CN106942278A - 一种从鲎试剂生产废料中提取抑菌组合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从鲎试剂生产废料中提取抑菌组合物的方法，方法包括：(1)原料处理，将鲎试剂生产过程中乳化物离心后的下层沉淀丢弃物作为原料备用，将鲎试剂生产过程中丢弃的血浆作为原料备用；(2)鲎素肽粗提液的制备，包括：酸解、调pH去沉淀及热变性处理；(3)血浆中血蓝蛋白粗提液的制备；(4)血浆中SOD粗提液的制备；(5)将上述三种粗提液按60‑80份的鲎素肽粗提液，10‑20份的血蓝蛋白粗提液，10‑20份的SOD粗提液混合，调节pH值4‑5后过滤，得到最终形式的抑菌组合物。本发明中各种粗提液采用快速，便捷的低成本提取方式，最终得到的抑菌组合物能有效的抑制各类细菌及真菌的生长，较传统化学抑菌产品而言，更为安全温和有效，无毒副作用，能避免常规抑菌产品耐药性和过敏现象的发生。
Description
技术领域
本发明涉及鲎试剂废料再提取技术领域，具体是一种从鲎试剂生产废料中提取抑菌组合物的方法。
背景技术
鲎，又称马蹄蟹，是一种生活在海洋中的大型底栖节肢动物,从早古生代的奥陶纪出现至今已有4亿多年的历史,是动物界具有独特进化地位的“活化石”之一。鲎是无脊椎动物血液学研究的绝好材料,也是目前鲎资源开发利用和鲎试剂研制的主要原材料,一直受到日、美等国学者的高度重视。随着对鲎血淋巴的免疫功能研究以及和其他无脊椎动物血淋巴的免疫学比较研究,尤其是从鲎血淋巴中分离出许多具有抗菌、抗病毒的活性物质。总体而言，鲎作为一种具有巨大医药开发潜力的重要资源，为世界各国高技术产业所瞩目。
目前鲎的主要用途是制备鲎试剂。鲎血细胞中的颗粒细胞中含有能与内毒素起凝集作用的酶系统。根据此原理，世界各国研究人员经不懈努力，开发出了用于药品细菌内毒素检测的鲎试剂。同时，鲎试剂还能被β-葡聚糖激活，而1-3-β-D葡聚糖是真菌细胞壁的特有成分，从而鲎试剂亦被开发应用于检测深度真菌感染。但鲎试剂的提取过程中仅利用到了鲎血细胞，剩余的其他成分并未得到有效开发利用。鲎试剂的提取过程由各生产厂家依情况而定，大致工艺包括：
a鲎细胞裂解液的配制：裂解液为Tris-HCl,NaCl缓冲液。其中，所述缓冲液为pH7-8，NaCl，Tris-HCl可根据实际情况调节，一般为50mmol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl；
b鲎细胞的裂解乳化：取全血离心后的鲎细胞，按1:5-1:8.5的比例加入鲎细胞裂解液，使用高速匀浆机匀浆5-20分钟，即得鲎细胞裂解乳化物。
c鲎细胞裂解液分离提纯：将上述乳化物低温离心25-30分钟，取上清液，分装备用，即为鲎细胞裂解液。向裂解液中以1:1-1:2的比例加入氯仿溶液，低温搅拌离心后，仔细取出上清液备用。
d制剂：取c步骤中最终上清液，各生产厂家根据自身情况，向其中添加多肽显色基质，低温搅拌分装后，真空冷冻干燥后即得鲎试剂。
另外，由上述鲎试剂的提取过程，也可看出，作为鲎全血的另一组成部分，鲎血浆并未得到有效利用，而是直接被废弃。
抗菌肽是动植物体内组成性表达或诱导产生的天然免疫物质,是机体先天性免疫的重要组成部分。抗菌肽对病原微生物具有选择性毒性，杀菌快速，广谱抗菌且微生物不易产生抗性。目前人们已从鲎血淋巴中分离得到多种抗菌肽，即鲎素肽，对于大批量鲎素肽的医用提取，其提取步骤与鲎试剂的提取过程有所不同，鲎素肽即可以从鲎细胞中获得，也可以从鲎试剂提取的废料中获得。提取步骤主要包括：
a.将鲎血细胞或鲎试剂提取废料悬浮于Tris-HCl,NaCl缓冲液匀浆。
b.离心30min，弃上清液，所收集的沉淀用同一缓冲液洗两次；
c.酸解：洗涤后的沉淀以固液比例1:6.5-8的比例加入酸液匀浆，匀浆离心收集上清液，沉淀用酸液重提收集上清反复3次，3次收集的上清液即为鲎血细胞酸抽提液；
d.提纯：鲎素肽的提纯方法不一，对上述酸抽提液，或经凝胶过滤后洗脱获得单一鲎素肽，或经热变性后超滤获得高纯鲎素肽。
若由鲎细胞中直接提取鲎素肽，与从鲎试剂废料中提取鲎素肽相比，最终获得的鲎素肽含量较高，但是由于与上述鲎试剂提取中的原料(鲎细胞)冲突，导致提取本身的成本昂贵。若直接从鲎试剂废料中提取鲎素肽，则鲎素肽含量较低，且后续纯化中步骤繁琐，工艺成本较高，所以对于医用鲎素肽来说，如何简易的获取鲎素肽，仍旧是一大难点。
鉴于上述背景技术，为了避免资源浪费，如何对鲎试剂生产废料进行再提取，从中获得更多可利用的生物活性物质，就显得十分必要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中鲎试剂生产废料浪费的现状，提供一种从鲎试剂生产废料中提取抑菌组合物的方法。
本发明实现目的的技术方案如下：
一种从鲎试剂生产废料中提取抑菌组合物的方法，该方法包括步骤如下：
(1)原料处理
a.收集鲎全血，
b.分离鲎血细胞及血浆，其中，鲎血细胞先用于鲎试剂生产，在鲎试剂生产过程的鲎血细胞裂解分纯的工艺中，将乳化物离心后的下层沉淀丢弃物作为原料备用，将鲎试剂生产过程中丢弃的血浆作为原料备用；
(2)鲎素肽粗提液的制备
a.酸解：将鲎细胞乳化物离心后的下层沉淀以固液比例1:6.5-8.0的比例加入20mmol/L的酸液，低温超声破碎，破碎条件为：每100ml超声波输出功率为700W，超声波总作用时间为10min,每次超声作用时间为10S，反复超声3次，收集上清液即为细胞酸抽提液；
b.调pH去沉淀：将酸抽提液用NaOH调节pH至6.5，离心除沉淀，得上清液；
c.热变性处理：上清液沸水浴处理5-10min,4℃下离心弃沉淀收集上清液，上清液用0.22uM膜过滤得鲎素肽粗提液；
(3)血浆中血蓝蛋白粗提液的制备
将上述步骤(1)中的血浆经300000g超离心3.5h，即得到初步提纯的血蓝蛋白沉淀，将沉淀再溶于pH7.0，0.2mol/L磷酸缓冲液中，即为血蓝蛋白粗提液；
(4)血浆中SOD粗提液的制备
按质量份数计，取100份上述步骤(1)中的鲎血浆，加入34份0.05mol/L磷酸盐缓冲液和100份0.9％NaCl溶液，轻轻搅拌混匀，将混合液置于65℃水浴锅中，恒温20min后，急冷至10℃，离心去除沉淀，取上清液，即为SOD粗提液；
(5)粗提液的混合
将上述三种粗提液按60-80份的鲎素肽粗提液，10-20份的血蓝蛋白粗提液，10-20份的SOD粗提液混合，使用pH调节剂调节pH值4-5后过滤，得到最终形式的抑菌组合物。
而且，所述步骤(5)中的pH调节剂为柠檬酸、柠檬酸钠、乳酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、硼酸、硼砂中的一种或多种的组合。
而且，作为所述抑菌组合物，鲎素肽粗提液﹕血蓝蛋白粗提液﹕SOD粗提液的最佳配比为：8﹕1﹕1或6﹕2﹕2。
本发明的优点和效果是：
1、本专利对鲎试剂生产废料进行了充分提取。主要提取了鲎血细胞提取废料中的鲎素肽及血浆中的血蓝蛋白及超氧化物歧化酶(SOD)等成分，将其混合后用于其他产品的制备,
2、由于本发明发法的最终抑菌组合物应用的领域为一般性日常抗菌，消炎，防腐性领域，因此，鲎素肽的提取采用的是快速，便捷的低成本提取方式，提取出的鲎素肽粗提液完全能够满足日常性抗菌，消炎，防腐性用品的需要。
2、本专利方法获得的组合物能有效的抑制各类细菌及真菌的生长。较传统化学抑菌产品而言，更为安全温和有效，无毒副作用，能避免常规抑菌产品耐药性和过敏现象的发生。
具体实施方式
下面结合具体实施方案对本发明进一步说明，其具体实施方案应该理解为仅为举例说明，不是限定性的，不能以下述举例说明来限定本发明的保护范围。
一种从鲎试剂生产废料中提取抑菌组合物的方法，该方法包括步骤如下：
(1)原料处理
a.收集鲎全血，
b.分离鲎血细胞及血浆，其中，鲎血细胞先用于鲎试剂生产，在对鲎试剂生产过程的鲎血细胞裂解分纯的工艺中，将乳化物离心后的丢弃物下层沉淀作为原料备用，将鲎试剂生产过程中丢弃的血浆作为原料备用；
(2)鲎素肽粗提液的制备
a.酸解：将鲎细胞乳化物离心后的下层沉淀以固液比例1:6.5-8的比例加入酸液(20mmol/L)，低温超声破碎，破碎条件为：每100ml超声波输出功率为700W，超声波总作用时间为10min,每次超声作用时间为10S。反复超声3次，收集上清液即为细胞酸抽提液；
b.调pH去沉淀：将抽提液用NaOH调节pH至6.5，离心除沉淀，得上清液；
c.热变性处理：上清液沸水浴处理5-10min,4℃下离心弃沉淀收集上清液，上清液用0.22uM膜过滤得鲎素肽粗提液；
(3)血浆中血蓝蛋白粗提液的制备
将上述步骤(1)中的血浆经300000g超离心3.5h，即得到初步提纯的血蓝蛋白沉淀，将沉淀再溶于pH7.0，0.2mol/L磷酸缓冲液中，即为血蓝蛋白粗提液；
(4)血浆中SOD粗提液的制备
按质量份数计，取100份上述步骤(1)中的鲎血浆，加入34份0.05mol/L磷酸盐缓冲液和100份0.9％NaCl溶液，轻轻搅拌混匀，将混合液置于65℃水浴锅中，恒温20min后，急冷至10℃，离心去除沉淀，取上清液，即为SOD粗提液；
(5)粗提液的混合
将上述三种粗提液按60-80份的鲎素肽粗提液，10-20份的血蓝蛋白提取液，10-20份的SOD提取液混合，使用pH调节剂调节pH值4-5后过滤，得到最终形式的抑菌组合物。
其中，所述pH调节剂为柠檬酸、柠檬酸钠、乳酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、硼酸、硼砂中的一种或多种的组合。
实例1
(1)原料处理
a.收集鲎全血，
b.分离鲎血细胞及血浆，其中，鲎血细胞先用于鲎试剂生产，在对鲎试剂生产过程的鲎血细胞裂解分纯的工艺中，将乳化物离心后的丢弃物下层沉淀作为原料备用，将鲎试剂生产过程中丢弃的血浆作为原料备用；
(2)鲎素肽粗提液的制备
a.酸解：将鲎细胞乳化物离心后的下层沉淀以固液比例1:6.5的比例加入酸液(20mmol/L)，低温超声破碎，破碎条件为：每100ml超声波输出功率为700W，超声波总作用时间为10min,每次超声作用时间为10S。反复超声3次，收集上清液即为细胞酸抽提液；
b.调pH去沉淀：将抽提液用NaOH调节pH至6.5，离心除沉淀，得上清液；
c.热变性处理：上清液沸水浴处理5-10min,4℃下离心弃沉淀收集上清液，上清液用0.22uM膜过滤得鲎素肽粗提液。
(3)血浆中粗提液的制备
取上述备用的血浆，血浆经300000g超离心3.5h，即得到初步提纯的血蓝蛋白沉淀。将沉淀再溶于pH7.0，0.2mol/L磷酸缓冲液中，即为血蓝蛋白粗提液。
(4)SOD粗提液的制备
按质量份数计，取上述备用的血浆100份鲎血浆，加入34份,0.05mol/L磷酸盐缓冲液和100份0.9％NaCl溶液，轻轻搅拌混匀。将混合液置于65℃水浴锅中，恒温20min后，急冷至10℃，离心去除沉淀，取上清液。即为SOD粗提液。
(5)粗提液的混合
将上述三种粗提液按60份的鲎素肽粗提液，20份的血蓝蛋白提取液，20份的SOD提取液混合，并调节pH后过滤，得到最终形式的抑菌组合物。
实例2
(1)原料处理
a.收集鲎全血，
b.分离鲎血细胞及血浆，其中，鲎血细胞先用于鲎试剂生产，在对鲎试剂生产过程的鲎血细胞裂解分纯的工艺中，将乳化物离心后的丢弃物下层沉淀作为原料备用，将鲎试剂生产过程中丢弃的血浆作为原料备用；
(2)鲎素肽粗提液的制备
a.酸解：将鲎细胞乳化物离心后的下层沉淀以固液比例1:8的比例加入酸液(20mmol/L)，低温超声破碎，破碎条件为：每100ml超声波输出功率为700W，超声波总作用时间为10min,每次超声作用时间为10S。反复超声3次，收集上清液即为细胞酸抽提液；
b.调pH去沉淀：将抽提液用NaOH调节pH至6.5，离心除沉淀，得上清液；
c.热变性处理：上清液沸水浴处理5-10min,4℃下离心弃沉淀收集上清液，上清液用0.22uM膜过滤得鲎素肽粗提液。
(3)血浆中粗提液的制备
取上述备用的血浆，血浆经300000g超离心3.5h，即得到初步提纯的血蓝蛋白沉淀。将沉淀再溶于pH7.0，0.2mol/L磷酸缓冲液中，即为血蓝蛋白粗提液。
(4)SOD粗提液的制备
按质量份数计，取上述备用的血浆100份鲎血浆，加入34份,0.05mol/L磷酸盐缓冲液和100份0.9％NaCl溶液，轻轻搅拌混匀。将混合液置于65℃水浴锅中，恒温20min后，急冷至10℃，离心去除沉淀，取上清液。即为SOD粗提液。
(5)粗提液的混合
将上述三种粗提液按80份的鲎素肽粗提液，10份的血蓝蛋白提取液，10份的SOD提取液混合，并调节pH后过滤，得到最终形式的抑菌组合物。
实例3
(1)原料处理
a.收集鲎全血，
b.分离鲎血细胞及血浆，其中，鲎血细胞先用于鲎试剂生产，在对鲎试剂生产过程的鲎血细胞裂解分纯的工艺中，将乳化物离心后的丢弃物下层沉淀作为原料备用，将鲎试剂生产过程中丢弃的血浆作为原料备用；
(2)鲎素肽粗提液的制备
a.酸解：将鲎细胞乳化物离心后的下层沉淀以固液比例1:7的比例加入酸液(20mmol/L)，低温超声破碎，破碎条件为：每100ml超声波输出功率为700W，超声波总作用时间为10min,每次超声作用时间为10S。反复超声3次，收集上清液即为细胞酸抽提液；
b.调pH去沉淀：将抽提液用NaOH调节pH至6.5，离心除沉淀，得上清液；
c.热变性处理：上清液沸水浴处理5-10min,4℃下离心弃沉淀收集上清液，上清液用0.22uM膜过滤得鲎素肽粗提液。
(3)血浆中粗提液的制备
取上述备用的血浆，血浆经300000g超离心3.5h，即得到初步提纯的血蓝蛋白沉淀。将沉淀再溶于pH7.0，0.2mol/L磷酸缓冲液中，即为血蓝蛋白粗提液。
(4)SOD粗提液的制备
按质量份数计，取上述备用的血浆100份鲎血浆，加入34份,0.05mol/L磷酸盐缓冲液和100份0.9％NaCl溶液，轻轻搅拌混匀。将混合液置于65℃水浴锅中，恒温20min后，急冷至10℃，离心去除沉淀，取上清液。即为SOD粗提液。
(5)粗提液的混合
将上述三种粗提液按70份的鲎素肽粗提液，15份的血蓝蛋白提取液，15份的SOD提取液混合，并调节pH后过滤，得到最终形式的抑菌组合物。
抑菌组合物的抑菌试验
A实验材料
由鲎素肽粗提液、血蓝蛋白提取液、SOD提取液组合的抑菌组合物。
B受试菌种
细菌：金黄色葡萄球菌：(Staphylococcus aureus)ATCC 6538
大肠埃希氏菌：(Escherichia coli)ATCC 8739
铜绿假单胞菌：(Pseudomonas.aeruginosa)ATCC 9027
注：上述菌株均由中科院典型培养物保藏委员会微生物菌种库提供。
C培养基
细菌培养基：卵磷脂吐温80-营养琼脂培养基，121℃高压灭菌20min后制成斜面备用。
D菌悬液的制备
实验前将各个菌株分别接种到相应的培养基斜面，细菌(金黄色葡萄球菌，大肠埃希氏菌，铜绿假单胞菌)均于36±1℃恒温培养箱中培养36～48小时。分别挑取适量菌落于无菌生理盐水中混匀，制成一定浓度的混合菌悬液。混合细菌悬液总浓度约为1.0×108cfu/ml。置于4℃贮存备用。
E抑菌组合物抑菌液的制备
按照正交设计法确定各提取液组合的配比，将四种提取液按表1的方案分别进行配制后，备用。
表1抑菌组合物抑菌作用考察因素及水平
F抑菌组合物的抑菌试验
采用滤纸片扩散法，无菌条件下进行，将滤纸用打孔器打成直径6mm的圆形滤纸片，置于洁净干净的小烧杯，121℃干热灭菌20min后，分别放入4种不同比例提取液复配液中充分浸泡，每只试管放入8片备用。将已配制好的固体培养基融化，分别倒入培养皿中，121℃灭菌20min，待冷却凝固后，吸取0.1ml菌悬液于平板上涂布均匀。用无菌镊子分别夹取已在提取物原液中浸泡过的直径为6mm圆形滤纸片，贴在含菌平板上，每个平板内贴5片，以无菌水浸泡的滤纸片作为空白对照，将各培养皿置于37℃恒温培养箱中平板倒置培养24h，测定抑菌圈直径的大小，设3个重复，取其平均值。混合细菌悬液的抑菌圈直径见表2
表2
由抑菌圈大小可以看出，提取液配比为8：1：1或6：2：2时，抑菌作用明显。
Claims (3)
1.一种从鲎试剂生产废料中提取抑菌组合物的方法，其特征在于该方法包括步骤如下：
(1)原料处理
a.收集鲎全血，
b.分离鲎血细胞及血浆，其中，鲎血细胞先用于鲎试剂生产，在鲎试剂生产过程的鲎血细胞裂解分纯的工艺中，将乳化物离心后的下层沉淀丢弃物作为原料备用，将鲎试剂生产过程中丢弃的血浆作为原料备用；
(2)鲎素肽粗提液的制备
a.酸解：将鲎细胞乳化物离心后的下层沉淀以固液比例1:6.5-8.0的比例加入20mmol/L的酸液，低温超声破碎，破碎条件为：每100ml超声波输出功率为700W，超声波总作用时间为10min,每次超声作用时间为10S，反复超声3次，收集上清液即为细胞酸抽提液；
b.调pH去沉淀：将酸抽提液用NaOH调节pH至6.5，离心除沉淀，得上清液；
c.热变性处理：上清液沸水浴处理5-10min,4℃下离心弃沉淀收集上清液，上清液用0.22uM膜过滤得鲎素肽粗提液；
(3)血浆中血蓝蛋白粗提液的制备
将上述步骤(1)中的血浆经300000g超离心3.5h，即得到初步提纯的血蓝蛋白沉淀，将沉淀再溶于pH7.0，0.2mol/L磷酸缓冲液中，即为血蓝蛋白粗提液；
(4)血浆中SOD粗提液的制备
按质量份数计，取100份上述步骤(1)中的鲎血浆，加入34份0.05mol/L磷酸盐缓冲液和100份0.9％NaCl溶液，轻轻搅拌混匀，将混合液置于65℃水浴锅中，恒温20min后，急冷至10℃，离心去除沉淀，取上清液，即为SOD粗提液；
(5)粗提液的混合
将上述三种粗提液按60-80份的鲎素肽粗提液，10-20份的血蓝蛋白粗提液，10-20份的SOD粗提液混合，使用pH调节剂调节pH值4-5后过滤，得到最终形式的抑菌组合物。
2.根据权利要求1所述的从鲎试剂生产废料中提取抑菌组合物的方法，其特征在于：所述步骤(5)中的pH调节剂为柠檬酸、柠檬酸钠、乳酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、硼酸、硼砂中的一种或多种的组合。
3.根据权利要求1所述的从鲎试剂生产废料中提取抑菌组合物的方法，其特征在于：所述抑菌组合物中鲎素肽粗提液﹕血蓝蛋白粗提液﹕SOD粗提液的最佳配比为：8﹕1﹕1或6﹕2﹕2。
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