CN107082821B - 一种提纯植物多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提纯植物多糖的方法，属于食品分离纯化领域。该方法是将样品进行蛋白酶酶解，干燥后，利用三氟甲磺酸切割结合多糖的多肽，采用芴甲氧羰酰氯法或氯甲酸叔丁酯法将游离多肽的氨基端衍生化，用乙酸乙酯萃取去除多酚及衍生化的多肽物质，制备得到纯化过的多糖。此方法的优点在于：1、此方法提纯后，蛋白和多酚的含量大幅度降低。2、本发明分离出的高纯度的多糖。
Description
技术领域
本发明涉及食品分离纯化领域，特别是指一种提纯植物多糖的方法。
背景技术
多糖是由糖苷键结合的糖链，至少要超过10个的单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物，可用通式(C6H10O5)n表示。由相同的单糖组成的多糖称为同多糖，如淀粉、纤维素和糖原，以不同的单糖组成的多糖称为杂多糖，如阿拉伯胶是由戊糖和半乳糖等组成。它是生物体内一种重要的组成成分，常规的农副产品植物资源，例如大米、马铃薯等，一般均含有较多的多糖（分为游离型多糖和结合型多糖），同时也含有较多的蛋白或多酚，许多多糖能与蛋白之间共价结合形成糖蛋白。有些糖蛋白的比例非常高，大部分分布在细胞膜上，具有识别功能。多酚类成分的化学结构中含有较多的羟基，在植物体内能与蛋白质、多糖或其他物质以氢键和疏水键形式形成较为稳定的复合物。研究发现，植物多糖具有多方面的生物活性，如抗肿瘤、免疫促进、抗炎、抗病毒、抗凝血、降血糖等。然而，要分析多糖的功能首先要获得较纯多糖样品，去除样品原料中的蛋白和多酚，防止其对结果进行干扰。
常用的多糖的分离方法为水溶醇沉法，利用乙醇可以将溶液中的多糖沉淀下来，从而提纯多糖。其缺点在于一方面非结合蛋白、多酚能与多糖形成共沉淀，另一方面沉淀的多糖含有部分结合蛋白，导致提取的多糖纯度低。结合型多糖的蛋白与多糖之间的共价键可以采用化学裂解法切割，常用的试剂为三氟甲磺酸。
由于多酚物质在分子结构中具有酚羟基、羟基、羧基等，具有一定的极性，在植物体内通常与蛋白质、多糖以氢键和疏水键形式形成稳定的化合物，而有机溶剂具有断裂氢键的作用，因此可以用乙酸乙酯、丙酮、乙醇等有机溶剂萃取，除去多酚。
为了尽可能多的除去蛋白和多酚，同时提高多糖的纯度，需要一种有效的分离多糖的纯化方法。在提纯多糖之前先将糖蛋白中的蛋白与糖链分开，并对多酚进行萃取，从而提高多糖纯度的文献还未见报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种工艺简单，能够制备高纯度多糖的分离方法。具体为将样品进行蛋白酶酶解，干燥后，利用三氟甲磺酸切割结合多糖的多肽，采用9-芴甲氧羰基法（Fmoc）或叔丁氧羰基（Boc）法将游离多肽的氨基端衍生化，用乙酸乙酯萃取去除多酚及衍生化的多肽物质，达到分离提纯多糖的目的。
为了实现上述发明目的，其具体的技术方案如下：
一种提纯植物多糖的方法，按照下述步骤进行：
（1）蛋白酶解
将蛋白样品加入蒸馏水混匀（底物浓度30~70 g/L），调节pH至8~9，温度45~55℃，加入蛋白酶底与底物比为0.5~2.5%的碱性蛋白酶，酶解时间5~12 h，沸水浴灭酶10~20min，离心取上清液，冻干。
（2）糖蛋白链断裂
准确称取上述绝干样品加入到预冷的样品管中，按0.3 mL/mg（蛋白酶酶解物样品）加入三氟甲磺酸，快速封口，轻摇2~5 min使样品溶解，于4℃下保温30~60 min，偶尔摇动，样品管中加入少量2%溴酚蓝指示剂，于-20℃下预冷，在干冰甲醇浴的环境下，用预冷的60%吡啶滴定，直至溴酚蓝变成浅紫色或蓝色，此时溶液pH约为6.0，最后对去离子水透析并冷冻干燥。
（3）分离多糖
将多肽进行氨基端疏水性衍生化，增加与多糖的极性差异，可采用Fmoc或Boc法。
（3-1）Fmoc衍生法：准确称取步骤（2）制备的冻干样品，溶解于10%碳酸钠溶液中，样品浓度为1~5%，加入少量丙酮，在0~4℃条件下加入与样品质量相同的芴甲氧羰酰氯法（Fmoc-Cl），搅拌反应4~12 h后，冷却，并用浓盐酸酸化到pH至2，100 mL乙酸乙酯萃取3~5次，将多酚和被保护的Fmoc-多肽溶于乙酸乙酯中，将水相过滤，经500 Da透析袋透析，去除小分子盐等杂质，浓缩干燥得纯化的多糖。
（3-2）Boc衍生法：准确称取步骤（2）制备的冻干样品放入烧杯中，倒入样品质量10mL/g（冻干样品）的水溶解，将二碳酸二叔丁酯（按照冻干样品重量的0.5~2倍），溶解于10mL/g（冻干样品）1,4-二氧六环溶剂中，倒入上述烧杯，搅拌后用三乙胺调节pH至8~9，溶液变浑浊后继续搅拌20 h，然后用石油醚作溶剂进行萃取，分离出水溶液在冰浴条件下搅拌，用1 mol/L盐酸调节pH至2~3，溶液再次变浑浊，再往溶液中加入适量饱和氯化钠溶液，乙酸乙酯萃取3~5次，将多酚和被保护的Boc-多肽溶于乙酸乙酯中，将水相过滤，经500 Da透析袋透析，去除小分子盐等杂质，浓缩干燥得纯化的多糖。
上述原料也可以为蛋白酶解产物、多糖粗提物，若原料的蛋白水解程度较高可以省略第一步骤。
上述三氟甲磺酸试剂可以用其他能断裂糖肽键的化学试剂简单代替。
本发明的优点在于：1、本发明在整个过程中操作要求低，设备要求简单，特别适合少量制备高纯度的多糖；2、能将样品中的蛋白、多肽、多酚物质去除，分离出的高纯度的多糖。
下面通过实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是，对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例1
1、蛋白酶解：称取干燥的大米蛋白原料21 g，加入700 mL蒸馏水混匀，调节pH至8，温度45℃，加入105 μL的碱性蛋白酶，酶解时间5 h，沸水浴灭酶10 min，离心取上清液，冻干。
2、糖蛋白链断裂：准确称取10 g绝干蛋白酶解物样品加入到预冷的样品管中，按3mL加入三氟甲磺酸，快速封口，轻摇5 min使样品溶解，于4℃下保温60 min，偶尔摇动，样品管中加入少量2%溴酚蓝指示剂，于-20℃下预冷，在干冰甲醇浴的环境下，用预冷的60%吡啶滴定，直至溴酚蓝变成浅紫色或蓝色，此时溶液pH约为6.0，最后对去离子水透析并冷冻干燥。
3、分离多糖：将上述冻干样品准确称取溶解于10%碳酸钠溶液中，样品浓度为5%，加入少量丙酮，在4℃条件下加入与样品质量相同的Fmoc-Cl，搅拌反应12 h后，冷却，并用浓盐酸酸化到pH=2，100 mL乙酸乙酯萃取3次，被保护的蛋白和多酚溶于乙酸乙酯中，将水相过滤，经500 Da透析袋透析，去除小分子盐等杂质，浓缩得多糖产品4.36 g。
4、多糖纯度：将多糖产物冻干后，采用苯酚硫酸法测定多糖的含量93.64%。
实施例2
1、蛋白酶解：称取干燥的大豆蛋白原料21 g，加入300 mL蒸馏水混匀，调节pH至9，温度55℃，加入525 μL的碱性蛋白酶，酶解时间12 h，沸水浴灭酶20 min，离心取上清液，冻干。
2、糖蛋白链断裂：准确称取10 g绝干蛋白酶解物样品加入到预冷的样品管中，按3mL加入三氟甲磺酸，快速封口，轻摇5 min使样品溶解，于4℃下保温60 min，偶尔摇动，样品管中加入少量2%溴酚蓝指示剂，于-20℃下预冷，在干冰甲醇浴的环境下，用预冷的60%吡啶滴定，直至溴酚蓝变成浅紫色或蓝色，此时溶液pH约为6.0，最后对去离子水透析并冷冻干燥。
3、分离多糖：将上述冻干样品准确称取溶解于10%碳酸钠溶液中，样品浓度为5%，加入少量丙酮，在4℃条件下加入与样品质量相同的Fmoc-Cl，搅拌反应12 h后，冷却，并用浓盐酸酸化到pH=2，100 mL乙酸乙酯萃取5次，被保护的蛋白和多酚溶于乙酸乙酯中，将水相过滤，经500 Da透析袋透析，去除小分子盐等杂质，浓缩得多糖产品4.58 g。
4、多糖纯度：将多糖产物冻干后，采用苯酚硫酸法测定多糖的含量92.17%。
实施例3
1、蛋白酶解：称取干燥的大米蛋白原料21 g，加入700 mL蒸馏水混匀，调节pH至8，温度45℃，加入105 μL的碱性蛋白酶，酶解时间5 h，沸水浴灭酶10 min，离心取上清液，冻干。
2、糖蛋白链断裂：准确称取10 g绝干蛋白酶解物样品加入到预冷的样品管中，按3mL加入三氟甲磺酸，快速封口，轻摇5 min 使样品溶解，于4℃下保温60 min，偶尔摇动，样品管中加入少量2%溴酚蓝指示剂，于-20℃下预冷，在干冰甲醇浴的环境下，用预冷的60%吡啶滴定，直至溴酚蓝变成浅紫色或蓝色，此时溶液pH约为6.0，最后对去离子水透析并冷冻干燥。
3、分离多糖：将上述冻干样品准确称取9.53 g放入烧杯中，倒入95.3 mL水溶解，将二碳酸二叔丁酯4.765 g溶解于95.3 mL 1,4-二氧六环溶剂中，倒入上述烧杯，搅拌后用三乙胺调节pH至8，溶液变浑浊后继续搅拌20 h，然后用石油醚作溶剂进行萃取，分离出水溶液在冰浴条件下搅拌，用1 mol/L盐酸调节pH至2，溶液再次变浑浊，再往溶液中加入适量饱和氯化钠溶液，乙酸乙酯萃取5次，被保护的蛋白和多酚溶于乙酸乙酯中，将水相过滤，经500 Da透析袋透析，去除小分子盐等杂质，浓缩得多糖产品3.47 g。
4、多糖纯度：将多糖产物冻干后，采用苯酚硫酸法测定多糖的含量为87.46%。
实施例4
1、蛋白酶解：称取干燥的大豆蛋白原料21 g，加入300 mL蒸馏水混匀，调节pH至9，温度55℃，加入525 μL的碱性蛋白酶，酶解时间12 h，沸水浴灭酶20 min，离心取上清液，冻干。
2、糖蛋白链断裂：准确称取10 g绝干蛋白酶解物样品加入到预冷的样品管中，按3mL加入三氟甲磺酸，快速封口，轻摇5 min 使样品溶解，于4℃下保温60 min，偶尔摇动，样品管中加入少量2%溴酚蓝指示剂，于-20℃下预冷，在干冰甲醇浴的环境下，用预冷的60%吡啶滴定，直至溴酚蓝变成浅紫色或蓝色，此时溶液pH约为6.0，最后对去离子水透析并冷冻干燥。
3、分离多糖：将上述冻干样品9.24 g准确称取放入烧杯中，倒入92.4 mL水溶解，将二碳酸二叔丁酯18.48 g溶解于92.4 mL 1,4-二氧六环溶剂中，倒入上述烧杯，搅拌后用三乙胺调节pH至9，溶液变浑浊后继续搅拌20 h，然后用石油醚作溶剂进行萃取，分离出水溶液在冰浴条件下搅拌，用1 mol/L盐酸调节pH至3，溶液再次变浑浊，再往溶液中加入适量饱和氯化钠溶液，乙酸乙酯萃取5次，被保护的蛋白和多酚溶于乙酸乙酯中，将水相过滤，经500 Da透析袋透析，去除小分子盐等杂质，浓缩得多糖产品3.68 g。
4、多糖纯度：将多糖产物冻干后，采用苯酚硫酸法测定多糖的含量为89.28%。
Claims (3)
1.一种提纯植物多糖的方法，其特征在于，将样品进行蛋白酶酶解，干燥后，利用三氟甲磺酸切割结合多糖的多肽，采用9-芴甲氧羰基法或叔丁氧羰基法将游离多肽的氨基端衍生化，用乙酸乙酯萃取去除多酚及衍生化的多肽物质，制备得到纯化过的多糖；
所述的蛋白酶酶解：将蛋白样品加入蒸馏水混匀，其底物浓度30~70 g/L，调节pH至8~9，温度45~55℃，加入蛋白酶与底物比为0.5~2.5%的碱性蛋白酶，酶解时间5~12 h，沸水浴灭酶10~20 min，离心取上清液，冻干；
所述的三氟甲磺酸切割结合多糖的多肽：准确称取绝干样品加入到预冷的样品管中，按0.3 mL/mg样品的比例加入三氟甲磺酸，快速封口，轻摇2~5 min使样品溶解，于4℃下保温30~60 min，偶尔摇动，样品管中加入少量2%溴酚蓝指示剂，于-20℃下预冷，在干冰甲醇浴的环境下，用预冷的60%吡啶滴定，直至溴酚蓝变成浅紫色或蓝色，此时溶液pH约为6.0，最后用去离子水透析并冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述一种提纯植物多糖的方法，其特征在于，所述的9-芴甲氧羰基法：准确称取前述所制备的冻干样品，溶解于10%碳酸钠溶液中，样品浓度为1~5%，加入少量丙酮，在0~4℃条件下加入与样品质量相同的芴甲氧羰酰氯，搅拌反应4~12 h后，冷却，并用浓盐酸酸化到pH至2，100 mL乙酸乙酯萃取3~5次，将多酚和被保护的多肽溶于乙酸乙酯中，将水相过滤，经500 Da透析袋透析，去除小分子盐杂质，浓缩干燥得纯化的多糖。
3.根据权利要求1所述一种提纯植物多糖的方法，其特征在于，所述的叔丁氧羰基法：准确称取前述所制备的冻干样品放入烧杯中，倒入样品质量10 mL/g冻干样品的水溶解，将二碳酸二叔丁酯按照冻干样品重量的0.5~2倍的比例，溶解于10 mL/g冻干样品的1,4-二氧六环溶剂中，倒入上述烧杯，搅拌后用三乙胺调节pH至8~9，溶液变浑浊后继续搅拌20 h，然后用石油醚作溶剂进行萃取，分离出水溶液在冰浴条件下搅拌，用1 mol/L盐酸调节pH至2~3，溶液再次变浑浊，再往溶液中加入适量饱和氯化钠溶液，乙酸乙酯萃取3~5次，将多酚和被保护的Boc-多肽溶于乙酸乙酯中，将水相过滤，经500 Da透析袋透析，去除小分子盐杂质，浓缩干燥得纯化的多糖。
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