CN107427461B - 活化乳酸细菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及活化活乳酸细菌的方法，其包括将所述细菌暴露于包含柠檬酸盐的制备物，其中所述细菌具有利用柠檬酸盐作为外部电子受体的能力。本发明还涉及增强某些活细菌在哺乳动物中的活性的方法。更具体地，本发明涉及改善某些乳酸细菌从冷冻干燥状态的觉醒。本发明还涉及包含所述活化细菌的制备物和所述活化细菌的治疗用途。

Description

活化乳酸细菌的方法
发明领域
本发明一般涉及增强某些活细菌在哺乳动物中的活性的发生。此外，本发明涉及包含基质组分和某些活细菌的制备物，所述基质组分被特别设计或选择以改善所述细菌的重构和早期生长。
发明背景
活细菌治疗的效力是目的和菌株特异性的，并且不同的菌株可通过不同的机制有助于宿主的健康。不同的活细菌可以预防或抑制病原体的增殖，抑制病原体的毒力因子的产生，以促炎或抗炎的方式调节免疫应答，并且以多种其它方式影响宿主。
罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）是一种异型发酵乳酸细菌，并且经常在人类和其它动物的胃肠道中发现。罗伊氏乳杆菌被认为是人类胃肠道的本地生物体，并且例如存在于胃体、胃窦、十二指肠和回肠的粘膜上。不同的罗伊氏乳杆菌菌株具有定殖肠道、充当腹泻治疗剂、调节肠动力、作为细菌病原体的抑制剂发挥功能、免疫调节胃肠粘膜、作为胃中的抗炎药物发挥功能等的能力。
活细菌的口服施用的问题是在活细菌将发挥其作用的肠道的位置处的活细菌的量和/或活性不足。这可能导致必须增加活细菌的剂量和/或需要更频繁的施用并且还可能导致活性丧失。这导致不必要的成本、不期望的摄入频率和/或减少或不存在的健康益处。
在活细菌的一些具体应用中，最重要的是在施用之后迅速地具有活性和代谢性活细菌以达到所需的健康效果，并且在那些应用的一些中，个体中的营养物的量可能必须由于医学原因被有意限制。因此，要解决的问题是快速活化待施用于个体的所选活细菌，但对给予个体的营养物的影响最小。本发明旨在解决某些细菌的这个问题。
发明概述
本发明的主要目的是提供某些活细菌在人类、特别是新生儿中的活性的增强的发生。活性的增强的发生基于当施用于所述新生儿而不显著改变给予新生儿的营养内容物时，活细菌的改善(例如更快或更快速)的重构和早期生长(例如改善的生长或生长速率)。新生儿包括早产婴儿至足月出生的婴儿。
在本发明中，为了快速活化例如早产婴儿中的活细菌，已经开发了添加至产品中的基质组分的新组合。本发明人令人惊讶地发现，将柠檬酸盐，优选与碳源(诸如乳糖)组合添加至制剂混合物，改善了罗伊氏乳杆菌DSM 17938和类似细菌的重构和早期生长。在本发明中应当优选使用可以使用柠檬酸盐作为其代谢中的电子受体的菌株，其对于给予婴儿的营养内容物的影响最小。
更具体地，本发明的目的是提供包含基质组分(包括柠檬酸盐和某些活细菌)的制备物，所述基质组分被专门设计以改善所述活细菌的重构、觉醒和早期生长。
本发明基于令人惊讶的发现：在当某些细菌被活化时(即，当它们从休眠形式转变为活性和代谢形式时)的时间点存在柠檬酸盐(暴露于柠檬酸盐)改善了它们的活化，例如在改善的重构、觉醒和/或生长的方面。换句话说，当活化细菌时，柠檬酸盐的存在(暴露于柠檬酸盐)为它们提供了“快速启动(kick-start)”。
因此，本发明提供活化活细菌、特别是乳酸细菌的方法，其包括将所述细菌暴露于包含柠檬酸盐的制备物，其中所述细菌具有利用柠檬酸盐作为外部电子受体的能力。具体而言，所述利用柠檬酸盐导致改善的生长速率。因此，本发明还提供活化活细菌、特别是乳酸细菌的方法，其包括将所述细菌暴露于包含柠檬酸盐的制备物，其中所述细菌具有利用柠檬酸盐改善生长速率的能力。
此外，本发明提供通过本发明的方法制备、获得或可获得的包含活化细菌、特别是乳酸细菌的制备物。
因此，本发明还提供制备物，其包含：
(i) 具有利用柠檬酸盐作为外部电子受体的能力的活细菌，特别是乳酸细菌；和
(ii) 柠檬酸盐。
在优选实施方案中，所述制备物中的细菌是休眠细菌，例如细菌，且将所述制备物冷冻、冻干或冷冻干燥。
在又另一个方面，本发明提供了本发明的这样的柠檬酸盐活化的细菌或如本文所述的本发明的制备物的治疗用途。
因此，本发明提供了通过本发明的方法制备、获得或可获得的活化细菌，特别是乳酸细菌，其用于疗法中，例如治疗具有将受益于施用更快活化的活细菌或具有改善生长速率的细菌的状况的受试者。因此，在本发明的一些实施方案中，进行活化方法的步骤，其后将活化的细菌用于疗法中。
本发明还提供了制备物，其包含(i)具有利用柠檬酸盐作为外部电子受体的能力的活细菌，特别是乳酸细菌，和(ii)柠檬酸盐，其用于疗法中，例如治疗具有将受益于施用更快活化的活细菌或具有改善生长速率的细菌的状况的受试者。
可选地考虑，本发明提供了柠檬酸盐活化的活细菌，特别是乳酸细菌，其用于疗法中，例如治疗具有将受益于施用更快活化的活细菌或具有改善生长速率的细菌的状况的受试者。
在进一步的方面，本发明还提供了通过本发明的方法制备、获得或可获得的活化细菌、特别是乳酸细菌在制备药物或组合物中的用途，所述药物或组合物用于治疗具有将受益于施用更快活化的活细菌或具有改善生长速率的细菌的状况的受试者。
本发明还提供了包含(i)具有利用柠檬酸盐作为外部电子受体的能力的活细菌，特别是乳酸细菌，和(ii)柠檬酸盐的制备物在制备药物或组合物中的用途，所述药物或组合物用于治疗具有将受益于施用更快活化的活细菌或具有改善生长速率的细菌的状况的受试者。
可选地考虑，本发明提供了柠檬酸盐活化的活细菌、特别是乳酸细菌在制备药物或组合物中的用途，所述药物或组合物用于治疗具有将受益于施用更快活化的活细菌或具有改善生长速率的细菌的状况的受试者。
本发明的进一步方面提供了治疗具有将受益于施用更快活化的活细菌或具有改善生长速率的细菌的状况的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的通过本发明的方法制备、获得或可获得的活化细菌，特别是乳酸细菌。
本发明还提供了治疗具有将受益于施用更快活化的活细菌或具有改善生长速率的细菌的状况的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的包含(i)具有利用柠檬酸盐作为外部电子受体的能力的活细菌，特别是乳酸细菌，和(ii)柠檬酸盐的制备物。
可选地考虑，本发明提供了治疗具有将受益于施用更快活化的活细菌或具有改善生长速率的细菌的状况的受试者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的柠檬酸盐活化的活细菌、特别是乳酸细菌。
以药学上或生理上有效量实施向需要治疗的受试者(哺乳动物)施用本发明的所述治疗方法和用途中的细菌或细菌制备物。因此，所述方法和用途可以涉及鉴定需要治疗的受试者的额外步骤。本文别处描述的本发明的可选的和优选的实施方案和特征同样适用于本发明的这些治疗方法和用途。
附图简述
图1是显示“模拟的肠基质”中的罗伊氏乳杆菌DSM 17938的生长的图。与三种不同的电子受体组合测试两种不同的碳水化合物来源。细菌不仅仅用碳水化合物生长，而且当添加电子受体时，生长增加。柠檬酸盐作为电子受体显示最高的效果。
图2显示来自凝胶电泳的结果，其将发酵罐培养物鉴定为DSM 17938：1. 标记物(GeneRuler 1kb加DNA梯); 2. 发酵罐样品1 (66 ng/µl); 3. 发酵罐样品2 (6.6 ng/µl); 4. 阳性对照(DSM 17938的细菌悬浮液); 5. 阴性对照(H2O); 6. 标记物。
图3显示来自浊度实验的结果，其揭示与没有柠檬酸盐的冻干培养基相比，含有柠檬酸盐的冻干培养基导致DSM 17938更快达到OD值增加3％。* = 显著性差异(Student'st-检验，α = 0.05)。
本发明的详述及其优选实施方案
为了便于理解本发明，在下文定义多个术语。
“新生的”或“新生儿（neonate）”和“新生儿（newborn）”可互换使用，并且是指新生儿和出生后立即的时间段。该术语包括早产出生的婴儿或早产婴儿至足月出生的婴儿，以及出生后立即的时间段。
“婴儿”和“婴孩”可互换使用，并且是指新生婴孩及其生命第一年(长达一年或长达十二个月)。
“早产(Preterm)”和“早产(premature)”是指在怀孕的第37周之前(或非人类哺乳动物的等效时间点)发生的出生。
“感染”是指致病微生物的入侵。
“代谢细菌”是活的，意味着其利用合适的基质组分生长和复制，例如导致代谢物的产生，并且意味着细菌可以用于特定目的。
“死细菌”是指不能复制且不能使其存活的非代谢细菌。
“休眠细菌”是指不能复制、但是活的并且可以被活化(或重新活化)为代谢细菌的非代谢细菌。这种休眠细菌的实例是冷冻或冷冻干燥或冻干(或以其它方式干燥，例如喷雾干燥)的细菌。进而，“休眠制备物”是指包含休眠细菌的制备物，例如冷冻或冷冻干燥或冻干(或以其它方式干燥，例如喷雾干燥)的制备物。
“活细菌”是指代谢细菌或可以活化以代谢的休眠细菌。
细菌的“活化”是指将细菌的状态从休眠改变为代谢细菌的状态的过程。
本发明可用于提供某些活细菌的活性的增强发生，特别是当对于施用部位的细菌存在有限量的营养物时。这全部完成而没有显著改变宿主的其它营养状况。
在本发明中，例如选择的罗伊氏乳杆菌的局部量和/或代谢活性得到增强（导致除了其它之外），降低活细菌剂量的潜力以及进一步定点健康益处成为可能。
NEC(坏死性小肠结肠炎)是主要见于早产婴儿中的一种医学状况。其特征在于肠道的可变损伤，范围为从粘膜损伤到全层坏死和穿孔，其中肠的部分由于肠中的感染和炎症而经历坏死。其在产后发生，并且是早产婴儿的死亡率的第二大常见原因。初步症状包括摄食不耐受、胃残留增加、腹部膨胀和血便。对于这种不可预测和破坏性的疾病，没有明确的治疗。因此，NEC预防策略是至关重要且迫切需要的，但迄今尚未成功或普遍被采用作为护理标准，并且NEC的预防仍然是未满足的医疗需求。NEC中异常胃肠道微生物群的涉及包括NEC婴儿中的菌血症和内毒素血症的发现以及肠气囊肿的放射学检查结果，这可能代表由细菌发酵产生的粘膜下层气体。
已经显示，处于接受或发展NEC或具有NEC的风险的早产婴儿受益于其肠内的罗伊氏乳杆菌DSM 17938，以抵消与NEC相关的大量感染和炎症。该程序可能挽救NICU(新生儿重症监护室)中的生命。该产品经由直接至胃中的鼻胃或口胃(NG/OG)管给予婴儿。
在处于发展NEC的风险的早产儿的生命的第一天中，通常通过胃肠外递送提供营养物来使婴儿存活，并且通常没有最初给予肠道的营养物。其原因是通过肠内喂养给予的早期营养物可诱导NEC，因此由此肠胃外给予营养。这进而意味着肠中没有营养物来支持需要的乳酸细菌的活化和生长，特别是在生命的关键的第一天，且特别是在早产婴儿中。由于肠是一种生活环境，可能有一些有限的营养物和糖可用，但在某种程度上不能支持细菌在那些条件下的快速活化和早期生长。
本发明是通过使活乳酸细菌或任何其它合适的活细菌在其被递送到婴儿肠道(例如在管饲系统中的途径上)中时已经能够快速和选择性地活化来提供该问题的改善解决方案，其对给予婴儿的营养影响最小。
通常，人乳是新生健康婴儿的营养的主要来源。在哺乳的前几天期间，母亲产生所谓的初乳，这是一种富含蛋白质和抗体的稀淡黄色的流体，为婴儿提供了良好的开端。几天后，流体将逐渐变化，并且变为含有蛋白质、脂肪、碳水化合物和矿物质的成熟乳。碳水化合物主要由乳糖组成。在哺乳的第一天，柠檬酸盐和乳糖的浓度通常如以下实例：柠檬酸盐0.25mM和乳糖76mM，而在哺乳的第五天，浓度如下：柠檬酸盐5mM和乳糖173mM。重新计算，这得到柠檬酸盐和乳糖的比率为1:30至1:300。
由于各种原因，新生婴儿的母乳喂养可能不可行，例如但不限于早产、复杂的分娩、功能问题(例如，母亲不产生任何乳或乳不足，乳管堵塞，乳腺炎)、母亲的疾病等。在此类情况下，婴儿需要其它方式的营养，并且通常婴儿配方是可用的，并且可以喂给婴儿以补偿哺乳。在关键事件中，例如婴儿没有时间在子宫中适当发育并且经常显示肠未发育的早产儿，快速建立可以减缓持续的感染和炎症的肠道环境是关键的。早产出生的婴儿是敏感的，并且需要特别护理以使之能够适应子宫外的生活。
对于诊断为发展NEC或处于发展NEC的风险的新生儿，本发明的产品通常经由直接至胃中的口胃或鼻胃(OG/NG)管给予，并且通常通过胃肠外递送给予保持婴儿活着的营养物，意味着通常没有最初给予肠道的营养物。
在本发明中，为了快速活化例如早产婴儿中的活细菌，已经开发了添加至制备物中的基质组分的新组合。本发明人令人惊讶地发现，将柠檬酸盐，优选与碳源(诸如乳糖)组合添加至制剂混合物，改善了罗伊氏乳杆菌DSM 17938的重构和早期生长。
通过本发明，柠檬酸盐充当外部电子受体并在特定细菌的代谢中释放NAD(P)H制动剂（brake）。
在这方面，发酵是从糖释放能量并且不需要氧气或电子传输链的过程。相反，有机分子被用作电子受体，进行糖酵解期间产生的NAD(P)H的再氧化。最通常，该有机分子是丙酮酸盐，Embden-Meyerhof途径(EMP)(最常见的糖酵解类型)的最终产物。
同型发酵乳酸杆菌使用EMP将碳水化合物转化为乳酸盐，而异型发酵乳酸杆菌(诸如罗伊氏乳杆菌)使用磷酸转酮酶途径(PKP)。与EMP相比，PKP具有差的能量产生，但是这可以通过添加外部电子受体来补偿，这产生了用于NAD(P)H再氧化的替代途径。这导致获得一个额外的ATP，使PKP与EMP一样有效。在本发明中，柠檬酸盐用作外部电子受体，因此选择具有利用柠檬酸盐作为外部电子受体的能力的细菌。
碳源，诸如乳糖，对于适应人母乳并且能够使用柠檬酸盐作为电子受体的菌株(诸如罗伊氏乳杆菌DSM 17938)的快速生长是特别有效的。
罗伊氏乳杆菌DSM 17938和柠檬酸盐所见的效果是菌株特异性的，并且例如其它罗伊氏乳杆菌菌株诸如罗伊氏乳杆菌ATCC PTA-4659、罗伊氏乳杆菌ATCC PTA-6475和罗伊氏乳杆菌ATCC PTA-5289不能使用柠檬酸盐作为电子受体，因此不适合用于本发明。柠檬酸盐和乳糖存在于人乳中，并且是乳中罗伊氏乳杆菌DSM 17938的生长的基础之一。
本发明涉及在给予需要对给予的营养物的影响最小的快速活化的活细菌、诸如罗伊氏乳杆菌DSM 17938的个体的产品中以适当比率添加柠檬酸盐与乳糖或另一合适的碳源(例如其它糖诸如蔗糖、果糖、葡萄糖或半乳-寡聚糖(GOS))。这将使得罗伊氏乳杆菌DSM17938的重构和生长更像在母乳喂养的婴儿肠道中在生命的前几天看到的那些状况。
本发明旨在通过提供某些活的和抗炎的乳酸细菌菌株诸如罗伊氏乳杆菌DSM17938或具有利用柠檬酸盐作为电子受体的类似能力的菌株(其具有改善的重构和早期生长能力)来解决与例如NEC的状况相关的健康相关问题。本发明的产品也可用于在口服喂养和接受静脉营养中有困难、而不特别诊断具有NEC的新生儿。本发明可以进一步用于其它情况中，其中特定乳酸细菌的快速活化从健康角度而言是有益的。
本发明通过添加至最终产品的基质组分的新组合实现了冻干的活细菌在例如早产婴儿中的快速活化。本发明进一步实现了选择和以特异性用于支持特定细菌的活性的增强的发生的比率混合的基质组分的用途。
因此，本发明提供了通过添加或掺入柠檬酸盐或以其它方式将所述细菌暴露于柠檬酸盐(和任选其它基质组分)来活化活细菌或改善活细菌的活化的方法。如本文所述的细菌的活化可以采取活细菌制备物的改善的重构的形式(例如，当将干燥的细菌，或其它休眠的细菌和/或休眠细菌的浓缩制剂稀释和活化使用时)，其可以进而本身表现为一旦重构已发生的活细菌的改善和/或更快速的生长，或者其它细菌活动的增强(增加)或更快发生，例如新陈代谢或定殖。
因此，本发明的活化方法和制剂中的柠檬酸盐的存在(暴露于柠檬酸盐)(例如在用于施用于受试者的最终制剂中)导致当与在制剂中不具有柠檬酸盐或适量(即活化量)柠檬酸盐的细菌制剂相比时改善的活化，例如，活细菌的改善或更快速的重构和/或改善的或更快速的生长或生长速率。据发明人所知，柠檬酸盐在制剂中使活细菌从休眠状态(例如当这种细菌被冷冻，冻干，冷冻干燥或以其它方式干燥时)活化的这样的用途还没有被公开，并且导致用于处理这种细菌的改善的方法，特别是对于本文别处所述的某些医疗治疗。
例如，在施用细菌之后(或之前或期间)休眠活细菌的快速活化在一些受试者中是重要的，例如，因为受试者通常不会在其胃或肠中具有营养物（所述营养物可以用于有效地活化休眠的活细菌），或者因为受试者可能由于医疗原因(例如具有NEC或具有NEC的风险的婴儿)故意具有受限量的营养物。施用对给予个体的营养物(例如在营养物有意受限的受试者中)具有最小影响的组合物或施用组合物而不显著改变受试者的其它营养状态也可以是重要的。在本发明的制剂、方法和用途中，制剂中存在足够的营养以使细菌开始(例如至少开始活化和生长)，使得细菌不必清除存在于受试者(例如早产婴儿)的肠道中的任何有限的营养物。这可能是重要的，因为必须仔细调节和平衡给予例如患有NEC或处于NEC的风险的婴儿的营养的量和内容物。
因此，在这样的受试者中，细菌需要快速活化，而不依赖于受试者肠道中现有的营养物，使得尽可能快且在宿主的健康恶化之前实现治疗益处。在施用之后(或之前或期间)的快速活化也是重要的，因为在宿主的胃中缺乏将使活化在受试者内发生的天然营养物。
本发明的方法提供该问题的解决方案，通过提供使用柠檬酸盐作为细菌的合适基质组分来活化活细菌并且优选还提供细菌的适当碳源诸如糖(例如乳糖)的方法。
可选地，如本文所述的活化方法可以被视为提供将细菌的状态从休眠改变为代谢状态(例如生长和复制、优选产生代谢物的状态)的方法。如本文所述的活化方法也可以被视为用于细菌的重构或生长的方法，例如改善休眠活细菌的重构和/或生长或生长速率的方法。
有利地，根据本发明的细菌的这种改善的活化也可导致细菌的所需剂量的减少，或导致细菌更低频率的施用，或者一旦施用，则导致细菌的活性改善(和因此治疗和健康益处)。
细菌的不同的菌株和类型具有不同的能力。用于本发明的适当活细菌或微生物是具有利用柠檬酸作为外部电子受体的能力的那些。在细菌生长和代谢的上下文中，术语“外部电子受体”是本领域的术语。“外部”例如意味着电子受体(柠檬酸盐)源自对细菌外源的来源，并且不源自细菌本身或由细菌本身产生。
适当的细菌还可以具有使用(或消耗)柠檬酸盐作为生长的营养物或基质的能力(具有在柠檬酸盐存在的情况下生长的能力)，或者在其代谢中使用柠檬酸盐作为外部电子受体的能力(具有代谢柠檬酸盐的能力)或具有在发酵反应中使用柠檬酸的能力(是柠檬酸盐发酵的)。
优选的活细菌是发酵细菌，诸如乳酸细菌，例如乳杆菌属或双歧杆菌属。特别优选的活细菌是异性发酵乳杆菌，例如，其使用磷酸转酮酶途径(PKP)来转化碳水化合物，诸如罗伊氏乳杆菌，特别是罗伊氏乳杆菌DSM 17938菌株或具有利用柠檬酸盐作为外部电子受体的相似能力的那些。罗伊氏乳杆菌DSM 17938菌株于2006年1月30日保藏于DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Mascheroder Weg1b, D-38124 Braunschweig)。在本发明的一些实施方案中，不使用罗伊氏乳杆菌DSM17938菌株。
用于本发明的优选的活细菌也将能够对以足够量对其施用它们的宿主或受试者具有健康益处。因此，在本发明中可以使用可用于治疗疾病或状况或在受试者、特别是婴儿或新生儿中具有健康益处的任何活微生物。例如，如本文别处所述，因为本发明的方法导致细菌的活化改善，例如，以更快的重构和生长的形式，有利地，本发明可以使细菌的健康益处得到改善，或者本发明可以允许使用较低或较小频率剂量的所选细菌来达到相同的健康益处。
因此，在一些实施方案中，例如，具有抗炎活性(以及利用柠檬酸盐作为外部电子受体的能力)的细菌是优选的。罗伊氏乳杆菌DSM 17938将是这样的实例。
如本文别处所述，本发明特别用于治疗受试者中的某些疾病或状况。
用于本文所述的本发明的制剂、制备物、方法和用途的细菌的适当剂量可以根据待治疗的疾病或状况、施用模式和关心的制剂进行选择。
因此，优选地，所述剂量是适合于所治疗的哺乳动物类型和病症的治疗有效剂量，并且适合于引起所需的治疗效果或健康益处。例如，可以使用105至1010、例如106至109或106至108或108至1010总CFU的细菌的每日剂量。优选的每日剂量是约109或1010总CFU，例如109至1010总CFU。这些剂量也可以等于每ml的示例性剂量，其中优选施用1ml剂量。
细菌菌株利用柠檬酸盐作为外部电子受体(例如在糖的发酵期间)的能力将是本领域技术人员很好理解的，并且可以使用标准技术容易地确定。例如，一个选项是通过简单地向生长培养基中添加柠檬酸来测试这样的能力，并且如果这导致细菌的更快、更好或改善的生长或生长速率，则可以得出结论，细菌菌株可以利用柠檬酸盐作为电子受体。可选地，可以通过测量柠檬酸盐是否被细菌消耗，例如通过测量当细菌生长时生长培养基中的柠檬酸盐浓度是否耗尽来评价柠檬酸盐的利用。
另一种选项是筛选细菌菌株中参与柠檬酸盐的代谢、例如柠檬酸盐转化为琥珀酸盐(例如经由草酰乙酸盐、苹果酸盐或富马酸盐)的酶中的一种或多种(例如2种或更多种，3种或更多种，4种或更多种等，或全部)的基因的存在。因此，可以筛选菌株中以下酶中的一种或多种(或优选全部)的存在：EC:1.1.1.37：苹果酸脱氢酶；EC:1.2.4.1；丙酮酸脱氢酶(乙酰基-转移)；EC:1.3.99.1：琥珀酸脱氢酶；EC:1.3.99.1：二氢硫辛酰基脱氢酶；EC:2.3.1.12：二氢硫辛酰基赖氨酸残基乙酰转移酶；EC:4.1.3.6：柠檬酸盐(pro-3S)-裂解酶(3种不同基因所代表的3个亚基)；EC:4.2.1.2：富马酸盐水合酶。柠檬酸裂解酶的存在是特别重要的。也可以筛选细菌菌株中柠檬酸盐透性酶的存在。
具有利用柠檬酸盐作为外部电子受体的能力的细菌的使用意味着本发明的制剂和制备物含有柠檬酸盐的来源，例如柠檬酸根离子，例如柠檬酸盐，诸如柠檬酸钠(例如柠檬酸三钠二水合物)或柠檬酸盐或柠檬酸的其它金属盐。优选的盐是对pH具有最小影响的那些盐，例如可以存在于约中性pH(例如pH 6.0至7.5)的缓冲溶液中的那些盐。
本发明人已令人惊讶地显示，在细菌制剂中柠檬酸盐的存在，即将细菌暴露于包含柠檬酸盐的制备物或制剂，与不含柠檬酸盐的制剂和制备物相比，导致细菌的改善(例如更快速)的活化，特别是在例如从冷冻干燥或冻干或其它休眠制备物重构细菌的改善或细菌生长的改善方面。
因此，与如果不包括柠檬酸盐相比，在施用于患者时，柠檬酸盐应当在最终制剂中(例如充当赋形剂)，以用于更快的活化。这意味着实施本发明的一种方便的方法是在冷冻干燥或冷冻或者使细菌休眠(因此当休眠细菌被活化时可获得它)之前向湿细菌制备物或浆液中加入柠檬酸盐。实施本发明的替代方便的方法是将柠檬酸盐作为干燥成分添加至已经干燥(例如冷冻干燥或冻干的)细菌的制剂中，使得柠檬酸盐再次存在于最终制剂中，并且当休眠细菌被活化时可获得。可选地，柠檬酸盐可以添加或可以存在于用于构成用于施用于患者的最终制剂(例如，用于溶解或重构或活化冷冻、冷冻干燥或冻干、或其它休眠细菌)的介质或其它溶液中。
实现根据本发明的细菌的活化（例如改善的活化）的柠檬酸盐的适当浓度可以由本领域技术人员通过任何适当的方法建立，例如通过将细菌暴露于不同浓度的柠檬酸根离子并观察对重构和/或生长的影响。例如用于刺激细菌的改善的生长(或生长速率)、优选细菌的显著改善的生长(或生长速率)的浓度是合适的。示例性浓度为0.01或0.05 mg/ml至100 mg/ml，例如0.05或0.1 mg/ml至1.0、2.0、3.0、5.0、10.0、20.0、30.0或50.0 mg/ml。可选浓度可以是1.0、2.0、3.0、5.0、10.0、20.0、30.0或50.0 mg/ml至100 mg/ml。优选的浓度可以是0.05或0.1 mg/ml至5.0或3.0或2.0或1.0或0.5 mg/ml，例如0.2至0.7 mg/ml，例如0.3至0.6 mg/ml。这些值也适用于给予受试者的等效mgs/剂量。
例如，本发明人已经显示，当制剂中（例如在冻干或冷冻干燥的细菌制剂中）存在柠檬酸盐时，则在柠檬酸盐存在的情况下，细菌显示与柠檬酸盐的不存在相比更快或改善的生长(生长速率)，例如，花费减少量的时间来达到某一光密度(OD)。因此，柠檬酸盐(柠檬酸根离子)的优选浓度是能够引起这种观察(例如，在存在相比于不存在柠檬酸盐的情况下，更快或改善的生长或更快或改善的生长速度)的那些。具体而言，柠檬酸盐的优选浓度是能够引起或导致细菌菌株与不存在柠檬酸盐的情况下相比在更短的时间(优选显著较短的时间)内达到特定OD或OD的百分数增加的浓度。适当的方法显示于实施例和图3中。例如，可以方便地测量细菌达到OD的 1％、2％、3％、4％或5％或大于1％、2％、3％、4％或5％的增加(例如，OD的3％或大于3％的增加)所花费的时间，并观察其更快、优选显著更快发生时，柠檬酸盐的浓度（柠檬酸盐存在相比于不存在(即在柠檬酸盐不存在相比于存在的情况下)）。柠檬酸盐的这种浓度将适合使用。可以使用细菌生长或生长速度或细菌数量的任何适当的量度。例如，可以使用用于测量OD的任何适当的技术，例如实施例中所示的适当的浊度实验。
细菌在柠檬酸盐存在的情况下更快地生长或显示改善的生长速率的能力也是根据本发明的细菌的活化的实例。
本发明的活细菌可以冻干、新鲜、冷冻、冷冻干燥、喷雾干燥等，并且可以在任何配制的产品中，包括在油或水溶液或悬浮液或乳液等或以肠内方式施用于新生儿的其它制剂，例如管饲递送系统，经由口服途径或经由直肠施用。
根据本发明，柠檬酸盐需要存在于施用于患者的最终制剂中。
在本发明的优选实施方案中，待活化的细菌是干燥或以其它方式休眠的，优选冷冻的、冻干的或冷冻干燥的。因此，在某些优选实施方案中，本发明的方法还包括其中细菌在活化发生之前被冻干或冷冻干燥或以其它方式制成休眠(例如通过冷冻)的步骤。优选地，柠檬酸盐(和任选碳源或糖，例如乳糖)存在于休眠细菌的这种制剂或制备物中(换句话说，细菌暴露于所述柠檬酸盐和任选所述碳源)。
在特别优选的实施方案中，柠檬酸盐(和任选碳源或糖，例如乳糖)存在于休眠细菌的冷冻干燥或其它干燥或固体制剂中(例如柠檬酸盐存在于冻干介质中)。优选地，柠檬酸盐刚好在冻干或以其它方式使细菌休眠之前加入，例如加入或形成冻干介质或冷冻介质的组分，而不是例如在冷冻干燥或冷冻发生之前的步骤中用于培养和扩增(生长)活细菌的群体的生长培养基中(换句话说，柠檬酸盐优选在细菌生长期间不被使用)。
干燥组分(干燥制剂)的这种制备物可以以任何适当的方式制备。例如，最终产品中的各个组分可以在液体制剂中组合在一起，然后冻干或干燥，或者将包括干燥或冻干的细菌的各个干燥(或冻干)组分混合或共混在一起以形成干燥制剂。然后可以将这两种类型的干燥制剂重构以形成适当的含有柠檬酸盐和活细菌的最终溶液或制剂用于向患者施用。
如本文别处所述，与如果不包括柠檬酸盐相比，在施用于患者时，柠檬酸盐应当在最终制剂中(例如充当赋形剂)以用于更快的活化。这意味着实施本发明并将细菌暴露于柠檬酸盐的一种方便的方法是恰好在冷冻干燥或冷冻(因此当休眠细菌被活化时可获得它)之前向湿细菌制备物或浆液中加入柠檬酸盐。实施本发明的可选的方便的方法是将柠檬酸盐作为干燥成分添加至已经干燥的(例如冷冻干燥或冻干的)细菌的制剂中，使得柠檬酸盐再次存在于最终制剂中，并且当休眠细菌被活化时可获得。可选地，柠檬酸盐可以添加或可以存在于用于构成用于施用于患者的最终制剂(例如，用于溶解或重构或稀释冷冻、干燥或冻干、或其它休眠细菌产品)的介质(例如生长培养基)或其它溶液中。
因此，在本发明的优选实施方案中，所述柠檬酸盐存在于冷冻、冻干、冷冻干燥或其它休眠细菌制备物中以及用于施用于受试者的最终制剂中。
当活细菌被冻干或冷冻时，本发明的一个特别的优点是，当从干燥或休眠形式重构细菌时，柠檬酸盐的存在允许改善的细菌活化。这种改善的活化可以采取更快速的重构或生长的形式。换句话说，柠檬酸盐的存在有助于快速启动或改善细菌从其冻干(干燥)或其它休眠状态的觉醒。
因此，本发明背后的概念是在当细菌从休眠(例如冷冻或冷冻干燥)状态转变为活性状态时的时间点或其附近存在柠檬酸盐，这意味着柠檬酸盐在施用于患者的最终制剂中(例如，作为用于重构或重新悬浮休眠细菌用于施用的介质或缓冲液的一部分，或在冷冻干燥或冷冻或其它休眠制备物本身中，例如恰好在细菌的冻干或冷冻发生之前添加柠檬酸盐)。
如本文别处所述，这在胃或肠中具有最小营养物以另外提供用于细菌的活化和生长的营养物的受试者中是特别有利的。在本发明的一些实施方案中，细菌的一些生长可能已经在制剂到达患者的肠内之前，例如，在其重构和施用于患者期间发生。
虽然柠檬酸盐是本发明的产品制剂、组合物和制备物(例如在待施用于患者的胃肠道的制剂中)中的必需组分(例如赋形剂)，，但也优选提供其它组分或赋形剂。
例如，活细菌可以用作生长基质的一种或多种适当的碳源的存在是优选的组分。适当的碳源可以根据制剂中活细菌的性质容易地确定。然而，优选的碳源是碳水化合物诸如糖。乳糖是优选的用于使用的糖。然而，可以使用任何其它适当的糖(例如条件是其支持细菌的生长)，例如蔗糖、果糖、葡萄糖或半乳-寡聚糖(GOS)。
因此，在本发明的优选实施方案中，使碳源或糖，例如，乳糖(例如乳糖一水合物)或替代糖与活细菌连同柠檬酸盐接触。换句话说，细菌、柠檬酸盐和碳源是相同的组合物或制剂或制备物的一部分。
因此，本发明的优选制备物包含如本文别处定义的活细菌、柠檬酸盐和乳糖(或如上所述的其它合适的糖，特别是GOS)。
还可以存在其它组分或赋形剂，例如可用于组合物或制备物的稳定化或其它性质的组分，例如，任何合适的冷冻保护剂或稳定剂。实例包括选自以下的一种或多种组分：明胶、谷氨酸钠、麦芽糖糊精和抗坏血酸。甘露醇是另一种任选的组分。
在本发明的制备物中，优选使用的组分是纯的或基本上纯的形式，其适合于向哺乳动物、优选人的药物施用。因此，各个组分优选为药物级别的，其可以以已知或精确的量存在，而不是例如作为未知量或复杂量组分的混合物的一部分存在或添加。因此，虽然本发明的制剂可以在可能含有柠檬酸盐和乳糖以及许多其它物质的母乳(或其它基于乳的产品)中混合或重构之后施用，但是优选的是用于施用于患者的产品制剂含有柠檬酸根离子，例如以柠檬酸盐的形式，例如如本文别处所述的柠檬酸钠，和乳糖(例如一水合乳糖)或其它糖的适当纯制备物。因此，在本发明的优选实施方案中，将制剂在水中重构(或稀释)或是水性制剂，并且例如不涉及在基于乳的产品诸如母乳或配方乳中重构或其存在。因此，本发明的优选制剂缺乏乳蛋白质。可选地考虑，本发明的优选制剂含有或暴露于不由基于乳的产品诸如母乳或配方乳提供的柠檬酸盐。
所述制剂还通常含有缓冲液或缓冲溶液以允许保留适当的pH。
本发明的优选制剂(特别是在乳糖和柠檬酸盐浓度方面)如表B或C中所述。其它优选的制剂将含有罗伊氏乳杆菌DSM 17938的可选的利用柠檬酸盐的细菌。一种可选的优选的制剂(特别是在术语乳糖和柠檬酸盐浓度的方面)是如表2中所述的含有柠檬酸盐的制剂。再次，虽然待与这种制剂一起使用的优选细菌是罗伊氏乳杆菌DSM 17938，但在替代实施方案中，可以使用如本文定义的其它利用柠檬酸盐的细菌。表2的制剂特别可用作用于利用柠檬酸盐的细菌的冻干介质(或冻干保护剂)，因为当细菌从其冻干形式重构时，其导致细菌的改善活化(例如改善的生长)。
如上所提及，在本发明的优选实施方案中，柠檬酸盐和乳糖都存在于细菌制备物中。这些组分可以以任何适当的浓度或比率存在。柠檬酸盐以活细菌的活化(或改善的活化)的浓度存在，如本文别处所述。乳糖(或其它糖)通常以使得可以支持活细菌的生长的量存在。在本发明的优选实施方案中，所述制备物包含1:10或1:50至1:100、1:200、1:300、1:400、1:500或1:600、优选1:40或1:50或1:60至1:100、1:200、1:300、1:400、1:500或1:600；或1:30至1:100、1:200、1:300、1:400、1:500或1:600、优选1:60至1:600或1:30至1:300或1:50至1:70或1:50至1:60的柠檬酸酯与乳糖的比率。
因此，本发明的另一个目的是提供包含1:10至1:600、至少1:60至1:600的比率，优选1:30至1:300或至少1:30至1:300的比率(或如本文概述的任何其它比率)的柠檬酸盐和乳糖(或其它糖)的制备物的最佳组合。柠檬酸盐的量的一个实例是约0.3mg/剂量的约1 x1010 CFU活细菌，且每个相同剂量的乳糖的量为16.6mg。柠檬酸盐的量的另一个实例是约0,6 mg/剂量的约1 x 109 CFU活细菌，且每个相同剂量的乳糖的量为35,7 mg。柠檬酸盐的量的一个实例是约1mg/剂量的约1 x 109 CFU活细菌。柠檬酸盐可以在0.01mg至100mg/剂量的范围内(或如本文所述的其它浓度)，并且可以根据上述比率计算乳糖或其它糖的量。
本发明的另一个目的是提供包含合适的基质组分和赋形剂例如乳糖、蔗糖、果糖、葡萄糖、GOS、1,2丙二醇、明胶、谷氨酸钠、麦芽糖糊精、甘露醇、抗坏血酸、柠檬酸盐、柠檬酸三钠二水合物和乳酸细菌或其它合适的细菌的制备物，所述基质组分被特别设计为进一步改善所述细菌从冻干、新鲜、冷冻、冷冻干燥、喷雾干燥等状态的重构和早期生长，且其中所述活细菌包含可以利用柠檬酸盐作为电子受体的乳酸细菌。
本发明的另一个目的是提供包含例如乳糖、蔗糖、果糖、葡萄糖、GOS、1,2丙二醇、明胶、谷氨酸钠、麦芽糖糊精、甘露醇、抗坏血酸、柠檬酸盐、柠檬酸三钠二水合物和活细菌的制备物，其中所述活细菌是罗伊氏乳杆菌DSM 17938。
本发明的另一个目的是提供包含例如乳糖一水合物、水解明胶、谷氨酸单钠、麦芽糖糊精、抗坏血酸、柠檬酸三钠二水合物和活细菌的制备物，其中所述活细菌是罗伊氏乳杆菌DSM 17938。优选的浓度概述于实施例2和3中。柠檬酸盐的特别优选的浓度为0.3mg/剂量或0.6mg/剂量，或例如0.3至0.6mg/剂量的范围内。细菌的优选浓度为1x109 CFU或1x1010CFU/剂量，或例如1x109 CFU至1x1010 CFU/剂量的范围。特别优选1x1010 CFU，任选地与0.3mg/剂量的柠檬酸盐浓度组合。
本发明的另一个目的是提供包含1:10至1:600、至少1:60至1:600的比率的柠檬酸盐和乳糖或其它糖的制备物的最佳组合。
如本文别处所述，通过本发明的方法制备、获得或可获得的柠檬酸盐活化的细菌或本发明的含有柠檬酸盐的制剂或制备物可用于疗法中，特别是用于治疗具有将受益于施用更快活化的活细菌或具有改善的生长速率的细菌的状况的受试者。因此，这种用途和涉及这种用途的治疗有需要的患者的方法形成本发明的又一个实施方案。
待用于这种治疗方法和用途中的细菌制备物的柠檬酸盐的优选浓度和其它优选特征在本文别处列出。具体而言，重要的是柠檬酸盐存在于用于施用于所述受试者的最终制剂中。然而，此外，在本发明的一些实施方案中，所述细菌或细菌制备物是冷冻的、冻干的或冷冻干燥的(或者细菌另外是休眠的)，在所述情况下，优选的是，所述柠檬酸盐存在于冷冻、冻干、冷冻干燥(或休眠)的细菌制备物中。也是优选的实施方案的是所述制备物在施用于所述受试者之前在水中重构。
用于本发明的治疗方法和用途的优选受试者是在其肠中缺乏营养物或具有有限的营养物的受试者，或者是其中已有意限制(例如，出于医疗原因)肠中的营养物的量的受试者。可选地，所述受试者是需要肠胃外或静脉内营养的受试者(换句话说，需要通过其它途径、例如非口服途径的额外或辅助营养，或不接受直接至肠的营养物)。这种情况例如在早产婴儿或患有NEC或处于NEC的风险的婴儿中相当常见。这样的受试者通常在其肠中不具有足够的营养物以支持向所述受试者施用的细菌制备物的活化和生长，特别是通常不能支持施用的细菌制备物的活化和生长至使得会观察到细菌赋予的健康益处的程度。
因此，可以看出，其它优选的受试者将是新生儿，或至多一岁的婴儿或过早出生的受试者(即为早产或早产出生)。
其它优选的受试者是具有NEC或处于发展NEC的风险的受试者，所述NEC是早产婴儿中常见的状况。
其他优选的受试者是不能进行母乳喂养或口服喂养的受试者或哺乳是不可行的受试者，如本文别处所述。这种情况可能由于婴儿或母亲的健康问题而出现，例如但不限于早产出生，复杂的分娩，功能问题(例如，母亲不产生任何乳或乳不足，堵塞乳管，乳腺炎)，母亲的疾病等，最终结果是，待治疗的受试者不能通过母乳喂养或甚至其它口服喂养来摄取足够的营养物，以维持健康或根本的生命。
如本文所用的术语“患者”或“受试者”包括任何哺乳动物，例如人类和任何家畜、家养或实验动物。具体实例包括小鼠、大鼠、猪、猫、狗、绵羊、兔、牛和猴。然而，优选地，所述患者或受试者是人类受试者。
以药学上或生理上有效量实施向需要治疗的受试者(哺乳动物，优选人)施用本发明的所述治疗方法和治疗用途中的活细菌菌株。因此，所述方法和用途可以涉及鉴定需要治疗的受试者的额外步骤。
如从本文别处的公开内容将清楚，本发明的方法和用途适用于预防疾病或状况以及治疗疾病或状况，特别是例如预防NEC。因此，本发明也包括预防性治疗。出于这个原因，在本发明的方法和用途中，治疗在适当时还包括预防或防止。
这种预防性(或保护性)方面可以方便地对处于发展本文所述的疾病或状况(例如， NEC)的风险的受试者实施，并且可以包括完全预防和显著预防。显著的预防可以包括这样的情况：与如果不给予治疗预期的严重程度或症状相比，疾病严重程度或疾病症状降低(例如可测量或显著降低)。
因此可以通过任何适当的测定法(其实例将是本领域技术人员熟知的)来测量这种状况、疾病或其症状(例如临床症状或严重程度)的减少或缓解。优选地，状况、疾病或症状的减少或缓解是显著的，例如，临床显著或统计学显著的，优选≤0.05的概率值。与适当的对照个体或群体(例如健康哺乳动物或受试者(或其群体))或未治疗或安慰剂治疗的哺乳动物或受试者(或其群体)或如果适当，治疗前相同的个体受试者相比，通常确定这种状况、疾病或症状的减少或缓解。
作为本发明的优选实施方案涉及治疗在肠中营养物有限或受限和/或其中难以进食或喂养的患者，施用的优选形式或模式直接至受试者的胃，例如，通过口(口胃)或鼻(鼻胃)管，或任何其它形式的肠内递送。如果受试者有能力，则口服递送也是合适的。也可以使用直肠递送。
本发明或用于本发明的含有柠檬酸盐的组合物可以使用用于施用至受试者(例如，人)的任何适当的溶液来配制或重构。例如，制备物可以用水(例如蒸馏水)或其它水溶液、模拟或复制肠中的条件的一些种类的制剂(例如，模拟的肠基质(SIS)培养基，或类似物，例如，如实施例中所述)、母乳、配方乳或如上所述的适于肠道施用(例如作为肠道饲养产品施用)的任何其它溶液重构或配制。
优选地和有利地，水可以用于重构本发明的制剂，特别是如本文所述的含有柠檬酸盐和糖(例如乳糖)的制剂。在这方面，本发明人已经发现，休眠细菌的干燥(例如冷冻干燥或冻干的)制剂或休眠细菌的其它制剂中的柠檬酸盐(和任选适当的糖诸如乳糖)的存在可导致当重构时活细菌的改善的活化，意味着不需要更复杂、更不稳定和不太容易获得的重构介质，诸如基于乳的制剂(乳或配方乳)或用于肠道施用的其它制剂。换句话说，使用柠檬酸盐与乳糖(或其它适当的糖)可以更快地活化活细菌的知识，使用水来重构本发明的优选制剂的能力有利地提供了使用水的“标准化”活化的方式，其不需要依赖于试剂的任何其它来源。
当与适当的对照水平或值或样品相比时，优选地，本文所述的任何改善、增强或增加(例如对生长、生长速率、重构或活化的正面效果以及实际上如本文别处所述的任何其它这样的提高的效果)是可测量的增加，等等(适当地)，更优选地，它们是显著的增加，优选临床显著或统计学显著的增加，例如概率值≤0.05。例如，为了评估柠檬酸盐的效果，与不存在柠檬酸盐的情况下的样品、制备物或受试者等进行适当的比较。
当与适当的对照水平或值或样品相比时，优选地，本文所述的任何降低或减少(例如达到适当OD的时间减少或剂量或疾病或症状的减少以及实际上如本文别处所述的任何其它降低的效果)是可测量的减少，更优选地，它们是显著的降低，优选临床显著或统计学显著的降低，例如概率值≤0.05。例如，为了评估柠檬酸盐的效果，与不存在柠檬酸盐的情况下的样品、制备物或受试者等进行适当的比较。
将参考以下非限制性实施例进一步描述本发明。
实施例
实施例1
罗伊氏乳杆菌在“模拟肠基质”中的生长
材料和方法
在“模拟肠基质”(SIS)中评估罗伊氏乳杆菌DSM 17938在糖和电子受体的不同组合上的生长。
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表A。
首先将菌株DSM 17938的罗伊氏乳杆菌细胞在37℃下在MRS液体培养基(Oxoid)中生长过夜。在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤后，将细菌在PBS中稀释10倍。然后将10μl细菌悬浮液接种至10ml SIS中(其中添加糖和电子受体)，并且将细菌在厌氧条件下且不振荡下在37℃下培养16小时。
在添加乳糖和柠檬酸盐的SIS中培养罗伊氏乳杆菌DSM 1738
以与上面对于GOS和柠檬酸盐作为电子受体相同的方式评估使用乳糖和柠檬酸盐作为糖-电子受体对的SIS中的罗伊氏乳杆菌DSM 17938的生长。使用上述基质(SIS)。罗伊氏乳杆菌DSM 17938与在GOS-柠檬酸盐组合上一样有效地在乳糖-柠檬酸盐上生长(数据未显示)。
实施例2
使用本发明的待用于管饲处于发展NEC的风险中的早产婴儿的合适产品的制剂。
用于口服悬浮液的IBP-9414粉末是在透明玻璃小瓶中提供的白色至灰白色冻干粉末，其含有约1 x 109 CFU罗伊氏乳杆菌DSM 17938/剂量和柠檬酸盐和其它赋形剂，如下表中所示。其被制备为新鲜，冷冻，冷冻干燥，喷雾干燥等，如行业中已知。
制剂/剂量
赋形剂 量
罗伊氏乳杆菌DSM 17938 1 x 10<sup>9</sup> CFU
乳糖一水合物 35,7 mg
水解明胶 23,4 mg
谷氨酸一钠 23,4 mg
麦芽糊精 12,7 mg
抗坏血酸 10,7 mg
柠檬酸三钠二水合物 0,6 mg
表B。
实施例3
使用本发明的待用于管饲处于发展NEC的风险中的早产婴儿的合适产品的制剂。
用于口服悬浮液的IBP-9414粉末是在透明玻璃小瓶中提供的白色至灰白色冻干粉末，其含有约1 x 1010 CFU罗伊氏乳杆菌DSM 17938/剂量和柠檬酸盐和其它赋形剂，如下表中所示。其被制备为新鲜，冷冻，冷冻干燥，喷雾干燥等，如行业中已知。
制剂/剂量
赋形剂 量
罗伊氏乳杆菌DSM 17938 1 x 10<sup>10</sup> CFU
乳糖一水合物 16,6 mg
水解明胶 10,9 mg
谷氨酸一钠 10,9 mg
麦芽糊精 5,9 mg
抗坏血酸 5,0 mg
柠檬酸三钠二水合物 0,3 mg
表 C。
实施例4
将柠檬酸盐添加至冻干保护剂缩短冻干的罗伊氏乳杆菌DSM 17938的活化时间
方法
培养：
将来自冷冻原液的罗伊氏乳杆菌DSM 17938接种至具有9 ml生长培养基(参见表1)的falcon管。将预培养物在37℃下孵育16小时。这随后进行第二预培养步骤，其中将5 ml第一预培养物添加至45ml新鲜培养基。允许第二预培养物达到≥13的光密度(600nm)(~24小时)。
制备容量为1.5升的发酵罐，并通过在121℃下高压灭菌20分钟来灭菌。将除葡萄糖外的所有组分添加至875 ml dH2O中并用发酵罐高压灭菌。用剩余的125 ml制备葡萄糖溶液并分别高压灭菌，然后添加至发酵罐中。在以100 rpm搅拌下，将发酵罐设定为37℃的温度和pH5.5(通过添加NaOH来控制)。允许发酵罐运行过夜以确定可能的污染。这之后，注入50 ml第二预培养物，并将发酵罐运行15小时，达到14.3的最终光密度。
将培养物从发酵罐泵送至灭菌的烧瓶(花费~2.5小时)，分成两部分，将其以3200rpm离心10分钟。将两个沉淀(13.4和15.2g)用谷氨酸钠缓冲液(在1.8升dH2 O中的45.2g谷氨酸钠，通过0.2μm无菌过滤器过滤)洗涤，随后悬浮于等量(13.4和15.2ml)的谷氨酸钠缓冲液中。将细菌悬浮液与等体积的添加(C)或不添加(N)柠檬酸盐的冻干缓冲液进一步混合(参见表2)。
表1. 生长培养基的组成
组分 量(g)
蒸馏水 1000 ml
酵母提取物 14
大豆蛋白胨 20
柠檬酸氢二铵 5.2
乙酸钠三水合物 4.8
磷酸氢二钾 2.0
硫酸镁，七水合物 0.1
硫酸锰，一水合物 0.018
硫酸锌，七水合物 0.01
Tween 80 0.52
D-葡萄糖无水物 54.5
表2. 冻干介质的组成
Figure DEST_PATH_IMAGE002
*谷氨酸钠浓度差异的原因是调节pH值、钠浓度和离子强度。
冻干：
在冻干前，将细菌悬浮液以1ml的体积分装至具有橡胶塞的5ml冷冻-干燥小瓶中。运行以下冻干程序：
表3. 冻干程序
Figure DEST_PATH_IMAGE003
在第二干燥步骤完成之后，在氮气存在的情况下无真空下密封小瓶。
定量：
在分配成两个部分前从培养物取出用于定量细菌的样品。为了测定存活率，后来将这些结果与冻干样品的分析进行比较。
发酵罐培养物的DNA制备：
DNeasy®血液和组织手册(目录号69504)(根据方案：革兰氏阳性细菌的预处理，稍作修改)
通过以5000 x g (7500 rpm)离心10分钟收获来自发酵罐培养物(1ml)的细胞。弃去上清液，并将细菌沉淀重新悬浮于180μl酶促裂解缓冲液中，并在37℃下孵育60分钟。这随后在2 ml微管PP (Sarstedt:订货号72.694.006)中使用0.25 ml 0.1 mm氧化锆/二氧化硅珠子(BioSpec:目录号11079101z)以速度5.0进行珠子击打步骤3 x 45 s (FastPrep®-24 Instrument, MP Biomedicals)。将珠子击打样品在56℃下孵育30分钟。根据该方案进行其余的步骤。
PCR:
引物：DSM17f2 (TACGGGGAACGAGTTATTGC)和DSM17r2 (GGACGGCTTAACAAAACAGC)；产物大小216 bp。
DreamTaq Green PCR 主混合物 (2X Thermo Scientific, 物品编号K1081)用于PCR反应。根据此的PCR反应：
与引物的主混合物 每个反应的体积
水(PCR质量) 3.0 µl
引物，正向(10 pmol/µl) 1.0 µl
引物，反向(10 pmol/µl) 1.0 µl
BSA (最终浓度0.1 µg/µl) 2.5 µl
DreamTaq 12.5 µl 。
将20μl 主混合物与5μl DNA样品混合，并运行以下程序：98℃ 5 min// 2x(95℃30s, 68℃ 30s, 72℃ 20s) //2x(95℃ 30s, 66℃ 30s, 72℃ 20s) //2x(95℃ 30s, 64℃ 30s, 72℃ 20s) // 2x(95℃ 30s, 62℃ 30s, 72℃ 20s) //35x(95℃ 30s, 62℃30s, 72℃ 20s) //72℃ 5 min //16℃。
活化时间的评估：
使用随时间测量浊度变化的计算机控制的培养箱/读数器/振荡器(BioScreen CMBR)分析冻干DSM 17938的两种变体(C和N)的模拟肠介质(STMmod3，参见表4)中的活化时间。介质STMmod 3用于模拟肠道中的条件。
向每个孔中添加200μl的STMmod3。然后添加不同体积(100、60、40、30、25μl)的细菌悬浮液(具有悬浮在1ml dH2O中的冻干细菌的小瓶)。用dH2O将体积调节至300μl。每个接种体积的分析一式三份进行。BioScreen分析在37℃下运行24小时，测量之间的间隔为15分钟(OD 600nm)，其中在每个测量点之前添加10秒振荡步骤。
表4. 模拟的肠介质(STMmod 3)的组成
Figure DEST_PATH_IMAGE004
结果
PCR：
对发酵罐培养物上的DNA提取物运行具有DSM 17938特异性引物的PCR，以证实已经培养正确的细菌。结果确实显示DSM 17938在发酵罐中培养(图2)。
定量：
冷干后DSM 17938的存活率被测定为用柠檬酸盐冻干的细菌(C)约为13％，而无柠檬酸盐冻干的细菌(N)为12％(参见表5)。
表5. DSM 17938的发酵罐和冷冻干燥的培养物的定量、存活率和光密度。
Figure DEST_PATH_IMAGE005
活化时间的评估：
来自浊度实验的结果揭示，当冻干保护剂含有柠檬酸盐时，DSM 17938的冷冻干燥的培养物在更短时间内达到3％的OD增加(参见图3)。
总结：结果揭示，在产品制剂中添加柠檬酸盐(由罗伊氏乳酸杆菌用作电子受体)缩短了模拟肠道培养基中罗伊氏乳酸杆菌DSM 17938的活化时间。

Claims (9)

1.包含(i)具有利用柠檬酸盐作为外部电子受体的能力的活罗伊氏乳杆菌细菌和(ii)柠檬酸盐的制备物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗具有将受益于施用在休眠后更快活化的活罗伊氏乳杆菌细菌或在休眠后具有改善生长速率的罗伊氏乳杆菌细菌的病状的受试者；
其中所述制备物中的细菌是冷冻、冻干或冷冻干燥的，其中所述冷冻、冻干或冷冻干燥的制备物在施用于所述受试者之前重构；
其中所述柠檬酸盐存在于所述冷冻、冻干或冷冻干燥的制备物中，和/或
其中所述柠檬酸盐存在于用于施用至所述受试者的最终制剂中；
其中在柠檬酸盐存在下的所述罗伊氏乳杆菌相比于不存在柠檬酸盐下的相同罗伊氏乳杆菌具有更快的活化速率，并且所述更快的活化速率是在相同时间段内更快增加的生长；
其中所述罗伊氏乳杆菌是罗伊氏乳杆菌DSM 17938；
其中所述受试者是人受试者并且是新生儿或至多一岁的婴儿，或已经过早地出生的所述受试者；
并且其中所述病状是这样的病状，其中所述新生儿、婴儿或过早地出生的受试者在口服喂养中有困难，不能进行母乳喂养或口服喂养，需要胃肠外或静脉内营养，或者是其中肠中的营养物质的量由于医疗原因而有意受限的受试者。
2.权利要求1的用途，其中所述细菌暴露于糖或所述制备物还包含糖。
3.权利要求2的用途，其中所述糖是乳糖。
4.权利要求1至3中任一项的用途，其中所述柠檬酸盐和任选所述糖存在于休眠细菌的制备物中，然后所述休眠细菌被活化。
5.权利要求1至3中任一项的用途，其中所述柠檬酸盐以0.01 mg/ml至10 mg/ml的浓度存在。
6.权利要求5的用途，其中所述柠檬酸盐以0.01 mg/ml至2.0 mg/ml的浓度存在。
7.权利要求3的用途，其中所述制备物包含1:10至1:600的柠檬酸盐与乳糖比率。
8.权利要求7的用途，其中所述制备物包含1:60至1:600或1:30至1:300的柠檬酸盐与乳糖比率。
9.权利要求1至3中任一项的用途，其中所述受试者是具有坏死性小肠结肠炎(NEC)或处于发展NEC的风险的受试者。
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