CN105969738A - 一种新型噬菌体的保存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种新型噬菌体的保存方法，将噬菌体液和噬菌体保存保护剂混合均匀得噬菌体原液，无菌滤纸吸附将上述噬菌体原液，于室温或者2‑7℃放在真空干燥器内干燥保存。本发明所述的新型噬菌体的保存方法，方法合理，应用方便，噬菌体可以在室温保存或者冷藏，对保存环境要求低，适应性好，并且可以长期保存。

Description

一种新型噬菌体的保存方法
技术领域
本发明属于生物技术和微生物制品领域，具体地，涉及一种新型噬菌体的保存方法。
背景技术
噬菌体是一类能感染细菌、放线菌、螺旋体等微生物的病毒的总称，对一些细菌具有高度的专一性，当噬菌体侵染这些细菌时，可在细菌中繁殖并杀死细菌，而它对动植物没有毒性。随着分子生物学技术的发展，噬菌体已经广泛用于疾病诊断、水处理等多个领域。由于噬菌体可以将基因插入宿主DNA内的特性，使得它还成为了重要的分子和遗传学研究工具。利用噬菌体，可以设计很多精巧的实验。
然而在上述过程中，都需要对噬菌体进行保存，现有技术的保存方案中噬菌体的保存效果差，噬菌体的保存时间短，存活率低，噬菌体容易被污染，并且必须在低温条件下进行保存，严重制约了对噬菌体应用的发展。
发明内容
发明目的：为了克服以上不足，本发明提供了一种新型噬菌体的保存方法。
技术方案：本发明提供了一种新型噬菌体的保存方法，包括以下步骤：
1)噬菌体溶液于2-7℃静置4-8h，出现絮状沉淀，经过8000-12000r/min离心20-40min；
2)向上述沉淀中加入噬菌体缓冲液，将沉淀溶解，得噬菌体液；
3)噬菌体液体积1-2.5倍的噬菌体保存保护剂混合均匀得噬菌体原液，所述噬菌体保存保护剂以重量组分计，包括以下组分：脱脂奶粉5-12份、白蛋白粉3-5份、酵母粉0.5-1.2份、中性白土0.02-0.1份、木炭粉0.01-0.03份、蜂胶0.02-0.05份、乳糖1-1.8份、麦芽糖0.8-2份、硫酸钠0.2-0.3份、氯化钙0.5-1.5份、氯化镁0.3-0.8份、磷酸氢二钾0.02-0.3份、磷酸二氢钠0.04-0.15份、甘油1-3份、司盘-80 0.01-0.08份和水100份；
4)无菌滤纸吸附将上述噬菌体原液，于室温或者2-7℃放在真空干燥器内干燥保存。
本发明所述的噬菌体的保存方法，方法合理，应用方便，噬菌体原液中加入保存保护剂，可以在室温保存或者冷藏，对保存环境要求低，适应性好，可以长期保存。其中噬菌体保存保护剂的组分合理，其中脱脂奶粉、白蛋白粉、酵母粉、中性白土等形成整个保存保护剂的骨架，防止低分子物质的碳化和氧化，同时保护活性物质不受温度影响，使保护剂形成多孔性、疏松的海绵状物且具有一定的含水量，在冻存过程中保持原有的构架，从而增加溶解度。此外，多种糖类和盐使噬菌体保持存活状态以及对水分起缓解作用，并且保持电解质浓度。噬菌体保存保护剂可以使噬菌体低温保存下免受溶液损伤和冰晶损伤等物理因素的损伤，并且维持噬菌体极高的存活率和活性，使噬菌体的活动处于半静止或静止状态。此外，保护剂同溶液中的水分子结合，发生水合作用，弱化水的结晶过程使溶液的粘性增加从而减少冰晶的形成，同时冷冻保护剂可以通过在噬菌体内外维持一定的摩尔浓度，降低内外未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤。此外，保护剂还可以在室温条件下用于多种噬菌体的保存，适应性好。
进一步的，上述的新型噬菌体的保存方法，所述噬菌体保存保护剂以重量组分计，还包括0.1-0.5份的维生素，所述维生素以重量组分计，包括以下组分：维生素C 1-3份、维生素E 3-8份、维生素A0.5-0.8份、维生素B2 0.2-0.5份。通过增加维生素，增加整个保存保护剂的营养成分和抗氧化作用，使噬菌体保持存活状态以及对水分起缓解作用。
进一步的，上述的新型噬菌体的保存方法，所述干燥器内装有无水氯化钙或无水甲醇或硅胶干燥剂。在干燥的条件下保存效果更佳，保存时间更久。
进一步的，上述的新型噬菌体的保存方法，所述步骤在4-6％的湿度条件下完成。4-6％的湿度条件下溶菌活性最佳，保存效果最好。
进一步的，上述的新型噬菌体的保存方法，所述噬菌体缓冲液以重量组分计，包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐8-15份、氯化钠0.05-0.2份、氯化钾1-5份、硫酸镁5-20份、磷酸氢二钾1-3份、磷酸二氢钠8-12份、明胶0.05-0.1份和水100份，并且调节pH到7-7.5。噬菌体缓冲液组分合理，使用方便，可以用于噬菌体的溶解和重悬，并且不影响噬菌体的活性。
进一步的，上述的新型噬菌体的保存方法，所述甘油为20％-40％的甘油。20％-40％的甘油流动性好，易于应用。
进一步的，上述的新型噬菌体的保存方法，所述的水为去离子水或纯化水。去离子水或纯化水可以保证噬菌体保存过程中质量稳定、可控。
进一步的，上述的新型噬菌体的保存方法的制备方法，使用稀盐酸和/或氢氧化钠调节溶液pH。原料来源广，调节十分方便，并且应用成本低。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明所述的噬菌体的保存方法，方法合理，应用方便，噬菌体可以在室温保存或者冷藏，对保存环境要求低，适应性好，并且可以长期保存。
附图说明
图1为本发明所述使用实施例1-4保存方法保存的噬菌体存活率图。
具体实施方式
下面将通过几个具体实施例，进一步阐明本发明，这些实施例只是为了说明问题，并不是一种限制。
实施例1
一种新型副溶血弧菌噬菌体的保存方法，在4％的湿度条件下完成，包括以下步骤：
1)副溶血弧菌噬菌体溶液于2℃静置4h，出现絮状沉淀，经过8000r/min离心40min；
2)向上述沉淀中加入噬菌体缓冲液，将沉淀溶解，得噬菌体液；所述噬菌体缓冲液以重量组分计，包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐8份、氯化钠0.05份、氯化钾1份、硫酸镁5份、磷酸氢二钾1份、磷酸二氢钠8份、明胶0.05份和去离子水100份，并且使用稀盐酸和/或氢氧化钠调节pH到7；
3)噬菌体液等体积的噬菌体保存保护剂混合均匀得噬菌体原液，所述噬菌体保存保护剂以重量组分计，包括以下组分：脱脂奶粉5份、白蛋白粉3份、酵母粉0.5份、中性白土0.02份、木炭粉0.01份、蜂胶0.02份、乳糖1份、麦芽糖0.8份、硫酸钠0.2份、氯化钙0.5份、氯化镁0.3份、磷酸氢二钾0.02份、磷酸二氢钠0.04份、20％甘油1份、司盘-80 0.01份和去离子水100份；
此外，还包括0.1份的维生素，所述维生素以重量组分计，包括以下组分：维生素C 1份、维生素E 3份、维生素A 0.5份、维生素B2 0.2份；
4)无菌滤纸吸附将上述噬菌体原液，于2℃放在装有无水氯化钙的真空干燥器内干燥保存。
实施例2
一种新型大肠杆菌噬菌体的保存方法，在6％的湿度条件下完成，包括以下步骤：
1)大肠杆菌噬菌体溶液于7℃静置8h，出现絮状沉淀，经过12000r/min离心20min；
2)向上述沉淀中加入噬菌体缓冲液，将沉淀溶解，得噬菌体液；所述噬菌体缓冲液以重量组分计，包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐15份、氯化钠0.2份、氯化钾5份、硫酸镁20份、磷酸氢二钾3份、磷酸二氢钠12份、明胶0.1份和纯化水100份，并且使用稀盐酸和/或氢氧化钠调节pH到7.5；
3)噬菌体液体积2.5倍的噬菌体保存保护剂混合均匀得噬菌体原液，所述噬菌体保存保护剂以重量组分计，包括以下组分：脱脂奶粉12份、白蛋白粉5份、酵母粉1.2份、中性白土0.1份、木炭粉0.03份、蜂胶0.05份、乳糖1.8份、麦芽糖2份、硫酸钠0.3份、氯化钙1.5份、氯化镁0.8份、磷酸氢二钾0.3份、磷酸二氢钠0.15份、40％甘油3份、司盘-80 0.08份和纯化水100份；
此外，还包括0.5份的维生素，所述维生素以重量组分计，包括以下组分：维生素C 3份、维生素E 8份、维生素A 0.8份、维生素B2 0.5份；
4)无菌滤纸吸附将上述噬菌体原液，于7℃放在装有无水甲醇的真空干燥器内干燥保存。
实施例3
一种新型溶藻弧菌噬菌体的保存方法，在5％的湿度条件下完成，包括以下步骤：
1)溶藻弧菌噬菌体溶液于4℃静置6h，出现絮状沉淀，经过9000r/min离心30min；
2)向上述沉淀中加入噬菌体缓冲液，将沉淀溶解，得噬菌体液；所述噬菌体缓冲液以重量组分计，包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10份、氯化钠0.1份、氯化钾3份、硫酸镁12份、磷酸氢二钾2份、磷酸二氢钠10份、明胶0.07份和纯化水100份，并且使用稀盐酸和/或氢氧化钠调节pH到7.2；
3)噬菌体液体积2倍的噬菌体保存保护剂混合均匀得噬菌体原液，所述噬菌体保存保护剂以重量组分计，包括以下组分：脱脂奶粉8份、白蛋白粉4份、酵母粉1份、中性白土0.06份、木炭粉0.02份、蜂胶0.03份、乳糖1.5份、麦芽糖1份、硫酸钠0.25份、氯化钙0.9份、氯化镁0.6份、磷酸氢二钾0.2份、磷酸二氢钠0.1份、30％甘油2份、司盘-80 0.016份和纯化水100份；
此外，还包括0.3份的维生素，所述维生素以重量组分计，包括以下组分：维生素C 2份、维生素E 6份、维生素A 0.7份、维生素B2 0.3份；
4)无菌滤纸吸附将上述噬菌体原液，于4℃放在装有硅胶的真空干燥器内干燥保存。
实施例4
一种新型噬菌体的保存方法，在4％的湿度条件下完成，包括以下步骤：
1)噬菌体溶液于2℃静置4h，出现絮状沉淀，经过8000r/min离心30min；
2)向上述沉淀中加入噬菌体缓冲液，将沉淀溶解，得噬菌体液；所述噬菌体缓冲液以重量组分计，包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐12份、氯化钠0.05份、氯化钾3份、硫酸镁20份、磷酸氢二钾3份、磷酸二氢钠8份、明胶0.1份，并且使用稀盐酸和/或氢氧化钠调节pH到7；
3)噬菌体液体积1.5倍的噬菌体保存保护剂混合均匀得噬菌体原液，所述噬菌体保存保护剂以重量组分计，包括以下组分：脱脂奶粉5份、白蛋白粉3份、酵母粉1.2份、中性白土0.1份、木炭粉0.02份、蜂胶0.03份、乳糖1.8份、麦芽糖2份、硫酸钠0.2份、氯化钙0.5份、氯化镁-0.8份、磷酸氢二钾0.1份、磷酸二氢钠0.04份、20％甘油3份、司盘-80 0.08份和去离子水100份；
此外，还包括0.2份的维生素，所述维生素以重量组分计，包括以下组分：维生素C 3份、维生素E 8份、维生素A 0.5份、维生素B2 0.2份；
4)无菌滤纸吸附将上述噬菌体原液，于20℃放在装有无水氯化钙的真空干燥器内干燥保存。
对使用实施例1-4的噬菌体保护剂的保存1、3、6、9个月后的噬菌体污染情况以及存活率分别进行考察，如表1所示，噬菌体均未污染，并且如图1所示，噬菌体在9个月内保持62.5％以上的存活率。
表1噬菌体污染情况
以上所述仅是发明的几个实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种新型噬菌体的保存方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）噬菌体溶液于2-7℃静置4-8h，出现絮状沉淀，经过8000-12000r/min离心20-40min；
2）向上述沉淀中加入噬菌体缓冲液，将沉淀溶解，得噬菌体液；
3）噬菌体液体积1-2.5倍的噬菌体保存保护剂混合均匀得噬菌体原液，所述噬菌体保存保护剂以重量组分计，包括以下组分：脱脂奶粉 5-12份、白蛋白粉 3-5份、酵母粉 0.5-1.2份、中性白土 0.02-0.1份、木炭粉 0.01-0.03份、蜂胶 0.02-0.05份、乳糖 1-1.8份、麦芽糖 0.8-2份、硫酸钠 0.2-0.3份、氯化钙 0.5-1.5份、氯化镁0.3-0.8份、磷酸氢二钾0.02-0.3份、磷酸二氢钠 0.04-0.15份 、甘油 1-3份、司盘-80 0.01-0.08份和水 100份；
4）无菌滤纸吸附将上述噬菌体原液，于室温或者2-7℃放在真空干燥器内干燥保存。
2.根据权利要求1所述的新型噬菌体的保存方法，其特征在于：所述噬菌体保存保护剂以重量组分计，还包括0.1-0.5份的维生素，所述维生素以重量组分计，包括以下组分：维生素C 1-3份、维生素E 3-8份、维生素A 0.5-0.8份、维生素B2 0.2-0.5份。
3.根据权利要求1所述的新型噬菌体的保存方法，其特征在于：所述干燥器内装有无水氯化钙或无水甲醇或硅胶干燥剂。
4.根据权利要求1所述的新型噬菌体的保存方法，其特征在于：所述步骤在4-6%的湿度条件下完成。
5.根据权利要求1所述的新型噬菌体的保存方法，其特征在于：所述噬菌体缓冲液以重量组分计，包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 8-15份、氯化钠 0.05-0.2份、氯化钾1-5份、硫酸镁 5-20份、磷酸氢二钾 1-3份、磷酸二氢钠 8-12份、明胶 0.05-0.1份和水 100份，并且调节pH到7-7.5。
6.根据权利要求1所述的新型噬菌体的保存方法，其特征在于：所述甘油为20%-40%的甘油。
7.根据权利要求1或5所述的新型噬菌体的保存方法，其特征在于：所述的水为去离子水或纯化水。
8.根据权利要求5所述的新型噬菌体的保存方法的制备方法，其特征在于：使用稀盐酸和/或氢氧化钠调节溶液pH。
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