JP2018503684A - 乳酸菌を活性化する方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、クエン酸塩を含む調製物に生乳酸菌を曝露すること含む前記細菌を活性化する方法に関し、ここで、前記細菌は、クエン酸塩を外部電子受容体として利用する能力を有する。本発明は、哺乳動物における特定の生細菌の活性を増強する方法にさらに関する。より具体的には、本発明は、フリーズドライ状態から特定の乳酸菌の目覚めを改善することに関する。本発明はまた、前記活性化細菌を含む調製物および前記活性化細菌の治療的使用に関する。

Description

本発明は、一般的に、哺乳動物における特定の生細菌の活性の開始を増強することに関する。さらに、本発明は、基質成分および特定の生細菌を含む調製物に関し、基質成分は、前記細菌の再構成および早期増殖を改善するように特異的に設計または選択される。
生細菌療法の有効性は、目的および菌株特異的であり、様々な菌株は、異なるメカニズムによって宿主の健康に寄与し得る。様々な生細菌は、病原体の増殖を防止または阻害することができ、病原体による毒性因子の産生を抑制し、炎症反応を促進する方法または抗炎症性の方法で免疫応答を調節し、多くの他の方法で宿主に影響を及ぼすことができる。
ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）は、ヘテロ発酵性乳酸菌であり、ヒトおよび他の動物の胃腸管においてしばしば見出される。ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）は、ヒト胃腸管の生来の有機体であると考えられ、例えば、胃体、胃前庭部、十二指腸、および回腸の粘膜上に存在する。様々なラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）菌株は、腸にコロニーを形成し、下痢治療剤として作用し、腸運動性を調節し、細菌性病原体の阻害剤として機能し、胃腸粘膜を免疫学的に調節し、胃等で抗炎症剤として機能する能力を有する。
生細菌の経口投与の問題は、それらの効果を主張するだろう腸管の場所における生細菌の不十分な量および／または活性である。これは、生細菌の用量が増加されなければならず、および／またはより頻繁な投与が必要であり、また活性の喪失をもたらすことができるという結果をもたらし得る。これは、不必要な費用、摂取の望ましくない頻度および／または減少したまたは存在しない健康効果をもたらす。
生細菌のいくつかの特定の適用において、投与後すぐに、所望の健康効果のために活性よび代謝生細菌を有することが最も重要であり、これらの適用のいくつかにおいて、個々の栄養素の量は、医学的理由により意図的に制限される必要があり得る。したがって、解決すべき問題は、個々に投与されるべき選択された生細菌を素早く活性化することであるが、個々に与えられる栄養素に対する影響を最小限に抑えることである。本明細書中で本発明は、特定の細菌に対するこの問題を解決することが意図される。
本発明の第１の目的は、ヒトにおける、特に新生児における特定の生細菌の活性化の強化された開始を提供することである。活性の強化された開始は、新生児に投与された栄養分を有意に変えることなく、前記新生児に投与される場合、生細菌の改善された（例えば、より速いまたはより迅速な）再構成および早い増殖（例えば、改善された増殖または増殖速度）に基づく。新生児は、早産児から正期産児を含む。
本明細書中の本発明において、例えば、未熟児における生細菌の速い活性化について、生成物に加える基質成分の新しい組み合わせが開発されている。本発明者らは、驚くべきことに、クエン酸塩の塩の、好ましくは、ラクトースなどの炭素源と組み合わせた、処方混合物への添加は、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９３８および類似の細菌の再構成および早期増殖を改善することを見出した。赤ちゃんに与えられる栄養分に対する最小限の影響を、代謝において電子受容体としてクエン酸塩を使用することができる菌株は、好ましくは、本明細書中の本発明で使用されるべきである。
より具体的には、本発明の目的は、基質成分を含む調製物を提供することであり、これはクエン酸塩および特定の生細菌を含み、基質成分は、前記生細菌の再構成、目覚めおよび増殖を改善するように特異的に設計されている。
本発明は、特定の細菌が活性化される時点で（すなわち、それらが休眠形態から活性および代謝形態に移行する場合）、クエン酸塩の存在（クエン酸塩への曝露）が、例えば、改善された再構成、目覚めおよび／または増殖の観点で、それらの活性化を改善する驚くべき知見に基づく。言い換えれば、クエン酸塩の存在（クエン酸塩への曝露）は、それらが活性化される場合、細菌に「キックスタート」を提供する。
したがって、本発明は、生細菌、特に乳酸菌を活性化する方法を提供し、これは前記細菌をクエン酸塩を含む調製物に曝露することを含み、ここで、前記細菌は、クエン酸塩を外部電子受容体として利用する能力を有する。特に、クエン酸塩の前記利用は、改善された増殖速度をもたらす。したがって、本発明はまた、生細菌、特に乳酸菌を活性化する方法を提供し、これは前記細菌をクエン酸塩を含む調製物に曝露することを含み、ここで、前記細菌は、改善された増殖速度のためにクエン酸塩を利用する能力を有する。
さらに、本発明は、本発明の方法によって調製され、得られ、または得ることができる活性化された細菌、特に乳酸菌を含む調製物を提供する。
したがって、本発明はまた、以下を含む調製物を提供する：
（ｉ）クエン酸塩を外部電子受容体として利用する能力を有する生細菌、特に乳酸菌；および
（ｉｉ）クエン酸塩。
好ましい態様において、前記調製物中の細菌は、休眠状態の細菌であり、例えば、細菌および調製物は、凍結、凍結乾燥またはフリーズドライされる。
またさらなる側面において、本発明は、本明細書中に記載されるように、本発明のそのようなクエン酸塩活性化細菌または本発明の調製物の治療的使用を提供する。
したがって、本発明は、治療における、例えば、より速い活性化された生細菌または改善された増殖速度を有する細菌の投与から恩恵を受ける状態の対象の治療における使用のために、本発明の方法によって調製され、得られまたは得ることができる活性化された細菌、特に乳酸菌を提供する。したがって、本発明のいくつかの態様において、活性化方法のステップが行われ、その後、活性化された細菌が治療で使用される。
本発明は、治療において、例えば、より速い活性化された生細菌または改善された増殖速度を有する細菌の投与から恩恵を受ける状態の対象の治療において使用するための、（ｉ）クエン酸を外部電子受容体として利用する応力を有する生細菌、特に乳酸菌、および（ｉｉ）クエン酸塩を含む調製物を提供する。
あるいは、本発明は、治療において、例えば、より速い活性化された生細菌または改善された増殖速度を有する細菌の投与から恩恵を受ける状態の対象の治療において使用するためのクエン酸塩活性化生細菌、特に乳酸菌を提供する。
さらなる側面において、本発明はまた、より速い活性化された生細菌または改善された増殖速度を有する細菌の投与から恩恵を受ける状態の対象の治療のための医薬品または組成物の製造において本発明の方法によって調製され、得られまたは得ることができる活性化された細菌、特に乳酸菌の使用を提供する。
本発明は、より速い活性化された生細菌または改善された増殖速度を有する細菌の投与から恩恵を受ける状態の対象の治療のための医薬品または組成物の製造において、（ｉ）クエン酸塩を外部電子受容体として利用する能力を有する生細菌、特に乳酸菌、および（ｉｉ）クエン酸塩を含む調製物の使用を提供する。
あるいは、本発明は、より速い活性化された生細菌または改善された増殖速度を有する細菌の投与から恩恵を受ける状態の対象の治療のための医薬品または組成物の製造における、クエン酸塩活性化生細菌、特に乳酸菌の使用を提供する。
本発明のさらなる側面は、より速い活性化された生細菌または改善された増殖速度を有する細菌の投与から恩恵を受ける状態の対象の治療の方法を提供し、前記方法は、前記対象に本発明の方法によって調製され、得られまたは得ることができる活性化された細菌、特に乳酸菌の有効量の投与を含む。
本発明は、より速い活性化された生細菌または改善された増殖速度を有する細菌の投与から恩恵を受ける状態の対象の治療の方法を提供し、前記方法は、前記対象に対して、（ｉ）クエン酸塩を外部電子受容体として利用する能力を有する生細菌、特に乳酸菌、および（ｉｉ）クエン酸塩を含む調製物の有効量の投与を含む。
あるいは、本発明は、より速い活性化された生細菌または改善された増殖速度を有する細菌の投与から恩恵を受ける状態の対象の治療の方法を提供し、前記方法は、前記対象に対して、クエン酸塩活性化生細菌、特に乳酸菌の有効量の投与を含む。
本発明の治療および使用の前記方法における細菌または細菌調製物の投与は、治療を必要とする対象（哺乳動物）に薬学的または生理学的有効量で実施される。したがって、前記方法および使用は、治療の必要な対象を特定するさらなるステップを含み得る。本明細書中の他の箇所に記載されるような本発明の代替的で好ましい態様および特徴は、本発明の治療および使用のこれらの方法に等しく適用する。
図１は、「人工腸基板」におけるラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９３８の増殖を示すグラフである。炭水化物の２つの異なる源は、３つの異なる電子受容体と組み合わせて試験された。細菌は、炭水化物のみでほとんど増殖しなかったが、電子受容体が添加された場合、増殖が増加した。電子受容体としてのクエン酸塩が、最も高い効果を示した。 図２は、発酵槽培養物をＤＳＭ１７９３８として同定するゲル電気泳動からの結果を示す：１．マーカー（ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ １ｋｂ＋ＤＮＡラダー）；２．発酵槽サンプル１（６６ｎｇ／μl）；３．発酵槽サンプル２（６．６ｎｇ／μl）；４．陽性対照（ＤＳＭ１７９３８の細菌懸濁液）；５．陰性対照（Ｈ２Ｏ）；６．マーカー。 図３は、クエン酸塩を含む凍結乾燥培地が、クエン酸塩を含まない凍結乾燥培地と比較してＤＳＭ１７９３８を３％速いＯＤ増加に到達させることを明らかにする、濁度実験からの結果を示す。＊＝有意差（スチューデントｔ検定、α＝０．０５）。
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下に定義する。
「新生児の（Ｎｅｏｎａｔａｌ）」、または「新生児（ｎｅｏｎａｔｅ）」および「新生児（ｎｅｗｂｏｒｎ）」は、交換可能に使用され、生まれたばかりの子供および出生直後の期間を指す。この用語は、早産児または未熟児から正期産児、および出生直後の期間を含む。
「乳児」および「赤ちゃん」は、交換可能に使用され、生まれたばかりの赤ちゃんおよび生後その最初の１年（１年までまたは１２ヶ月まで）を指す。
「早産（ｐｒｅｔｅｒｍ）」および「早産（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ）」は、妊娠の３７週前（または非ヒト哺乳動物の同等の時点）に起こる出生を指す。
「感染」は、疾患を引き起こす微生物の侵入を指す。
「代謝細菌」は、生存可能であり、例えば、代謝産物の生成をもたらす適切な基質成分を利用して増殖および複製することを意味し、その細菌が特定の目的のために使用されることができることを意味する。
「死菌」は、複製せず、生存不能な非代謝細菌を意味する。
「休眠細菌」は、複製しないが、生存しており、代謝細菌に活性化（または再活性化）されることができる非代謝細菌を意味する。そのような休眠細菌の例は、凍結またはフリーズドライまたは凍結乾燥（またはそうでなければ、乾燥、例えば噴霧乾燥）された細菌である。次に、「休眠調製物」は、休眠細菌を含む調製物、例えば、凍結またはフリーズドライまたは凍結乾燥（またはそうでなければ、乾燥、例えば噴霧乾燥）された調製物を意味する。
「生細菌」は、代謝するために活性化されることができる代謝細菌または休眠細菌を意味する。
細菌の「活性化」は、細菌の状態を休眠から代謝細菌の状態に変化させるプロセスを意味する。
本明細書中の本発明は、特に、投与の局所における細菌のための栄養素の量が限られている場合、特定の生細菌の活性の増強された開始を提供するために使用されることができる。これは全て、宿主の他の栄養状態を大きく変えることなく行われる。
本発明において、例えば、選択されたラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）の局所的な量および／または代謝活性が増強されて、とりわけ、生細菌の用量を低下させる可能性に至り、およびさらに部位特異的な健康効果が可能になる。
ＮＥＣ（壊死性腸炎）は、未熟児に主に見られる病状である。それは、腸における感染および炎症による粘膜損傷から全層壊死および腸の一部が壊死する穿孔に至る腸管に対する様々な損傷によって特徴付けられる。それは出生後に発生し、未熟児の死亡原因の２番目に最も一般的な原因である。初期の症状は、摂食不耐性、増加した胃内残存物、腹部膨満および血便を含む。この予測不可能で壊滅的な病気について、決定的な治療法はない。よって、ＮＥＣ予防戦略は必須であり、緊急に必要とされるが、今日までに、ケアの基準として成功裏にまたは一般的に採用されておらず、ＮＥＣの予防は、真の満たされていない医療ニーズのままである。ＮＥＣにおける異常な胃腸の微生物叢の関与は、ＮＥＣ乳児の菌血症および内毒素血症の所見および細菌性発酵によって産生される粘膜下ガスをおそらく示す腸壁嚢状気腫（ｐｎｅｕｍａｔｏｓｉｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）の放射線所見を含む。
ＮＥＣを受け入れまたは発症する、またはＮＥＣを有するリスクのある早産乳児は、ＮＥＣに関連した大規模な感染症および炎症に対抗するように腸において、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９３８から恩恵を受けることが示されている。この手順は、ＮＩＣＵ（新生児集中治療室）で命を潜在的に救う。生成物は、赤ちゃんに対して、経鼻胃または口腔胃（ＮＧ／ＯＧ）チューブを介して胃の中に直接与えられる。
ＮＥＣを発症するリスクのある早産児の赤ちゃんの生後１日目で、赤ちゃんの生存を保つための栄養素の供給は、通常、非経口送達によって与えられ、通常、腸に最初に与えられる栄養素はない。この理由は、経腸栄養法を介して与えられる早期の栄養素がＮＥＣを誘発し得るからであり、したがって、栄養は非経口的に与えられる。次にこれは、特に、生命の危機的な最初の日において、特に未熟児において、必要な乳酸菌の活性化および増殖を支持するために腸内に栄養素がないことを意味する。腸は生きている環境であるため、利用可能ないくらかの限られた栄養素および糖が存在し得るが、そのような条件下で細菌の早期活性化と早期増殖を支持する程度ではない。
本明細書中における本発明は例えば、チューブ送り送達システムのルート上で、赤ちゃんに与えられる栄養素の影響を最小限にして、赤ちゃんの腸に送達される場合に、すでに生乳酸菌または任意の他の適切な生細菌の早い選択的な活性化を可能にすることによって問題に対する改善された解決を提供することである。
通常、人間のミルクは、新生児の健康な赤ちゃんの栄養の主な源である。授乳の最初の日の間、母親は、初乳といわれるものを生産し、これは、赤ちゃんに良いスタートを提供するタンパク質と抗体が豊富な薄い黄色がかった液体である。数日後、その液体は、徐々に変化し、タンパク質、脂質、炭水化物およびミネラルを含む成熟した乳になる。炭水化物は、主にラクトースからなる。授乳の最初の日に、クエン酸塩およびラクトースの濃度は、通常、以下の例のようになる：クエン酸塩０．２５ｍおよびラクトース７６ｍＭ、授乳の５日目、濃度は次の通りである：クエン酸塩５ｍＭおよびラクトース１７３ｍＭ。再計算すると、これは、１：３０〜１：３００のクエン酸塩とラクトースの間の比を与える。
様々な理由のために、新生児の赤ちゃんの授乳は、早産、複雑な分娩、機能的な問題（例えば、母親が乳を全くまたは十分に産生していない、乳管の閉塞、乳腺炎など）、母親の病気などに限定されないが、実現可能ではない可能性がある。そのような場合、赤ちゃんは、他の方法で栄養を必要とし、通常乳児用調製粉末が入手可能であり、授乳を補うために乳児に供給されることができる。危機的な事象においては、例えば、早産児乳児が子宮内で適切に発達する時間がなく、しばしば未発達の腸を示す早産児乳児の場合、進行中の感染症および炎症を遅らせる腸内環境を迅速に確立することが中心的である。早産児の赤ちゃんは、敏感であり、子宮外の生活に適合できるように特別なケアが必要である。
診断されたまたはＮＥＣ発症のリスクがある新生児について、本明細書中の本発明の生成物は、しばしば、経口胃または経鼻胃（ＯＧ／ＮＧ）チューブを介して胃中に直接与えられ、赤ちゃんの生存を保つ栄養を通常は、非経口送達を通じて与えられ、これは、通常は、腸に最初に与えられた栄養素はないことを意味する。
本明細書中の本発明において、例えば未熟児における生細菌の速い活性化のために、調製物に加える基質成分の新しい組み合わせが開発されている。驚くべきことに、本発明者らは、処方混合物へのクエン酸塩の塩、好ましくは、ラクトースなどの炭素源と組み合わせの添加は、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９３８の再構成および早期増殖を改善したことを見出した。
本発明により、クエン酸塩は、外部電子受容体として働き、特定の細菌による代謝においてＮＡＤ（Ｐ）Ｈブレーキを放出する。
これに関して、発酵は、糖からエネルギーを放出し、酸素または電子輸送鎖を必要としないプロセスである。代わりに、有機分子が電子受容体として使用され、解糖の間に生成されたＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再酸化を行う。ほとんどの場合、この有機分子は、ピルビン酸塩であり、エムデン・マイヤーホフ経路（ＥＭＰ）の最終生成物、最も一般的なタイプの解糖系である。
ホモ発酵性乳酸菌は、ＥＭＰを使用して、炭水化物を乳酸塩に変換するが、ヘテロ発酵性乳酸菌（ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）など）は、ホスホケトラーゼ経路（ＰＫＰ）を使用する。ＰＫＰは、ＥＭＰのものに比べてエネルギー収率が低いが、これは、外部電子受容体の添加によって補われることができ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ再酸化のための代替経路を作る。これは、１つの追加のＡＴＰを得られ、ＰＫＰはＥＭＰと同様に効率的になることをもたらす。本発明において、クエン酸は、外部電子受容体として使用され、よって、外部電子受容体としてのクエン酸塩を利用する能力を有する細菌が選択される。
ラクトースなどの炭素源は、ヒト母乳に適合され、電子受容体としてクエン酸塩を使用することができるラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９３８などの菌株の早い増殖に特に効果的である。
ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９３８およびクエン酸塩によって見られる効果は、菌株特異的であり、例えば、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＡＴＣＣ ＰＴＡ−４６５９、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６４７５およびラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＡＴＣＣ ＰＴＡ−５２８９などの他のラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）菌株は、クエン酸塩を電子受容体として使用することができず、よって、本発明での使用に適切ではない。クエン酸塩およびラクトースは、ヒト乳中に存在し、乳中のラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９３８の増殖の基礎の１つである。
本明細書中の本発明は、与えられる栄養素に最小限の影響でラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９３８などの迅速に活性化された生細菌を必要とする個体に与えられる生成物において、ラクトース、または別の適した炭素源（例えば、スクロース、フルクトース、グルコースまたはガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）などの他の糖）との適切な比でクエン酸塩の添加に関する。これは、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９３８の再構成および増殖が、生後１日目に、母乳で育てられた乳児の消化管に見られる条件によく似ているだろう。
本発明は、改善された再構成および早期増殖能力を有するラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９３８などの特定の生存および抗炎症性乳酸菌株、または電子受容体としてクエン酸塩を利用する類似の能力を有する菌株を提供することによって、例えば、ＮＥＣの状態に関連する健康関連の問題を解決することを目的とする。本発明の生成物は、口からの摂食の困難性を有し、ＮＥＣと具体的に診断されることなく、静脈栄養を受ける新生児にも使用されることができる。本発明は、特定の乳酸菌の迅速な活性化が健康の観点から有益である他の場合にさらに使用されることができる。
本発明は、例えば、未熟児における凍結乾燥生細菌の迅速な活性化を、最終生成物に加えるための基質成分の新しい組み合わせによって実現する。本発明は、具体的には、特定の細菌の活性の増強された開始を支持するのに役立つ比で選択され、混合される基質成分の使用をさらに具体化する。
したがって、本発明は、生細菌を活性化する、またはクエン酸塩の添加または取り込みによる生細菌の活性化を改善する、あるいは前記細菌をクエン酸塩（および任意に、他の基質成分）に曝露する方法を提供する。本明細書中に記載されるような細菌の活性化は、生細菌調製物の改善された再構成の形態をとることができ（例えば、乾燥した、あるいは休眠状態の、および／または休眠状態の細菌の濃縮された処方は、使用のために希釈および活性化される場合）、次にこれは、生再構成が起こると、細菌の改善されたおよび／またはより迅速な増殖、または他の細菌活性の増強された（増加した）またはより速い開始、例えば、代謝またはコロニー形成となることができる。
したがって、本発明の活性化方法、および処方中の（例えば、対象への投与のための最終処方中の）クエン酸塩の存在（クエン酸塩への曝露）は、クエン酸塩または処方中のクエン酸塩の適切な量（すなわち、活性化量）を有しない細菌処方と比較した場合、改善された活性化、例えば、生細菌の改善された若しくはより迅速な再構成および／または改善された若しくはより迅速な増殖または増殖速度を生じさせる。休眠状態から生細菌を活性化する処方中のクエン酸塩のそのような使用は（例えば、そのような細菌が凍結、凍結乾燥、フリーズドライまたは他の方法で乾燥される場合）、本発明者の知識によれば、以前に開示されておらず、特に本明細書中の他の箇所に記載されているような特定の医学的処置のために、そのような細菌を取り扱うための改善されたプロセスを生じる。
例えば、対象は、一般的には、休眠生細菌を効率的に活性化するために使用されることができる胃または腸に栄養素を有さないので、または対象（例えば、ＮＥＣを有するまたはＮＥＣを有するリスクのある乳児）は、医学的理由で栄養素の量が意図的に制限され得るので、例えば、細菌の投与後（または投与前または投与中）の休眠生細菌の迅速な活性化は、いくつかの対象で重要である。個体（例えば、栄養素が意図的に制限される対象において）に与えられる栄養素に最小限の影響を有する組成物を投与すること、または対象の他の栄養状態を有意に変えることなく、組成物を投与することも重要であり得る。本発明の処方、方法および使用において、細菌が開始される（例えば、活性および増殖するために少なくとも開始する）ための処方中に十分な栄養があるので、細菌は、対象、例えば、未熟児の赤ちゃんの腸に存在し得る任意の制限された栄養を掃除する必要がない。これは、例えば、ＮＥＣに罹患しているかまたはＮＥＣのリスクのある赤ちゃんに与えられる栄養の量および内容が、注意深く規制され、バランスがとられなければならないため重要であり得る。
したがって、そのような対象において、宿主の健康が悪化する前に治療効果ができるだけ早く達成されるように、細菌は、対象の腸内の既存の栄養素に頼らず、迅速に活性化される必要がある。対象内で起こる活性化を可能にする宿主の胃中の天然の栄養素がないから、投与後（または投与前または投与中）の迅速な活性化も重要である。
本発明の方法は、細菌のための適切な基質成分としてクエン酸塩を使用して生細菌を活性化する方法を提供することによって、また好ましくは、糖（例えば、ラクトース）などの細菌に対する適切な炭素源を提供することによって、この問題に対する解決法を提供する。
あるいは、本明細書中に記載されるような活性化の方法は、休眠状態から代謝状態（例えば、増殖および複製および好ましくは代謝産物を産生する状態）に細菌の状態を変化させる方法の提供として見ることができる。本明細書中に記載されるような活性化の方法は、細菌の再構成または増殖のための方法、例えば、休眠生細菌の再構成および／または増殖または増殖速度を改善する方法としても見ることもできる。
有利には、本発明による細菌のそのような改善された活性化はまた、細菌の必要な用量の減少をもたらすことができるか、または細菌の投与頻度の低下をもたらすことができるか、または投与されると細菌の改善された活性化（したがって、治療上の利益および健康効果）をもたらすことができる。
異なる菌株およびタイプの細菌は、異なる能力を有する。本発明における使用のための適切な生細菌または微生物は、クエン酸塩を外部電子受容体として利用する能力を有するものである。細菌の増殖および代謝の文脈において、用語「外部電子受容体」は、当該技術分野の用語である。「外部」とは、例えば、電子受容体（クエン酸塩）が細菌に対する外来の供給源に由来し、細菌自体に由来しないかまたは細菌自体によって産生されないことを意味する。
適切な細菌は、増殖のための栄養素または基質としてクエン酸塩を使用（または消費）する能力を有し得る（クエン酸塩の存在下で増殖する能力を有する）か、またはそれらの代謝で外部電子受容体としてクエン酸塩を使用する能力を有し得る（クエン酸塩を代謝する能力を有する）か、または発酵反応においてクエン酸塩を使用する（クエン酸塩発酵性である）能力を有し得る。
好ましい生細菌は、乳酸菌、例えば、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）またはビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）などの発酵性細菌である。特に好ましい生細菌は、ヘテロ発酵性乳酸菌であり、例えば、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、特にラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９３８菌株またはクエン酸塩を外部電子受容体として利用するための類似の能力を有するものなど、炭水化物を変換するホスホケトラーゼ経路（ＰＫＰ）を使用する。ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９３８菌株は、２００６年１月３０日にＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ (Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ, Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ)に寄託された。本発明のいくつかの態様において、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９３８菌株は使用されない。
本発明での使用のための好ましい生細菌はまた、それらが適切な量で投与される宿主または対象に健康効果を有することができるだろう。したがって、疾患または状態を治療するために有用であるか、または対象、特に乳児または新生児において何らかの健康効果を有する任意の生きた微生物が、本発明で使用されることができる。例えば、本明細書中の他の箇所に記載されるように、本発明の方法は、例えば、より速い再構成および増殖の形態で、細菌の改善された活性化をもたらし、有利には、本発明は、細菌の健康効果を改善させることを許すことができ、または本発明は、より低いまたはより少ない頻度の用量の選択された細菌を、同じ健康効果を達成するために使用せることができる。
したがって、例えば、抗炎症活性（並びにクエン酸塩を外部電子受容体として利用する能力）を有する細菌が、いくつかの実施例において、好ましい。ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９３８菌株は、そのような例であるだろう。
本明細書中の他の箇所で記載されるように、本発明は、対象における特定の疾患または状態の治療で特定の使用を見出す。
本明細書中に記載されるような本発明の処方、調製物、方法および使用における使用のための細菌の適切な用量は、処置される疾患または状態、投与の方法および関連する処方に応じて選択されることができる。
よって、好ましくは、前記用量は、哺乳動物のタイプおよび処置される状態に適切である治療効果のある用量であり、所望の治療効果または健康効果を生じさせるのに適切である。例えば、細菌の１０５〜１０１０、例えば１０６〜１０９、または１０６〜１０８、または１０８〜１０１０総ＣＦＵの１日用量が使用され得る。好ましい１日用量は、約１０９または１０１０総ＣＦＵ、例えば１０９〜１０１０総ＣＦＵである。これらの用量はまた、１ｍｌ当たりの例示的な用量に等しくすることができ、好ましくは１ｍｌ用量が投与される。
クエン酸塩を外部電子受容体として利用する細菌株の能力（例えば、糖の発酵中）は、当業者によってよく理解され、標準的な技術を使用して容易に決定することができる。例えば、１つの選択肢は、クエン酸塩を増殖培地に単に添加することによってそのような能力について試験することであり、細菌のより速く、より良好にまたは改善された増殖または増殖速度を生じる場合、細菌株は、クエン酸塩を電子受容体として利用することができることが結論づけられることができる。あるいは、クエン酸塩の利用は、クエン酸塩が、細菌によって消費されるかどうかを測定することによって、例えば、増殖培地中のクエン酸塩濃度が、細菌が増殖するときに枯渇するかどうかを測定することによって、評価されることができる。
別の選択肢は、クエン酸塩の代謝、例えば、クエン酸塩のコハク酸塩への変換（例えば、オキサロ酢酸塩、リンゴ酸塩またはフマル酸塩を介する）に含まれる酵素の１つ以上（例えば２つ以上、３つ以上、４つ以上等、または全て）をコードする遺伝子の存在について細菌の菌株をスクリーニングすることだろう。したがって、菌株は、次の酵素の１つ以上（または好ましくは全て）の存在についてスクリーニングされることができる：ＥＣ：１．１.１．３７：リンゴ酸脱水素酵素；ＥＣ：１．２.４．１；ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（アセチル転移）；ＥＣ：１．３.９９．１：コハク酸デヒドロゲナーゼ；ＥＣ：１．８.１．４：ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｌｉｐｏｙｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）；ＥＣ：２．３.１．１２：ジヒドロリポイルリジン−残基アセチルトランスフェラーゼ；ＥＣ：４．１.３．６：クエン酸（プロ−３Ｓ）−リアーゼ（３つの異なる遺伝子によって表される３つのサブユニット）；ＥＣ：４．２.１．２：フマル酸塩水和物。クエン酸リアーゼ酵素の存在は、特に重要である。細菌株はまた、クエン酸パーミアーゼ酵素の存在についてスクリーニングされ得る。
クエン酸塩を外部電子受容体として利用する能力を有する細菌の使用は、本発明の処方および調製物が、クエン酸塩の源、例えば、クエン酸塩イオン、例えばクエン酸ナトリウムなどのクエン酸塩（例えば、クエン酸三ナトリウム二水和物）、またはクエン酸塩またはクエン酸の他の金属塩を含む。好ましい塩は、ｐＨ、例えば、中性のｐＨ付近、例えばｐＨ６．０〜７．５で緩衝溶液中に存在することができるものに最小限の影響を有するものである。
本発明者らは、驚くべきことに、細菌処方中のクエン酸塩の存在、すなわち、細菌のクエン酸塩を含む調製物または処方への曝露は、クエン酸塩を含まない処方および調製物と比較して、特に、細菌の改善された再構成の観点から、例えば、フリーズドライされた、または凍結乾燥された、あるいは休眠調製物からの、細菌の改善された（例えば、より迅速な）活性化、または細菌の改善された増殖を生じることを示している。
したがって、クエン酸塩は、クエン酸塩が含まれない場合と比較してより速い活性化のために、患者への投与の時間で（例えば賦形剤として作用するための）最終処方中にあるはずである。これは、本発明を実施するための１つの便利な方法が、クエン酸塩を湿った細菌調製物またはフリーズドライするまたは凍結するまたは細菌を休眠状態にする直前のスラリーに添加することである（そのため休眠細菌が活性化される場合に利用可能である）。本発明を実施するための別の便利な方法は、すでに乾燥（例えばフリーズドライされたまたは凍結乾燥された）細菌の処方に乾燥成分としてクエン酸塩を添加することであり、そのためクエン酸塩は、最終処方中に存在し、休眠細菌が活性化される場合に、利用可能である。あるいは、クエン酸塩は、患者への投与のための最終処方を構成するために使用される培地または他の溶液中に添加されるか、または存在することができる（例えば、凍結された、フリーズドライされたまたは凍結乾燥されたまたは別に休眠の細菌を溶解または再構成または活性化するために使用される）。
活性化を達成するためのクエン酸塩の適切な濃度、例えば、本発明による細菌の改善された活性化は、当業者によって、任意の適切な方法によって、例えば、細菌を異なる濃度でクエン酸塩イオンに曝露し、再構成および／または増殖についての効果を観察することによって確立されることができる。例えば、改善された増殖（または増殖速度）を刺激するように作用する濃度、好ましくは、細菌の有意に改善された増殖（または増殖速度）が適切である。例示的な濃度は、０．０１または０．０５ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、例えば、０．０５または０．０１ｍｇ／ｍｌ〜１．０、２．０、３．０、５．０、１０．０、２０．０、３０．０または５０．０ｍｇ／ｍｌである。代替濃度は、１．０、２．０、３．０、５．０、１０．０、２０．０、３０．０または５０．０ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌであり得る。好ましい濃度は、０．０５または０．１ｍｇ／ｍｌ〜５．０または３．０または２．０または１．０または０．５ｍｇ／ｍｌ、例えば０．２〜０．７ｍｇ／ｍｌ、例えば０．３〜０．６ｍｇ／ｍｌであり得る。これらの値は、対象に与えられる同等のｍｇ／用量に対しても適切であることができる。
例えば、本発明者らは、クエン酸塩が、処方中、例えば凍結乾燥された又はフリーズドライされた細菌処方中に存在する場合、クエン酸塩の存在下で、細菌は、より速いまたは改善された増殖（例えば増殖速度）を示し、例えば、クエン酸塩の非存在下と比較した場合、一定の光学密度（ＯＤ）を達成するのに要する時間が短縮されることを示している。したがって、クエン酸塩（クエン酸塩イオン）の好ましい濃度は、そのような観察を生じることができるもの、例えば、クエン酸塩の非存在下に対する存在下のより速い若しくは改善された増殖またはより速い若しくは改善された増殖速度である。特に、クエン酸塩の好ましい濃度は、クエン酸塩が存在しない場合よりも短い時間、好ましくは、有意により短い時間、特定のＯＤまたはＯＤにおけるパーセンテージの上昇を達成する細菌株を生じさせるかまたは結果として生じることができるものである。適切な方法論を実施例および図３に示す。例えば、便利には、細菌がＯＤで１％、２％、３％、４％若しくは５％、または１％、２％、３％、４％若しくは５％超え増加（例えば、ＯＤで３％以上）を達成するのに要する時間を測定することができ、これは、クエン酸塩非存在に対してクエン酸塩存在で（すなわち、非存在下と比較してクエン酸塩の存在下で）、より迅速に、好ましくは著しくより迅速に起こるクエン酸塩の濃度を観察する。クエン酸塩のそのような濃度は、使用に適切だろう。細菌増殖または増殖速度または細菌数の任意の適切な手段を使用することができる。例えば、ＯＤを測定するための任意の適切な技術、例えば、実施例に示される適切な濁度実験を使用することができる。
クエン酸塩の存在下でより迅速に増殖するまたは改善された増殖速度を示す細菌の能力はまた、本発明による細菌の活性化の一例である。
本明細書中の本発明の生細菌は、凍結乾燥され、新鮮な、凍結され、フリーズドライされ、噴霧乾燥される等であることができ、油、または水溶液、または懸濁液、またはエマルジョンなどを含む任意の処方された生成物であってもよく、または経腸的方法で、例えば、経管栄養送達システムで、経口経路を介してまたは直腸経路を介して新生児に投与される他の処方であってもよい。
本発明によれば、クエン酸塩は、患者に投与される最終処方中に存在する必要がある。
本発明の好ましい態様において、活性化されるべき細菌は、乾燥されるか、あるいは休眠状態、好ましくは、凍結、凍結乾燥またはフリーズドライされる。したがって、特定の好ましい態様において、本発明の方法は、細菌が、凍結乾燥されるか、またはフリーズドライされるか、あるいは活性化が起こる前に休眠状態にされる（例えば、凍結による）ステップをさらに含む。好ましくは、クエン酸塩（および任意に炭素源または糖、例えばラクトース）が休眠細菌のそのような処方または調製物中に存在する（換言すれば、細菌は、前記クエン酸塩および任意に前記炭素源に曝露される）。
特に好ましい態様において、クエン酸塩（および任意に炭素源または糖、例えばラクトース）は、休眠細菌のフリーズドライされた、またはあるいは乾燥または固体処方中に存在する（例えば、クエン酸塩は、凍結乾燥培地に存在する）。好ましくは、クエン酸塩は、凍結乾燥直前に添加されるか、あるいは細菌を休眠状態にする前に添加される、例えば、クエン酸塩は、凍結乾燥または凍結が起こる前のステップで生細菌の集団を培養および拡大（増殖）するために使用される増殖培地中で使用されるのとは対照的に、例えば、凍結乾燥培地または凍結培地の成分に添加するか、または凍結乾燥培地または凍結培地の成分を形成する（換言すれば、クエン酸塩は、好ましくは、菌の増殖中に使用されない）。
乾燥成分（乾燥処方）のそのような調製物は、任意の適切な方法で調製されることができる。例えば、最終生成物中の個々の成分は、液体処方中で一緒に組み合わせられることができ、次に、乾燥または凍結乾燥された細菌を含む、凍結乾燥されたまたは乾燥された、または個々の乾燥（または凍結乾燥された）成分は、一緒に混合またはブレンドされて乾燥処方を形成する。次に、乾燥処方のこれらのタイプの両方は、患者に投与するために、再構成されて適切なクエン酸塩および最終溶液または処方を含む生細菌を形成するこができる。
本明細書中の他の箇所に記載されるように、クエン酸塩は、クエン酸塩が含まれない場合と比較してより速い活性化のために患者への投与の時（例えば、賦形剤として働くために）最終処方中にあるべきである。これは、本発明を実施し、細菌をクエン酸塩に曝露する１つの便利な方法は、フリーズドライまたは凍結直前にクエン酸塩を湿った細菌調製物またはスラリーに添加することである（そのため、それは、休眠細菌が活性化される場合に、利用可能である）ことを意味する。本発明を実施する別の便利な方法は、クエン酸塩が、再び最終処方中に存在し、休眠細菌が活性化された場合に利用可能であるように、クエン酸塩を乾燥成分としてすでに乾燥（例えばフリーズドライされたまたは凍結乾燥された）細菌の処方に添加することである。あるいは、クエン酸塩は、患者への投与のための最終処方を構成するために使用される（例えば、凍結された、乾燥されたまたは凍結乾燥された、あるいは休眠細菌生成物を溶解または再構成または希釈するために使用される）培地（例えば、増殖培地）または他の溶液に添加されることができるか、または存在することができる。
したがって、本発明の好ましい態様において、前記クエン酸塩は、凍結された、凍結乾燥された、フリーズドライされたまたは休眠細菌調製物並びに対象への投与のための最終処方中に存在する。
生細菌が凍結乾燥されるか、または凍結される場合、クエン酸塩の存在は、それらが乾燥形態または休眠形態から再構成される場合、細菌の改善された活性化を可能にすることが本発明の特別な利点である。そのような改善された活性化は、より迅速な再構成または増殖の形態をとることができる。換言すれば、クエン酸塩の存在は、それらの凍結乾燥された（乾燥）または休眠状態からの細菌の目覚めを促進するのを助けるか、または改善する。
したがって、本発明の背景にある概念は、クエン酸塩が、細菌が休眠（例えば、凍結または凍結乾燥される）状態から活性状態に移行する時点またはその付近に存在することであり、これは、クエン酸塩が、患者に投与される最終処方中にあることを意味する（例えば、投与のために休眠細菌を再構成または再懸濁するために使用される培地または緩衝液の一部として、または凍結乾燥または凍結または休眠調製物自体に、例えば、クエン酸塩が細菌の凍結乾燥または凍結が起こる直前に添加される）。
本明細書中の他の箇所に記載されるように、これは、細菌の活性化および増殖のための栄養素を別に提供するために、胃または腸で最小の栄養素を有する対象において特に有利である。本発明のいくつかの態様において、処方が、患者の腸に到達する前に、例えば、患者へのその再構成および投与の間、細菌のある程度の増殖がすでに起こり得る。
クエン酸塩は、本発明の生成物処方、組成物および調製物中（例えば、患者の胃腸管に投与されるべき処方中）に必須の成分（例えば賦形剤）であるが、他の成分または賦形剤も好ましくは提供される。
例えば、生細菌が増殖基質として使用することができる１つ以上の適切な炭素源の存在が、好ましい成分である。適切な炭素源は、処方中の生細菌の性質に応じて容易に決定されることができる。しかしながら、好ましい炭素源は、糖などの炭水化物である。ラクトースは、使用するのに好ましい糖である。しかしながら、任意の他の適切な糖が使用されることができ（例えば、それが細菌の増殖を支持するという条件で）、例えば、スクロース、フルクトース、グルコースまたはガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）である。
したがって、本発明の好ましい態様において、炭素源または糖、例えばラクトース（例えば、ラクトース一水和物）または代替の糖は、クエン酸塩とともに生細菌と接触させられる。換言すると、細菌、クエン酸塩および炭素源は、同じ組成物または処方または調製物の一部である。
したがって、本発明の好ましい調製物は本明細書中の他の箇所に定義される生細菌、クエン酸塩およびラクトース（または上記の他の適切な糖、特にＧＯＳ）を含む。
他の成分または賦形剤もまた存在することができ、例えば、組成物または調製物の安定化または他の特性に有用な成分、例えば任意の適切な凍結保護剤または安定剤である。例としては、ゼラチン、グルタミン酸ナトリウム、マルトデキストリン、およびアスコルビン酸からなる群から選択される１つ以上の成分を含む。マンニトールは、さらなる任意の成分である。
本発明の調製物において、使用される成分は、哺乳動物、好ましくはヒトへの医薬品投与に適した純粋なまたは実質的に純粋な形態であることが好ましい。したがって、個々の成分は、好ましくは、例えば、未知の量または複雑な量の成分の混合物の一部として存在するか、または添加されるよりも既知または正確な量で存在することができる医薬グレードのものである。したがって、本発明の処方は、他の多くの物の中でクエン酸塩およびラクトースを含み得る母乳（または他のミルクベースの生成物）における混合または再構成後に投与され得るが、患者への投与のための生成物処方は、クエン酸塩イオンの純粋な調製物、例えば、クエン酸塩の形態で、例えば、本明細書中の他の箇所に記載されるクエン酸ナトリウム、およびラクトース（例えば、ラクトース一水和物）または他の糖を適切に含むことが好ましい。したがって、本発明の好ましい態様において、処方は水中で再構成（または希釈）されるか、または水性処方であり、例えば、母乳または調合乳などのミルクベースの生成物の中のまたは存在下で再構成を含まない。したがって、本発明の好ましい処方は、乳タンパク質を欠く。別の見方では、本発明の好ましい処方は、母乳または調合乳などのミルクベースの生成物によって提供されないクエン酸塩を含むか、またはそれに曝露される。
処方はまた、一般的には、緩衝液または緩衝溶液を含んでおり、適切なｐＨを維持可能にする。
本発明の好ましい処方（特に、ラクトースおよびクエン酸塩の濃度に関して）は、表ＢまたはＣに記載されるとおりである。他の好ましい処方は、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９３８とは別のクエン酸塩利用細菌を含むだろう。別の好ましい処方（特にラクトースおよびクエン酸塩濃度に関して）は、表２で記載されるような処方を含むクエン酸塩である。そのような処方と共に使用される好ましい細菌は、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９３８であるが、別の態様において、本明細書中に定義されるような他のクエン酸塩利用細菌が使用されることができる。表２の処方は、細菌が凍結乾燥形態から再構成される場合、細菌の改善された活性化（例えば、改善された増殖）をもたらすので、クエン酸塩利用細菌の凍結乾燥培地（または凍結保護剤）として特に有用である。
上記のように、本発明の好ましい態様において、クエン酸塩およびラクトースは、細菌調製物中に両方存在する。これらの成分は、任意の適切な濃度または比で存在することができる。クエン酸塩は、本明細書中の他の箇所で記載されるように生細菌の活性化（または改善された活性化）が起こる濃度で存在する。ラクトース（または他の糖）は、一般的には、生細菌の増殖が支持されることができる量で存在する。本発明の好ましい態様において、調製物は、１：１０または１：５０〜１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００または１：６００、好ましくは、１：４０または１：５０または１：６０〜１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００または１：６００；または１：３０〜１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００または１：６００、好ましくは１：６０〜１：６００または１：３０〜１：３００または１：５０〜１：７０または１：５０〜１：６０のラクトースに対するクエン酸塩の比を含む。
したがって、本発明の別の目的は、１：１０〜１：６００、少なくとも１：６０〜１：６００の間の比で、好ましくは１：３０〜１：３００、または少なくとも１：３０〜１：３００の間の比（または本明細書中に概説されるような任意の他の比）でクエン酸塩およびラクトース（または他の糖）を含む調製物の最適な組み合わせを提供することである。クエン酸塩の量の一例は、１×１０１０ＣＦＵ生細菌の用量当たり０．３ｇであり、ラクトースの量は、同じ用量当たり１６．６ｍｇである。クエン酸塩の量の別の例は、約１×１０９ＣＦＵ生細菌の用量当たり０．６ｍｇであり、ラクトースの量は、同じ用量当たり３５．７ｍｇである。クエン酸塩の量の一例は、約１×１０９ＣＦＵ生細菌の用量当たり１ｍｇである。クエン酸塩は、１用量当たり０．０１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲で（または本明細書中に記載されるような他の濃度で）あることができ、ラクトース、または他の糖の量は、上記の比に従って計算されることができる。
本発明の別の目的は、適切な基質成分および賦形剤、例えば、ラクトース、スクロース、フルクトース、グルコース、ＧＯＳ、１，２プロパンジオール、ゼラチン、グルタミン酸ナトリウム、マルトデキストリン、マンニトール、アスコルビン酸、クエン酸塩、クエン酸三ナトリウム二水和物および乳酸菌または他の適切な細菌、凍結乾燥された、新鮮な、凍結された、フリーズドライされた、噴霧乾燥されたなどの状態から前記細菌の再構成および早期増殖をさらに改善するように特異的に設計されている基質成分を含む調製物を提供することであり、ここで、前記生細菌は、電子受容体としてクエン酸塩を利用することができる乳酸菌を含む。
本発明の別の目的は、例えば、ラクトース、スクロース、フルクトース、グルコース、ＧＯＳ、１，２プロパンジオール、ゼラチン、グルタミン酸ナトリウム、マルトデキストリン、マンニトール、アスコルビン酸、クエン酸塩、クエン酸三ナトリウム二水和物および生細菌を含む調製物を提供することであり、ここで前記生細菌は、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９３８である。
本発明の別の目的は、例えば、ラクトース一水和物、加水分解ゼラチン、グルタミン酸一ナトリウム、マルトデキストリン、アスコルビン酸、クエン酸三ナトリウム二水和物および生細菌を含む調製物を提供することであり、ここで前記生細菌は、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９３８である。好ましい濃度は、例２および３に概説される。クエン酸塩の特に好ましい濃度は、０．３ｍｇ／用量または０．６ｍｇ／用量のいずれかであるか、または例えば、０．３〜０．６ｍｇ／用量の範囲である。細菌の好ましい濃度は、１用量当たり１×１０９ＣＦＵまたは１×１０１０ＣＦＵであるか、または例えば、１用量当たり１×１０９ＣＦＵ〜１×１０１０ＣＦＵの範囲である。１×１０１０ＣＦＵは、任意に０．３ｍｇ／用量のクエン酸塩濃度との組み合わせにおいて、特に好ましい。
本発明の別の目的は、１：１０〜１：６００、少なくとも１：６０〜１：６００の間の比で、クエン酸塩およびラクトース、または他の糖を含む調製物の最適な組み合わせを提供することである。
本明細書中の他の箇所に記載されるように、本発明の方法または本発明のクエン酸塩含有処方または調製物によって調製され、得られ、または得られうるクエン酸塩活性化細菌は、治療、特に、より速い活性化生細菌または改善された増殖速度を有する細菌の投与から恩恵を受けるであろう状態を有する対象の治療での使用のために有用である。したがって、そのような使用、およびそのような使用を含むそれを必要とする患者の治療方法は、本発明のまたさらなる態様を形成する。
そのような治療方法および使用で使用されるクエン酸塩の好ましい濃度および細菌調製物の他の好ましい特徴は、本明細書中の他の箇所に記載される。特に、クエン酸塩が前記対象への投与のための最終処方中に存在することが重要である。しかしながら、また、本発明のいくつかの態様において、前記クエン酸塩が凍結された、凍結乾燥された、フリーズドライされた（または休眠状態）細菌調製物中に存在することが好ましい場合において、細菌または細菌調製物は、凍結され、凍結乾燥されまたはフリーズドライされる（または細菌が休眠状態である）。前記調製物が、前記対象への投与前に水中で再構成されることも好ましい態様である。
本発明の治療方法および使用のための好ましい対象は、腸内に栄養素を欠いているか、または栄養素が限られている対象であるか、または腸内の栄養素の量が、例えば、医学的理由のために、故意に制限されている対象である。あるいは、前記対象は、非経口または静脈内栄養を必要とする（換言すれば、他の経路、例えば、非経口経路による追加的または補足的な栄養を必要とするか、または腸に直接的に栄養素を受けない）対象である。この状況は、例えば、ＮＥＣに罹患しているかまたはそのリスクがある未熟児の赤ちゃんまたは赤ちゃんでよく見られる。そのような対象は、一般的には、前記対象に細菌の投与される調製物の活性化および増殖を支持するのに十分な栄養素を腸内に有せず、特に、一般的には、細菌によって与えられる健康効果が観察される程度に、細菌の投与される調製物の活性化および増殖を支持することができないだろう。
したがって、他の好ましい対象は、新生児、または１歳までの幼児、または未熟児で生まれた対象（すなわち、早産または早産誕生である）であろうと考えられる。
他の好ましい対象は、ＮＥＣを有する対象またはＮＥＣ発症のリスクがある対象であり、未熟児に一般的であり得る状態である。
他の好ましい対象は、授乳不可能または経口摂食不可能な対象または本明細書中の他の箇所で記載されるような授乳が不可能である対象である。そのような状況は、赤ちゃんまたは母親のいずれかの健康上の問題により、例えば、早産、複雑な分娩、機能的問題（例えば、母親が母乳を産生していないかまたは不十分である、乳管が閉塞している、乳腺炎）、母親の病気により起こり得るが、これらに限定されず、最終的な結果は、治療される対象が、健康、または最終的に生命を維持するために、授乳または他の経口摂食によっても十分な栄養素を摂取できないことである。
本明細書中で使用される場合、用語「患者」または「対象」は、任意の哺乳動物、例えば、ヒトおよび任意の家畜（ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ）、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌ）または実験動物を含む。特定の例には、マウス、ラット、ブタ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウシおよびサルを含む。しかしながら、好ましくは、患者または対象は、ヒト対象である。
治療の前記方法および本発明の治療的使用における生細菌株の投与は、治療を必要とする対象（哺乳動物、好ましくはヒト）に薬学的にまたは生理学的に有効な量で実施される。したがって、前記方法および使用は、治療を必要とする対象を同定するさらなるステップを含み得る。
本明細書中の他の箇所の開示から明らかなように、本発明の方法および使用は、疾患または状態の予防並びに疾患または状態の治療、特に、例えば、ＮＥＣの予防に適している。したがって、予防的治療も本発明に包含される。本発明の方法および使用でのこの理由のために、治療はまた、適切な場合、予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）または予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）も含む。
そのような予防的（または保護的）側面は、本明細書中に記載される疾患または状態、例えば、ＮＥＣを発症する危険性のある対象で好都合に実施されることができ、完全な予防および重大な予防の両方を含むことができる。有意な予防は、治療がされない場合に予想される重篤度または症状と比較して、疾患の重症度または疾患の症状が軽減される（例えば、測定可能または有意に低減される）シナリオを含むことができる。
したがって、そのような状態、疾患または症状（例えば、臨床症状または重篤度）のそのような軽減または緩和は、任意の適切なアッセイによって測定されることができ、その例は、当業者に周知である。好ましくは、状態、疾患または症状の軽減または緩和は、重要であり、例えば、臨床的に有意または統計的に有意であり、好ましくは、≦０．０５の確率値である。状態、疾患または症状のそのような軽減または緩和は、一般的には、適切な対照個体または集団、例えば、健康な哺乳動物または対象（またはその集団）または未治療またはプラセボ処理された哺乳動物または対象（またはその集団）、または適切な場合、治療前の同じ個々の対象と比較して決定される。
本発明の好ましい態様は、腸内の限られたまたは制限された栄養素を有する患者の治療および／または食欲がわかないまたは摂食困難な患者の治療に関するので、投与の好ましい形態または様式は、例えば、口（経口胃）または鼻（経鼻胃）管、または経腸送達の任意の他の形態によって、対象の胃に対して直接的である。対象が可能な場合、経口送達もまた適している。直腸送達も使用され得る。
本発明のまたは本発明での使用のためのクエン酸塩含有組成物は、対象、例えば、ヒトへの投与のために任意の適切な溶液で処方または再構成され得る。例えば、調製物は、水（例えば、蒸留水）または他の水溶液、腸の状態を模倣または複製するいくつかの種類の処方、例えば、人工腸基板（ＳＩＳ）培地、または同様のもの、例えば、実施例で記載されるように、上記のように母乳、調合乳、または腸内投与に適した任意の他の溶液（例えば、経腸栄養生成物としての投与）で再構成または処方され得る。
好ましくは、そして有利には、水は、本発明の処方、特に本明細書中で記載されるようなクエン酸塩および糖（例えば、ラクトース）含有処方を再構成するために使用されることができる。これに関して、休眠細菌の乾燥（例えばフリーズドライされたまたは凍結乾燥された）処方または休眠細菌の他の処方いのけるクエン酸塩（および任意にラクトースなどの適切な糖）の存在は、再構成される場合に生細菌の改善された活性化をもたらすことができるという本発明者らの発見は、ミルクベースの処方（母乳または調合乳）または腸内投与のための他の処方などのより複雑で、より安定ではなく、より容易に入手できない再構成培地を必要としないことを意味する。言い換えれば、本発明の好ましい処方を再構成するために水を使用する能力は、ラクトース（または他の適切な糖）と共にクエン酸塩が生細菌をより早く活性化することができるという知識を使用して、有利には、任意の他の試薬源に頼る必要なく、水を使用して「標準化された」活性化の手段を提供する。
好ましくは、本明細書中に記載の改善、増強または増加のいずれか（例えば、増殖、増殖速度、再構成または活性化に対する正の効果、および本明細書中の他の箇所に記載のような実際、何らかの他のそのような上昇効果）は、（適切には）測定可能な増加等であり、より好ましくは、それらは有意に増加、好ましくは臨床的に有意または統計的に有意な増加であり、例えば、適切な対照レベルまたは値またはサンプルと比較した場合に、≦０．０５の確率値を有する。例えば、クエン酸塩の効果の評価のために、クエン酸塩が存在しない場合、適切な比較は、サンプル、調製物、対象等に対してである。
好ましくは、本明細書中に記載される減少または低下のいずれか（例えば、適切なＯＤまたは用量または疾患または症状の低下に達する減少した時間、および実際に本明細書中の他の箇所で記載されるような任意の他の低下した効果）は、測定可能な減少であり、より好ましくは、それらは有意な減少、好ましくは、臨床的に有意または統計的に有意な減少であり、例えば、適切な対照レベルまたは値またはサンプルと比較した場合に、≦０．０５の確率値を有する。例えば、クエン酸塩の効果の評価のために、クエン酸塩が存在しない場合、適切な比較は、サンプル、調製物、対象等に対してである。
本発明を、以下の非限定的な実施例を参照してさらに説明する。
例１
「人工腸基板」におけるラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）の増殖
材料および方法
糖および電子受容体の異なる組み合わせについてラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９８３の増殖を「人工腸基板」（ＳＩＳ）で評価した。
菌株ＤＳＭ１７３８のラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）細胞を、最初にＭＲＳブロス（オキソイド）中で、３７℃で一晩、増殖させた。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄した後、細菌をＰＢＳ中で１０倍に希釈した。その後、細菌懸濁液の１０ ｌ（リットル）を１０ｍｌのＳＩＳ（糖および電子受容体の添加と一緒に）に接種し、細菌を嫌気的条件下および振盪なしに、３７℃で１６時間培養した。
ラクトースおよびクエン酸塩を添加したＳＩＳにおけるラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９８３の培養
糖−電子受容体対としてのラクトースおよびクエン酸塩を有するＳＩＳにおいてラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９３８の増殖は、ＧＯＳおよび電子受容体としてのクエン酸について上記のような同じ方法で評価される。上記基質（ＳＩＳ）が使用される。ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９３８は、ＧＯＳ−クエン酸塩の組み合わせと同様に、ラクトース−クエン酸塩で効率的に増殖している（データを示さす）。
例２
本明細書中で本発明を使用して、ＮＥＣを発症するリスクのある未熟児をチューブ給餌で使用するのに適した生成物の処方
経口懸濁用ＩＢＰ−９４１４粉末は、以下の表のように、１用量当たり約１×１０９ＣＦＵのラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９３８およびクエン酸塩および他の賦形剤を含む透明な硝子バイアル中で提供される白色からオフホワイトの凍結乾燥粉末である。それは、業界で公知のように、新鮮な、凍結され、フリーズドライされ、噴霧乾燥されるなどにより製造される。
例３
本明細書中の本発明を使用して、ＮＥＣを発症するリスクのある未熟児をチューブ給餌する際に使用されるのに適切な生成物の処方
経口懸濁用ＩＢＰ−９４１４粉末は、以下の表のように、１用量当たり約１×１０９ＣＦＵのラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９３８およびクエン酸塩および他の賦形剤を含む透明な硝子バイアル中で提供される白色からオフホワイトの凍結乾燥粉末である。それは、業界で公知のように、新鮮な、凍結され、フリーズドライされ、噴霧乾燥されるなどにより製造される。
例４
凍結保護剤へのクエン酸塩の添加は、凍結保護剤へのクエン酸塩の添加は、凍結乾燥されたラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９３８の活性化時間を短縮する。
方法
培養：
９ｍｌの増殖培地を有するファルコンチューブ（表１参照）に凍結ストックからのラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９３８を接種した。前培養物を、３７℃で１６時間インキュベートした。この後に、第１の前培養物の５ｍｌを４５ｍｌの新鮮な培地に添加する第２の前培養ステップを行った。第２の前培養物は、≧１３の光学密度（６００ｎｍ）に到達するようにした（約２４時間）。
１．５Ｌの容量を有する発酵槽を調製し、１２１℃で２０分間オートクレーブによって滅菌した。グルコースを除く全ての成分を８７５ｍｌのｄＨ２Ｏに添加し、発酵槽でオートクレーブした。グルコース溶液を残りの１２５ｌで作製し、別々にオートクレーブし、その後発酵槽に加えた。発酵槽を１００ｒｐｍで撹拌しながら３７℃の温度およびｐＨ５．５に設定した（ＮａＯＨの添加によって制御した）。発酵槽を一晩稼動して、起こりうる汚染を決定した。これに続いて、５０ｍｌの第２の前培養物を注入し、発酵槽を１５時間稼動して、１４．３の最終光学密度に到達した。
培養物を発酵槽から滅菌されたフラスコにポンプ輸送し（約２．５時間かけて）、２つの部分に分け、これらを１０分間３２００ｒｐｍで遠心分離した。２つのペレット（１３．４および１５．２ｇ）をグルタミン酸ナトリウム緩衝液で洗浄し（１．８ＬのｄＨ２Ｏ中４５．２ｇのグルタミン酸ナトリウム、０．２μｍの滅菌フィルターを通してろ過した）、その後グルタミン酸ナトリウム緩衝液の等量（１３．４および１５．２ｍｌ）中に懸濁液させた。細菌懸濁液を、クエン酸塩の添加あり（Ｃ）またはなし（Ｎ）の凍結乾燥緩衝液の等容量とさらに混合した（表２参照）。

凍結乾燥：
凍結乾燥前に、細菌懸濁液を１ｍｌの体積でゴム栓付きの５ｍｌのフリーズドライバイアル中に等分した。以下の凍結乾燥プログラムを実行した：
第二の乾燥ステップの完了後、バイアルを窒素ガスの存在下で減圧（真空）せずに密封した。
定量化：
細菌の定量のためのサンプルを２つの部分に分配する前の培養物から取り出した。生存率を決定するために、これらの結果を後で、凍結乾燥サンプルの分析と比較した。
発酵槽培養物のＤＮＡ調製：
ＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（カタログ番号６９５０４）（プロトコル：グラム陽性菌の前処理によるわずかに変更）
発酵槽培養物（１ｍｌ）からの細胞を５０００×ｇ（７５００ｒｐｍ）で１０分間遠心分離によって採取した。上清を捨て、細菌ペレットを１８０μｌの酵素溶解緩衝液中に再懸濁し、３７℃で６０分間インキュベートした。このあとに、３×４５秒間、速度５．０で、２ｍｌのマイクロチューブＰＰ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ：注文番号７２.６９４．００６）中の０．１ｍｍジルコニア／シリカビーズ（ＢｉｏＳｐｅｃ：カタログ番号１１０７９１０１ｚ）の０．２５ｍｌを使用するビーズビーティングステップを行った（ＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）−２４ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ, ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）。ビーズビーティングサンプルを、５６℃で３０分間インキュベートした。ステップの残りをプロトコルに従って実施した。
ＰＣＲ：
プライマー：ＤＳＭ１７ｆ２ (ＴＡＣＧＧＧＧＡＡＣＧＡＧＴＴＡＴＴＧＣ)およびＤＳＭ１７ｒ２ (ＧＧＡＣＧＧＣＴＴＡＡＣＡＡＡＡＣＡＧＣ)；生成物サイズ２１６ｂｐ
ＤｒｅａｍＴａｑ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（２Ｘ Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、品番Ｋ１０８１)をＰＣＲ反応に使用した。これに従ったＰＣＲ反応：
プライマーを有するＭａｓｔｅｒｍｉｘ 反応ごとの体積
水(ＰＣＲ品質) ３．０μｌ
プライマー, ｆｏｒｗ. (10 pmol/μl) １．０μｌ
プライマー, ｒｅｖ. (10 pmol/μl) １．０μｌ
BSA (最終濃度 0.1 μg/μl) ２．５μｌ
ＤｒｅａｍＴａｑ １２．５μｌ
２０μｌのＭａｓｔｅｒｍｉｘを５μｌのＤＮＡサンプルと混合し、以下のプログラムを実施した：９８℃ ５分// ２ｘ(９５℃ ３０秒, ６８℃ ３０秒, ７２℃ ２０秒) //２ｘ(９５℃ ３０秒, ６６℃ ３０秒, ７２℃ ２０秒) //２ｘ(９５℃ ３０秒, ６４℃ ３０秒, ７２℃ ２０秒) // ２ｘ(９５℃ ３０秒, ６２℃ ３０秒, ７２℃ ２０秒) //３５ｘ(９５℃ ３０秒, ６２℃ ３０秒, ７２℃ ２０秒) //７２℃ ５分//１６℃。
活性化時間の評価：
凍結乾燥ＤＳＭ１７９３８の２つの変異体（ＣおよびＮ）の人工腸培地（ＳＴＭｍｏｄ ３、表４参照）における活性化時間を、経時的な濁りの変化を測定するコンピュータ制御インキュベータ／リーダー／シェーカー（ＢｉｏＳｃｒｅｅｎ Ｃ ＭＢＲ）を使用して分析した。培地ＳＴＭｍｏｄ ３を使用して、腸内の状態を模倣した。
各ウェルに、２００μｌのＳＴＭｍｏｄ ３を添加した。その後、異なる体積（１００、６０、４０、３０、２５μｌ）の細菌懸濁液（１ｍｌのｄＨ２Ｏ中に懸濁された凍結乾燥細菌を含むバイアル）を添加した。体積をｄＨ２Ｏで３００μｌに調整した。各接種体積の分析を３回行った。ＢｉｏＳｃｒｅｅｎ分析は、各測定点の前に１０秒の振盪のステップを加えて測定（ＯＤ６００ｎｍ）の間の１５分間の間隔で２４時間３７℃で行った。
結果
ＰＣＲ：
ＤＳＭ１７９３８特異的プライマーを用いたＰＣＲを、発酵槽培養物上のＤＮＡ抽出について行い、正確な細菌が培養されたことを確認した。結果は実際に、ＤＳＭ１７９３８が発酵槽で培養されたことを示す（図２）。
定量化：
凍結乾燥後のＤＳＭ１７９３８の生存率は、クエン酸塩ありで凍結乾燥された細菌（Ｃ）で約１３％およびクエン酸塩なしで凍結乾燥された細菌（Ｎ）で１２％であることが決定された（表５参照）。
活性化時間の評価：
濁度実験の結果は、ＤＳＭ１７９３８のフリーズドライされた培養物が、凍結保護剤がクエン酸塩を含む場合、より短い時間でＯＤ中３％上昇に達したことを明らかにした（図３参照）。
要約する：結果は、生成物処方中のクエン酸塩（電子受容体としてラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）によって使用される）の添加は、人工腸培地においてラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９３８の活性化時間を短縮することを明らかにした。

Claims (34)

  1. クエン酸塩を含む調製物に生乳酸菌を曝露することを含む該細菌を活性化させる方法であって、ここで、該細菌は、外部電子受容体としてクエン酸塩を利用する能力を有する、上記方法。
  2. クエン酸塩の前記利用は、前記細菌の改善された増殖速度をもたらす、請求項１に記載の方法。
  3. 前記方法は、細菌を糖に曝露することをさらに含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
  4. 前記糖が、ラクトースである、請求項３に記載の方法。
  5. 前記クエン酸塩および任意の前記糖は、次に活性化される休眠状態の細菌の調製物中に存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記クエン酸塩は、０．０１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１ｍｇ／ｍｌ〜５．０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 調製物は、１：１０〜１：６００、好ましくは１：６０〜１：６００または１：３０〜１：３００のクエン酸塩／ラクトース比を含む、請求項４〜６のいずれかに記載の方法。
  8. 前記細菌が、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、好ましくは、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記細菌が、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９３８である、請求項８に記載の方法。
  10. 活性化される細菌が、凍結、凍結乾燥またはフリーズドライされる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記クエン酸塩は、前記凍結、凍結乾燥またはフリーズドライされた調製物中に存在する、および／または前記クエン酸塩は、最終調製物中に存在する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記凍結、凍結乾燥またはフリーズドライされた調製物は、水中で再構成される、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
  13. より速い活性化された生細菌または改善された増殖速度を有する細菌の投与から恩恵を受ける状態の対象の治療における使用のための、請求項１〜１２のいずれか一項の方法によって調製される活性化された乳酸菌。
  14. より速い活性化された生細菌または改善された増殖速度を有する細菌の投与から恩恵を受ける状態の対象の治療において使用するための、（ｉ）クエン酸塩を外部電子受容体として利用する能力を有する生乳酸菌、および（ｉｉ）クエン酸塩を含む調製物。
  15. より速い活性化された生細菌または改善された増殖速度を有する細菌の投与から恩恵を受ける状態の対象の治療において使用するためのクエン酸塩活性化乳酸菌。
  16. 前記クエン酸塩は、０．０１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、０．１ｍｇ／ｍｌ〜５．０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の使用のための活性化された細菌または使用のための調製物。
  17. 前記細菌は、凍結、凍結乾燥またはフリーズドライされ、前記クエン酸塩は、凍結、凍結乾燥またはフリーズドライされた調製物中に存在し；および／または
    前記クエン酸塩は、前記対象への投与のための最終処方中に存在する、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の使用のための活性化された細菌または使用のための調製物。
  18. 前記調製物は、前記対象への投与前に水中で再構成される、請求項１７の使用のための活性化された細菌または使用のための調製物。
  19. 前記対象は、腸内で栄養素を欠いている若しくは栄養素が限られている対象であるか、または腸内の栄養素の量が医学的理由により意図的に制限されている対象であるか、または非経口若しくは静脈栄養を必要とする対象である、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の使用のための活性化された細菌または使用のための調製物。
  20. 前記対象が、新生児、または１歳までの乳児である、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の使用のための活性化された細菌または使用のための調製物。
  21. 前記対象は、未熟児で生まれた、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の使用のための活性化された細菌または使用のための調製物。
  22. 前記対象は、壊死性腸炎（ＮＥＣ）を有する対象であるか、またはＮＥＣを発症するリスクがある、請求項１３〜２１のいずれか一項に記載の使用のための活性化された細菌または使用のための調製物。
  23. 前記対象は、授乳または口からの摂食が不可能である、請求項１３〜２２のいずれか一項に記載の使用のための活性化された細菌または使用のための調製物。
  24. 前記対象が、ヒトである、請求項１３〜２３のいずれか一項に記載の使用のための活性化された細菌または使用のための調製物。
  25. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法によって調製される活性化された乳酸菌を含む調製物。
  26. 以下を含む調製物：
    （ｉ）クエン酸塩を外部電子受容体として利用する能力を有する生乳酸菌；および
    （ｉｉ）クエン酸塩。
  27. 前記調製物は、糖をさらに含む、請求項２５または請求項２６に記載の調製物。
  28. 前記糖が、ラクトースである、請求項２７に記載の調製物。
  29. 前記クエン酸塩は、０．０１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、０．１ｍｇ／ｍｌ〜５．０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記調製物は、１：１０〜１：６００、好ましくは１：６０〜１：６００または１：３０〜１：３００のクエン酸塩／ラクトース比を含む、請求項２８または請求項２９に記載の調製物。
  31. 前記細菌が、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、好ましくは、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）である、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の調製物。
  32. 前記細菌が、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９３８である、請求項３１に記載の調製物。
  33. 細菌が、凍結、凍結乾燥またはフリーズドライされる、請求項２５〜３２のいずれか一項に記載の調製物。
  34. 前記クエン酸塩は、凍結、凍結乾燥またはフリーズドライされた調製物中に存在する、および／または前記クエン酸塩は、最終調製物中に存在する、請求項２５〜３３のいずれか一項に記載の調製物。
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