CN107574155B - 一种鼠伤寒沙门氏菌噬菌体ФSa-1冻干保护剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鼠伤寒沙门氏菌噬菌体ФSa‑1冻干保护剂，该冻干保护剂的组成为：50~60 g/L脱脂奶粉，20~30 g/L魔芋粉，30~40 g/L蔗糖，20~30 g/L谷氨酸钠，30~40g/L硫代硫酸钠，20~30 g/L微晶纤维素，10~20 g/LTris。与现有技术中的冻干保护剂相比，本发明针对特定的鼠伤寒沙门氏菌噬菌体（Salmonella typhimurium phage）ΦSa‑1筛选优化得到使得冻干粉中的噬菌体存活率较高的冻干保护剂，存活率高达75%，并且，冻干保护剂优化配方保护的噬菌体冻干粉对pH和热有更强的耐受性能。

Description

一种鼠伤寒沙门氏菌噬菌体ФSa-1冻干保护剂

技术领域

本发明涉及一种鼠伤寒沙门氏菌噬菌体(Salmonella typhimurium phage)ΦSa-1冻干保护剂，属于微生物发酵工业技术领域。

背景技术

鼠伤寒沙门氏菌具有广泛的宿主，是危害人类和动物的重要肠道致病菌，每年的感染量约占沙门氏菌感染量的1/5，造成了严重的经济损失。随着经济发展和人们对动物性食品安全问题广泛关注，噬菌体作为一种天然绿色、安全有效的抗生素替代品，具有广阔的应用前景。为此，申请人前期研究了一株具有鼠伤寒沙门氏菌防治效果的噬菌体ФSa-1，已于2017年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2017217，记载在专利CN 107099511A，该噬菌体ФSa-1以鼠伤寒沙门氏菌为宿主菌，对小鼠抗伤寒沙门氏菌感染有良好的防治效果，具有较好的耐热性和pH耐受性，研发出的具有优异性能的噬菌体ФSa-1对防治鼠伤寒沙门氏菌具有十分重要的意义。该噬菌体ΦSa-1可以被制备成饲料添加剂、饮用水添加剂、饲料、饮用水、清洁剂或消毒剂各种形式的产品，能够在较广的温度范围和pH条件下对鼠伤寒沙门氏菌进行杀灭。

然而，如何将该噬菌体ФSa-1进行有效保存一直是困扰该申请人的主要问题。目前冷冻干燥是保持微生物、细胞及蛋白质等活性物质生物活性的一个普遍的方法。但是在冷冻干燥过程中，冷冻和干燥不可避免地会造成部分微生物细胞的损伤、死亡，及某些蛋白分子的钝化。

一直以来我国生产的噬菌体制剂以液体形式保存，效价低，活力较差，噬菌体制剂几乎全部依赖于进口，成本也随之提高。冻干保护剂的应用使噬菌体悬液形成干粉方便运输、销售和使用，具有重大的实际应用价值。保护剂又称稳定剂，是指冷冻干燥过程中除抗原物质以外的添加物，是为保护或降低在冷冻干燥和保存过程中微生物或蛋白质的生物活性与抗原活性的损失、变化程度，加稀释液后迅速溶解，最大程度恢复原有性状的一类物质。

现有技术中公开了多种噬菌体保护剂，但并非每种保护剂对所有微生物都有保护作用，由于微生物结构和大小的差异，不同的微生物即使采用相同保护剂所取得的效果也不同。

如CN 105950567 A公开了一种噬菌体的冻干粉胶囊保存方法，其中的噬菌体保存保护剂，包括以下组分：脱脂奶粉5-12份、聚乙二醇2-8份、藻蛋白粉0.2-0.6份、谷氨酸钠0.3-0.8份、羧甲基纤维素0.3-0.5份、膨润土0.08-0.15、氢氧化铝胶0.03-0.18份、棉子糖0.3-1.2份、硫酸镁0.1-0.6份、氯化钙0.6-1.2份、硫酸钠0.3-0.8份、甘露醇0.5-1.2份、磷酸氢二钾0.03-0.2份、磷酸二氢钠0.05-0.3份、甘油0.02-0.08份、二甲基亚砜0.01-0.04份和水100份。

CN 105950475 A公开了一种噬菌体的冻干保存方法，其中的噬菌体保存保护剂，包括以下组分：脱脂乳6-18份、硅藻土0.3-0.8份、糖醇2-5份、DEAE-葡聚糖0.8-1.5份、阿拉伯胶0.01-0.16份、牛血清白蛋白0.7-1.2份、麦芽糖糊精0.05-0.3份、蜂蜜0.01-0.08份、棉子糖0.8-1.6份、磷酸铝0.03-0.06份、氯化钠0.01-0.04份、硫酸镁0.3-0.7份、氯化钙0.6-1.2份、甘油1-3份、阿拉西A0.05-0.12份和水100份。

CN 106065399公开了一种噬菌体保存保护剂，包括以下组分：脱脂奶粉5-12份、蛋白胨3-5份、蔗糖0.5-1.2份、海藻糖0.8-1.5份、香菇多糖1-1.6份、硫酸镁0.2-0.5份、氯化钙0.6-1.2份、硫酸钠0.6-0.8份、明胶0.05-0.2份、甘露醇0.8-1.2份、聚乙烯吡咯烷酮0.1-0.3份等。

然而针对特定的噬菌体ФSa-1(该噬菌体具有呈正多面体的头部结构，没有尾部，头部直径约65nm)，上述噬菌体保护剂仍然无法满足冻干保护后噬菌体ФSa-1仍具有较好的耐热性和pH耐受性特性的要求。

因此，亟需一种针对该噬菌体的新型保护方法或保护剂，使用该保护方法或保护剂后，该噬菌体ФSa-1能够最大程度的存活，同时，具有其较好的耐热性和pH耐受性，并且还能在饲料领域、饮用水领域等具有较广泛的应用前景。

发明内容

针对上述现有技术，本发明人前期经过试验研究和分析，发现现有技术中的冻干保护剂无法实现噬菌体ФSa-1的有效冻干保护；针对此，本发明人进一步对该噬菌体ФSa-1进行研究分析，发现该噬菌体ФSa-1头部的衣壳蛋白和其包裹的核酸与现有的噬菌体有一定的差异性，导致其理化性质与现有的噬菌体并不相同，这说明所需要冻干保护的噬菌体ФSa-1具有一定的特殊性；针对该噬菌体ФSa-1的自身特性，本发明经过一系列的研究和分析得到一种适合噬菌体ФSa-1的冻干保护剂及其制备方法。

具体的，本发明公开了如下所述的技术方案：

本发明的第一个方面，提供一种鼠伤寒沙门氏菌噬菌体ФSa-1冻干保护剂，该冻干保护剂是由以下质量份的原料组成：

脱脂奶粉50～60份，魔芋粉20～30份，蔗糖30～40份，谷氨酸钠20～30份，硫代硫酸钠30～40份，微晶纤维素20～30份，Tris10～20份。

本发明的第二个方面，提供了一种鼠伤寒沙门氏菌噬菌体ФSa-1冻干保护剂的制备方法，所述方法包括：将脱脂奶粉、魔芋粉、谷氨酸钠、硫代硫酸钠、微晶纤维素和Tris按照设定质量比例混合均匀，即可得到该冻干保护剂。

本发明的第三个方面，提供上述冻干保护剂在鼠伤寒沙门氏菌噬菌体ФSa-1冻干保存中的应用。

本发明的第四个方面，提供一种鼠伤寒沙门氏菌噬菌体ФSa-1的保存方法，所述方法包括使用上述冻干保护剂。

本发明还保护通过上述保存方法制备得到的鼠伤寒沙门氏菌噬菌体ФSa-1产品。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下技术效果：

(1)与现有技术中的冻干保护剂相比，本发明针对特定的鼠伤寒沙门氏菌噬菌体(Salmonella typhimurium phage)ΦSa-1筛选优化得到使得冻干粉中的噬菌体存活率较高的冻干保护剂，存活率高达75％。

(2)与现有技术中的冻干保护剂相比，冻干保护剂优化配方保护的噬菌体冻干粉对pH和热有更强的耐受性能。

(3)本发明的噬菌体ФSa-1冻干粉可以被制备成饲料添加剂、饮用水添加剂、饲料、饮用水、清洁剂或消毒剂各种形式的产品，能够在较广的温度范围和pH条件下对鼠伤寒沙门氏菌进行杀灭。

(4)本发明的噬菌体ФSa-1冻干粉保存时间极大的延长，且利于运输。

附图说明

构成本发明的一部分说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1：噬菌体ФSa-1液体稳定性试验。

图2：噬菌体ФSa-1冻干粉贮存稳定性试验。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

术语解释：

本发明中采用的Tris即为三(羟甲基)氨基甲烷。

本发明中采用的魔芋粉是指用魔芋干(包括片、条、角)经物理干法以及鲜魔芋采用粉碎后快速脱水或经食用酒精湿法加工初步去掉淀粉等杂质制成的粒度≤0.425mm(40目)的颗粒占90％以上的魔芋粉。

正如背景技术所介绍的，现有技术中噬菌体冻干保护剂对噬菌体ΦSa-1的保存仍存在一定的不足，比如存活率较低以及噬菌体冻干粉的耐pH性能和耐热性显著降低，为了解决如上的技术问题，本发明提出了一种鼠伤寒沙门氏菌噬菌体ФSa-1冻干保护剂，该冻干保护剂是由以下质量份的原料组成：

脱脂奶粉50～60份，魔芋粉20～30份，蔗糖30～40份，谷氨酸钠20～30份，硫代硫酸钠30～40份，微晶纤维素20～30份，Tris10～20份。

针对该噬菌体ФSa-1的自身特性，本发明设计了如上特定原料和配比含量的冻干保护剂，其中，冻干保护剂中的微晶纤维素能在水中形成稳定的分散体系，将其与噬菌体混成悬浮状液体；魔芋粉和脱脂奶粉与蔗糖通过氢键作用力将悬浮液中的含有噬菌体的液滴形成保护骨架，这样形成了一层保护噬菌体的稳定界面膜，能够保护噬菌体蛋白质不受温度的影响；谷氨酸钠具有清除自由基的能力，同时能够降低冰晶对噬菌体结构的损伤作用，并且能够提供羧基分子，与魔芋粉和脱脂奶粉形成氢键进行有效联结，提高噬菌体的存活率和维持噬菌体的生物活性；硫代硫酸钠可阻断冻干过程中的氧化链反应，防止冷冻干燥及储藏过程中的氧化变质；Tris能够将冷冻干燥过程中的pH调整到该噬菌体活性物质最稳定的区域，从而保证噬菌体高的生物活性，具有较强的耐高温和较宽pH的性能。

在本发明优选的实施方案中，该冻干保护剂的组成为：

脱脂奶粉50～60份，魔芋粉20～21份，蔗糖30～40份，谷氨酸钠20～22份，硫代硫酸钠35～38份，微晶纤维素20～22份，Tris10～12份。

在本发明最优选的实施例中，该冻干保护剂的组成为：

脱脂奶粉51.9份，魔芋粉20.3份，蔗糖39.8份，谷氨酸钠21.0份，硫代硫酸钠37.0份，微晶纤维素21.6份，Tris10份。

经试验验证，采用该配方冻干后噬菌体存活率高达75％，并且该优化配方保护的噬菌体冻干粉对pH和热有更强的耐受性能。

在本发明优选的实施方案中，所述鼠伤寒沙门氏菌噬菌体是本申请人实验室内部自主分离到的一株鼠伤寒沙门氏菌标准株噬菌体(Salmonella typhimurium phage)，其命名为ФSa-1。该噬菌体属于盖噬菌体科，在固体培养基上形成较大空斑，直径为2～3mm，该噬菌体在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCC NO：M 2017217，保藏日期为2017年4月28日，保藏单位地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。

在本发明优选的实施方案中，提供了一种鼠伤寒沙门氏菌噬菌体ФSa-1冻干保护剂的制备方法，所述方法包括：将脱脂奶粉、魔芋粉、谷氨酸钠、硫代硫酸钠、微晶纤维素和Tris按照设定质量比例混合均匀，即可得到该冻干保护剂。

在本发明优选的实施方案中，还提供了一种上述冻干保护剂在鼠伤寒沙门氏菌噬菌体ФSa-1冻干保存中的应用。

在本发明优选的实施方案中，提供一种鼠伤寒沙门氏菌噬菌体ФSa-1的保存方法，所述方法包括使用上述冻干保护剂。

进一步的，所述方法包括：

按照设定比例将噬菌体ФSa-1的培养液与所述冻干保护剂混合均匀，得到含有50～60g/L的脱脂奶粉，20～30g/L的魔芋粉，30～40g/L的蔗糖，20～30g/L的谷氨酸钠，30～40g/L的硫代硫酸钠，20～30g/L的微晶纤维素，10～20g/L的Tris，将上述混合溶液真空冷冻干燥后保存。(50～60g/L的脱脂奶粉是将50～60g脱脂奶粉加入1L的噬菌体培养液中)

其中，所述含有鼠伤寒沙门氏菌噬菌体ФSa-1的培养液的制备方法如下：

噬菌体ФSa-1和宿主菌鼠伤寒沙门氏菌混合至液体TSB培养基中，先孵育一定时间，再进行发酵培养，除去宿主菌鼠伤寒沙门氏菌后即得到含有鼠伤寒沙门氏菌噬菌体ФSa-1的培养液。

上述方法中，宿主菌鼠伤寒沙门氏菌的制备方法如下：将宿主菌的斜面种子接种在灭菌后的种子培养基中，在37℃、180r/min培养4h，得到宿主菌液体种子液。

所述种子培养基的组成为：TSB培养基(即胰蛋白胨大豆肉汤培养基)，具体配方为：胰蛋白胨1.5％(g/100ml)、大豆蛋白胨0.5％(g/100ml)、氯化钠0.5％(g/100ml)，用蒸馏水配制而成，调节pH为7.2±0.2，经121℃压力蒸汽灭菌后使用。

具体如下：将噬菌体ФSa-1(3×10⁴PFU/mL)和宿主菌鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028(3×10⁸cfu/mL)各400μL添加到40mL液体TSB中，37℃孵育10min，37℃、180r/min发酵培养3～4h。

在本发明优选的实施方案中，还提供一种采用上述保存方法制备得到的鼠伤寒沙门氏菌噬菌体ФSa-1产品。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1：噬菌体ФSa-1液体稳定性试验

噬菌体ФSa-1液体5000r/min离心10min，0.22μm滤膜过滤后分装至数个1.5mL离心管，分别置于常温、4℃和-20℃冰箱保存。噬菌体ФSa-1液体初始效价为1.295×10¹⁰pfu/mL，于15d、30d、60d计数结果见图1。

由图1可知，噬菌体ФSa-1液体在常温保存30d效价降低98.03％，在-20℃保存60d效价降低70.99％，在4℃冰箱保存60d效价降低55.08％。

实施例2：鼠伤寒沙门氏菌噬菌体ФSa-1产品的制备方法

2.1鼠伤寒沙门氏菌的制备方法

将鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028的斜面种子接种在灭菌后的TSB培养基中，在37℃、180r/min培养4h，得到鼠伤寒沙门氏菌液体种子液。

所述TSB培养基的组成为：TSB培养基(即胰蛋白胨大豆肉汤培养基)，具体配方为：胰蛋白胨1.5％(g/100mL)、大豆蛋白胨0.5％(g/100mL)、氯化钠0.5％(g/100mL)，用蒸馏水配制而成，调节pH为7.2±0.2，经121℃压力蒸汽灭菌后使用。

2.2鼠伤寒沙门氏菌噬菌体ФSa-1的培养液的制备方法

所述含有鼠伤寒沙门氏菌噬菌体ФSa-1的培养液的制备方法如下：

将噬菌体ФSa-1(3×10⁴PFU/mL)和宿主菌鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028(3×10⁸cfu/mL)各400μL添加到40mL液体TSB中，37℃孵育10min，37℃、180r/min发酵培养3～4h。发酵结束后，将发酵液10000r/min高速离心，0.22μm滤膜过滤除去宿主菌鼠伤寒沙门氏菌，即得噬菌体液体。

2.3鼠伤寒沙门氏菌噬菌体ФSa-1产品的制备方法

所述方法为：将待选的保护剂按照设定质量比例溶于上述2.2制备的噬菌体液体中，混合均匀，真空冷冻干燥后即得鼠伤寒沙门氏菌噬菌体ФSa-1产品。

实施例3：冻干保护剂单因素初筛

本申请人经过预实验以及根据实际应用需求选取了以下冻干保护剂原料进行初筛：

选取脱脂奶粉、明胶、微晶纤维素、魔芋粉、蛋白胨、可溶性淀粉、糊精、KI、硫代硫酸钠)、精氨酸、甘氨酸、山梨醇、甘露醇、海藻糖、蔗糖、葡萄糖、谷氨酸钠、乳酸钙和Tris(调pH至7.0左右)共19种冻干保护剂待选原料，分别研究每种保护剂待选原料对噬菌体ΦSa-1的冻干后保护效果。

表1 19种冻干保护剂对噬菌体ФSa-1冻干保护效果研究

经过以上单因素试验，初步筛选以下12种保护剂进行后续试验：脱脂奶粉、明胶、微晶纤维素、魔芋粉、硫代硫酸钠、海藻糖、蔗糖、精氨酸、山梨醇、谷氨酸钠、乳酸钙、Tris。

实施例4：Plackett–Burman试验筛选显著因子

通过Plackett–Burman试验进行显著因子筛选的试验设计，这是一种主要针对影响因子数目较多，并且未确定众多影响因子对于响应变量的显著性时所采用的实验设计方法。

在冻干保护剂单因素筛选优化实验中选取了对噬菌体ФSa-1具有较大影响的12种保护剂进行实验编号为：A脱脂奶粉、B明胶、C乳酸钙、D魔芋粉、E精氨酸、F谷氨酸钠、G海藻糖、H蔗糖、I山梨醇、J硫代硫酸钠、K微晶纤维素、L Tris。选用N＝23的实验设计，对12个因素同时进行考察，每个独立变量设置两个级别，分别为高水平(+1)和低水平(-1)；设置7个虚拟列，分别为N、O、P、Q、R、S、T，设置三个中心点。

表2 Plackett-Burman试验设计与结果

注：“均值±标准误”为spass16.0分析出来的结果。

表3 Plackett-Burman试验设计的因素水平及效应分析

采用一阶多项式模型来拟合试验数据：

其中，Y代表响应值(噬菌体存活率)，为模型截距，为线性系数，x_i为自变量。试验结果如表2所示。

随编码的自变量变化的方程如下：

Y＝64.75-4.64A-2.67B+0.60C+2.10D+1.98E+4.56F-0.95G-4.71H-2.96I+6.68J+2.20K+2.70L (2)

上述方程中，各自变量前的回归系数代表着各因素对响应值的正负影响效应的大小。回归系数的绝对值越大，对响应值的影响也就越大。

一阶多项式模型拟合的试验数据方差分析如表3所示。噬菌体存活率响应值模型的AdjR²和R²均高，表明模型拟合程度良好，分析结果具有一定的可信度。

由表3可以看出，有4个试验因素的Prob＞F值小于0.05，有3个试验因素的Prob＞F值大于0.05且小于0.1，共7个试验因素对噬菌体存活率有显著影响，影响力大小为Tris＞微晶纤维素＞魔芋粉＞硫代硫酸钠＞蔗糖＞脱脂奶粉＞谷氨酸钠，这七个因素可信度在90％以上，可以考虑作为主要因素进一步做响应面试验。其中魔芋粉、谷氨酸钠、硫代硫酸钠、微晶纤维素、Tris对噬菌体存活率的影响为正相关，脱脂奶粉、蔗糖对噬菌体存活率的影响为负相关。

实施例5：最陡爬坡试验(Steepest ascent)确定中心点

响应面所拟合的方程只在邻近区域才能精确地模拟出其模型，因此为获得有效的响应面回归模型首先要寻找到邻近最佳值区域。而最陡爬坡试验就是一种沿着响应值增大的路径移动到最佳区域的方法，爬坡路径则是由PB设计中所得的线性回归方程来确定的。

由PB实验可知，魔芋粉、谷氨酸钠、硫代硫酸钠、微晶纤维素、Tris对噬菌体冻干后存活率具有正效应，脱脂奶粉、蔗糖对噬菌体冻干后存活率具有负效应。可以通过增大魔芋粉(D)、谷氨酸钠(F)、硫代硫酸钠(J)、微晶纤维素(K)、Tris(L)的添加量和减少脱脂奶粉(A)、蔗糖(H)的添加量提高噬菌体冻干存活率，以达到最大响应值。由线性回归方程

Y＝64.75-4.64A-2.67B+0.60C+2.10D+1.98E+4.56F-0.95G-4.71H-2.96I+6.68J+2.20K+2.70L可知A、H的系数为4.64、4.71，其比例大概为1：1，即A每减少1个单位(％)，F减少1个单位(％)；D、F、J、K、L的系数分别为0.60、2.10、4.56、6.68、2.20、2.70，其比例大概为3∶6∶9∶3∶4，即D每增加1个单位(％)，F增加2个单位(％)。最陡爬坡实验设计及结果如表4所示。

表4 最陡爬坡试验设计及结果

由表4可知，第4组噬菌体的存活率最高，第5、6、7、8组噬菌体的存活率开始下降，在七种保护剂的共同作用下，噬菌体的存活率最高值为68.70％，因此，在后续的响应面分析实验中以本试验第4组为中心点进行响应面设计分析。

实施例6：设计响应面试验(Box-Behnken Design，BBD)确定最优结果

响应面分析方法是通过合理的试验设计，同时将试验所得的数据用多元二次回归方程进行表达，进一步作出函数估计的工具，研究因子与因子之间、因子与响应面之间的相互关系，最终通过对模型建立的回归方程进行计算分析，进而来寻求最优工艺参数，这是在解决多变量问题时一种常用的统计方法。

首先由PB试验设计筛选出7个显著影响因子，并由最陡爬坡试验估计显著因子的添加水平，在最终的响应面分析时采用了7因素、3水平、5个中心点、61组试验的BBD响应面设计。实验结果用Design Expert 8.0软件进行分析，得到理论最优点。根据PB实验和最陡爬坡试验的结果，对影响噬菌体冻干存活率的七个因素谷氨酸钠、硫代硫酸钠、脱脂奶粉、蔗糖等进行响应面分析，以噬菌体存活率为响应值。因为有七个自变量，为使拟合响应方程具有旋转性和通用性，选择中心点试验数为5。BBD实验设计及结果分析如下表5、6。

表5 BBD的因素及水平

表6 BBD设计试验结果的二介多项式模型分析

二阶多项式模型拟合的试验数据的方差分析结果如表6所示，从中可以看出，以噬菌体ФSa-1冻干后存活率为响应值，模型拟合的Adj R²和R²分别为0.8389和0.9194，表明模型的拟合程度良好，可信度高。此模型优化出三组配方(见表7)，其中最优配方预测的响应值为72.73％，组成为5.19％脱脂奶粉、2.03％魔芋粉、2.10％谷氨酸钠、3.98％蔗糖、3.70％硫代硫酸钠、2.16％微晶纤维素和1.00％Tris。

实施例7：优化配方冻干验证试验

对上述冻干保护剂优化出的三组配方进行冻干试验验证，试验结果如表7所示，最优配方试验结果75.0％与预测的存活率72.73％相当，说明响应面优化试验结果可靠。

表7 噬菌体ФSa-1三组配方冻干后的试验验证

实施例8：冻干保护剂配方对噬菌体ФSa-1耐热性能的影响

各取适量用上述优化后的三组冻干保护剂(配方1、配方2、配方3)冻干保护的噬菌体ФSa-1冻干粉、噬菌体ФSa-1发酵液(未加保护剂的发酵原液)分别置于1mL缓冲液中，使其噬菌体效价均达到1.0×10⁹pfu/mL。于40℃、50℃、60℃、70℃和80℃的水浴中作用60min，作用时间结束后取样，并立即将样品置于水浴中冷却，经过稀释后测定噬菌体的效价，各组效价见表8。

表8 噬菌体ФSa-1在不同温度条件处理60min后噬菌体效价(pfu/mL)

由表8可知，使用配方1冻干保护的噬菌体ФSa-1所得的冻干粉在70℃、80℃处理1h后效价分别降低约2、6个数量级，比配方2、3及噬菌体发酵液耐热性能好。

实施例9：冻干保护剂配方对噬菌体ФSa-1耐pH性能的影响

各取适量用上述优化后的三组冻干保护剂(配方1、配方2、配方3)冻干保护的噬菌体ФSa-1冻干粉、噬菌体ФSa-1发酵液(未加保护剂的发酵原液)分别置于1mL缓冲液中，使其噬菌体效价均达到1.0×10⁹pfu/mL。调节pH值分别为2、4、6、8和10，混匀，37℃作用2h，作用时间结束后取出，并立即将样品置于水浴中冷却，经过稀释后测定噬菌体的效价，各组效价见表9。

表9 噬菌体ФSa-1在不同pH条件处理2h后噬菌体效价(pfu/mL)

由表9可知，使用配方1冻干保护的噬菌体ФSa-1所得的冻干粉在pH 4～6处理2h后效价几乎不变，pH 8、10分别降低约0.5、2个数量级，比优化配方2、3及噬菌体发酵液耐pH性能好。

综合三组推荐配方对噬菌体ФSa-1的冻干保护作用、耐热及pH性能的影响可知，配方1(51.9g/L脱脂奶粉、20.3g/L魔芋粉、39.8g/L蔗糖、21.0g/L谷氨酸钠、37.0g/L硫代硫酸钠、21.6g/L微晶纤维素、10g/L Tris)为最优配方，选择此配方作为噬菌体ФSa-1后续贮存稳定性试验用配方。

实施例10：噬菌体ФSa-1优化配方冻干粉贮存稳定性试验

将加有优化配方七种冻干保护剂的噬菌体ФSa-1冻干粉研磨后混匀，分别置于常温、4℃和-20℃保存。ФSa-1冻干粉初始效价为4.86×10⁹pfu/mL，分别于30d、60d、90d、120d、150d、180d计数。由图2可知ФSa-1冻干粉在常温保存180d效价降低90％以上，在-20℃和4℃冰箱保存180d效价几乎没有变化。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种鼠伤寒沙门氏菌噬菌体ФSa-1冻干保护剂，其特征是，该冻干保护剂是由以下质量份的原料组成：

脱脂奶粉50~60份，魔芋粉20~30份，蔗糖30~40份，谷氨酸钠20~30份，硫代硫酸钠30~40份，微晶纤维素20~30份，Tris10~20份。

2.如权利要求1所述的冻干保护剂，其特征是，该冻干保护剂的组成为：

脱脂奶粉50~60份，魔芋粉20~21份，蔗糖30~40份，谷氨酸钠20~22份，硫代硫酸钠35~38份，微晶纤维素20~22份，Tris10~12份。

3.如权利要求2所述的冻干保护剂，其特征是，该冻干保护剂的组成为：

脱脂奶粉51.9份，魔芋粉20.3份，蔗糖39.8份，谷氨酸钠21.0份，硫代硫酸钠37.0份，微晶纤维素21.6份，Tris10份。

4. 如权利要求1~3中任一项所述的冻干保护剂，其特征是：所述鼠伤寒沙门氏菌噬菌体ФSa-1在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCC NO：M 2017217，保藏日期为2017年4月28日，保藏单位地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。

5.权利要求1~4中任一项所述的鼠伤寒沙门氏菌噬菌体ФSa-1冻干保护剂的制备方法，其特征是，所述方法包括：将脱脂奶粉、魔芋粉、谷氨酸钠、硫代硫酸钠、微晶纤维素和Tris按照设定质量比例混合均匀，即可得到该冻干保护剂。

6.权利要求1~4中任一项所述的鼠伤寒沙门氏菌噬菌体ФSa-1冻干保护剂在鼠伤寒沙门氏菌噬菌体ФSa-1冻干保存中的应用。

7.一种鼠伤寒沙门氏菌噬菌体ФSa-1的保存方法，其特征是，所述方法包括使用权利要求1~4中任一项所述的鼠伤寒沙门氏菌噬菌体ФSa-1冻干保护剂。

8. 如权利要求7所述的保存方法，其特征是，该方法包括： 按照设定比例将含有鼠伤寒沙门氏菌噬菌体ФSa-1的培养液与所述冻干保护剂混合均匀，真空冷冻干燥后保存。

9.如权利要求7所述的保存方法，其特征是，所述含有鼠伤寒沙门氏菌噬菌体ФSa-1的培养液的制备方法如下：

噬菌体ФSa-1 和宿主菌鼠伤寒沙门氏菌混合至液体TSB培养基中，先孵育一定时间，再进行发酵培养，除去宿主菌鼠伤寒沙门氏菌后即得到含有鼠伤寒沙门氏菌噬菌体ФSa-1的培养液。

10.采用权利要求7~9中任一项保存方法制备得到的鼠伤寒沙门氏菌噬菌体ФSa-1产品。