CN105950568A - 一种高质量噬菌体保存保护剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种高质量噬菌体保存保护剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种高质量噬菌体保存保护剂以及该高质量噬菌体保存保护剂的制备和应用方法。其中本发明所述的高质量噬菌体保存保护剂，脱脂奶粉、聚乙二醇、藻蛋白粉、羧甲基纤维素、膨润土形成整个保存保护剂的骨架，还包含多种糖类和盐，组分合理，原料来源广，易于获得，成本低，并且可以用于多种噬菌体的保存，适应性好。本发明所述的高质量噬菌体保存保护剂的制备方法，方法合理，工艺简单易行，效率高，应用成本低，操作简单、易于实现。高质量噬菌体保存保护剂具有极高的应用前景，并且使用方便，应用便捷。

Description

一种高质量噬菌体保存保护剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术和微生物制品领域，具体地，涉及一种高质量噬菌体保存保护剂，以及该高质量噬菌体保存保护剂的制备方法和应用方法。
背景技术
噬菌体是一类能感染细菌、放线菌、螺旋体等微生物的病毒的总称，对一些细菌具有高度的专一性，当噬菌体侵染这些细菌时，可在细菌中繁殖并杀死细菌，而它对动植物没有毒性。随着分子生物学技术的发展，噬菌体已经广泛用于疾病诊断、水处理等多个领域。由于噬菌体可以将基因插入宿主DNA内的特性，使得它还成为了重要的分子和遗传学研究工具。利用噬菌体，可以设计很多精巧的实验。
然而在上述过程中，都需要对噬菌体进行保存，在噬菌体的保存过程中，往往需要加入保存保护剂从而保证噬菌体的活性。现有技术中的保护剂常常保存效果差，噬菌体的保存时间短，存活率低，噬菌体容易被污染，并且必须在低温条件下进行保存，严重制约了对噬菌体应用的发展。
发明内容
发明目的：为了克服以上不足，本发明提供了一种高质量噬菌体保存保护剂以及该高质量噬菌体保存保护剂的制备和应用方法。
技术方案：本发明提供了一种高质量噬菌体保存保护剂，以重量组分计，包括以下组分：
脱脂奶粉 5-12份
聚乙二醇 2-8份
藻蛋白粉 0.2-0.6份
谷氨酸钠 0.3-0.8份
羧甲基纤维素 0.3-0.5份
膨润土 0.08-0.15份
氢氧化铝胶 0.03-0.18份
棉子糖 0.3-1.2份
硫酸镁 0.1-0.6份
氯化钙 0.6-1.2份
硫酸钠 0.3-0.8份
甘露醇 0.5-1.2份
磷酸氢二钾 0.03-0.2份
磷酸二氢钠 0.05-0.3份
甘油 0.02-0.08份
二甲基亚砜 0.01-0.04份
水 100份。
本发明所述的高质量噬菌体保存保护剂，其组分合理，其中脱脂奶粉、聚乙二醇、藻蛋白粉、羧甲基纤维素、膨润土形成整个保存保护剂的骨架，防止低分子物质的碳化和氧化，同时保护活性物质不受温度影响，使保护剂形成多孔性、疏松的海绵状物且具有一定的含水量，在冻存过程中保持原有的构架，从而增加溶解度。此外，多种糖类和盐使噬菌体保持存活状态以及对水分起缓解作用，并且保持电解质浓度。噬菌体保存保护剂可以使噬菌体低温保存下免受溶液损伤和冰晶损伤等物理因素的损伤，并且维持噬菌体极高的存活率和活性，使噬菌体的活动处于半静止或静止状态。此外，保护剂同溶液中的水分子结合，发生水合作用，弱化水的结晶过程使溶液的粘性增加从而减少冰晶的形成，同时冷冻保护剂可以通过在噬菌体内外维持一定的摩尔浓度，降低内外未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤。此外，保护剂还可以在室温条件下用于多种噬菌体的保存，适应性好。
进一步的，上述的高质量噬菌体保存保护剂，以重量组分计，还包括0.2-0.6份的抗氧化剂，
所述抗氧化剂以重量组分计，包括以下组分：
维生素C 2-8份
维生素E 3-10份
硫脲 3-7份
碘化钾 2-5份
硫代硫酸钠 0.3-1份
钼酸铵 0.5-2份。
通过增加抗氧化剂，使噬菌体长期保持温度的存活状态，保存效果好。
进一步的，上述的高质量噬菌体保存保护剂，所述甘油为20％-40％的甘油。20％-40％的甘油流动性好，易于应用。
进一步的，上述的高质量噬菌体保存保护剂，所述的水为去离子水或纯化水。去离子水或纯化水可以保证高质量噬菌体保存保护剂质量稳定、可控。
本发明还提供一种高质量噬菌体保存保护剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将脱脂奶粉、聚乙二醇、藻蛋白粉、谷氨酸钠、棉子糖、硫酸镁和氯化钙加入到1/2重量的水中，升温到20-30℃，磁力搅拌混匀后备用；
2)将羧甲基纤维素、膨润土、氢氧化铝胶、硫酸钠、甘露醇、磷酸氢二钾和磷酸二氢钠加入到1/2重量的水中，磁力搅拌混匀后备用；
3)将步骤1)的混合液加入到步骤2)得到的溶液中混合，磁力搅拌均匀；
4)向混合步骤3)的溶液中再滴加甘油和二甲基亚砜，磁力搅拌20-30min；
5)调节步骤4)得到的溶液的pH到5.5-7.5后于115-121℃加热灭菌20-30min，得所述高质量噬菌体保存保护剂。
本发明所述的高质量噬菌体保存保护剂的制备方法，工艺简单易行，效率高，应用成本低，操作简单、易于实现，应用方便。
进一步的，上述的高质量噬菌体保存保护剂的制备方法，热灭菌液冷却到室温后，在无菌条件下加入抗氧化剂，磁力搅拌混匀。后添加抗氧化剂，保证抗氧化剂的成分不被破坏。
进一步的，上述的高质量噬菌体保存保护剂的制备方法，所述搅拌速度为50-200r/min。条件温和，易于实现。
进一步的，上述的高质量噬菌体保存保护剂的制备方法，使用稀盐酸和/或氢氧化钠调节溶液pH。原料来源广，调节十分方便，并且应用成本低。
进一步的，上述的高质量噬菌体保存保护剂的制备方法，所述室温为15-25℃。条件温和，易于实现。
本发明还提供一种高质量噬菌体保存保护剂的应用方法，所述高质量噬菌体保存保护剂应用时，噬菌体液与高质量噬菌体保存保护剂按照1：1-2.5的体积比混合均匀，于室温保存或者真空冷冻干燥后2-7℃进行冻存。高质量噬菌体保存保护剂使用方便，可以用于多种不同的噬菌体冻存的使用，适应性好，可以于室温或者冷藏保存，对环境温度要求低，并非要求必须低温才能保存，即便在15-25℃的室温条件下也可以进行噬菌体的保存，可以用于多种情况下的保存，具有极高的应用前景。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明所述的高质量噬菌体保存保护剂，其组分合理，原料来源广，易于获得，成本低，可以维持噬菌体极高的存活率和活性，并且适应性好。本发明所述的高质量噬菌体保存保护剂的制备方法，方法合理，工艺简单易行，效率高，应用成本低，操作简单、易于实现。具有极高的应用前景，对保存温度要求低，并且使用方便，可以用于多种情况下的保存，应用便捷。
附图说明
图1为本发明所述使用实施例1-4高质量噬菌体保存保护剂的噬菌体存活率图。
具体实施方式
下面将通过几个具体实施例，进一步阐明本发明，这些实施例只是为了说明问题，并不是一种限制。
实施例1
一种高质量噬菌体保存保护剂，以重量组分计，包括以下组分：
脱脂奶粉 5份
聚乙二醇 2份
藻蛋白粉 0.2份
谷氨酸钠 0.3份
羧甲基纤维素 0.3份
膨润土 0.08份
氢氧化铝胶 0.03份
棉子糖 0.3份
硫酸镁 0.1份
氯化钙 0.6份
硫酸钠 0.3份
甘露醇 0.5份
磷酸氢二钾 0.03份
磷酸二氢钠 0.05份
20％甘油 0.02份
二甲基亚砜 0.01份
去离子水 100份；
此外，上述的高质量噬菌体保存保护剂，以重量组分计，还包括0.2份的抗氧化剂，
所述抗氧化剂以重量组分计，包括以下组分：
维生素C 2份
维生素E 3份
硫脲 3份
碘化钾 2份
硫代硫酸钠 0.3份
钼酸铵 0.5份。
上述高质量噬菌体保存保护剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将脱脂奶粉、聚乙二醇、藻蛋白粉、谷氨酸钠、棉子糖、硫酸镁和氯化钙加入到1/2重量的水中，升温到20℃，50r/min的搅拌速度下磁力搅拌混匀后备用；
2)将羧甲基纤维素、膨润土、氢氧化铝胶、硫酸钠、甘露醇、磷酸氢二钾和磷酸二氢钠加入到1/2重量的水中，50r/min的搅拌速度下磁力搅拌混匀后备用；
3)将步骤1)的混合液加入到步骤2)得到的溶液中混合，50r/min的搅拌速度下磁力搅拌均匀；
4)向混合步骤3)的溶液中再滴加甘油和二甲基亚砜，50r/min的搅拌速度下磁力搅拌20min；
5)使用稀盐酸和/或氢氧化钠调节步骤4)得到的溶液的pH到5.5后于115℃加热灭菌20min，热灭菌液冷却到15℃后，在无菌条件下加入抗氧化剂，50r/min的搅拌速度下磁力搅拌混匀，得所述高质量噬菌体保存保护剂。
上述噬菌体保存保护剂用于分歧杆菌噬菌体的保存，应用时，噬菌体液与噬菌体保存保护剂按照1：1的体积比混合均匀，真空冷冻干燥后于2℃进行冻存。
实施例2
一种高质量噬菌体保存保护剂，以重量组分计，包括以下组分：
脱脂奶粉 12份
聚乙二醇 8份
藻蛋白粉 0.6份
谷氨酸钠 0.8份
羧甲基纤维素 0.5份
膨润土 0.15份
氢氧化铝胶 0.18份
棉子糖 1.2份
硫酸镁 0.6份
氯化钙 1.2份
硫酸钠 0.8份
甘露醇 1.2份
磷酸氢二钾 0.2份
磷酸二氢钠 0.3份
40％甘油 0.08份
二甲基亚砜 0.04份
纯化水 100份；
此外，上述的高质量噬菌体保存保护剂，以重量组分计，还包括0.6份的抗氧化剂，
所述抗氧化剂以重量组分计，包括以下组分：
维生素C 8份
维生素E 10份
硫脲 7份
碘化钾 5份
硫代硫酸钠 1份
钼酸铵 2份。
上述高质量噬菌体保存保护剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将脱脂奶粉、聚乙二醇、藻蛋白粉、谷氨酸钠、棉子糖、硫酸镁和氯化钙加入到1/2重量的水中，升温到30℃，200r/min的搅拌速度下磁力搅拌混匀后备用；
2)将羧甲基纤维素、膨润土、氢氧化铝胶、硫酸钠、甘露醇、磷酸氢二钾和磷酸二氢钠加入到1/2重量的水中，200r/min的搅拌速度下磁力搅拌混匀后备用；
3)将步骤1)的混合液加入到步骤2)得到的溶液中混合，200r/min的搅拌速度下磁力搅拌均匀；
4)向混合步骤3)的溶液中再滴加甘油和二甲基亚砜，200r/min的搅拌速度下磁力搅拌30min；
5)使用稀盐酸和/或氢氧化钠调节步骤4)得到的溶液的pH到7.5后于121℃加热灭菌30min，热灭菌液冷却到25℃后，在无菌条件下加入抗氧化剂，200r/min的搅拌速度下磁力搅拌混匀，得所述高质量噬菌体保存保护剂。
上述噬菌体保存保护剂用于大肠杆菌噬菌体的保存，应用时，噬菌体液与噬菌体保存保护剂按照1：2.5的体积比混合均匀，真空冷冻干燥后于7℃进行冻存。
实施例3
一种高质量噬菌体保存保护剂，以重量组分计，包括以下组分：
脱脂奶粉 8份
聚乙二醇 6份
藻蛋白粉 0.4份
谷氨酸钠 0.6份
羧甲基纤维素 0.4份
膨润土 0.1份
氢氧化铝胶 0.12份
棉子糖 0.8份
硫酸镁 0.4份
氯化钙 0.8份
硫酸钠 0.6份
甘露醇 0.9份
磷酸氢二钾 0.1份
磷酸二氢钠 0.2份
30％甘油 0.05份
二甲基亚砜 0.02份
去离子水 100份；
此外，上述的高质量噬菌体保存保护剂，以重量组分计，还包括0.4份的抗氧化剂，
所述抗氧化剂以重量组分计，包括以下组分：
维生素C 5份
维生素E 5份
硫脲 5份
碘化钾 3份
硫代硫酸钠 0.8份
钼酸铵 1份。
上述高质量噬菌体保存保护剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将脱脂奶粉、聚乙二醇、藻蛋白粉、谷氨酸钠、棉子糖、硫酸镁和氯化钙加入到1/2重量的水中，升温到25℃，100r/min的搅拌速度下磁力搅拌混匀后备用；
2)将羧甲基纤维素、膨润土、氢氧化铝胶、硫酸钠、甘露醇、磷酸氢二钾和磷酸二氢钠加入到1/2重量的水中，100r/min的搅拌速度下磁力搅拌混匀后备用；
3)将步骤1)的混合液加入到步骤2)得到的溶液中混合，100r/min的搅拌速度下磁力搅拌均匀；
4)向混合步骤3)的溶液中再滴加甘油和二甲基亚砜，100r/min的搅拌速度下磁力搅拌25min；
5)使用稀盐酸和/或氢氧化钠调节步骤4)得到的溶液的pH到7后于118℃加热灭菌25min，热灭菌液冷却到20℃后，在无菌条件下加入抗氧化剂，100r/min的搅拌速度下磁力搅拌混匀，得所述高质量噬菌体保存保护剂。
上述噬菌体保存保护剂用于乳杆菌噬菌体的保存，应用时，噬菌体液与噬菌体保存保护剂按照1：2的体积比混合均匀，真空冷冻干燥后于5℃进行冻存。
实施例4
一种高质量噬菌体保存保护剂，以重量组分计，包括以下组分：
脱脂奶粉 5份
聚乙二醇 2份
藻蛋白粉 0.6份
谷氨酸钠 0.8份
羧甲基纤维素 0.3份
膨润土 0.08份
氢氧化铝胶 0.03份
棉子糖 1份
硫酸镁 0.2份
氯化钙 0.8份
硫酸钠 0.3份
甘露醇 0.5份
磷酸氢二钾 0.2份
磷酸二氢钠 0.3份
40％甘油 0.08份
二甲基亚砜 0.02份
纯化水 100份；
此外，上述的高质量噬菌体保存保护剂，以重量组分计，还包括0.3份的抗氧化剂，
所述抗氧化剂以重量组分计，包括以下组分：
维生素C 2份
维生素E 3份
硫脲 7份
碘化钾 5份
硫代硫酸钠 0.5份
钼酸铵 2份。
上述高质量噬菌体保存保护剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将脱脂奶粉、聚乙二醇、藻蛋白粉、谷氨酸钠、棉子糖、硫酸镁和氯化钙加入到1/2重量的水中，升温到20℃，120r/min的搅拌速度下磁力搅拌混匀后备用；
2)将羧甲基纤维素、膨润土、氢氧化铝胶、硫酸钠、甘露醇、磷酸氢二钾和磷酸二氢钠加入到1/2重量的水中，120r/min的搅拌速度下磁力搅拌混匀后备用；
3)将步骤1)的混合液加入到步骤2)得到的溶液中混合，120r/min的搅拌速度下磁力搅拌均匀；
4)向混合步骤3)的溶液中再滴加甘油和二甲基亚砜，120r/min的搅拌速度下磁力搅拌30min；
5)使用稀盐酸和/或氢氧化钠调节步骤4)得到的溶液的pH到7后于115℃加热灭菌30min，热灭菌液冷却到15℃后，在无菌条件下加入抗氧化剂，120r/min的搅拌速度下磁力搅拌混匀，得所述高质量噬菌体保存保护剂。
上述噬菌体保存保护剂用于溶藻弧菌噬菌体的保存，应用时，噬菌体液与噬菌体保存保护剂按照1：1.5的体积比混合均匀，于20℃进行保存。
对使用实施例1-4的噬菌体保护剂的保存1、3、6、9个月后的噬菌体污染情况以及存活率分别进行考察，如表1所示，噬菌体均未污染，并且如图1所示，噬菌体在9个月内保持60％以上的存活率。
表1噬菌体污染情况
以上所述仅是发明的几个实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种高质量噬菌体保存保护剂，其特征在于：以重量组分计，包括以下组分：
脱脂奶粉 5-12份
聚乙二醇 2-8份
藻蛋白粉 0.2-0.6份
谷氨酸钠 0.3-0.8份
羧甲基纤维素 0.3-0.5份
膨润土 0.08-0.15份
氢氧化铝胶 0.03-0.18份
棉子糖 0.3-1.2份
硫酸镁 0.1-0.6份
氯化钙 0.6-1.2份
硫酸钠 0.3-0.8份
甘露醇 0.5-1.2份
磷酸氢二钾0.03-0.2份
磷酸二氢钠 0.05-0.3份
甘油 0.02-0.08份
二甲基亚砜 0.01-0.04份
水 100份。
2.根据权利要求1所述的高质量噬菌体保存保护剂，其特征在于：以重量组分计，还包括0.2-0.6份的抗氧化剂，
所述抗氧化剂以重量组分计，包括以下组分：
维生素C 2-8份
维生素E 3-10份
硫脲 3-7份
碘化钾 2-5份
硫代硫酸钠 0.3-1份
钼酸铵 0.5-2份。
3.根据权利要求1所述的高质量噬菌体保存保护剂，其特征在于：所述甘油为20%-40%的甘油。
4.根据权利要求1所述的高质量噬菌体保存保护剂，其特征在于：所述的水为去离子水或纯化水。
5.根据权利1-4任一项所述的高质量噬菌体保存保护剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）将脱脂奶粉、聚乙二醇、藻蛋白粉、谷氨酸钠、棉子糖、硫酸镁和氯化钙加入到1/2重量的水中，升温到20-30℃，磁力搅拌混匀后备用；
2）将羧甲基纤维素、膨润土、氢氧化铝胶、硫酸钠、甘露醇、磷酸氢二钾和磷酸二氢钠加入到1/2重量的水中，磁力搅拌混匀后备用；
3）将步骤1）的混合液加入到步骤2）得到的溶液中混合，磁力搅拌均匀；
4）向混合步骤3）的溶液中再滴加甘油和二甲基亚砜，磁力搅拌20-30min；
5）调节步骤4）得到的溶液的pH到5.5-7.5后于115-121℃加热灭菌20-30min，得所述高质量噬菌体保存保护剂。
6.根据权利要求5所述的高质量噬菌体保存保护剂的制备方法，其特征在于：热灭菌液冷却到室温后，在无菌条件下加入抗氧化剂，磁力搅拌混匀。
7.根据权利要求5或6所述的高质量噬菌体保存保护剂的制备方法，其特征在于：所述搅拌速度为50-200r/min。
8.根据权利要求5所述的高质量噬菌体保存保护剂的制备方法，其特征在于：使用稀盐酸和/或氢氧化钠调节溶液pH。
9.根据权利要求5所述的高质量噬菌体保存保护剂的制备方法，其特征在于：所述室温为15-25℃。
10.根据权利要求1或5所述的高质量噬菌体保存保护剂的应用方法，其特征在于：所述高质量噬菌体保存保护剂应用时，噬菌体液与高质量噬菌体保存保护剂按照1：1-2.5的体积比混合均匀，于室温保存或者真空冷冻干燥后2-7℃进行冻存。
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