CN102417896A - 一种金黄色葡萄球菌的噬菌体及其应用 - Google Patents

一种金黄色葡萄球菌的噬菌体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN102417896A
CN102417896A CN201110380587XA CN201110380587A CN102417896A CN 102417896 A CN102417896 A CN 102417896A CN 201110380587X A CN201110380587X A CN 201110380587XA CN 201110380587 A CN201110380587 A CN 201110380587A CN 102417896 A CN102417896 A CN 102417896A
Authority
CN
China
Prior art keywords
phage
streptococcus aureus
food
staphylococcus aureus
cfu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201110380587XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN102417896B (zh
Inventor
史锋
贾静静
李永富
李烨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Xinnong Technology Co., Ltd
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN 201110380587 priority Critical patent/CN102417896B/zh
Publication of CN102417896A publication Critical patent/CN102417896A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102417896B publication Critical patent/CN102417896B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

一种金黄色葡萄球菌的噬菌体，保藏号为：CCTCC M2011409，该噬菌体对金黄色葡萄球菌具有有效的裂解作用；该噬菌体保存条件为：噬菌体培养液过滤除菌后于4℃下可以保存2个月以上，于-70℃下保存于甘油管中可以保存2年以上；所述噬菌体培养液储液浓度为1011pfu/mL；金黄色葡萄球菌的噬菌体的应用：将噬菌体培养液直接喷涂于固体食品的表面，或混合于含菌食品中，用于抑制食品中的金黄色葡萄球菌。噬菌体在含菌料中的添加量为0.0001~100pfu/cfu。本发明可以有效控制食品体系中的金黄色葡萄球菌污染，相对于抗生素和化学防腐剂而言，具有特异性高、无残留和安全的特点。

Description

一种金黄色葡萄球菌的噬菌体及其应用
技术领域
本发明涉及一种噬菌体菌株及其应用，尤其是涉及一种能够抑制金黄色葡萄球菌的噬菌体。 
背景技术
金黄色葡萄球菌是食品中容易污染的一种革兰氏阳性病原菌，尤其是即食食品、冷鲜食品中，它也是医院中极易污染的病原菌。目前，在食品、饲料、医疗等领域中使用的抑制金黄色葡萄球菌的抗菌试剂主要有抗生素和化学防腐剂两类，但由于抗生素的过度使用，已有越来越多的金黄色葡萄球菌对抗生素产生了耐药性，甚至出现了多重耐药性菌株以及万古霉素抗性菌株，且抗生素残留后不易被快速降解。化学防腐剂则难以被人体分解，积累到一定量后可能具有潜在的毒副作用，因此存在安全性隐患。于是需要寻找可替代的、安全的抑菌试剂。 
目前已被发现的可被降解的抑菌试剂主要有溶菌酶、抗菌肽、乳铁蛋白、中草药提取物、特异性噬菌体等。溶菌酶虽然对部分细菌有良好的杀灭效果，但对多数金黄色葡萄菌菌株的抑制效果却很低。噬菌体近年来被认定为安全的抗菌性试剂，其杀菌效果优良、特异性高，允许在食品、医药、饲料等体系中添加使用。噬菌体可以吸附在金黄色葡萄球菌细胞壁表面的特定受体上，进入细胞内部后可以大量增殖，并通过释放出裂解酶而使噬菌体的子代颗粒从宿主中释放出来。而在这个过程中作为噬菌体的宿主菌则被杀死，从而起到控制病原菌金黄色葡萄球菌的目的。噬菌体是一种安全的、特异性高、抑菌效果特别好的抑菌剂。 
发明内容
      针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种金黄色葡萄球菌的噬菌体及其应用。本发明可以有效控制食品体系中的金黄色葡萄球菌污染，相对于抗生素和化学防腐剂而言，具有特异性高、无残留和安全的特点。 
      本发明的技术方案如下： 
一种金黄色葡萄球菌的噬菌体，保藏号为：CCTCC M 2011409，该噬菌体对金黄色葡萄球菌具有有效的裂解作用。该噬菌体保存条件为：噬菌体培养液过滤除菌后于4℃下可以保存2个月以上，于-70℃下保存于甘油管中可以保存2年以上；所述噬菌体培养液储液浓度为1011 pfu/mL。
金黄色葡萄球菌的噬菌体的应用：将噬菌体培养液直接喷涂于固体食品的表面，或混合于含菌食品中，用于抑制食品中的金黄色葡萄球菌。噬菌体在含菌料中的添加量为0.0001~100 pfu/cfu。 
本发明有益的技术效果在于： 
申请人从食品加工厂的污水中通过大量筛选，分离到一株能特异性抑制金黄色葡萄球菌的噬菌体JS01，并对其裂解性能和对食品体系中金黄色葡萄球菌的控制作用进行了大量的研究工作，在此基础上提供了一种利用此噬菌体快速、有效抑制金黄色葡萄球菌的方法。
本抑菌剂仅包含专一性金黄色葡萄球菌噬菌体JS01。噬菌体随食品摄入人体后，可以被消化道内的酶类降解，并吸收、再利用，不会对人体产生任何毒副作用。 
当噬菌体以0.0002~2 pfu/cfu的添加量添加到金黄色葡萄球菌溶液中，可使金黄色葡萄球菌的数量降低4.8~7.7个数量级，对其它细菌则没有影响；当以MOI（MOI，即噬菌体与金黄色葡萄球菌的含量比pfu/cfu）为1的添加量添加到染菌食品中，在1天内可将金黄色葡萄球菌的数量降低4.5~6.0个数量级，抑菌效果优异。 
附图说明
图1为噬菌体JS01对金黄色葡萄球菌ATCC25923的抑制进程； 
图2为不同添加量的噬菌体JS01对金黄色葡萄球菌ATCC25923的抑制效果；
图3为噬菌体JS01对牛奶中病原菌的控制效果；
图4为噬菌体JS01对热狗中病原菌的控制效果。
具体实施方式
本噬菌体JS01保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2011.11.22，保藏编号：CCTCC NO：M 2011409，分类学命名：金黄色葡萄球菌噬菌体JS01 (Staphylococcus phage, dsDNA virus JS01)。 
实施例1：噬菌体的分离、增殖 
噬菌体JS01是从食品加工厂的污水中分离到的。其分离、增殖过程如下：
（1）首先配制所需培养基：LB液体培养基：1L水中加入10g蛋白胨、5g酵母粉、10g NaCl；2×LB液体培养基：1L水中加入20g蛋白胨、10g酵母粉、20g NaCl；底层培养基：LB液体培养基中加入1.5%琼脂粉；上层培养基：LB液体培养基中加入0.7%琼脂粉；
（2）将金黄色葡萄球菌ATCC25923（来自于美国典型培养物保藏中心ATCC）接种到LB液体培养基中，37℃震荡培养10 h，得到金黄色葡萄球菌培养液。
（3）将污水用0.22μm滤膜过滤除菌后，与2×LB液体培养基等体积混合，转入金黄色葡萄球菌培养液中，37℃震荡培养10 h，增殖噬菌体； 
（4）将上述增殖液用0.22μm滤膜过滤除菌后，取1mL过滤液与100??L培养至对数期的金黄色葡萄球菌悬浮液（107 cfu/mL）和3mL保温于45℃的上层培养基混匀后，快速倒入含底层培养基的平板上铺匀，37℃培养24 h，筛选透明圈；
（5）挑取单个透明圈到金黄色葡萄球菌培养液中，37℃震荡培养10h，增殖噬菌体；
（6）将上述增殖液用0.22μm滤膜过滤除菌后，梯度稀释，每个梯度分别取1mL梯度稀释的增殖液，与100??L培养至对数期的金黄色葡萄球菌悬浮液（107 cfu/mL）和3mL保温于45℃的上层培养基混匀后，快速倒入含底层培养基的平板上铺匀，37℃培养24 h，得到噬菌斑；
（7）挑取形态相同的、独立的噬菌斑到金黄色葡萄球菌培养液中，37℃震荡培养10h，培养分离到的噬菌体；
（8）将以上培养液移入无菌离心管中，6000r/min离心30min，取上清液。将0.5mL上清液与1mL培养至对数期的金黄色葡萄球菌培养液和5mL LB液体培养基混合，37℃培养12 h，增殖噬菌体；
（9）按上一个步骤继续增殖噬菌体1次以后，培养液中的噬菌体就可以达到109 pfu/mL以上，将此增殖液经0.22μm滤膜过滤除菌后，就得到噬菌体溶液，可以直接保存于4℃，也可以将0.8mL噬菌体液与0.4mL SM液和0.4mL甘油混合后保存于-72℃。SM液的配制：NaCl 5.8g, MgSO4·7H2O 2g，1mol/L, pH7.5 Tris-HCl 50 mL，2%明胶5mL，加水至1000 mL。0.1MPa高温灭菌20 min。
实施例2：噬菌体JS01对金黄色葡萄球菌ATCC25923的抑制进程 
接种金黄色葡萄球菌ATCC25923至5mL的LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养过夜，以2%的比例接种至50mL的LB液体培养基中，37℃、200rpm下培养至OD600nm为1.2，即培养液中的菌浓为5×108 cfu/mL时，加入含有108 pfu/mL的噬菌体溶液1mL，作用6小时，培养液的OD600nm降低到了0.152，同时活菌数降至4.3×104 cfu/mL，结果见图1所示；
对比试验：不加噬菌体JS01，培养液一直在37℃、200rpm下培养，OD600nm上升至4.414，同时活菌数达到3.8×109 cfu/mL。实施例2与对比试验相比，在噬菌体作用6小时时，活菌数降低5.0 log units，而在噬菌体作用3小时时，活菌数则降低了6.1 log units。
实施例3：噬菌体JS01在不同浓度下对金黄色葡萄球菌ATCC25923的抑菌效果 
接种金黄色葡萄球菌ATCC25923至5mL的LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养过夜，以1%的比例接种至50mL的LB液体培养基中，37℃、200rpm下培养至培养液中的菌液为1×108 cfu/mL时，各加入0、101、102、103、104、105、106、107、108、109、1010 pfu的噬菌体JS01，裂解1h后，测定液体中的活菌数。结果当噬菌体JS01的添加量在106-1010 pfu时，即MOI在0.0002~2时，金黄色葡萄球菌得到有效抑制，活菌数降低4.8~7.7 log units。结果见图2所示。
实施例4：噬菌体JS01对牛奶中病原菌的控制效果 
对于液态食品牛奶，取3mL加入到10mL的灭过菌的试管中，加入109 cfu/mL的金黄色葡萄球菌溶液0.1mL，然后加入109 pfu/mL噬菌体JS01溶液0.1mL，放置到4℃下，每2天测一次液体里面的活菌数，对比实验中以0.1mL无菌水代替0.1mL噬菌体溶液；
实验结果表明：噬菌体JS01作用于牛奶1天后，活菌数降至2×102 cfu/mL，随后的几天活菌数会不断增加上升至1.5×107 cfu/mL；而对比实验中活菌数则维持在0.5~3.2×108 cfu/mL，噬菌体JS01对牛奶中金黄色葡萄球菌的抑制率最高可以达到6.0 log units，结果见图3所示。
实施例5：噬菌体JS01对热狗中病原菌的控制效果 
对于固态食品热狗，用小刀切碎成小块，称取1g到10mL的灭过菌的试管中，然后加入3mL灭过菌的蒸馏水，以及109 cfu/mL的金黄色葡萄球菌溶液0.1mL，最后加入109 pfu/mL噬菌体JS01溶液0.1mL，放置到4℃下，每2天测一次液体里面的活菌数，对比实验中以0.1mL无菌水代替0.1mL噬菌体溶液。
实验结果表明：噬菌体JS01作用于热狗1天后，活菌数降至9.1×103 cfu/mL；而对比实验中活菌数则维持在0.7~5.4×108 cfu/mL，噬菌体JS01对热狗中金黄色葡萄球菌的抑制率最高可以达到4.5 log units，结果见图4所示。 
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，本发明不限于以上实施例。可以理解，本领域技术人员在不脱离本发明构思的前提下直接导出或联想到的其他改进和变化，应包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (4)

1.一种金黄色葡萄球菌的噬菌体，其特征在于保藏号为：CCTCC M 2011409，该噬菌体对金黄色葡萄球菌具有有效的裂解作用。
2.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌的噬菌体，其特征在于该噬菌体保存条件为：噬菌体培养液过滤除菌后于4℃下可以保存2个月以上，于-70℃下保存于甘油管中可以保存2年以上；所述噬菌体培养液储液浓度为1011 pfu/mL。
3.一种如权利要求1所述的金黄色葡萄球菌的噬菌体的应用，其特征在于：将噬菌体培养液直接喷涂于固体食品的表面，或混合于含菌食品中，用于抑制食品中的金黄色葡萄球菌。
4. 根据权利要求3所述的金黄色葡萄球菌的噬菌体的应用，其特征在于：噬菌体在含菌料中的添加量为0.0001~100 pfu/cfu。
CN 201110380587 2011-11-25 2011-11-25 一种金黄色葡萄球菌的噬菌体及其应用 Active CN102417896B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201110380587 CN102417896B (zh) 2011-11-25 2011-11-25 一种金黄色葡萄球菌的噬菌体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201110380587 CN102417896B (zh) 2011-11-25 2011-11-25 一种金黄色葡萄球菌的噬菌体及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102417896A true CN102417896A (zh) 2012-04-18
CN102417896B CN102417896B (zh) 2013-04-17

Family

ID=45942540

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 201110380587 Active CN102417896B (zh) 2011-11-25 2011-11-25 一种金黄色葡萄球菌的噬菌体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102417896B (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105950567A (zh) * 2016-06-14 2016-09-21 苏州埃瑞特生物技术有限公司 一种噬菌体的冻干粉胶囊保存方法
CN105950568A (zh) * 2016-06-14 2016-09-21 苏州埃瑞特生物技术有限公司 一种高质量噬菌体保存保护剂及其制备方法和应用
CN105950570A (zh) * 2016-06-14 2016-09-21 苏州埃瑞特生物技术有限公司 一种噬菌体的保存方法
CN108359643A (zh) * 2017-01-22 2018-08-03 菲吉乐科(南京)生物科技有限公司 新型金黄色葡萄球菌噬菌体及其组合物和应用
CN109082414A (zh) * 2018-06-29 2018-12-25 浙江工业大学 一种金黄色葡萄球菌噬菌体及应用
CN109730235A (zh) * 2019-02-01 2019-05-10 珠海横琴普罗恩能医用食品有限公司 一种用于医用食品的防腐剂

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004020635A1 (ja) * 2002-08-28 2004-03-11 Techno Network Shikoku Co., Ltd. バクテリオファージおよび細菌感染症治療剤
CN100336902C (zh) * 2001-12-13 2007-09-12 雀巢产品有限公司 分离的噬菌体及其在食品或宠物食品中的用途
US20100203019A1 (en) * 2009-02-12 2010-08-12 Intron Biotechnology, Inc. Podoviriedae bacteriophage having killing activity specific to staphylococcus aureus
CN101921734A (zh) * 2010-09-09 2010-12-22 天津科技大学 一种噬菌体层析法纯化方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100336902C (zh) * 2001-12-13 2007-09-12 雀巢产品有限公司 分离的噬菌体及其在食品或宠物食品中的用途
WO2004020635A1 (ja) * 2002-08-28 2004-03-11 Techno Network Shikoku Co., Ltd. バクテリオファージおよび細菌感染症治療剤
US20100203019A1 (en) * 2009-02-12 2010-08-12 Intron Biotechnology, Inc. Podoviriedae bacteriophage having killing activity specific to staphylococcus aureus
CN101921734A (zh) * 2010-09-09 2010-12-22 天津科技大学 一种噬菌体层析法纯化方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李陇平等: "金黄色葡萄球菌烈性噬菌体的分离鉴定和最佳保存方法研究", 《中国畜牧兽医》 *
石琰璟等: "金黄色葡萄球菌噬菌体的分离纯化", 《青岛科技大学学报(自然科学版)》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105950567A (zh) * 2016-06-14 2016-09-21 苏州埃瑞特生物技术有限公司 一种噬菌体的冻干粉胶囊保存方法
CN105950568A (zh) * 2016-06-14 2016-09-21 苏州埃瑞特生物技术有限公司 一种高质量噬菌体保存保护剂及其制备方法和应用
CN105950570A (zh) * 2016-06-14 2016-09-21 苏州埃瑞特生物技术有限公司 一种噬菌体的保存方法
CN108359643A (zh) * 2017-01-22 2018-08-03 菲吉乐科(南京)生物科技有限公司 新型金黄色葡萄球菌噬菌体及其组合物和应用
CN108359643B (zh) * 2017-01-22 2021-07-02 菲吉乐科(南京)生物科技有限公司 新型金黄色葡萄球菌噬菌体及其组合物和应用
CN109082414A (zh) * 2018-06-29 2018-12-25 浙江工业大学 一种金黄色葡萄球菌噬菌体及应用
CN109730235A (zh) * 2019-02-01 2019-05-10 珠海横琴普罗恩能医用食品有限公司 一种用于医用食品的防腐剂

Also Published As

Publication number Publication date
CN102417896B (zh) 2013-04-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105219681B (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM及制备方法和应用
CN102417896B (zh) 一种金黄色葡萄球菌的噬菌体及其应用
CN109337841B (zh) 一株具有高效抑菌性能的枯草芽孢杆菌bys2
CN104403962B (zh) 一株特基拉芽孢杆菌及其防治禾谷镰刀菌方面的应用
CN107236693A (zh) 贝莱斯芽孢杆菌js25r及其应用
CN102703513A (zh) 一种利用超耐硒微生物制备红色单质硒的方法
CN101649298B (zh) 一种消除水产品革兰氏阳性致病菌的蛭弧菌菌株及其应用
CN109439577A (zh) 一株广谱抗菌解淀粉芽孢杆菌及其应用
JP6995408B2 (ja) アフラトキシンを効率的に分解するフラボバクテリウムブレーブバイオコントロール株およびその使用
CN103937681A (zh) 一株食品级黑曲霉及其在玉米赤霉烯酮降解的应用
CN109777755A (zh) 一株暹罗芽孢杆菌dh35及其发酵上清液的应用
CN103320365A (zh) 一株鱼源嗜水气单胞菌拮抗菌株及其应用
CN102994419B (zh) 一种短小芽孢杆菌lnxm12及其应用
CN102559534A (zh) 一种蜡样芽孢杆菌及其制剂和应用
CN103525721B (zh) 具有抑菌能力的益生菌及其应用
CN107964517A (zh) 一种可拮抗多种水产养殖病原菌的芽孢杆菌及其应用
CN113151035A (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌、筛选方法、鉴定方法及应用
CN104845897A (zh) 一种苏云金芽孢杆菌及选育方法及其应用
CN104059869B (zh) 一株海洋解淀粉芽孢杆菌及其培养方法和应用
CN106754751B (zh) 一种肠出血性大肠杆菌噬菌体及其应用
CN103451117B (zh) 一种防治土壤环境病原菌的芽胞杆菌制剂及制备方法和应用
CN112725215A (zh) 一种拮抗梨火疫病原菌的复合菌剂及其制备方法与应用
CN102870818A (zh) 一种用于水产养殖的消毒剂及其制备方法
Mohamed et al. Mutagenesis and inter-specific protoplast fusion between Trichoderma koningii and Trichoderma reesei for biocontrol improvement
CN103087949B (zh) 一株生防内生放线菌——盐屋链霉菌

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20170424

Address after: Songjiang District Jiangtian road 201613 Shanghai City No. 128

Patentee after: SHANGHAI XINNONG FEED CO., LTD.

Address before: No. 1800 road 214122 Jiangsu Lihu Binhu District City of Wuxi Province

Patentee before: Jiangnan University

CP03 Change of name, title or address
CP03 Change of name, title or address

Address after: 201600 No. 4263, Wenxiang Road, Songjiang District, Shanghai

Patentee after: Shanghai Xinnong Technology Co., Ltd

Address before: Songjiang District Jiangtian road 201613 Shanghai City No. 128

Patentee before: SHANGHAI XINNONG FEED Co.,Ltd.