KR20210062608A - 구연산염을 포함하는 유산균 동결 보호용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 출원은 구연산 염을 포함하는 유산균 동결 보호용 조성물; 상기 조성물을 이용한 동결보호된 유산균제의 제조방법; 및 상기 조성물을 이용한 유산균제의 보존 방법에 관한 것이다.
본 출원에서 제공되는 구연산 염을 포함하는 유산균 동결 보호용 조성물을 사용할 경우, 유산균의 보관 안정성이 향상되며 특히 고온에서도 동결 건조 전후 유산균의 활성을 최대로 유지시킬 수 있다.

Description

구연산염을 포함하는 유산균 동결 보호용 조성물 {Composition for cryoprotecting lactic acid bacteria containing citrate}
본 출원은 구연산염을 포함하는 유산균 동결 보호용 조성물; 상기 조성물을 이용한 동결 보호된 유산균제의 제조방법; 및 상기 조성물을 이용한 유산균제의 보존 방법에 관한 것이다.
유산균(lactic acid bacteria)은 락트산균 또는 젖산균이라고도 하며, 포유류의 장내에 서식하여 잡균에 의한 이상 발효를 방지하여 정장제로도 이용되는 중요한 세균이다. 예를 들어, 불가리아 젖산균(L. bulgaricus)은 가장 오래 전부터 알려진 유산균으로, 요구르트의 제조에 사용되며, 치즈나 발효 버터 제조 시의 스타터로도 사용된다. 호기성 젖산균(L. acidophilus)은 사람 및 모든 포유류와 그 밖의 동물의 장에 존재하며, 버터 또는 우유의 제조나 장내 자가 중독의 치료에 사용된다. 또한, 락티스 젖산 구균(L. lactis)은 DL-젖산을 생성하며, 이것은 항상 우유 속에 존재하여 버터 또는 치즈 제조에 사용되며 낙농용 젖산균으로서 가장 중요한 균이다.
상기와 같이 유용한 유산균은 장에 정착하여 장관 운동 활성화, 유해균 억제, 비타민을 비롯한 면역증강 물질 촉진, 아토피 피부의 완화 등 다양한 생리활성 효과를 발휘한다. 그러나 상기 생리학적 효과를 발휘하기 위해서는, 기존에 요거트 등 식품으로 섭취하는 양보다 훨씬 더 많은 양의 유산균을 섭취해야 한다. 따라서 유산균만을 분리하여 분말이나 캡슐 형태로 간편하게 먹는 방법이 대중화되어 있다. 그러나 유산균을 분말이나 캡슐형으로 만들게 되면, 장기적인 유통 과정 중에 사멸하는 유산균이 많아 유산균 본래의 생리 활성 기능을 발휘하지 못하게 되는 한계점이 있다.
일반적으로 유산균은 동결 건조법 또는 분사 건조법에 의하여 분말 형태로 제조하며, 그중 동결 건조법은 동결건조용 현탁용액에 미생물을 현탁시켜 동결시킨 후 감압 하에서 건조시키는 방법이다. 그러나, 유산균은 편혐기성이고 주위환경에 매우 민감하기 때문에, 분말 유산균은 저온 및 상온에서 생존율이 저하되어 생균수가 감소하게 된다. 최근에는 이러한 단점을 극복하기 위해 각종 피복제를 사용하여 유산균을 코팅시키는 방법이 개발되고 있는데, 예컨대 전분, 젤라틴, 알긴산, 셀룰로오스, 경화유, 각종 유화제 등을 동결 보호제로 사용하여 유통기간 내에 품질을 유지하도록 하는 방법 등이 개발되고 있다.
대표적으로, 젤라틴으로 코팅된 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)를 동결 건조하여 유산균의 안정성에 저장 온도 및 폴리머가 미치는 영향을 확인한 연구가 수행된 바 있다(Claude P.C. et al, Food. Res. Int., 1996, 29, 555∼562). 그러나, 상기 연구에서는 20 ℃에서 6개월 저장한 후 약 1%의 유산균이 생존하였고, 12개월 후에는 약 0.2%의 유산균만이 생존하였음을 개시하고 있어, 유산균의 생존률 및 보관안정성을 더욱 높일 수 있는 방법의 개발이 요구되는 실정이다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 구연산 염을 포함하는 조성물로 유산균을 코팅하여 동결 보호시킬 경우, 유산균의 보관 안정성이 획기적으로 향상되며 특히 고온에서도 유산균의 활성을 최대로 유지시킬 수 있음을 확인하여 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은, 구연산 염을 포함하는 유산균 동결 보호용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은, (a) 유산균을 배지에서 배양하여 균체를 회수하는 단계; (b) 구연산 염을 포함하는 조성물을 제조하는 단계; (c) 상기 (a) 단계의 유산균과 (b) 단계의 조성물을 혼합하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계의 혼합물을 동결건조하여 분말화하는 단계;를 포함하는, 동결 보호된 유산균제의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은, (a) 유산균을 배지에서 배양하여 균체를 회수하는 단계; (b) 구연산 염을 포함하는 조성물을 제조하는 단계; (c) 상기 (a) 단계의 유산균과 (b) 단계의 조성물을 혼합하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계의 혼합물을 동결 또는 건조하여 분말화하는 단계;를 포함하는, 유산균제의 보존 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 구연산 염의 유산균 동결 보호 용도를 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 출원의 하나의 양태는, 구연산 염을 포함하는 유산균 동결 보호용 조성물을 제공한다.
본 출원에서, "동결 보호"는 유산균의 활성을 그대로 보존하기 위해 동결 건조하여 보관할 때 유산균 조직을 결빙으로부터 보호하는 것을 의미한다. 본 출원에서 상기 "동결 건조(Freeze drying)"는 용기의 온도를 급격하게 낮추어 건조시키고자 하는 재료를 얼린 다음, 용기 내부의 압력을 진공으로 만들어 재료에 포함된 고체화된 용매를 바로 수증기로 승화시켜 건조하는 방법이다. 동결 건조는 열에 민감한 물질의 손상을 최소화하고 효과적으로 장기 보존할 수 있는 방법으로서 오염 방지, 저장, 수송, 경제성 측면에서 유용하다. 하지만, 유산균의 동결 건조 과정에서 유산균의 활성과 생존율이 급격하게 감소하게 되고, 동결시 얼음 입자가 만들어지면서 유산균 세포의 막 구조를 손상시키는 문제점이 있다. 이를 개선하기 위해 유산균이 손상되거나 사멸하지 않고 재수화(再水和)시 그 기능을 회복할 수 있도록 동결 건조시 함께 첨가하는 물질을 동결 보호제라고 지칭하며, 이는 유산균에 물리화학적 안정성을 부여하여 생존율을 높이는 역할을 한다.
본 출원에서, 동결 건조의 동결 온도는 영하의 온도, 예컨대 -10 ℃ 내지 -196 ℃(액화질소의 비점), -40 ℃ 내지 -196 ℃, -50 ℃ 내지 -196 ℃, -70 ℃ 내지 -196 ℃일 수 있고, 이와 같은 저온에서 세포 사멸을 초래하는 생화학적 반응을 포함하는 유산균의 모든 생물 활성이 효과적으로 정지된다.
본 출원에서, "구연산염(Citrate)"은 구연산의 임의의 염을 의미하며, 이러한 염은 나트륨, 마그네슘 또는 칼륨과 형성될 수 있다. "구연산(Citric acid)"은 음식이나 음료수에 산성 또는 신맛을 첨가하기 위해 사용되는 유기산으로, 화학식은 C6H8O7이다. 상기 구연산은 함수 구연산 또는 무수 구연산일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 본 출원의 목적상 동결 보호용 조성물에 이용될 수 있는 구연산염을 형성할 수 있는 구연산은 제한없이 포함될 수 있다. 상기 구연산염은 구연산삼염, 구연산수소이염 또는 구연산이수소일염 등으로 존재할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 그 예로, 구연산염은 구연산염의 3- 형태로서 화학식 C6H5O7 3 -의 염기성 구연산염을 의미할 수 있으나 이에 제한 되지 않는다.
본 출원의 목적상, 상기 구연산염은 동결 건조로 인한 유산균의 손상 또는 사멸을 방지하고 보관 안정성을 높이는 동결 보호제의 역할을 하며, 이는 본 출원에서 최초로 규명된 것이다.
본 출원에서, 상기 구연산염은 특별히 이에 제한되지는 않지만, 구연산나트륨, 구연산삼나트륨, 구연산마그네슘 또는 구연산삼마그네슘, 구연산칼륨일 수 있고, 그 예로, 구연산나트륨 또는 구연산삼나트륨일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물에 포함될 수 있는 구연산염은 구연산나트륨, 구연산삼나트륨, 및 구연산칼륨으로 이루어진 그룹에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 "구연산삼나트륨"은 화학식이 C6H5Na3O7인 화합물로서 백색 분말의 형태를 하는 물질로 시트르산삼나트륨으로도 불린다. 식품 제조 분야에서는 청량음료,　이온음료 등에 첨가되어 구연산의 신맛을 완화하는 산미 완화제, 가공식품(슬라이스 치즈 등), 아이스크림, 잼, 젤리,　유제품 등의 pH 조정제, 유제품의 산패 방지제, 치즈 및 어육연제품의 증점제, 아이스크림의 유화제 및 안정제 등으로 주로 사용되어 왔다.
본 출원에서, 상기 구연산 염을 종래의 동결 보호제와 사용할 경우, 이는 유산균 균체의 구조를 보다 강화할 수 있다. 유산균을 동결 보호용 조성물과 혼합할 경우 에너지원이 없는 조건에서 살아있는 유산균은 유기산을 생성하게 되고, 이로 인한 pH 저하는 유산균의 사멸을 유도하게 된다. 특히, 상기 구연산염은 약한 알칼리성을 띄기 때문에 pH 변화를 완충시키는 역할을 수행함으로써, 유산균의 손상 및 사멸을 방지한다.
상기 구연산 염은 유산균 동결 보호용 조성물 전체 중량 대비 0.1 중량% 내지 50 중량%로 포함될 수 있고, 구체적으로 0.5 중량% 내지 30 중량%, 1 중량% 내지 20 중량%, 1 중량% 내지 10 중량%, 1 중량% 내지 5 중량%, 또는 5 중량%일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 구연산 염의 중량은 유산균의 종류, 크기, 양, 동결 건조 조건, 조성물에 포함되는 다른 성분의 종류 및 함량 등에 따라 당업자가 적절히 조절하여 사용할 수 있다.
또한, 본 출원에서, 구연산 염은 0.1 중량% 내지 50 중량%로 수용화하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 0.1 중량% 내지 30 중량%, 0.1 내지 10 중량%, 0.5 내지 10 중량%, 3 내지 10 중량%, 3 내지 8 중량%, 3 내지 5 중량%, 또는 5 중량%로 수용화할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 동결보호용 조성물은 유산균의 고형분 함량을 15 중량 % 내지 50 중량 %, 또는 15 중량 % 초과 내지 50 중량 % 미만, 16 중량 % 내지 45 중량 %, 20 중량 % 내지 49 중량 %, 20 중량 % 내지 45 중량 %, 25 중량 % 내지 45 중량 %, 25 중량 % 내지 40 중량 %, 25 중량 % 내지 35 중량 %로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일반적으로, 유산균의 고형분 함량이 15 중량 % 내지 50 중량%일 경우 본 공정의 이용 시 유산균 건조 분말 수율을 유지하면서, 공정상에 제조비를 적정 수준으로 유지할 수 있으므로, 이를 바탕으로 유산균의 고형분 함량을 적절히 선택할 수 있다.
상기 동결보호용 조성물은 유산균 균체 100 중량부 대비, 5 내지 25 중량부, 5 내지 10 중량부, 5 내지 15 중량부, 5 내지 20 중량부, 5 내지 21 중량부, 5 내지 22 중량부, 5 내지 23 중량부, 5 내지 24 중량부, 6 내지 10 중량부, 6 내지 15 중량부, 6 내지 20 중량부, 6 내지 25 중량부, 8 내지 10 중량부, 8 내지 15 중량부, 8 내지 20 중량부, 8 내지 25 중량부, 10 내지 15 중량부, 10 내지 20 중량부, 10 내지 25 중량부, 15 내지 20 중량부, 또는 15 내지 25 중량부로 첨가되도록 포함된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 유산균 동결 보호용 조성물은 동결 보호제, 다공성 지지체 및 질소원으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 1종, 2종 및 3종을 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 유산균 동결 보호용 조성물은 구연산염을 제외하고도, 종래에 동결보호제로서 알려진 성분을 추가로 포함할 수 있다. 즉, 본 출원에서 유산균 동결 보호용 조성물에 추가로 포함되는 "동결 보호제"는 구연산 염을 제외하고 해당 기술분야에서 통상적으로 사용되는 동결 보호 효능을 가지는 물질을 의미한다. 상기 동결 보호제는 시판되는 것을 구입하여 이용할 수 있으며, 그 종류에는 특별한 없다. 구체적으로, 동결 보호제로서 트레할로스, 당류, 아미노산, 펩티드, 젤라틴, 글리세롤, 당알콜, 유청, 알긴산, 아스코르빈산, 효모 추출물, 탈지유 등을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 보다 구체적으로 트레할로스일 수 있다.
본 출원에서, 상기 "트레할로스(Trehalose)"는 식물이나 미생물등 자연계에 널리 존재하고 있는 당질로서 화학식이 C12H22O11인 물질이다. 트레할로스는 동결 건조로 인해 유산균이 손상 또는 사멸하는 것을 방지하며 재수화시 그 기능을 회복할 수 있게 도와주는 동결 보호제의 역할을 하는 것으로 알려진 물질이며, 특히 본 출원에서 구연산 염과 트레할로스가 함께 사용될 경우 유산균의 동결 보호 효과를 높일 수 있다.
상기 트레할로스는 유산균 동결 보호용 조성물 전체 중량 대비 10 내지 40 중량%, 10 내지 30 중량%, 15 내지 25 중량%, 또는 20 중량%일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 트레할로스를 포함하여, 동결 보호제의 중량은 본 출원의 조성물에 포함되는 구연산 염의 중량, 유산균의 종류, 크기, 양, 동결 건조 조건, 다른 성분의 종류 및 함량 등에 따라 당업자가 적절히 조절하여 사용할 수 있다.
본 출원에서, 상기 "다공성 지지체"는 외부 수분 및 공기의 유입을 차단하고, 동결 건조된 유산균에 다공성을 부여하여 재수화 작용을 용이하게 하는 역할을 한다. 상기 다공성 지지체는 해당 기술분야에서 동결 건조시 통상적으로 사용되는 다공성 지지체로서 시판되는 것을 구입하여 이용할 수 있으며, 특별히 그 종류에 제한이 없다. 구체적으로, 다공성 지지체는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 말토덱스트린, 알기네이트, 키토산, 전분, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 트리아세틴, 아세틸트리에틸 시트레이트, 트리에틸 시트레이트, 글리세린, 또는 이들의 조합일 수 있고, 보다 구체적으로 말토덱스트린일 수 있다.
본 출원에서, 상기 "말토덱스트린(Maltodextrin)"은 다공성 입자 기제의 백색 분말로서, 흔히 요구르트, 소스, 샐러드 드레싱 등 일반 식품에 종종 사용되는 식품 첨가물이며, 본 출원에서는 유산균의 동결 건조시 다공성 지지체로서 사용된다.
상기 말토덱스트린은 유산균 동결 보호용 조성물 전체 중량 대비 1 중량% 내지 50 중량%일 수 있고, 구체적으로 1 중량% 내지 30 중량%, 1 중량% 내지 10 중량%, 1 중량% 내지 5 중량%, 또는 5 중량%일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서, 상기 "질소원(N-source)"은 유산균의 질소 에너지원으로 사용되는 물질을 의미하며, 이는 후발효에 의한 균체의 손상을 방지하는 역할을 한다. 유산균을 동결 보호용 조성물과 혼합할 경우 에너지원이 없는 조건에서 살아있는 유산균은 유기산을 생성하게 되고, 이는 pH 저하를 일으켜 유산균의 사멸을 유도한다. 따라서, 질소 에너지원은 유기산 생성 및 이로인한 pH 저하를 방지하므로, 유산균의 사멸을 예방할 수 있게 된다.
상기 질소원은 해당 기술분야에서 동결 건조시 통상적으로 사용되는 질소원으로서 시판되는 것을 구입하여 이용할 수 있으며, 특별히 그 종류에 제한이 없다. 구체적으로, 질소원은 특별히 이에 제한되지는 않으나, 탈지 분유, 유청 단백질, 효모 추출물, 맥아 추출물, 비프 추출물, 카세인 가수분해물, 맥아 추출물, 트립톤, 시스테인, 펩톤일 수 있고, 구체적으로 상기 펩톤으로는 소이펩톤, 피쉬 펩톤, 프로테오스 펩톤, 카세인 펩톤, 펩톤 No.3를 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 소이펩톤일 수 있다.
상기 소이펩톤은 유산균 동결 보호용 조성물 전체 중량 대비 1 중량% 내지 50 중량%일 수 있고, 구체적으로 1 중량% 내지 30 중량%, 1 중량% 내지 10 중량%, 1 중량% 내지 5 중량%, 또는 5 중량%일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서, "유산균"은 당류를 발효하여 에너지를 획득하고 다량의 락트산을 생성하는 세균을 총칭하는 용어로서, 특별히 이에 제한되지는 않으나, 락토바실러스 속(Lactobacillus sp .), 비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp .), 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp .), 락토코커스 속(Lactococcus sp .), 엔테로코커스 속(Enterococcus sp .), 페디오코커스 속(Pediococcus sp .) 류코노스톡 속(Leuconostoc sp .) 및 비셀라 속(Weissella sp .)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다. 구체적으로, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 람노서(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 롱굼(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 스트렙토코커스 훼칼리스(Streptococcus faecalis) 및 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp . lactis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다. 보다 구체적으로, 대한민국 등록특허 제1178217호에 개시된 락토바실러스 플란타룸 CJLP243(Lactobacillus plantarum CJLP243), 대한민국 등록특허 제1486999호에 개시된 락토바실러스 플란타룸 CJLP133(Lactobacillus plantarum CJLP133), 대한민국 등록특허 제1075558호에 개시된 락토바실러스 플란타룸 CJLP136(Lactobacillus plantarum CJLP136), 대한민국 등록특허 제1255050호에 개시된 락토바실러스 플란타룸 CJLP55(Lactobacillus plantarum CJLP55) 및 대한민국 등록특허 제1075557호에 개시된 락토바실러스 플란타룸 CJLP56(Lactobacillus plantarum CJLP56)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 균주는 한국생명공학연구원 유전자 은행에 기탁되어 있으며, 통상의 기술자가 용이하게 입수할 수 있다.
본 출원의 유산균 동결 보호용 조성물은 코팅제 형태로 적용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 즉, 본 발명의 유산균 동결 보호용 조성물은 유산균과 혼합되어 유산균의 표면을 코팅시킬 수 있고, 이를 통해 유산균을 외부 환경으로부터 보호하고 보관 안정성을 높이는 것일 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는, (a) 유산균을 배지에서 배양하여 균체를 회수하는 단계; (b) 구연산 염을 포함하는 조성물을 제조하는 단계; (c) 상기 (a) 단계의 유산균과 (b) 단계의 조성물을 혼합하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계의 혼합물을 동결건조하여 분말화하는 단계;를 포함하는, 동결 보호된 유산균제의 제조방법을 제공한다.
(a) 단계의 유산균은 상기에서 설명한 바와 같다.
본 출원에서, "배양"은 상기 유산균을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서, "배지"는 상기 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스, 만니톨, 소르비톨 등과 같은 탄수화물; 당 알코올, 글리세롤, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 알코올; 유기산, 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2종 이상이 조합되어 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2종 이상이 조합되어 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 나트륨-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서, 유산균의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
배지의 온도는 20 ℃ 내지 50 ℃, 구체적으로는 30 ℃ 내지 37 ℃일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 배양 기간은 유용 물질의 원하는 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 10시간 내지 100시간일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 유산균 균체를 회수하는 단계는 본 출원의 유산균의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지로부터 목적하는 균체를 회수할 수 있다. 예컨대 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 및 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으나, 이들 예에 제한되지 않는다.
상기 회수 단계는 추가적인 정제 공정을 포함할 수 있다. 상기 정제공정은 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 회수된 유산균 균체를 정제할 수 있다.
(b) 단계의 구연산염은 상기에서 설명한 바와 같다. 구연산염은 구연산나트륨, 구연산삼나트륨 및 구연산칼륨으로 이루어진 그룹에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 (b) 단계의 조성물은 동결 보호제, 다공성 지지체 및 질소원으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 트레할로스, 말토덱스트린 및 소이펩톤으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
동결 보호제, 다공성 지지체, 질소원, 트레할로스, 말토덱스트린, 소이펩톤은 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 (b) 단계의 조성물은 조성물 내 유산균의 고형분 함량이 15 중량% 내지 50 중량 %일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 (c) 단계의 혼합은 유산균 균체 100 중량부 대비 5 내지 25 중량부의 구연산염이 첨가된 (b) 단계의 조성물을 혼합하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 고형분 함량 범위 및 구연삼연의 첨가 함량 범위는 상기에서 설명한 바와 같다.
또한, 상기 (c) 단계는 동결 건조 전 (a) 단계의 유산균과 (b) 단계의 유산균 동결 보호용 조성물을 혼합하는 단계로서, 유산균과 조성물의 혼합비는 중량 기준으로 1:0.1 내지 1:5일 수 있고, 구체적으로 1:0.1 내지 1:4, 1:0.5 내지 1:3, 1:0.5 내지 1:2, 또는 1:2일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 (d) 단계는 (c) 단계의 혼합물을 건조하여 분말화하는 단계로서, 혼합물을 건조 트레이(Tray)에 옮겨 담아 건조 공정을 진행한다. 상기 건조방법은 특별히 이에 제한되지는 않지만, 대기 건조, 분무 건조, 진공 건조 또는 동결 건조일 수 있고, 구체적으로 동결 건조일 수 있다. 보다 구체적으로, -10 ℃ 내지 -196 ℃, -40 ℃ 내지 -196 ℃, 또는 -40 ℃ 내지 -70 ℃의 온도에서 12시간 내지 24시간로 유지시켜 동결시킨 후, 동결 건조기에서 해동하여 수분을 제거하는 단계일 수 있다.
상기 유산균제는 그래뉼, 분말, 산제, 과립제, 침제, 유제, 유동제, 정제, 환제, 캅셀제, 과립제, 연고, 좌제, 주사액, 흡입제, 에어로졸, 현탁제, 시럽제, 에멀젼, 연·경질 캡슐, 엘릭시르제(elixirs), 트로치제(troches) 또는 로젠제(lozenge) 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 다른 하나의 양태는, (a) 유산균을 배지에서 배양하여 균체를 회수하는 단계; (b) 구연산 염을 포함하는 조성물을 제조하는 단계; (c) 상기 (a) 단계의 유산균과 (b) 단계의 조성물을 혼합하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계의 혼합물을 동결 또는 건조하여 분말화하는 단계;를 포함하는, 유산균제의 보존 방법을 제공한다.
본 출원에서 "보존 방법"은, 본 출원의 목적상 장기간 특정 온도 범위에서 유산균제의 바람직한 기능 및/또는 생물 활성을 유지하면서 존재시키는 방법을 의미하며, 보다 구체적으로 실온에서 1년 이상 존재시키는 방법을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 유산균제의 바람직한 기능 및/또는 생물 활성은 10% 이상으로 유지될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
(a) 단계의 유산균, 배지, 배양, 회수, (b) 단계의 구연산염, (c) 단계의 혼합비는 상기에서 설명한 바와 같다.
(d) 단계의 건조는 그 방법이 특별히 이에 제한되지는 않지만, 대기 건조, 분무 건조, 진공 건조 또는 동결 건조일 수 있고, 구체적으로 동결 건조일 수 있다.
본 출원의 또 하나의 양태는 구연산 염의 유산균 동결 보호 용도를 제공하는 것이다.
구연산염, 및 유산균 동결 보호 용도는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 출원에서 제공되는 구연산 염을 포함하는 유산균 동결 보호용 조성물을 사용할 경우, 유산균의 보관 안정성이 향상되며 특히 고온에서도 동결 건조 전후 유산균의 활성을 최대로 유지시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 유산균제의 제조방법을 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 출원을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 출원을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 동결 보호제로 구연산삼나트륨 성분을 포함하는 유산균 건조 분말의 제조
락토바실러스 플란타룸 CJLP133 균주를 MRS 액체 배지(Difco, USA)를 이용하여, 37 ℃에서 18 내지 24시간 동안 배양하였다. 원심 분리기를 이용하여 상등액은 버리고 유산균만을 회수하였다.
이후, 트레할로스(유산균 동결 보호용 조성물 전체 중량 대비 20 중량%), 말토덱스트린(유산균 동결 보호용 조성물 전체 중량 대비 5 중량%), 소이펩톤(유산균 동결 보호용 조성물 전체 중량 대비 5 중량%), 구연산염의 예인 구연산삼나트륨(유산균 동결 보호용 조성물 전체 중량 대비 5 중량%) 및 물(잔량)을 혼합하고 멸균하였다.
회수한 유산균(고형분 함량 30 중량%)과 상기 동결 보호용 조성물을 1:2 중량 비율로 혼합하여 현탁하였고, 동결 건조 트레이에 옮겨 담아, 급속 동결 조건(-10 ℃ 이하)에서 12 내지 24시간 전후로 유지한 후, 동결 건조기에서 해동하면서 수분을 제거하여 상기 동결 보호용 조성물로 코팅된 유산균 분말을 수득하였다.
비교예 1: 트레할로스 및 말토덱스트린을 포함하는 유산균 건조 분말의 제조
락토바실러스 플란타룸 CJLP133 균주를 MRS 액체 배지(Difco, USA)를 이용하여, 37 ℃에서 18 내지 24시간 동안 배양하였다. 원심 분리기를 이용하여 상등액은 버리고 유산균만을 회수하였다.
이후, 트레할로스(유산균 동결 보호용 조성물 전체 중량 대비 20 중량%), 말토덱스트린(유산균 동결 보호용 조성물 전체 중량 대비 5 중량%), 및 물(잔량)을 혼합하고 멸균하였다. 유산균(고형분 함량 30 중량%)과 상기 동결 보호제를 1:2 중량비율로 혼합하여 현탁하였다. 혼합액을 동결 건조 트레이에 옮겨 담아, 급속 동결 조건(-10 ℃ 이하)에서 12 내지 24시간 전후로 유지한 후, 동결 건조기에서 해동하면서 수분을 제거하였다.
즉, 비교예 1은 실시예 1과 대비하여 코팅액 제조시 소이펩톤과 구연산삼나트륨을 생략한 것이다.
비교예 2: 트레할로스 , 말토덱스트린 및 소이펩톤을 포함하는 유산균 건조 분말의 제조
락토바실러스 플란타룸 CJLP133 균주를 MRS 액체 배지(Difco, USA)를 이용하여, 37 ℃에서 18 내지 24시간 동안 배양하였다. 원심 분리기를 이용하여 상등액은 버리고 유산균만을 회수하였다.
이후, 트레할로스(유산균 동결 보호용 조성물 전체 중량 대비 20 중량%), 말토덱스트린(유산균 동결 보호용 조성물 전체 중량 대비 5 중량%), 소이펩톤(유산균 동결 보호용 조성물 전체 중량 대비 5 중량%), 및 물(잔량)을 혼합하고 멸균하였다. 유산균과 상기 동결 보호제를 1:2 중량 비율로 혼합하여 현탁하였다. 혼합액을 동결 건조 트레이에 옮겨 담아, 급속 동결 조건(-10 ℃ 이하)에서 12 내지 24시간 전후로 유지한 후, 동결 건조기에서 해동하면서 수분을 제거하였다.
즉, 비교예 2은 실시예 1과 대비하여 코팅액 제조시 구연산삼나트륨을 생략한 것이다.
실험예 1: 구연산삼나트륨 유무에 따른 고온 안정성 평가(40℃에서 6주 저장)
동결 건조화된 유산균 분말은 저장 온도 및 저장 기간에 따라 점차 활성이 감소한다. 일반적으로 활성에 영향을 주는 요인으로는 온도, 산소, 수분 등이 꼽힌다. 1차적으로, 동결 건조화된 유산균 분말은 흡습성이 매우 강하여 저장 초기에 많은 함량 감소가 일어나게 된다. 유통 저장성을 향상하기 위하여 포장재에 탈산소제를 적용하거나, 제습을 위한 여러 가지 방법들이 있지만, 궁극적으로는 유산균 분말 자체의 코팅 정도에 따라 저장 기간에 많은 차이를 보이게 된다. 따라서 원료 특성에 기인한 흡습성을 완화하기 위해 포도당과 덱스트린과 같은 부형제를 분말 대비 1 내지 10배 범위 이내에서 혼합하여 보관한다. 본 실험에서는 말토덱스트린과 무수결정포도당이 1:1 비율로 혼합된 부형제를 분말과 혼합부형제 1:9의 비율로 혼합하여 보관하였다. 저장 기간 중의 공기 투과성을 배제하기 위하여 알루미늄 파우치에 개별 포장하여 보관하였으며, 40℃에서 4주간 보관하여 가혹 조건에서의 생존율을 분석하였다.
구체적으로, 동결 건조 분말화한 비교예 1, 비교예 2 및 실시예 1 시료를 알루미늄 파우치 포장에 일정량을 담아 개별 포장하여 밀봉하였다. 시료는 각각 40 ℃ 인큐베이터에 4주간 보관하였다. 일정 시간이 지난 후 실험군 시료를 Saline Buffer에 1:100의 배율로 희석하여 멸균백에 담은 후 균질화하였다. Saline Buffer로 연속적인 희석을 진행한 샘플을 MRS 아가 플레이트(Agar Plate)에 도말하였다. 플레이트를 수거하고 37 ℃ 호기 조건 하에서 24시간 정치 배양한 후 계수하여, 그 결과를 아래 표 1 및 표 2에 나타내었다. 하기 표에 기재한 숫자는 초기 유산균 대비 생존율(%)을 나타낸다.
비교예 1 비교예 2 실시예 1
초기 100.0% 100.0% 100.0%
1주 55.3% 66.5% 79.8%
2주 41.0% 43.7% 74.6%
3주 35.4% 45.4% 69.7%
4주 23.5% 45.7% 75.4%
가혹 조건을 적용하여 균의 활성을 전후 비교 측정하였다. 구연산삼나트륨이 포함된 실시예 1에서, 가혹 조건 이후에도 높은 비율로 유산균을 회수할 수 있었으며, 구연산삼나트륨이 포함되지 않은 비교예 1, 2와 비교하여 유산균의 생존율이 현저히 높은 것을 확인하였다. 이와 같은 결과는 구연산염의 대표적인 예인 구연산삼나트륨이 유산균에서 우수한 동결 보호제 성분이 될 수 있음을 시사하는 것이다.
실험예 2: 구연산삼나트륨 함량에 따른 보관 안정성 평가
실시예 1의 구연산삼나트륨의 양을 5 중량%에서 다르게 변경하면서 실험예 1과 동일한 방법의 실험을 수행하였다. 트레할로스, 말토덱스트린, 소이펩톤 및 구연산삼나트륨의 함량은 다음과 같이 혼합하였다.
실시예 2 실시예 3 실시예 4
트레할로스 20 중량% 20 중량% 20 중량%
말토덱스트린 5 중량% 5 중량% 5 중량%
소이펩톤 5 중량% 5 중량% 5 중량%
구연산삼나트륨 0.1 중량% 1 중량% 2.5 중량%
유산균을 계수한 후 초기 유산균 대비 생존율(%)을 계산하여 하기 표 3에 나타내었다.
실시예 2
(구연산삼나트륨
0.1%)		 실시예 3
(구연산삼나트륨
1%)		 실시예 4
(구연산삼나트륨
2.5%)		 실시예 1
(구연산삼나트륨
5%)
초기 100.0% 100.0% 100.0% 100.0%
1 75.5% 97.3% 80.6% 79.8%
2 61.8% 84.1% 72.8% 74.6%
3 50.7% 73.0% 60.9% 69.7%
4 44.9% 61.6% 58.9% 75.4%
상기 표 3에서 알 수 있듯이, 구연산삼나트륨이 가장 많이 함유된 실시예 1의 경우, 1주차의 생존율이 가장 높게 나타나지는 않았으나, 시간이 경과하여도 사멸하는 유산균의 수가 가장 낮아, 생존율 감소가 가장 낮게 나타남을 확인하였다. 따라서, 4주 후 최종적으로는 유산균의 생존율이 가장 높게 나타났으며, 이를 통해 구연산삼나트륨의 함량이 가장 높은 실시예 1에서 유산균의 보관 안정성이 가장 높은 것을 확인하였다.
실험예 3: 구연산삼나트륨 함량에 따른 동결 건조 수율 평가
살아있는 유산균은 보관 안정성의 향상을 위해 건조 과정을 거치며, 가장 열에너지를 적게 받아 건조 수율이 높은 동결 건조 방법이 선호된다. 하지만 동결 건조 과정에서도 유산균의 사멸을 100% 예방할 수는 없으며, 동결 보호제의 조성에 따라 그 수율에 영향을 주게 된다. 건조 전 유산균의 총균수 대비 건조 후 총균수의 생존율(%)을 계산하여, 해당 결과를 표 4에 나타내었다.
실시예 2
(구연산삼나트륨 0.1%)		 실시예 3
(구연산삼나트륨 1%)		 실시예 4
(구연산삼나트륨 2.5%)		 실시예 1
(구연산삼나트륨 5%)
수율 66.6% 71.9% 88.0% 99.1%
상기 표 4에서 알 수 있듯이, 구연산삼나트륨의 함량이 높아질수록, 건조 전·후를 비교한 유산균의 생존률이 비례하여 증가하였다. 즉, 구연산삼나트륨은 동결 건조시 유산균의 사멸을 방지하는 역할을 수행하였으며, 구연산삼나트륨의 함량이 높아질수록 이의 효과 또한 함께 증가함을 시사하는 것이다.
실험예 4: 구연산삼나트륨 유무에 따른 보관 안정성 평가(CJLP243)
락토바실러스 플란타룸 CJLP133 대신 락토바실러스 플란타룸 CJLP243 균주를 사용한 것을 제외하고는, 비교예 1 및 실시예 1과 동일한 함량의 조성물을 제조하여 실험예 1을 동일하게 수행하였다. 초기 유산균 대비 생존율(%)을 계산하여 하기 표 5에 나타내었다.
비교예 1 실시예 1
초기 100.0% 100.0%
1 46.0% 66.2%
2 36.2% 60.9%
3 26.2% 42.5%
4 16.1% 40.8%
표 5에 나타난 바와 같이, 유산균 균주를 락토바실러스 플란타룸 CJLP243로 변경하여 실험을 수행하더라도, 구연산삼나트륨을 함유하는 실시예 1에서 유산균 생존율이 현저히 높게 나타나고, 시간의 경과에 따른 시간 안정성 또한 우수함을 확인하였다. 즉, 상기 구연산삼나트륨의 함유에 따른 보관 안정성의 효과는 유산균 균주에 관계 없이 발현될 수 있음을 시사하는 것이다.
상기와 같은 결과들은 구연산염이 유산균 균주의 종류에 관계없이 안전성을 유지하면서 동결 보호를 할 수 있음을 시사하는 것으로, 유산균 생존율이 장기간 높게 유지할 수 있는 우수한 유산균의 동결 보호 용도로서 이용될 수 있음을 시사하는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (16)

  1. 구연산염 및 질소원을 포함하는, 유산균 동결 보호용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 구연산염은 구연산나트륨, 구연산삼나트륨, 및 구연산칼륨으로 이루어진 그룹에서 선택된 1종 이상인, 유산균 동결 보호용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 동결 보호제 및 다공성 지지체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는, 유산균 동결 보호용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 트레할로스, 말토덱스트린 및 소이펩톤으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는, 유산균 동결 보호용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp.), 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 락토코커스 속(Lactococcus sp.), 엔테로코커스 속(Enterococcus sp.), 페디오코커스 속(Pediococcus sp.) 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.) 및 비셀라 속(Weissella sp.)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인, 유산균 동결 보호용 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 구연산염은 유산균 동결보호용 조성물 전체 중량 대비 0.1 중량% 내지 50 중량%로 포함한 것인, 유산균 동결 보호용 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 동결보호용 조성물은 유산균의 고형분 함량을 15 중량% 내지 50 중량%로 포함하는 것인, 유산균 동결 보호용 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 구연산염은 유산균 균체 100 중량부 대비 5 내지 25 중량부로 첨가되도록 포함된 것인, 유산균 동결 보호용 조성물.
  9. (a) 유산균을 배지에서 배양하여 균체를 회수하는 단계;
    (b) 구연산염 및 질소원을 포함하는 조성물을 제조하는 단계;
    (c) 상기 (a) 단계의 유산균과 (b) 단계의 조성물을 혼합하는 단계; 및
    (d) 상기 (c) 단계의 혼합물을 동결건조하여 분말화하는 단계를 포함하는, 동결 보호된 유산균제의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 (b) 단계의 구연산염은 구연산나트륨, 구연산삼나트륨, 및 구연산칼륨으로 이루어진 그룹에서 선택된 1종 이상인, 동결 보호된 유산균제의 제조방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 (b) 단계의 조성물은 동결 보호제 및 다공성 지지체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는, 동결 보호된 유산균제의 제조방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 (b) 단계의 조성물은 트레할로스, 말토덱스트린 및 소이펩톤으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는, 동결 보호된 유산균제의 제조방법.
  13. 제9항에 있어서, 상기 (b) 단계의 조성물은 조성물 내 유산균의 고형분 함량이 15 중량% 내지 50 중량%인, 동결 보호된 유산균제의 제조방법.
  14. 제9항에 있어서, 상기 (c) 단계의 혼합은 유산균 균체 100 중량부 대비 5 내지 25 중량부의 구연산염이 첨가된 (b) 단계의 조성물을 혼합하는 것인, 동결 보호된 유산균제의 제조방법.
  15. (a) 유산균을 배지에서 배양하여 균체를 회수하는 단계;
    (b) 구연산 염 및 질소원을 포함하는 조성물을 제조하는 단계;
    (c) 상기 (a) 단계의 유산균과 (b) 단계의 조성물을 혼합하는 단계; 및
    (d) 상기 (c) 단계의 혼합물을 동결 또는 건조하여 분말화하는 단계를 포함하는, 유산균제의 보존 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 건조는 대기 건조, 분무 건조, 진공 건조 또는 동결 건조인, 유산균제의 보존 방법.
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