有些蛋白的糖基比例非常高，可在糖基链上形成支链，糖蛋白中糖链一般含有10~15个单糖单位，大部分分布在细胞膜上，具有识别功能。
近年来，利用蛋白质制备活性多肽的研究非常热门，因为多肽不仅具有无抗原性，并且具有很多生物活性，例如降血压、抗氧化等。然而，因多肽的制备原料含有较多的结合型和游离型多糖，在实际的研究中，多糖和多肽可能具有类似的生理学功能，所以准确分析多肽的功能首先要除去多糖，防止多糖对结果进行干扰，而目前尚无简单的方法进行去除。例如采用碱溶酸沉方法提取米渣蛋白（Yang L., Chen J., Xu T., et al. Rice proteinextracted by different methods affects cholesterol metabolism in rats due toits lower digestibility, Int. J. of Mol. Sci. 12 (2011) 7594-7608），可将大部分游离多糖除去，分离提纯蛋白，但是提取的产物包含糖蛋白，在后续的酶解工艺中，糖蛋白酶解形成肽多糖，会对多肽的活性检测进行干扰。
多肽与糖的分离可以采用酶法或化学法，酶法由于O-糖链的解离目前只有1种酶-内切α-N-乙酰半乳糖胺酶，只能识别乙酰半乳糖与半乳糖之间的连接，由于识别位点的局限因此使用不多，为了尽可能多的除去多糖，可采用化学裂解方法。三氟甲磺酸在裂解多肽与葡萄糖之间的共价键的同时，还能保持多肽的完整及活性。
9-芴甲氧羰基法（Fmoc）或叔丁氧羰基（Boc）法可以将多肽的氨基端衍生化，使之极性改变更容易溶于有机溶剂中进行提纯，后期可将提纯的多肽去衍生化，得到目标多肽。Boc法相比于Fmoc法制得纯化的目标多肽不含盐，更加适合纯化多肽。目前，结合多肽衍生化及糖肽键切割对粗多肽进行分离提纯，去除结合型和游离型多糖，用于准确性质分析，这方面的研究还未见报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种工艺简单、得率高的酶解液中肽的分离方法。具体为将蛋白酶解物样品干燥后，利用三氟甲磺酸切割结合多糖的多肽，采用叔丁氧羰基（Boc）法将多肽的氨基端衍生化，用乙酸乙酯萃取衍生化的多肽后进行去衍生化处理，达到分离纯化多肽的目的。
为了实现上述发明目的，其具体的技术方案如下：一种提纯蛋白酶解物中小分子多肽的方法，按照下述步骤进行：
（1）蛋白酶解产物的干燥
将大米蛋白酶解产物（15%≤水解度≤25%）离心后，上清液采用真空冷冻干燥机干燥至绝干。
（2）肽链与糖链分离
准确称取绝干酶解上清液样品加入到预冷的样品管中，按0.3 mL/mg（大米蛋白酶解产物样品）加入三氟甲磺酸，快速封口，轻摇2~5 min使样品溶解，于4℃下保温30~60min，偶尔摇动，样品管中加入少量2%溴酚蓝指示剂，于-20℃下预冷，在干冰甲醇浴的环境下，用预冷的60%吡啶滴定，直至溴酚蓝变成浅紫色或蓝色，此时溶液pH约为6.0，最后对去离子水透析并冷冻干燥。
（3）多肽的分离
准确称取步骤（2）制备的冻干样品放入烧杯中，倒入样品质量10 mL/g（冻干样品）的水溶解，将二碳酸二叔丁酯（按照冻干样品重量的0.5~2倍），溶解于10 mL/g（冻干样品）1,4-二氧六环溶剂中，倒入上述烧杯，搅拌后用三乙胺调节pH至8~9，溶液变浑浊后继续搅拌20 h，然后用石油醚作溶剂进行萃取，分离出水溶液在冰浴条件下搅拌，用1 mol/L盐酸调节pH至2~3，溶液再次变浑浊，再往溶液中加入适量饱和氯化钠溶液，乙酸乙酯萃取6~10次，合并乙酸乙酯溶液，将合并的乙酸乙酯溶液再用饱和氯化钠溶液洗涤2~3次，无水硫酸钠干燥，过滤，直接旋干得到Boc-多肽。在反应物中加入甲苯，甲苯按照20~50 mL/g（Boc-多肽）添加，搅拌均匀后，加入硅胶，加热回流，反应结束后，冷却至室温，过滤，然后用水清洗硅胶，将滤液蒸干后，即得提纯多肽。
上述的大米蛋白酶解物为较高水解度的酶解产物，也可以由其他蛋白原料制备的较高水解度的酶解产物简单代替。
上述三氟甲磺酸试剂可以用其他能断裂糖肽键的化学试剂简单代替。
本发明的优点在于：1、此方法提纯后，多糖的含量大幅度降低。2、本发明分离出的小分子肽纯度高，得率高。3、提纯后的小分子肽保留较高的生物学活性。本发明分离的是蛋白质酶解为小分子的肽，小分子肽利于人体吸收利用，同时还具有降血压、抗氧化等功能活性。
下面通过实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是，对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例1
（1）蛋白酶解产物的干燥：将大米蛋白（蛋白含量63.52%）酶解产物（水解度15%）离心后，上清液采用真空冷冻干燥机干燥至绝干。
（2）肽链与糖链分离：称10 g绝干酶解上清液样品，取3 mL三氟甲磺酸加入到预冷的样品管中，快速封口，轻摇5 min使样品溶解，于4℃下保温50 min，偶尔摇动，样品管中加入少量2%溴酚蓝指示剂，于-20℃下预冷，在干冰甲醇浴的环境下，用预冷的60%吡啶滴定，直至溴酚蓝变成浅紫色或蓝色，此时溶液pH约为6.0，最后对去离子水透析并冷冻干燥。
（3）多肽的分离：准确称取步骤2中的冻干样品9.38 g放入烧杯中，倒入93.8 mL水溶解，将二碳酸二叔丁酯4.69 g溶解于93.8 mL 1,4-二氧六环溶剂中，倒入上述烧杯，搅拌后用三乙胺调节pH至8，溶液变浑浊后继续搅拌20 h，然后用石油醚作溶剂进行萃取，分离出水溶液在冰浴条件下搅拌，用1 mol/L盐酸调节pH至2，溶液再次变浑浊，再往溶液中加入适量饱和氯化钠溶液，乙酸乙酯萃取6次，合并乙酸乙酯溶液，将合并的乙酸乙酯溶液再用饱和氯化钠溶液洗涤2次，无水硫酸钠干燥，过滤，直接旋干得到Boc-多肽。在圆底烧瓶中加入Boc-多肽底物和甲苯，甲苯按照20 mL/g（Boc-多肽）添加，搅拌均匀后加入10倍量的硅胶（摩尔比），加热回流，将体系冷却到室温，过滤，用少量水清洗硅胶3次，将滤液蒸干后得到产物多肽3.94 g，采用凯氏定氮法测定多肽含量，其含量为89.42%。将全部所得多肽样品加少量水溶解，定容至2 L，测定1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）清除率为41.27%，血管紧张素转化酶（ACE）抑制率为53.18%。同时将未提取的10 g样品定容至2 L，测定DPPH清除率为48.37%，ACE抑制率为61.35%。
实施例2
（1）蛋白酶解产物的干燥：将大米蛋白（蛋白含量63.52%）酶解产物（水解度25%）离心后，上清液采用真空冷冻干燥机干燥至绝干。
（2）肽链与糖链分离：称10 g绝干酶解上清液样品，取3 mL三氟甲磺酸加入到预冷的样品管中，快速封口，轻摇2 min使样品溶解，于0℃下保温50 min，偶尔摇动，样品管中加入少量2%溴酚蓝指示剂，于-20℃下预冷，在干冰甲醇浴的环境下，用预冷的60%吡啶滴定，直至溴酚蓝变成浅紫色或蓝色，此时溶液pH约为6.0，最后对去离子水透析并冷冻干燥。
（3）多肽的分离：准确称取步骤2中的冻干样品9.75 g放入烧杯中，倒入97.5 mL水溶解，将二碳酸二叔丁酯19.5 g溶解于97.5 mL 1,4-二氧六环溶剂中，倒入上述烧杯，搅拌后用三乙胺调节pH至9，溶液变浑浊后继续搅拌20 h，然后用石油醚作溶剂进行萃取，分离出水溶液在冰浴条件下搅拌，用1 mol/L盐酸调节pH至3，溶液再次变浑浊，再往溶液中加入适量饱和氯化钠溶液，乙酸乙酯萃取10次，合并乙酸乙酯溶液，将合并的乙酸乙酯溶液再用饱和氯化钠溶液洗涤3次，无水硫酸钠干燥，过滤，直接旋干得到Boc-多肽。在圆底烧瓶中加入Boc-多肽底物和甲苯，甲苯按照20 mL/g（Boc-多肽）添加，搅拌均匀后加入10倍量的硅胶（摩尔比），加热回流，将体系冷却到室温，过滤，用少量水清洗硅胶3次，将滤液蒸干后得到产物多肽4.33 g，采用凯氏定氮法测定多肽含量，其含量为91.85%。将全部所得多肽样品加少量水溶解，定容至2 L，测定DPPH清除率为55.64%，ACE抑制率为65.05%。同时将未提取的10 g样品定容至2 L，测定DPPH清除率为63.42%，ACE抑制率为79.38%。
Claims (2)
1.一种提纯蛋白酶解物中小分子多肽的方法，其特征在于，将蛋白酶解物样品干燥后，利用三氟甲磺酸切割结合多糖的多肽，采用叔丁氧羰基法将多肽的氨基端衍生化，用乙酸乙酯萃取衍生化的多肽后进行去衍生化处理，得到提纯后的多肽；
其中三氟甲磺酸切割结合多糖的多肽，按照下述步骤进行：准确称取干燥后的蛋白酶解物样品加入到预冷的样品管中，按0.3 mL/mg加入三氟甲磺酸，快速封口，轻摇2~5 min使样品溶解，于4℃下保温30~60 min，偶尔摇动，样品管中加入少量2%溴酚蓝指示剂，于-20℃下预冷，在干冰甲醇浴的环境下，用预冷的60%吡啶滴定，直至溴酚蓝变成浅紫色或蓝色，此时溶液pH约为6.0，最后对去离子水透析并冷冻干燥；
采用叔丁氧羰基法将多肽的氨基端衍生化，用乙酸乙酯萃取衍生化的多肽后进行去衍生化处理，得到提纯后的多肽，按照下述步骤进行：准确称取经三氟甲磺酸切割后的冻干样品放入烧杯中，放入适量水溶解，另外将二碳酸二叔丁酯溶解于1,4-二氧六环溶剂中，倒入上述烧杯，搅拌后用三乙胺调节pH至8~9，溶液变浑浊后继续搅拌20 h，然后用石油醚作溶剂进行萃取，分离出水溶液在冰浴条件下搅拌，用1 mol/L盐酸调节pH至2~3，溶液再次变浑浊，再往溶液中加入适量饱和氯化钠溶液，乙酸乙酯萃取6~10次，合并乙酸乙酯溶液，将合并的乙酸乙酯溶液再用饱和氯化钠溶液洗涤2~3次，无水硫酸钠干燥，过滤，直接旋干得到Boc-多肽；在反应物中加入甲苯，搅拌均匀后，加入硅胶，加热回流，反应结束后，冷却至室温，过滤，然后用水清洗硅胶，将滤液蒸干后，即得提纯多肽。
2.根据权利要求1所述一种提纯蛋白酶解物中小分子多肽的方法，其特征在于，蛋白酶解物水解度≥15%。
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