CN108998427B - 一种酚氧化酶活性蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酚氧化酶活性蛋白的制备方法。本发明是以制备鲎试剂残留的废血浆为原料，通过饱和硫酸铵溶液盐析蛋白质，冷冻离心得鲎血蓝蛋白，再将血蓝蛋白的PBS溶液通过MW3500Da透析袋透析除盐，经SephacrylS‑100丙烯葡聚糖凝胶柱纯化、浓缩处理获得高效酚氧化酶活性血蓝蛋白，其反应初速度Vi=74.52 nmol·（min·mg）。本发明获得的产品纯度、活性高，可以用于制备高效，简便，成本低的酚类污染物的微型检测器；本发明制备方法简单，采用MW3500Da透析袋和SephacrylS‑100丙烯葡聚糖凝胶柱相配合的方式可同时达到脱盐、分离、纯化和浓缩的效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种活性蛋白的制备方法，具体是一种酚氧化酶活性蛋白的制备方法，属于天然活性物质提取技术领域。
背景技术
酚类主要包括苯酚、甲酚、氨基酚、二硝基邻甲酚、荼酸和五氯酚等，酚主要来源于炼焦、炼油、制造煤气、酚、绝缘材料、药、造纸等生产过程中排出的废气和废水。酚是一种中等强度的化学毒物，是恶臭物质，可经消化道、呼吸道和皮肤粘膜侵入人体，与细胞原生质中的蛋白结合，使细胞失去活力；同时，酚还对神经、泌尿、消化系统有毒害作用，低浓度可引起蓄积性慢性中毒，高浓度可引起急性中毒以致昏迷死亡。酚被列入美国环境保护署（EPA）公布的水环境中129种优先控制污染物之一，具有长效性和生物积累性，即使在低浓度下也是有毒的，不仅会对水生生物造成很大伤害，而且会对人类造成几种全身性疾病。
酚类污染是指酚类对环境造成的污染。由于酚的用途极为广泛，谨防酚的外泻，预防其污染的工作很困难。目前，酚类化合物的检测和测定方法主要有：色谱分析法﹑光谱分析法﹑免疫分析法和电化学分析法。色谱法和光谱法以其准确度高灵敏度高等优点成为酚类物质的主要检测方法，但其设备复杂昂贵。免疫分析法减少了样品前处理步骤，可实现高通量筛选，成本低等优点。电化学分析法可以用于连续，自动及其遥控测定具有灵敏度高，选择性好，设备简单，操作方便等优点受到越来越多的关注。
酚氧化酶是一种化学物质，是在分子氧存在下，能把酚类氧化成邻苯醌，或对苯醌的酶。现有技术中，利用多酚氧化酶制备生物酶传感器用于检测废水中的酚类。随着检测技术的发展，快速简单有效的测定方法将是今后酚类污染物检测技术的重要发展趋势。
酚氧化酶几乎存在于所有的机体中，执行一些重要的生物功能，例如，它对植物和节肢动物体内黑色素的合成、皮肤和毛发色素的沉淀、果实的着色和伤口的愈合有促进作用。研究证实，血蓝蛋白在物理化学性质﹑基因序列和蛋白质结构上和酚氧化酶非常相似。
血蓝蛋白又称血蓝素，是一种多功能蛋白，一般认为，血蓝蛋白的主要生物学功能与机体内的输氧有关，它与血红蛋白和蚯蚓血红蛋白并称为动物界的三种呼吸蛋白。但近年来的一些研究表明，血蓝蛋白是一种多功能蛋白，它不仅具有输氧功能，而且还和能量的储存，渗透压的维持以及蜕皮过程的调节有关。特别引起学术界的重视的是，血蓝蛋白还具有酚氧化酶活性、抗菌活性、抗肿瘤活性、凝集活性等多种非特异性免疫学活性，被认为是节肢动物和软体动物中的一种重要的免疫分子。
近几年人们发现血蓝蛋白在一定的条件下也可以表现出来酚氧化酶的活性。严芳等发现凡纳滨对虾血蓝蛋白在胰蛋白酶诱导下可表现出酚氧化酶的活性，其活性会被不同的糖所抑制；而陈锋菊等发现锯缘青蟹血蓝蛋白在没有任何诱导物的情况下表现出酚氧化酶活性，Ca2+和Cu2+能使血蓝蛋白的酚氧化酶有显著增强。现有很多研究报道了酚氧化酶的体内和体外的激活机制，也有部分学者尝试用不同的激活剂来激活血蓝蛋白的酚氧化酶活性，比如盐，尿素，醇，金属离子等，其中，十二烷基磺酸钠（SDS）是应用得最多的一个激活剂；研究者们发现淡水小龙虾、日本帝王蟹、黄道蟹等的血蓝蛋白既可在胰蛋白酶又可在SDS诱导下表现出酚氧化酶活性；Siddiqui等还证实了螺旋状的β-血蓝蛋白及亚基或功能单位在蛋白酶或SDS的诱导下均可表现出不同程度的酚氧化酶活性。血蓝蛋白在一定条件下可以向结构相似的酚氧化酶发生转变，这说明了血蓝蛋白是节肢动物和软体动物中的一种相当重要的潜在的免疫分子。
发明内容
本发明的目的在于提供一种酚氧化酶活性蛋白的制备方法，该方法是以制备鲎试剂后的鲎的废血浆为原料，获得的酚氧化酶活性蛋白具有高效的酚氧化酶活性，可用于超微量酚生物检测器的研制，有助于对酚的预警和检测。
本发明技术方案如下：一种酚氧化酶活性蛋白的制备方法，包括如下具体步骤：
（1）取鲎血浆置于10℃的水浴中，滴加入100%的饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，滴加完后，置于冰箱4℃冷藏室中静置1小时；
（2）静置1小时后取出，用高速冷冻离心机，在4℃、10000-12000r/min条件下，离心25-35min，得鲎血浆血蓝蛋白，4℃保存，备用；
（3）取步骤（2）制得的鲎血浆血蓝蛋白溶于0.01mol/L、pH=7的PBS缓冲液，装入MW3500Da透析袋中，透析过夜，收集得血蓝蛋白溶液，4℃保存，备用；
（4）将步骤（3）收集的血蓝蛋白溶液过SephacrylS-100丙烯葡聚糖凝胶柱纯化，用50mmol/L、pH=7.0的Tris-HCl洗脱，收集在280nm处有吸收的溶液，得到血蓝蛋白溶液为酚氧化酶活性蛋白；
（5）在步骤（4）获得的酚氧化酶活性蛋白中加入10uL的十二烷基硫酸钠（SDS）溶液进行激活，激活条件为：pH6.0-6.4，操作温度30-40℃。
优选的，步骤（1）所述鲎血浆与100%的饱和硫酸铵溶液的物料比是0.6-0.7:1。
进一步优选的，步骤（1）所述取鲎血浆与100%的饱和硫酸铵溶液的物料比是0.68:1。
优选的，步骤（2）所述高速冷冻离心机在11000r/min条件下，离心30min。
优选的，步骤（3）所述鲎血浆血蓝蛋白溶于PBS缓冲液时，蛋白浓度为10 mg/mL。
优选的，步骤（5）所述十二烷基硫酸钠（SDS）溶液浓度为30mmol/L，激活条件为：pH6.2，操作温度37℃。
本发明最优的技术方案为如下步骤：
（1）取鲎血浆置于10℃的水浴中，滴加入100%的饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，滴加完后，置于冰箱4℃冷藏室中静置1小时；鲎血浆与100%的饱和硫酸铵溶液的物料比是0.68:1；
（2）静置1小时后取出，用高速冷冻离心机，在4℃、11000r/min条件下，离心30min，得鲎血浆血蓝蛋白，4℃保存，备用；
（3）取鲎血浆血蓝蛋白溶于0.01mol/L、pH=7的PBS，装入MW3500Da透析袋中，透析过夜，收集溶液，4℃保存，备用；
（4）将步骤（3）收集的溶液过SephacrylS-100丙烯葡聚糖凝胶柱纯化，用50mmol/L、pH=7.0的Tris-HCl洗脱，收集在280nm处有吸收的溶液，得到血蓝蛋白溶液为酚氧化酶活性蛋白；
（5）在步骤（4）获得的酚氧化酶活性蛋白中加入10uL浓度为30mmol/L的十二烷基硫酸钠（SDS）溶液进行激活，激活条件为：pH6.2，操作温度37℃，此时，获得的血蓝蛋白酚氧化酶活性最强，Vi=74.52 nmol·（min·mg）。
本发明的技术点在于，先用100%的饱和硫酸铵溶液进行盐析，再采用MW3500Da透析袋和SephacrylS-100丙烯葡聚糖凝胶柱纯化获得血蓝蛋白，在十二烷基硫酸钠（SDS）激活下血蓝蛋白显示较强酚氧化酶活性。
相比与现有技术，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明通过100%的饱和硫酸铵溶液盐析获得鲎血浆中的血蓝蛋白，制备方法简单；获得的产品可以用于制备高效，简便，成本低的酚类污染物的微型检测器；
（2）采用MW3500Da透析袋和SephacrylS-100丙烯葡聚糖凝胶柱相配合的方式，大大提高产品纯度；同时还达到了脱盐、分离、纯化和浓缩的效果，简化生产工艺；
（3）经本发明制备方法步骤（4）获得的酚氧化酶活性蛋白本身具有酚氧化酶活性，当加入激活剂十二烷基硫酸钠（SDS）激活之后其酚氧化酶活性增强；激活后的蛋白与不加激活剂的对照组中国鲎血蓝蛋白相比，活性提高了8%。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，本发明实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
实施例1采用以下步骤制备：
（1）取40ml鲎血浆置于10℃的水浴中，滴加入57.7ml 100%的饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，滴加完后，置于冰箱4℃冷藏室中静置1小时；
（2）静置1小时后取出，用高速冷冻离心机，在4℃、11000r/min条件下，离心30min，得鲎血浆血蓝蛋白，4℃保存，备用；
（3）取鲎血浆血蓝蛋白溶于0.01mol/L、pH=7的PBS缓冲液中（蛋白浓度为10mg/mL），装入MW3500Da透析袋中，透析过夜，收集溶液，4℃保存，备用；
（4）将步骤（3）收集的溶液过SephacrylS-100丙烯葡聚糖凝胶柱纯化，用50mmol/L、pH=7.0的Tris-HCl洗脱，收集在280nm处有吸收的溶液，得到血蓝蛋白溶液为酚氧化酶活性蛋白；
（5）在步骤（4）获得的酚氧化酶活性蛋白中加入10uL浓度为30mmol/L的十二烷基硫酸钠（SDS）溶液进行激活，激活条件为：pH6.2，操作温度37℃，此时，获得的血蓝蛋白酚氧化酶活性Vi=74.52 nmol·（min·mg）。
实施例2 采用以下步骤制备：
（1）取40ml鲎血浆置于10℃的水浴中，滴加入57.7ml 100%的饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，滴加完后，置于冰箱4℃冷藏室中静置1小时；
（2）静置1小时后取出，用高速冷冻离心机，在4℃、11000r/min条件下，离心30min，得鲎血浆血蓝蛋白，4℃保存，备用；
（3）取鲎血浆血蓝蛋白溶于0.01mol/L、pH=7的PBS缓冲液（蛋白浓度为10 mg/mL），装入MW3500Da透析袋中，透析过夜，收集溶液，4℃保存，备用；
（4）将步骤（3）收集的溶液过SephacrylS-100丙烯葡聚糖凝胶柱纯化，用50mmol/L、pH=7.0的Tris-HCl洗脱，收集在280nm处有吸收的溶液，得到血蓝蛋白溶液为酚氧化酶活性蛋白；
（5）在步骤（4）获得的酚氧化酶活性蛋白中加入10uL浓度为30mmol/L的尿素溶液进行激活，激活条件为：pH6.2，操作温度37℃，此时，获得的血蓝蛋白酚氧化酶活性Vi=57.46 nmol·（min·mg）。
实施例3采用以下步骤制备：
（1）取40ml鲎血浆置于10℃的水浴中，滴加入57.7ml 100%的饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，滴加完后，置于冰箱4℃冷藏室中静置1小时；
（2）静置1小时后取出，用高速冷冻离心机，在4℃、11000r/min条件下，离心30min，得鲎血浆血蓝蛋白，4℃保存，备用；
（3）取鲎血浆血蓝蛋白溶于0.01mol/L、pH=7的PBS缓冲液（蛋白浓度为10 mg/mL），装入MW3500Da透析袋中，透析过夜，收集溶液，4℃保存，备用；
（4）将步骤（3）收集的溶液过SephacrylS-100丙烯葡聚糖凝胶柱纯化，用50mmol/L、pH=7.0的Tris-HCl洗脱，收集在280nm处有吸收的溶液，得到血蓝蛋白溶液为酚氧化酶活性蛋白；
（5）在步骤（4）获得的酚氧化酶活性蛋白中加入10uL浓度为30mmol/L的胰蛋白酶溶液进行激活，激活条件为：pH6.2，操作温度37℃，此时，获得的血蓝蛋白酚氧化酶活性Vi=49.17nmol·（min·mg）。
实施例4 采用以下步骤制备：
（1）取40ml鲎血浆置于10℃的水浴中，滴加入57.7ml 100%的饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，滴加完后，置于冰箱4℃冷藏室中静置1小时；
（2）静置1小时后取出，用高速冷冻离心机，在4℃、11000r/min条件下，离心30min，得鲎血浆血蓝蛋白，4℃保存，备用；
（3）取鲎血浆血蓝蛋白溶于0.01mol/L、pH=7的PBS缓冲液（蛋白浓度为10 mg/mL），装入MW3500Da透析袋中，透析过夜，收集溶液，4℃保存，备用；
（4）将步骤（3）收集的溶液过SephacrylS-100丙烯葡聚糖凝胶柱纯化，用50mmol/L、pH=7.0的Tris-HCl洗脱，收集在280nm处有吸收的溶液，得到血蓝蛋白溶液为酚氧化酶活性蛋白；
（5）在步骤（4）获得的酚氧化酶活性蛋白中不加入任何激活剂，调节pH6.2，操作温度37℃时，血蓝蛋白酚氧化酶活性Vi=69.00 nmol·（min·mg）。
实施例5 采用以下步骤制备：
（1）取40ml鲎血浆置于10℃的水浴中，滴加入57.7ml 100%的饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，滴加完后，置于冰箱4℃冷藏室中静置1小时；
（2）静置1小时后取出，用高速冷冻离心机，在4℃、11000r/min条件下，离心30min，得鲎血浆血蓝蛋白，4℃保存，备用；
（3）取鲎血浆血蓝蛋白溶于0.01mol/L、pH=7的PBS缓冲液（蛋白浓度为10mg/mL），装入MW3500Da透析袋中，透析过夜，收集溶液，4℃保存，备用；
（4）将步骤（3）收集的溶液过SephacrylS-100丙烯葡聚糖凝胶柱纯化，用50mmol/L、pH=7.0的Tris-HCl洗脱，收集在280nm处有吸收的溶液，得到血蓝蛋白溶液为酚氧化酶活性蛋白；
（5）在步骤（4）获得的酚氧化酶活性蛋白中加入10uL浓度为30mmol/L的十二烷基硫酸钠（SDS）溶液进行激活，激活条件为：pH6.2，操作温度40℃，此时，获得的血蓝蛋白酚氧化酶活性Vi=40.20 nmol·（min·mg）。
实施例6 采用以下步骤制备：
（1）取40ml鲎血浆置于10℃的水浴中，滴加入57.7ml 100%的饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，滴加完后，置于冰箱4℃冷藏室中静置1小时；
（2）静置1小时后取出，用高速冷冻离心机，在4℃、11000r/min条件下，离心30min，得鲎血浆血蓝蛋白，4℃保存，备用；
（3）取鲎血浆血蓝蛋白溶于0.01mol/L、pH=7的PBS缓冲液（蛋白浓度为10mg/mL），装入MW3500Da透析袋中，透析过夜，收集溶液，4℃保存，备用；
（4）将步骤（3）收集的溶液过SephacrylS-100丙烯葡聚糖凝胶柱纯化，用50mmol/L、pH=7.0的Tris-HCl洗脱，收集在280nm处有吸收的溶液，得到血蓝蛋白溶液为酚氧化酶活性蛋白；
（5）在步骤（4）获得的酚氧化酶活性蛋白中加入10uL浓度为30mmol/L的十二烷基硫酸钠（SDS）溶液进行激活，激活条件为：pH6.4，操作温度37℃，此时，获得的血蓝蛋白酚氧化酶活性Vi=23.16 nmol·（min·mg）。
表1 不同激活条件下的血蓝蛋白酚氧化酶活性对比
| 项目 | 激活剂 | pH | 温度 | Vi [nmol·（min·mg）] |
| 实施例1 | 十二烷基硫酸钠 | 6.2 | 37℃ | 74.52 |
| 实施例2 | 尿素 | 6.2 | 37℃ | 57.46 |
| 实施例3 | 胰蛋白酶 | 6.2 | 37℃ | 49.17 |
| 实施例4 | 无 | 6.2 | 37℃ | 69.00 |
| 实施例5 | 十二烷基硫酸钠 | 6.2 | 40℃ | 40.20 |
| 实施例6 | 十二烷基硫酸钠 | 6.4 | 37℃ | 23.16 |
Claims (4)
1.一种酚氧化酶活性蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）取鲎血浆置于10℃的水浴中，滴加入100%的饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，滴加完后，置于冰箱4℃冷藏室中静置1小时；
（2）静置1小时后取出，用高速冷冻离心机，在4℃、10000-12000r/min条件下，离心25-35min，得鲎血浆血蓝蛋白，4℃保存，备用；
（3）取步骤（2）制得的鲎血浆血蓝蛋白溶于0.01mol/L、pH=7的PBS缓冲液，装入MW3500Da透析袋中，透析过夜，收集得血蓝蛋白溶液，4℃保存，备用；
（4）将步骤（3）收集的血蓝蛋白溶液过SephacrylS-100丙烯葡聚糖凝胶柱纯化，用50mmol/L、pH=7.0的Tris-HCl洗脱，收集在280nm处有吸收的溶液，得到血蓝蛋白溶液为酚氧化酶活性蛋白；
（5）在步骤（4）获得的酚氧化酶活性蛋白中加入10uL的十二烷基硫酸钠（SDS）溶液进行激活，激活条件为：pH6.2，操作温度37℃；
步骤（1）所述鲎血浆与100%的饱和硫酸铵溶液的物料比是0.6-0.7:1；
步骤（5）所述十二烷基硫酸钠（SDS）溶液浓度为30mmol/L。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述取鲎血浆与100%的饱和硫酸铵溶液的物料比是0.68:1。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述高速冷冻离心机在11000r/min条件下，离心30min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述鲎血浆血蓝蛋白溶于PBS缓冲液时，蛋白浓度为10 mg/mL。
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