BR112017014192B1 - Preparação - Google Patents

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Abstract

bactéria ativada, e, preparação. a presente invenção se refere a métodos para ativar bactérias vivas do ácido lático compreendendo expor as ditas bactérias a uma preparação compreendendo citrato, em que as ditas bactérias têm a capacidade de utilizar citrato como um aceptor de elétron externo. a presente invenção adicionalmente se refere a métodos para intensificar a atividade de certas bactérias vivas em mamíferos. mais especificamente a invenção se refere a melhorar o despertar de certas bactérias do ácido lático do estado seco e congelado. a presente invenção também se refere a preparações compreendendo as ditas bactérias ativadas e usos terapêuticos das ditas bactérias ativadas.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção se refere no geral à intensificação do início de atividade de certas bactérias vivas em mamíferos. Além do mais, esta invenção se refere a preparações compreendendo componentes de substrato e a certas bactérias vivas, os componentes de substrato sendo especificamente projetados ou selecionados para melhorar a reconstituição e crescimento inicial das ditas bactérias.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[002] A efetividade da terapêutica de bactérias vivas é específica do propósito e da cepa, e cepas diferentes podem contribuir com a saúde do hospedeiro através de diferentes mecanismos. Diferentes bactérias vivas podem prevenir ou inibir a proliferação de patógenos, suprimir produção de fatores de virulência por patógenos, modular a resposta imune de um modo pró-inflamatório ou um anti-inflamatório e influenciar o hospedeiro de inúmeras outras maneiras.
[003] Lactobacillus reuteri é uma bactéria do ácido lático heterofermentativa e é frequentemente encontrada no trato gastrintestinal de humanos e outros animais. L. reuteri é considerada um organismo nativo do trato gastrintestinal de humano e está, por exemplo, presente na mucosa do corpo gástrico, antro gástrico, duodeno e íleo. Diferentes cepas de L. reuteri têm a capacidade de colonizar o intestino, agir como um agente terapêutico de diarreia, modular a motilidade de intestino, funcionar como um inibidor de patógenos bacterianos, modular imunologicamente a mucosa gastrintestinal, funcionar como um agente anti-inflamatório no estômago, etc.
[004] Um problema com administração oral de bactérias vivas são as quantidades e/ou atividade insuficientes das bactérias vivas em locais do trato intestinal onde elas afirmarão seus efeitos. Isso pode ter como uma consequência que a dosagem de bactérias vivas tem que ser aumentada e/ou administração mais frequente é necessária e pode também resultar em perda de atividade. Isso leva a custos desnecessários, frequência indesejável de ingestão e/ou benefícios para saúde reduzidos ou inexistentes.
[005] Em algumas aplicações específicas de bactérias vivas, é mais importante, após rápida administração, ter bactérias vivas ativas e metabolizantes para os efeitos para saúde desejados e, em algumas dessas aplicações, as quantidades de nutrientes no sujeito podem ter de ser deliberadamente restringidas por questão médica. Assim o problema a resolver é ativar rapidamente as bactérias vivas selecionadas a ser administradas em um sujeito, mas com mínima influência sobre os nutrientes dados ao sujeito. A invenção aqui se destina a solucionar este problema para certas bactérias.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[006] Um objetivo primário da presente invenção é prover um início intensificado de atividade de certas bactérias vivas em humanos, especialmente em recém-nascidos. O início intensificado da atividade é baseado na reconstituição e crescimento inicial melhorados (por exemplo, de forma mais pronta ou mais rápida) (por exemplo, crescimento ou taxa de crescimento melhorada) das bactérias vivas quando administradas ao dito recém-nascido sem alterar significativamente o teor de nutriente dado ao recém-nascido. Recém-nascidos incluem bebês prematuros a bebês nascidos no tempo certo.
[007] Na invenção aqui, para uma ativação rápida das bactérias vivas, por exemplo, no bebê prematuro, uma nova combinação de componentes de substrato para adicionar ao produto foi desenvolvida. Os inventores surpreendentemente observaram que a adição de sais de citrato, preferivelmente em combinação com uma fonte de carbono, tal como lactose, na mistura da formulação, reconstituição melhorada e crescimento inicial de L. reuteri DSM 17938 e bactérias similares. Cepas que podem usar citrato como um aceptor de elétron em seu metabolismo, com mínima influência sobre o teor de nutriente dado ao bebê, deve preferivelmente ser usado na invenção aqui.
[008] Mais especificamente, o objetivo da presente invenção é prover preparações compreendendo componentes de substrato, incluindo citrato e certas bactérias vivas, os componentes de substrato sendo especificamente projetados para melhorar a reconstituição, despertar e crescimento inicial das ditas bactérias vivas.
[009] A presente invenção é baseada na descoberta surpreendente de que a presença de citrato (exposição a citrato) no ponto de tempo quando certas bactérias são ativadas (isto é, quando elas transicionam de uma forma dormente para uma forma ativa e metabolizante) melhora sua ativação, por exemplo, em termos de reconstituição, despertar e/ou crescimento melhorados. Em outras palavras, a presença de citrato (exposição a citrato) fornece um “impulso” nas bactérias quando elas são ativadas.
[0010] Assim, a presente invenção fornece um método de ativar bactérias vivas, em particular bactérias do ácido lático, compreendendo expor as ditas bactérias a uma preparação compreendendo citrato, em que as ditas bactérias têm a capacidade de utilizar citrato como um aceptor de elétron externo. Em particular, a dita utilização de citrato resulta em uma taxa de crescimento melhorada. Assim, a presente invenção também fornece um método para ativar bactérias vivas, em particular bactérias do ácido lático, compreendendo expor as ditas bactérias a uma preparação compreendendo citrato, em que as ditas bactérias têm a capacidade de utilizar citrato para taxa de crescimento melhorada.
[0011] Além disso, a presente invenção fornece uma preparação compreendendo bactérias ativadas, em particular bactérias do ácido lático, preparadas, obtidas ou obteníveis pelos métodos da invenção.
[0012] Assim, a presente invenção também fornece uma preparação compreendendo: (i) uma bactéria viva, em particular uma bactéria do ácido lático, que tem a capacidade de utilizar citrato como um aceptor de elétron externo; e (ii) citrato.
[0013] Em modalidades preferidas, as bactérias na dita preparação são bactérias dormentes, por exemplo, as bactérias e a preparação são congeladas, liofilizadas ou secas com congelamento.
[0014] Ainda em um aspecto adicional a invenção provê usos terapêuticos de tais bactérias ativadas com citrato da invenção ou preparações da invenção como descrito aqui.
[0015] Assim, a presente invenção fornece bactérias ativadas, em particular bactérias do ácido lático, preparadas, obtidas ou obteníveis pelos métodos da invenção, para uso em terapia, por exemplo, no tratamento de um sujeito com uma condição que se beneficiará da administração de uma bactéria viva ativada mais rapidamente ou uma bactéria com uma taxa de crescimento melhorada. Desse modo, em algumas modalidades da invenção, as etapas do método para ativação são realizadas, após o que as bactérias ativadas são usadas na terapia.
[0016] A invenção fornece adicionalmente uma preparação compreendendo (i) uma bactéria viva, em particular bactérias do ácido lático, que têm a capacidade de utilizar citrato como um aceptor de elétron externo, e (ii) citrato, para uso em terapia, por exemplo, no tratamento de um sujeito com uma condição que se beneficiará da administração de uma bactéria viva ativada mais rapidamente ou uma bactéria com uma taxa de crescimento melhorada.
[0017] Visto de forma alternativa, a presente invenção fornece uma bactéria viva ativada com citrato, em particular bactérias do ácido lático, para uso em terapia, por exemplo, no tratamento de um sujeito com uma condição que se beneficiará da administração de uma bactéria viva ativada mais rapidamente ou uma bactéria com uma taxa de crescimento melhorada.
[0018] Em um aspecto adicional, a invenção também provê o uso de bactérias ativadas, em particular bactérias do ácido lático, preparadas, obtidas ou obteníveis pelos métodos da invenção na fabricação de um medicamento ou composição para o tratamento de um sujeito com uma condição que se beneficiará da administração de uma bactéria viva ativada mais rapidamente ou uma bactéria com uma taxa de crescimento melhorada.
[0019] A invenção provê adicionalmente o uso de uma preparação compreendendo (i) uma bactéria viva, em particular bactérias do ácido lático, que têm a capacidade de utilizar citrato como um aceptor de elétron externo, e (ii) citrato, na fabricação de um medicamento ou composição para o tratamento de um sujeito com uma condição que se beneficiará da administração de uma bactéria viva ativada mais rapidamente ou uma bactéria com uma taxa de crescimento melhorada.
[0020] Visto de forma alternativa, a presente invenção provê o uso de uma bactéria viva ativada com citrato, em particular bactérias do ácido lático, na fabricação de um medicamento ou composição para o tratamento de um sujeito com uma condição que se beneficiará da administração de uma bactéria viva ativada mais rapidamente ou uma bactéria com uma taxa de crescimento melhorada.
[0021] Aspectos adicionais da invenção fornecem um método para tratamento de um sujeito com uma condição que se beneficiará da administração de uma bactéria viva ativada mais rapidamente ou uma bactéria com uma taxa de crescimento melhorada, o dito método compreendendo administração de uma quantidade efetiva de bactérias ativadas, em particular bactérias do ácido lático, preparadas, obtidas ou obteníveis pelos métodos da invenção, no dito sujeito.
[0022] A invenção fornece adicionalmente um método para tratamento de um sujeito com uma condição que se beneficiará da administração de uma bactéria viva ativada mais rapidamente ou uma bactéria com uma taxa de crescimento melhorada, o dito método compreendendo administração de uma quantidade efetiva de uma preparação compreendendo (i) uma bactéria viva, em particular bactérias do ácido lático, que têm a capacidade de utilizar citrato como um aceptor de elétron externo, e (ii) citrato, no dito sujeito.
[0023] Visto de forma alternativa, a presente invenção fornece um método para tratamento de um sujeito com uma condição que se beneficiará da administração de uma bactéria viva ativada mais rapidamente ou uma bactéria com uma taxa de crescimento melhorada, o dito método compreendendo administração de uma quantidade efetiva de uma bactéria viva ativada com citrato, em particular bactérias do ácido lático, no dito paciente.
[0024] A administração das bactérias ou preparações bacterianas nos ditos métodos para tratamento e usos da invenção é realizada em quantidades farmacêutica ou fisiologicamente efetivas, aos sujeitos (mamíferos) que necessitam de tratamento. Desse modo, os ditos métodos e usos podem envolver a etapa adicional de identificar um sujeito que necessita de tratamento. Modalidades alternativas e preferidas e recursos da invenção como descrito em outra parte aqui se aplicam igualmente a esses métodos para tratamento e usos da invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0025] A Figura 1 é um gráfico que mostra o crescimento de Lactobacillus reuteri DSM 17938 em “substrato intestinal simulado”. Duas diferentes fontes de carboidratos foram testadas em combinação com três diferentes aceptores de elétron. As bactérias não cresceram muito apenas com carboidratos, mas, quando aceptores de elétron foram adicionados, o crescimento aumentou. Citrato como aceptor de elétron mostrou o efeito mais alto.
[0026] A Figura 2 mostra os resultados de eletroforese de gel identificando a cultura fermentadora como DSM 17938: 1. Marcador (GeneRuler 1kb Plus DNA ladder); 2. Amostra do fermentador 1 (66 ng/μL); 3. Amostra do fermentador 2 (6,6 ng/μL); 4. Controle positivo (suspensão bacteriana de DSM 17938); 5. Controle negativo (H2O); 6. Marcador
[0027] A Figura 3 mostra os resultados dos experimentos de turbidez, revelando que um meio de liofilização contendo citrato faz com que DSM 17938 atinja um aumento de OD de 3% mais rápido comparado com meio de liofilização sem citrato. * = diferença significante (teste t de Student, α = 0,05).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO E MODALIDADES PREFERIDAS DA MESMA
[0028] Para facilitar o entendimento da invenção, inúmeros termos são definidos a seguir.
[0029] “Neonatal”, ou “neonato” e “recém-nascido” são usados indiferentemente e se referem a uma criança recém-nascida e o período de tempo diretamente após o nascimento. Este termo inclui crianças nascidas pré-termo ou bebês prematuros a bebês nascidos no tempo certo, e o período de tempo diretamente após o nascimento.
[0030] “Criança” e “bebê” são usados indiferentemente e se referem a um bebê recém-nascido e seu primeiro ano de vida (até um ano ou até doze meses de idade).
[0031] “Pré-termo” e “prematuro” se referem a um nascimento que ocorreu antes de 37 semanas de gravidez (ou o ponto de tempo equivalente em mamíferos não humanos).
[0032] “Infecção” se refere a invasão de um micro-organismo que causa doença.
[0033] Uma “bactéria metabolizante” é viável significa que ela cresce e replica utilizando componentes de substrato adequados, por exemplo, resultando na produção de metabólitos, e significando que as bactérias podem ser usadas com propósitos específicos.
[0034] “Bactéria morta” significa uma bactéria não metabolizante que não replica e não pode se tornar viável.
[0035] “Bactérias dormentes” significam uma bactéria não metabolizante que não replica, mas está viva e pode ser ativada (ou reativadas) em uma bactéria metabolizante. Exemplos de tais bactérias dormentes são bactérias congeladas secadas por congelamento, ou liofilizadas (ou de outra forma secas, por exemplo, secas por pulverização). Por sua vez, uma “preparação dormente” significa uma preparação compreendendo bactérias dormentes, por exemplo, uma preparação congelada ou secada por congelamento, ou liofilizada (ou de outra forma seca, por exemplo, seca por pulverização).
[0036] “Bactérias vivas” significam bactérias metabolizantes ou bactérias dormentes que podem ser ativadas para metabolizar.
[0037] “Ativação” de bactérias significa o processo de mudar o estado de uma bactéria de ser dormente para o estado de bactérias metabolizantes.
[0038] A invenção aqui pode ser usada para fornecer um início intensificado de atividade de certas bactérias vivas, especialmente quando existem quantidades limitadas de nutrientes para as bactérias na localidade de administração. Isto é tudo feito sem alterar significativamente outro estado nutricional do hospedeiro.
[0039] Na presente invenção, as quantidades locais e/ou atividade metabólica, por exemplo, de L. reuteri selecionada são intensificadas levando, entre outras coisas, a que o potencial de redução da dosagem das bactérias vivas e adicionalmente que benefícios direcionados ao sítio para saúde são possíveis.
[0040] NEC (enterocolite necrosante) é uma condição médica basicamente vista em bebês prematuros. Ela é caracterizada por dano variável ao trato intestinal, variando de lesão mucosal a necrose e perfuração de espessura total, onde porções do intestino passam por necrose devido a infecção e inflamação no intestino. Ela ocorre depois do nascimento e é a segunda causa mais comum de mortalidade em bebês prematuros. Sintomas iniciais incluem intolerância a alimentação, residuais gástricos aumentados, distensão abdominal e fezes com sangue. Para essa doença imprevisível e devastadora não existe tratamento definitivo. Desse modo, estratégias de prevenção da NEC são vitais e urgentemente necessárias, mas até hoje nenhuma teve êxito ou foi no geral adotada como o padrão de cuidado, e profilaxia para NEC permanece uma necessidade médica verdadeiramente não atendida. O envolvimento de uma microbiota gastrintestinal anormal em NEC inclui descobertas de bacteriemia e endotoxemia em crianças com NEC e descobertas radiológicas de pneumatose intestinal, que provavelmente representa gás submucosal produzido por fermentação bacteriana.
[0041] Mostrou-se que crianças pré-termo em risco de receber ou desenvolver NEC, ou tendo NEC, se beneficiam de L. reuteri DSM 17938 em seu intestino para contrabalançar a infecção e inflamação massivas associadas com NEC. Este procedimento potencialmente salva vidas nas NICU’s (unidade de cuidado intensivo neonatal). O produto deve ser dado ao bebê por meio de um tubo nasogástrico ou orogástrico (NG/OG) diretamente no estômago.
[0042] Nos primeiros dias de vida de um bebê pré-termo em risco de desenvolver NEC, a provisão de nutrientes para manter o bebê vivo é normalmente dada através de dispensação parenteral, e normalmente não existem nutrientes inicialmente dados no intestino. O motivo para isso é que nutrientes iniciais dados através de alimentação enteral podem induzir NEC de maneira que a nutrição é, portanto, dada parenteralmente. Isso, por sua vez, significa que não existem nutrientes no intestino para suportar a ativação e crescimento das bactérias do ácido lático necessárias, particularmente nos primeiros dias de vida críticos e particularmente em bebês prematuros. Uma vez que o intestino é um ambiente vivo, pode haver alguns nutrientes limitados e açúcares disponíveis, mas não até o ponto de suportar uma ativação e crescimento inicial rápidos das bactérias naquelas condições.
[0043] A invenção aqui é para fornecer uma solução melhorada para o problema permitindo uma ativação rápida e seletiva das bactérias vivas do ácido lático ou quaisquer outras bactérias vivas adequadas já quando ela está sendo dispensada no intestino do bebê, por exemplo, na via no sistema de dispensação de alimentação por tubo, com mínima influência sobre os nutrientes dados ao bebê.
[0044] Normalmente, leite humano é a fonte de nutrição primária para bebês recém-nascidos saudáveis. Durante os primeiros dias de lactação, a mãe produz o que é chamado colostro, que é um fluido amarelado fino rico em proteínas e anticorpos para prover o bebê com um bom começo. Após alguns dias o fluido mudará gradualmente e se tornará leite maduro que contém proteína, gordura, carboidratos e minerais. Carboidratos consistem principalmente em lactose. No primeiro dia de lactação, as concentrações de citrato e lactose são normalmente como o exemplo a seguir: citrato 0,25 mM e lactose 76 mM, enquanto que no quinto dia de lactação as concentrações são como a seguir: citrato 5 mM e lactose 173 mM. Recalculado, isso dá uma razão entre citrato e lactose de 1:30 a 1:300.
[0045] Por vários motivos, alimentação no peito de um bebê recém- nascido pode não ser viável, por exemplo, mas não limitada ao nascimento pré-termo, dispensação complicada, problemas funcionais (por exemplo, a mãe não está produzindo nenhum leite ou leite insuficiente, bloqueio de leite dutos, mastite), enfermidade da mãe, etc. Em tais casos, o bebê precisa de nutrição de outras maneiras e normalmente fórmulas para criança são disponíveis e podem ser dadas às crianças para compensar a lactação. Em casos críticos, por exemplo, crianças pré-termo onde as crianças não tiveram o tempo para desenvolver adequadamente no útero e frequentemente mostram um intestino não desenvolvido, é fundamental estabelecer rapidamente um ambiente no intestino que diminua uma infecção e inflamação em andamento. Os bebês recém-nascidos pré-termos são sensíveis e necessitam de cuidado especial para poder adaptar a uma vida fora do útero.
[0046] Para recém-nascidos diagnosticados ou em risco de desenvolver NEC, o produto da invenção aqui, é frequentemente dado por meio de um tubo orogástrico ou nasogástrico (OG/NG) diretamente no estômago e nutrientes para manter o bebê vivo são normalmente dados através de dispensação parenteral, o que significa que normalmente não existem nutrientes inicialmente dados no intestino.
[0047] Na invenção aqui, para uma ativação rápida das bactérias vivas, por exemplo, no bebê prematuro, uma nova combinação de componentes de substrato para adicionar na preparação foi desenvolvida. Os inventores surpreendentemente observaram que a adição de sais de citrato, preferivelmente em combinação com uma fonte de carbono, tal como lactose, na reconstituição melhorada da mistura da formulação e crescimento inicial de L. reuteri DSM 17938.
[0048] Por esta invenção, citrato atua como um aceptor de elétron externo e libera o freio de NAD(P)H no metabolismo pelas bactérias específicas.
[0049] A este respeito, fermentação é um processo que libera energia de um açúcar e não exige oxigênio ou uma cadeia de transporte de elétron. Em vez disso, uma molécula orgânica é usada como aceptor de elétron, realizando a reoxidação de NAD(P)H produzida durante a glicólise. Mais frequentemente, esta molécula orgânica é piruvato, o produto final do caminho de Embden-Meyerhof (EMP), o tipo mais comum de glicólise.
[0050] Lactobacilos homofermentativo convertem carboidratos em lactato usando o EMP, enquanto que lactobacilos heterofermentativos (tal como L. reuteri) usam o caminho de fosfocetolase (PKP). O PKP tem um baixo rendimento energético, comparado com aquele do EMP, mas isso pode ser compensado pela adição de aceptores de elétron externos, que criam caminhos alternativos para reoxidação de NAD(P)H. Isso resulta em ganhar um ATP adicional, tornando o PKP tão eficiente quanto o EMP. Na presente invenção, citrato é usado como um aceptor de elétron externo e desse modo bactérias que têm a capacidade de utilizar citrato como um aceptor de elétron externo são selecionadas.
[0051] A fonte de carbono, tal como lactose, é especificamente efetiva para crescimento rápido das cepas adaptadas ao leite do peito de humano e que são aptas para usar citrato como um aceptor de elétron, tal como L. reuteri DSM 17938.
[0052] O efeito observado por L. reuteri DSM 17938 e citrato é específico da cepa e, por exemplo, outras cepas Lactobacillus reuteri tais como L. reuteri ATCC PTA-4659, L. reuteri ATCC PTA-6475 e L. reuteri ATCC PTA-5289 não são capazes de usar citrato como um aceptor de elétron e desse modo não são apropriadas para uso na presente invenção. Citrato e lactose estão presentes em leite humano e são uma das bases para crescimento de L. reuteri DSM 17938 em leite.
[0053] A invenção aqui se refere a adição de citrato em razão adequada com lactose, ou uma outra fonte de carbono adequada (por exemplo, outros açúcares tais como sacarose, frutose, glicose ou galacto- oligossacarídeos (GOS)), em um produto a ser dado a um sujeito que necessita de uma bactéria viva ativada rapidamente, tal como L. reuteri DSM 17938 com mínima influência sobre os nutrientes dados. Isto tornará a reconstituição e crescimento de L. reuteri DSM 17938 mais semelhantes àquelas condições vistas no intestino de criança alimentada no peito nos primeiros dias de vida.
[0054] A presente invenção visa resolver os problemas relacionados com a saúde associados com as condições, por exemplo, de NEC fornecendo certas cepas bacterianas do ácido lático vivas e anti-inflamatórias tal como L. reuteri DSM 17938, ou cepas com capacidade similar de utilizar citrato como um aceptor de elétron, com uma capacidade de reconstituição e crescimento inicial melhorada. O produto da invenção poderia também ser usado para recém-nascidos que têm dificuldades em alimentação oral e recebem nutrição intravenosa sem ser especificamente diagnosticados com NEC. A invenção pode adicionalmente ser usada em outros casos onde uma ativação rápida de bactérias específicas do ácido lático seria benéfica a partir de uma perspectiva de saúde.
[0055] A invenção concebe uma ativação rápida das bactérias vivas liofilizadas, por exemplo, no bebê prematuro por uma nova combinação de componentes de substrato para adicionar no produto final. A invenção adicionalmente abrange o uso de componentes de substrato que são selecionados e misturados em uma razão que especificamente serviria para suportar o início intensificado de atividade das bactérias específicas.
[0056] A presente invenção desse modo fornece um método para ativar bactérias vivas ou melhorar a ativação de bactérias vivas pela adição ou incorporação de citrato, ou de outra forma pela exposição das ditas bactérias a citrato (e, opcionalmente, outros componentes de substrato). Ativação de bactérias como descrito aqui pode tomar a forma de reconstituição melhorada de uma preparação bacteriana viva (por exemplo, quando uma formulação seca, ou de outra forma dormente, e/ou concentrada de bactérias dormentes é diluída e ativada para uso) que pode, por sua vez, manifestar por si mesmo como crescimento melhorado e/ou mais rápido das bactérias vivas, uma vez que a reconstituição tenha ocorrido, ou o início intensificado (aumentado) ou mais rápido de outras atividades bacterianas, por exemplo, metabolismo ou colonização.
[0057] Desse modo, os métodos para ativação da invenção, e a presença de citrato (exposição a citrato) nas formulações (por exemplo, nas formulações finais para administração ao sujeito), dão origem à ativação melhorada, por exemplo, a reconstituição melhorada ou mais rápida e/ou crescimento ou taxa de crescimento melhorado ou mais rápido de bactérias vivas, quando comparadas com formulações bacterianas que não têm citrato ou uma quantidade apropriada (isto é, uma quantidade de ativação) de citrato na formulação. Tal uso de citrato em formulações para ativar bactérias vivas de um estado dormente (por exemplo, quando tais bactérias são congeladas, liofilizadas, secadas por congelamento ou de outra forma secas), de acordo com o conhecimento dos inventores, não foi descrito antes e resulta em um processo melhorado par manusear tais bactérias, especialmente para certos tratamentos médicos como descrito em outra parte aqui.
[0058] Por exemplo, ativação rápida de bactérias vivas dormentes após (ou antes ou durante) administração de bactérias é importante em alguns sujeitos, por exemplo, em virtude de os sujeitos no geral não terem nutrientes em seu estômago ou intestino que podem ser usados para ativar eficientemente bactérias vivas dormentes, ou em virtude de os sujeitos poderem ter quantidades de nutrientes deliberadamente restritas por motivos médicos (por exemplo, crianças tendo ou em risco de ter NEC). Pode também ser importante administrar uma composição que tem a mínima de influência sobre nutrientes dados ao sujeito (por exemplo, em sujeitos onde nutrientes são deliberadamente restritos) ou administrar uma composição sem alterar significativamente outro estado nutricional do sujeito. Nas formulações, métodos e usos da invenção, existe nutrição suficiente na formulação para as bactérias iniciarem (por exemplo, pelo menos começar a ativar e crescer) de maneira que as bactérias não tenham de remover qualquer nutriente limitado que possa estar presente no intestino do sujeito, por exemplo, o bebê prematuro. Isto pode ser importante já que as quantidades e teor de nutrição dados, por exemplo, a um bebê que sofre ou em risco de sofrer de NEC têm de ser criteriosamente regulados e balanceados.
[0059] Consequentemente, em tais sujeitos, as bactérias necessitam ser ativadas rapidamente sem contar com nutrientes existentes no intestino do sujeito de maneira que o benefício terapêutico é obtido tão rápido quanto possível e antes de a saúde do hospedeiro deteriorar. Ativação rápida após (ou antes ou durante) administração é também importante em virtude de haver uma falta de nutrientes naturais no estômago do hospedeiro que permitirá que ativação ocorra no sujeito.
[0060] Os métodos da invenção fornecem uma solução para esse problema fornecendo um método para ativar bactérias vivas usando citrato como um componente de substrato adequado para as bactérias e preferivelmente também fornecer uma fonte de carbono apropriada para as bactérias tal como um açúcar (por exemplo, lactose).
[0061] Alternativamente, os métodos para ativação como descrito aqui podem ser vistos como a provisão de um método para mudar o estado de uma bactéria de dormente para o estado metabolizante (por exemplo, o estado de crescer e replicar e preferivelmente produzir metabólitos). Os métodos para ativação como descritos aqui podem também ser vistos como métodos para reconstituição ou crescimento de bactérias, por exemplo, métodos para melhorar a reconstituição e/ou crescimento ou taxa de crescimento de bactérias vivas dormentes.
[0062] Vantajosamente, tal ativação melhorada de bactérias de acordo com a presente invenção pode também resultar em uma redução das doses exigidas de bactérias, ou resultar em administração menos frequente de bactérias, ou resultar em atividade melhorada das bactérias uma vez administradas (e consequentemente benefícios terapêuticos e para saúde).
[0063] Diferentes cepas e tipos de bactérias têm diferentes capacidades. Bactérias ou micro-organismos vivos apropriados para uso na presente invenção são aqueles que têm a capacidade de utilizar citrato como um aceptor de elétron externo. A expressão “aceptor de elétron externo” no contexto de crescimento e metabolismo bacteriano é uma expressão da técnica. Por “externo”, por exemplo, entende-se que o aceptor de elétron (citrato) é derivado de uma fonte exógena para as bactérias e não é derivado de ou produzido pelas próprias bactérias.
[0064] Bactérias apropriadas podem também ter a capacidade de usar (ou consumir) citrato como um nutriente ou substrato para crescimento (ter a capacidade de crescer na presença de citrato), ou usar citrato como um aceptor de elétron externo em seu metabolismo (ter a capacidade de metabolizar citrato) ou ter a capacidade de usar citrato em uma reação de fermentação (seja fermentação de citrato).
[0065] Bactérias vivas preferidas são bactérias fermentativas tais como bactérias do ácido lático, por exemplo, Lactobacillus ou Bifidobacterium. Particularmente, bactérias vivas preferidas são lactobacilos heterofermentativos, por exemplo, que usam o caminho de fosfocetolase (PKP) para converter carboidratos, tal como Lactobacillus reuteri, em particular, a cepa Lactobacillus reuteri DSM 17938 ou aquelas com capacidade similar de utilizar citrato como um aceptor de elétron externo. A cepa Lactobacillus reuteri DSM 17938 foi depositada no DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig) em 30 de janeiro de 2006. Em algumas modalidades da invenção, a cepa Lactobacillus reuteri DSM 17938 não é usada.
[0066] Bactérias vivas preferidas para uso na presente invenção também serão capazes de ter um benefício para a saúde no hospedeiro ou sujeito no qual elas são administradas em quantidades adequadas. Desse modo, qualquer micro-organismo vivo que seria útil para tratar doenças ou condições ou teria qualquer benefício para a saúde em um sujeito, em particular uma criança ou recém-nascido, pode ser usado na presente invenção. Por exemplo, como descrito em outra parte aqui, uma vez que os métodos da presente invenção resultam em ativação melhorada das bactérias, por exemplo, na forma de reconstituição e crescimento mais rápidos, vantajosamente a invenção pode permitir que o benefício para a saúde das bactérias seja melhorado ou a presente invenção pode permitir que doses menores ou menos frequentes das bactérias selecionadas sejam usadas para obter os mesmos benefícios para saúde.
[0067] Desse modo, por exemplo, bactérias que têm uma atividade anti-inflamatória (bem como a capacidade de utilizar citrato como um aceptor de elétron externo) são preferidas em algumas modalidades. Lactobacillus reuteri DSM 17938 seria um exemplo como esse.
[0068] Como descrito em outra parte aqui, a presente invenção encontra uso particular no tratamento de certas doenças ou condições em um sujeito.
[0069] Doses apropriadas das bactérias para uso nas formulações, preparações, métodos e usos da invenção como descrito aqui pode ser escolhidas dependendo da doença ou condição a ser tratada, o modo de administração e a formulação envolvidos.
[0070] Desse modo, preferivelmente, a dita dosagem é uma dosagem terapeuticamente efetiva que é apropriada para o tipo de mamífero e condição que está sendo tratada e é apropriada para dar origem aos efeitos terapêuticos ou benefícios para saúde desejados. Por exemplo, doses diárias de 105 a 1010, por exemplo, 106 a 109, ou 106 a 108, ou 108 a 1010 CFUs totais de bactérias podem ser usados. Uma dose diária preferida é em torno de 109 ou 1010 CFUs totais, por exemplo, 109 a 1010 CFUs totais. Essas doses podem também ser iguais às doses exemplares por mL, onde preferivelmente uma dose de 1 mL é administrada.
[0071] A capacidade de uma cepa bacteriana de utilizar citrato como um aceptor de elétron externo (por exemplo, durante fermentação de açúcares) seria bem entendida pelos versados na técnica e poderia ser facilmente determinada usando técnicas padrões. Por exemplo, uma opção é testar para tal uma capacidade simplesmente adicionando citrato no meio de crescimento e se este resultar em um crescimento melhor ou taxa de crescimento maior ou mais melhorada das bactérias, então, pode-se concluir que a cepa bacteriana pode utilizar citrato como um aceptor de elétron. Alternativamente, a utilização de citrato pode ser avaliada medindo se citrato é consumido pelas bactérias, por exemplo, medindo se concentração de citrato no meio de crescimento é esgotada quando as bactérias crescem.
[0072] Uma outra opção seria classificar as cepas de bactérias quanto a presença de genes que codificam um ou mais (por exemplo, 2 ou mais, 3 ou mais, 4 ou mais, etc., ou todas) das enzimas envolvidas no metabolismo de citrato, por exemplo, na conversão de citrato em succinato (por exemplo, por meio de oxaloacetato, malato ou fumarato). Desse modo, as cepas podem ser classificadas quanto a presença de um ou mais (ou preferivelmente todas) das enzimas seguintes: EC:1.1.1.37: malato desidrogenase; EC:1.2.4.1; piruvato desidrogenase (acetil-transferase); EC:1.3.99.1: succinato desidrogenase; EC:1.8.1.4: di-hidrolipoil desidrogenase; EC:2.3.1.12: di-hidrolipoilisina- resíduo acetiltransferase; EC:4.1.3.6: citrato (pro-3S)-liase (3 subunidades representadas por 3 diferentes genes); EC:4.2.1.2: hidratos de fumarato. A presença da enzima citrato liase é particularmente importante. As cepas bacterianas podem também ser classificadas quanto a presença de uma enzima citrato permease.
[0073] O uso de bactérias que têm a capacidade de utilizar citrato como um aceptor de elétron externo significa que as formulações e preparações da presente invenção contêm fontes de citrato, por exemplo, íons de citrato, por exemplo, sais de citrato tal como citrato de sódio (por exemplo, di-hidrato do citrato de trissódio), ou outros sais metálicos de citrato ou ácido cítrico. Sais preferidos são aqueles que têm uma mínima influência sobre pH, por exemplo, aqueles que podem estar presentes em soluções tamponadas em torno de pH neutro, por exemplo, pH 6,0 a 7,5.
[0074] Os presentes inventores surpreendentemente mostraram que a presença de citrato nas formulações bacterianas, isto é, a exposição das bactérias a uma preparação ou formulação compreendendo citrato, resulta em ativação melhorada (por exemplo, mais rápida) das bactérias, em particular em termos de reconstituição melhorada das bactérias, por exemplo, a partir de uma preparação secada por congelamento, ou liofilizada ou de outra forma dormente, ou crescimento melhorado das bactérias, em comparação com formulações e preparações que não contêm citrato.
[0075] Desse modo, citrato deve ser na formulação final no momento de administração ao paciente (por exemplo, para agir como um excipiente) para ativação mais rápida comparado com se citrato não for incluído. Isto significa que um modo conveniente para praticar a invenção é adicionar citrato na preparação bacteriana molhada ou pasta fluida imediatamente antes de secagem por congelamento ou congelamento ou de outra forma tornando as bactérias dormentes (de maneira que elas ficam disponíveis quando as bactérias dormentes são ativadas). Um modo alternativo conveniente para praticar a invenção é adicionar citrato como um ingrediente seco na formulação de bactérias já secas (por exemplo, secadas por congelamento, ou liofilizadas) de maneira que citrato estejam novamente presentes na formulação final e disponíveis quando as bactérias dormentes são ativadas. Alternativamente, o citrato pode ser adicionado ou pode estar presente no meio ou outra solução usada para constituir a formulação final para administração ao paciente (por exemplo, usado para dissolver ou reconstituir ou ativar as bactérias congeladas, secadas por congelamento, ou liofilizadas ou de outra forma dormentes).
[0076] Uma concentração apropriada de citrato para obter a ativação, por exemplo, a ativação melhorada, das bactérias de acordo com a presente invenção pode ser estabelecida pelos versados na técnica por qualquer dos métodos apropriados, por exemplo, expondo as bactérias a íons de citrato em concentrações diferente e observando o efeito na reconstituição e/ou crescimento. Concentrações, por exemplo, que agem para estimular o crescimento melhorado (ou taxa de crescimento), preferivelmente crescimento significativamente melhorado (ou taxa de crescimento) de bactérias são apropriadas. Concentrações exemplares são 0,01 ou 0,05 mg/mL a 100 mg/mL, por exemplo, 0,05 ou 0,1 mg/mL a 1,0, 2,0, 3,0, 5,0, 10,0, 20,0, 30,0 ou 50,0 mg/mL, Concentrações alternativas podem ser 1,0, 2,0, 3,0, 5,0, 10,0, 20,0, 30,0 ou 50,0 mg/mL a 100 mg/mL. Uma concentração preferida pode ser 0,05 ou 0,1 mg/mL a 5,0 ou 3,0 ou 2,0 ou 1,0 ou 0,5 mg/mL, por exemplo, 0,2 a 2,7 mg/mL, por exemplo, 0,3 a 2,6 mg/mL. Esses valores podem também ser apropriados para mg/dose equivalentes dados ao sujeito.
[0077] Por exemplo, os presentes inventores mostraram que quando citrato está presente em uma formulação, por exemplo, em uma formulação bacteriana liofilizada ou secada por congelamento, então, na presença de citrato, as bactérias mostram crescimento mais rápido ou melhorado (taxa de crescimento), por exemplo, levam uma quantidade de tempo reduzida para obter uma certa densidade óptica (OD) quando comparadas com a ausência de citrato. Desse modo, concentrações preferidas de citrato (íons de citrato) são aquelas que podem dar origem a tais observações, por exemplo, um crescimento mais rápido ou melhorado, ou uma taxa de crescimento mais rápida ou melhorada na presença versus ausência de citrato. Em particular, concentrações de citrato preferidas são aqueles que podem dar origem a, ou resultar nas cepas bacterianas obtendo um certo OD ou porcentagem elevada na OD em um tempo mais curto, preferivelmente um tempo significativamente mais curto, do que quando citrato está ausente. Metodologia apropriada é mostrada nos Exemplos e Figura 3. Por exemplo, convenientemente pode-se medir o tempo que leva para as bactérias atingirem um aumento de 1%, 2%, 3%, 4% ou 5%, ou um maior que 1%, 2%, 3%, 4% ou 5%, na OD (por exemplo, um aumento de 3% ou um maior que 3% na OD), e observar as concentrações de citrato onde isto acontece mais rapidamente, preferivelmente de forma significativa mais rapidamente, com citrato presente versus ausente (isto é, na presença de citrato comparado com a ausência). Tais concentrações de citrato seriam apropriadas para uso. Qualquer medida apropriada de crescimento bacteriano ou taxa de crescimento ou números bacterianos podem ser usado. Por exemplo, qualquer técnica apropriada para medir OD pode ser usada, por exemplo, experimentos apropriados de turbidez como mostrado nos Exemplos.
[0078] A capacidade de as bactérias crescerem mais rapidamente ou mostrarem uma taxa de crescimento melhorada na presença de citrato é também um exemplo da ativação de bactérias de acordo com a presente invenção.
[0079] As bactérias vivas da invenção aqui podem ser liofilizadas, frescas, congeladas, secadas por congelamento, secas por pulverização ou similares e podem ser em qualquer produto formulado, incluindo em um óleo, ou solução aquosa, ou suspensão, ou emulsão ou similares ou uma outra formulação que é administrada ao recém-nascido de um modo enteral, por exemplo, em um sistema de dispensação de alimentação por tubo, por meio de uma via oral ou por meio de uma via retal.
[0080] De acordo com a presente invenção, citrato precisa estar presente na formulação final que é administrada aos pacientes.
[0081] Em modalidades preferidas da invenção, as bactérias a serem ativadas são secas ou de outra forma dormentes, preferivelmente congeladas, liofilizadas secadas por congelamento. Desse modo, em certas modalidades preferidas, os métodos da invenção adicionalmente compreendem uma etapa na qual as bactérias são liofilizadas secadas por congelamento ou de outra forma tornadas dormente (por exemplo, por congelamento) antes de a ativação ocorrer. Preferivelmente, citrato (e opcionalmente a fonte de carbono ou açúcar, por exemplo, lactose) está presente em tais formulações ou preparações de bactérias dormentes (em outras palavras, a bactéria é exposta ao dito citrato e opcionalmente à dita fonte de carbono).
[0082] Em modalidades particularmente preferidas, o citrato (e opcionalmente a fonte de carbono ou açúcar, por exemplo, lactose) está presente na formulação secada por congelamento ou de outra forma seca ou sólida de bactérias dormentes (por exemplo, o citrato está presente no meio de liofilização). Preferivelmente, o citrato é adicionado imediatamente antes da liofilização ou de outra forma tornando as bactérias dormentes, por exemplo, é adicionado, ou forma um componente do meio de liofilização ou meio de congelamento, por exemplo, em vez de ser usado no meio de crescimento usado para cultivar e expandir (crescer) a população de bactérias vivas nas etapas antes de ocorrer liofilização ou congelamento (em outras palavras, o citrato preferivelmente não é usado durante crescimento das bactérias).
[0083] Tais preparações de componentes secos (formulações secas) podem ser preparadas de qualquer modo apropriado. Por exemplo, os componentes individuais no produto final podem ser combinados entre si em uma formulação líquida e então liofilizados ou secos, ou os componentes secos individuais (ou liofilizados), incluindo as bactérias secas ou liofilizadas, podem ser misturados ou combinados entre si para formar a formulação seca. Ambos esses tipos de formulação seca podem então ser reconstituídos para formar um citrato apropriado e solução ou formulação final contendo bactérias vivas para administração aos pacientes.
[0084] Como estabelecido em outra parte aqui, citrato deve estar na formulação final no momento de administração ao paciente (por exemplo, para agir como um excipiente) para ativação mais rápida comparado com se citrato não estivesse incluído. Isto significa que um modo conveniente para praticar a invenção e expor as bactérias a citrato é adicionar citrato na preparação bacteriana molhada ou pasta fluida imediatamente antes de secagem por congelamento ou congelamento (de modo que ela fique disponível quando a bactéria dormente é ativada). Um modo alternativo conveniente para praticar a invenção é adicionar citrato como um ingrediente seco na formulação de bactérias já secas (por exemplo, secadas por congelamento, ou liofilizadas) de maneira que citrato esteja novamente presente na formulação final e disponível quando a bactéria dormente é ativada. Alternativamente, o citrato pode ser adicionado ou pode estar presente no meio (por exemplo, meio de crescimento) ou outra solução usada para constituir a formulação final para administração ao paciente (por exemplo, usada para dissolver ou reconstituir ou diluir o produto bacteriano congelado, seco ou liofilizado, ou de outra forma dormente).
[0085] Desse modo, em modalidades preferidas da invenção, o dito citrato está presente na preparação bacteriana congelada, liofilizada, secada por congelamento ou de outra forma dormente bem como na formulação final para administração ao sujeito.
[0086] Onde as bactérias vivas são liofilizadas ou congeladas, elas têm uma vantagem particular da invenção que a presença de citrato permite ativação melhorada das bactérias quando elas são reconstituídas a partir da forma seca ou dormente. Tal ativação melhorada pode tomar a forma de reconstituição ou crescimento mais rápido. Em outras palavras, a presença de citrato ajuda a dar partida ou melhora o despertar das bactérias do seu estado liofilizado (seco) ou de outra forma dormente
[0087] Desse modo, o conceito por trás da presente invenção é para citrato estar presente no ponto de tempo ou em torno dele quando as bactérias vão de um estado dormente (por exemplo, congeladas secadas por congelamento) a um estado ativo, significa que o citrato está na formulação final que é administrada ao paciente (por exemplo, como parte do meio ou tampão usado para reconstituir ou ressuspender as bactérias dormentes para administração, ou na preparação secada por congelamento ou congelada ou de outra forma dormente por si mesma, por exemplo, o citrato é adicionado imediatamente antes de liofilização ou congelamento das bactérias ocorrer).
[0088] Como descrito em outra parte aqui, isso é particularmente vantajoso em sujeitos que têm mínimos nutrientes no estômago ou intestino para de outra forma fornecer nutrientes para a ativação e crescimento das bactérias. Em algumas modalidades da invenção, parte do crescimento das bactérias pode já ter ocorrido antes de a formulação atingir o intestino do paciente, por exemplo, durante sua reconstituição e administração ao paciente.
[0089] Embora citrato seja um componente essencial (por exemplo, um excipiente) nas formulações do produto, composições e preparações da invenção (por exemplo, nas formulações a ser administradas no trato gastrintestinal dos pacientes), outros componentes ou excipientes são também preferivelmente fornecidos.
[0090] Por exemplo, a presença de uma ou mais fontes de carbono apropriadas, por exemplo, que as bactérias vivas podem usar como um substrato de crescimento, é um componente preferido. Fontes de carbono apropriadas podem facilmente ser determinadas dependendo da natureza das bactérias vivas nas formulações. Entretanto, fontes de carbono preferidas são carboidratos tais como açúcares. Lactose é um açúcar preferido para uso. Entretanto, qualquer outro açúcar apropriado pode ser usado (por exemplo, desde que ele suporte o crescimento das bactérias), por exemplo, sacarose, frutose, glicose ou galacto-oligossacarídeos (GOS).
[0091] Desse modo, em modalidades preferidas da invenção, a fonte de carbono ou açúcar, por exemplo, lactose (por exemplo, mono-hidrato de lactose) ou açúcar alternativo, é colocada em contato com as bactérias vivas junto com o citrato. Em outras palavras, as bactérias, citrato e uma fonte de carbono são parte da mesma composição ou formulação ou preparação.
[0092] Desse modo, preparações preferidas da invenção compreendem bactérias vivas como definidas em outra parte aqui, citrato e lactose (ou outro açúcar apropriado como descrito anteriormente, em particular GOS).
[0093] Outros componentes ou excipientes podem também estar presentes, por exemplo, componentes que são úteis para a estabilização ou outras propriedades da composição ou preparação, por exemplo, quaisquer crioprotetores ou estabilizadores apropriados. Exemplos incluem um ou mais componentes selecionados do grupo que consiste em: gelatina, glutamato de sódio, maltodextrina e ácido ascórbico. Manitol é um componente adicionalmente opcional.
[0094] Nas preparações da invenção, prefere-se que os componentes usados sejam em uma forma pura ou substancialmente pura adequada para administração farmacêutica a mamíferos, preferivelmente humanos. Desse modo, os componentes individuais são preferivelmente de grau farmacêutico que podem estar presentes em uma quantidade conhecida ou precisa, em vez de, por exemplo, estar presente ou adicionado como parte de uma mistura de quantidades desconhecidas ou quantidades complexas de componentes. Desse modo, embora as formulações da invenção possam ser administradas após mistura ou reconstituição em leite de peito (ou outros produtos a base de leite) que pode conter citrato e lactose entre muitas outras coisas, prefere-se que as formulações de produto para administração a pacientes contenham preparações apropriadamente puras de íons de citrato, por exemplo, na forma de sais de citrato, por exemplo, citrato de sódio como descrito em outra parte aqui, e lactose (por exemplo, mono-hidrato de lactose) ou outros açúcares. Desse modo, em modalidades preferidas da invenção, as formulações são reconstituídas (ou diluídas) em água ou são formulações aquosas e, por exemplo, não envolvem reconstituição em um produto a base de leite ou na presença dele, tal como leite de peito ou leite de fórmula. Desse modo, formulações preferidas da invenção não têm proteínas de leite. Vistas de forma alternativa, formulações preferidas da invenção contêm ou são expostas a citrato que não é fornecido por um produto a base de leite tal como leite de peito ou leite de fórmula.
[0095] As formulações também no geral contêm um tampão ou solução tampão para permitir que um pH apropriado seja retido.
[0096] Formulações preferidas da invenção (em particular, em termos de concentrações de lactose e citrato) são como descritas na Tabela B ou C. Outras formulações preferidas conteriam um citrato alternativo utilizando bactérias em Lactobacillus reuteri DSM 17938. Uma formulação preferida alternativa (em particular em termos de concentrações de lactose e citrato) é a formulação contendo citrato como descrita na Tabela 2. Novamente, embora uma bactéria preferida a ser usada com uma formulação como essa seja Lactobacillus reuteri DSM 17938, em modalidades alternativas outro citrato utilizando bactérias como definido aqui pode ser usado. A formulação da Tabela 2 é particularmente útil como um meio de liofilização (ou lioprotetor) para bactérias utilizando citrato, já que isso resulta em ativação melhorada (por exemplo, crescimento melhorado) das bactérias quando elas são reconstituídas a partir de sua forma liofilizada.
[0097] Como mencionado anteriormente, em modalidades preferidas da invenção, citrato e lactose estão ambos presentes nas preparações bacterianas. Esses componentes podem estar presentes em qualquer concentração ou razão apropriada. O citrato está presente a uma concentração na qual a ativação (ou ativação melhorada) das bactérias vivas ocorre como descrito em outra parte aqui. Lactose (ou outros açúcar) no geral está presente em uma quantidade de maneira que crescimento das bactérias vivas possa ser suportado. Em modalidades preferidas da invenção, a preparação compreende uma razão de citrato para lactose de 1:10 ou 1:50 a 1:100, 1:200, 1:300, 1:400, 1:500 ou 1:600, preferivelmente 1:40 ou 1:50 ou 1:60 a 1:100, 1:200, 1:300, 1:400, 1:500 ou 1:600; ou 1:30 a 1:100, 1:200, 1:300, 1:400, 1:500 ou 1:600, preferivelmente 1:60 a 1:600 ou 1:30 a 1:300 ou 1:50 a 1:70 ou 1:50 a 1:60.
[0098] Desse modo, um outro objetivo da invenção é fornecer uma combinação ideal de uma preparação compreendendo citrato e lactose (ou outro açúcar), em uma razão entre 1:10 a 1:600, pelo menos 1:60 a 1:600, preferivelmente em uma razão entre 1:30 a 1:300, ou pelo menos 1:30 a 1:300 (ou qualquer outra razão salientada aqui). Um exemplo da quantidade de citrato é 0,3 mg por dose de cerca de 1 x 1010 CFU de bactérias vivas e a quantidade de lactose é 16,6 mg para a mesma dose. Um outro exemplo da quantidade de citrato é 0,6 mg por dose de cerca de 1 x 109 CFU de bactérias vivas e a quantidade de lactose é 35,7 mg para a mesma dose. Um exemplo da quantidade de citrato é 1 mg por dose de cerca de 1 x 109 CFU de bactérias vivas. O citrato pode ser na faixa de 0,01 mg a 100 mg por dose (ou em outras concentrações como descrito aqui) e a quantidade de lactose, ou outro açúcar, pode ser calculada de acordo com as ditas razões anteriores.
[0099] Um outro objetivo da invenção é fornecer uma preparação compreendendo componentes de substrato e excipientes adequados, por exemplo, lactose, sacarose, frutose, glicose, GOS, 1,2 propanodiol, gelatina, glutamato de sódio, maltodextrina, manitol, ácido ascórbico, citrato, di- hidrato do citrato de trissódio e uma bactéria do ácido lático ou outras bactérias adequadas, os componentes de substrato sendo especificamente projetados para melhorar ainda mais a reconstituição e crescimento inicial das ditas bactérias a partir do estado liofilizado, fresco, congelado, seco com congelamento, seco por pulverização ou similares e em que as ditas bactérias vivas compreendem uma bactéria do ácido lático que pode utilizar citrato como um aceptor de elétron.
[00100] Um outro objetivo da invenção é fornecer uma preparação compreendendo, por exemplo, lactose, sacarose, frutose, glicose, GOS, 1,2 propanodiol, gelatina, glutamato de sódio, maltodextrina, manitol, ácido ascórbico, citrato, di-hidrato do citrato de trissódio e uma bactéria viva em que a dita bactéria viva é Lactobacillus reuteri DSM 17938.
[00101] Um outro objetivo da invenção é fornecer uma preparação compreendendo, por exemplo, mono-hidrato de lactose, gelatina hidrolisada, glutamato de monossódio, maltodextrina, ácido ascórbico, di-hidrato do citrato de trissódio e uma bactéria viva em que a dita bactéria viva é Lactobacillus reuteri DSM 17938. Concentrações preferidas são esboçadas nos Exemplos 2 e 3. Particularmente, concentrações preferidas de citrato têm tanto 0,3 mg/dose quanto 0,6 mg/dose, ou, por exemplo, uma faixa de 0,3 a 2,6 mg/dose. Concentrações preferidas de bactérias são 1x109 CFU ou 1x1010 CFU por dose, ou, por exemplo, uma faixa de 1x109 CFU a 1x1010 CFU por dose. 1x1010 CFU é particularmente preferida, opcionalmente em combinação com uma concentração de citrato de 0,3 mg/dose.
[00102] Um outro objetivo da invenção é fornecer uma combinação ideal de uma preparação compreendendo citrato e lactose, ou outro açúcar, em uma razão entre 1:10 a 1:600, pelo menos 1:60 a 1:600.
[00103] Como estabelecido em outra parte aqui, as bactérias ativadas com citrato preparadas, obtidas ou obteníveis pelos métodos da presente invenção ou as formulações ou preparações contendo citrato da presente invenção são úteis em terapia, em particular para uso no tratamento de um sujeito com uma condição que se beneficiará da administração de uma bactéria viva ativada mais rapidamente ou uma bactéria com uma taxa de crescimento melhorada. Desse modo, tais usos, e métodos para tratamento de pacientes que necessitam da mesma envolvendo tais usos, formam ainda modalidades adicionais da invenção.
[00104] Concentrações preferidas de citrato e outros recursos preferidos das preparações bacterianas a ser usadas em tais métodos e usos terapêuticos são estabelecidos em outra parte aqui. Em particular, é importante que citrato esteja presente na formulação final para administração no dito sujeito. Entretanto, além do mais, em algumas modalidades da invenção as bactérias ou as preparações bacterianas são congeladas, liofilizadas secadas por congelamento (ou as bactérias são de outra forma dormentes) em cujo caso prefere-se que o dito citrato esteja presente na preparação bacteriana congelada, liofilizada, secada por congelamento (ou dormente). É também uma modalidade preferida que as ditas preparações sejam reconstituídas em água antes de administração no dito sujeito.
[00105] Um sujeito preferido para os métodos e usos terapêuticos da presente invenção é um sujeito que não tem ou tem nutrientes limitados no seu intestino, ou é um sujeito no qual a quantidade de nutrientes no intestino foi deliberadamente restrita, por exemplo, por motivos médicos. Alternativamente, o dito sujeito é um sujeito que exige nutrição parenteral ou intravenosa (em outras palavras, exige nutrição adicional ou suplementar por outras vias, por exemplo, vias não orais, ou não está recebendo nutrientes diretamente no intestino). Esta situação é, por exemplo, muito comum em bebês prematuros ou em bebês que sofrem ou em risco de NEC. Tais sujeitos no geral não teriam nutrientes suficientes em seu intestino para suportar a ativação e crescimento de uma preparação de bactéria administrada no dito sujeito, em particular, no geral não seriam capazes de suportar a ativação e crescimento de uma preparação de bactéria administrada a um tal ponto que um benefício para a saúde conferido pelas bactérias seria observado.
[00106] Desse modo, pode-se observar que outros sujeitos preferidos seriam recém-nascidos, ou crianças até um ano de idade, ou um sujeito que nasceu prematuramente (isto é, é um nascimento prematuro ou pré-termo).
[00107] Outros sujeitos preferidos são sujeitos tendo NEC ou em risco de desenvolver NEC, uma condição que pode ser comum em bebês prematuros.
[00108] Outros sujeitos preferidos são sujeitos que são incapazes de alimentação no peito ou alimentação oral ou sujeitos onde alimentação no peito não é viável como descrito em outra parte aqui. Uma situação como essa pode surgir devido a problemas de saúde tanto com o bebê quanto com a mãe, por exemplo, mas não se limitando ao nascimento pré-termo, dispensação complicada, problemas funcionais (por exemplo, a mãe não está produzindo nenhum leite ou leite insuficiente, bloqueio de dutos de leite, mastite), enfermidade da mãe, etc., o resultado final sendo que o sujeito a ser tratado não é capaz de ingerir nutrientes suficientes através de alimentação no peito ou mesmo outra alimentação oral para sustentar a saúde, ou basicamente a vida.
[00109] O termo “paciente” ou “sujeito” como usado aqui inclui qualquer mamífero, por exemplo, humanos e qualquer animal de fazenda, doméstico ou de laboratório. Exemplos específicos incluem camundongos, ratos, porcos, gatos, cães, cabra, coelhos, vacas e macacos. Preferivelmente, entretanto, o paciente ou sujeito é um sujeito humano.
[00110] A administração das cepas bacterianas vivas nos ditos métodos para tratamento e usos terapêuticos da invenção é realizada em quantidades farmacêuticas ou fisiologicamente efetivas, aos sujeitos (mamíferos, preferivelmente humanos) que necessitam de tratamento. Desse modo, os ditos métodos e usos podem envolver a etapa adicional de identificar um sujeito que necessita de tratamento.
[00111] Como ficará clara a partir da descrição em outra parte aqui, os métodos e usos da presente invenção são adequados para prevenção de doenças ou condições, bem como para o tratamento de doenças ou condições, em particular, por exemplo, a prevenção de NEC. Desse modo, tratamento profilático é também englobado pela invenção. Por esse motivo, nos métodos e usos da presente invenção, tratamento também inclui profilaxia ou prevenção onde apropriado.
[00112] Tais aspectos preventivos (ou protetores) podem convenientemente ser realizados nos sujeitos em risco de desenvolver as doenças ou condições descritas aqui, por exemplo, NEC, e podem incluir tanto prevenção completa quanto prevenção significante. Prevenção significante pode incluir o cenário onde a severidade da doença ou sintomas da doença são reduzidos (por exemplo, reduzida de forma mensurável ou significante) comparada com a severidade ou sintomas que seriam esperados se não for dado nenhum tratamento.
[00113] Tal redução ou alívio de condições, doenças ou sintomas das mesmas (por exemplo, sintomas clínicos ou severidade) pode desse modo ser medida por qualquer ensaio apropriado, exemplos dos quais seriam bem conhecidos pelos versados na técnica. Preferivelmente, a redução ou alívio de condições, doenças ou sintomas é significante, por exemplo, clinicamente significante ou estatisticamente significante, preferivelmente com um valor de probabilidade de <0,05. Tal redução ou alívio de condições, doenças ou sintomas é no geral determinada comparada com um sujeito ou população de controle apropriado, por exemplo, um mamífero ou sujeito saudável (ou uma população dos mesmos) ou um mamífero ou sujeito não tratado ou tratado com placebo (ou uma população dos mesmos), ou, se apropriado, o mesmo sujeito particular antes de tratamento.
[00114] As modalidades preferidas da invenção se referem ao tratamento de pacientes com nutrientes limitados ou restritos no intestino e/ou ou que estão tendo dificuldade de comer ou alimentar, uma forma ou modo preferido de administração é direto no estômago do sujeito, por exemplo, por tubo na boca (orogástrico) ou nariz (nasogástrico), ou qualquer outra forma de dispensação enteral. Se o sujeito for capaz, então dispensação oral é também adequada Dispensação retal pode também ser usada.
[00115] As composições contendo citrato da invenção ou para uso na invenção podem ser formuladas ou reconstituídas com qualquer solução apropriada para administração ao sujeito, por exemplo, um humano. Por exemplo, a preparação pode ser reconstituída ou formulada com água (por exemplo, água destilada) ou outra solução aquosa, algum tipo de formulação que imita ou replica as condições no intestino, por exemplo, meio de substrato intestinal simulado (SIS), ou similar, por exemplo, como descrito nos Exemplos, leite de peito, leite de fórmula, ou qualquer outra solução adequada para administração entérica (por exemplo, administração como um produto de alimentação enteral) como descrita anteriormente.
[00116] Preferível e vantajosamente, água pode ser usada para reconstituir as formulações da invenção, em particular uma formulação contendo citrato e açúcar (por exemplo, lactose) como descrito aqui. A este respeito, a descoberta que os inventores fizeram de que a presença de citrato (e opcionalmente um açúcar apropriado tal como lactose) em formulações secas (por exemplo, secadas por congelamento, ou liofilizadas) de bactérias dormentes ou outras formulações de bactérias dormentes pode resultar em ativação melhorada das bactérias vivas quando reconstituídas significa que não existe necessidade de um meio de reconstituição mais complicado, menos estável e menos facilmente disponível, tal como uma formulação a base de leite (leite do peito ou de fórmula) ou outra formulação para administração entérica. Em outras palavras, a capacidade de usar água para reconstituir as formulações preferidas da invenção, usando o conhecimento que o citrato junto com lactose (ou outro açúcar apropriado) pode ativar as bactérias vivas mais rapidamente, vantajosamente fornece um meio de ativação “padronizada” usando água sem precisar contar com qualquer outra fonte de reagente.
[00117] Preferivelmente, qualquer das melhorias, intensificações ou aumentos descritos aqui (por exemplo, os efeitos positivos no crescimento, taxa de crescimento, reconstituição ou ativação e, certamente, quaisquer outros efeitos elevados como esses como mencionado em outra parte aqui) são aumentos mensuráveis, etc., (como apropriado), mais preferivelmente, eles são aumentos significantes, preferivelmente aumentos clinicamente significantes ou estatisticamente significantes, por exemplo, com um valor de probabilidade de <0,05, quando comparado com um nível ou valor ou amostra de controle apropriado. Por exemplo, para a avaliação dos efeitos de citrato, uma comparação apropriada é com uma amostra, preparação ou sujeito, etc., onde nenhum citrato está presente.
[00118] Preferivelmente, qualquer das reduções ou diminuições descritas aqui (por exemplo, os tempos reduzidos para atingir ODs apropriados ou a redução de doses ou doenças ou sintomas, e certamente quaisquer outros efeitos diminuídos como mencionado em outra parte aqui) são reduções mensuráveis, mais preferivelmente elas são reduções significantes, preferivelmente reduções clinicamente significantes ou estatisticamente significantes, por exemplo, com um valor de probabilidade de <0,05, quando comparado com um nível ou valor de controle ou amostra apropriados. Por exemplo, para a avaliação dos efeitos de citrato, uma comparação apropriada é com uma amostra, preparação ou sujeito, etc., onde nenhum citrato está presente.
[00119] A invenção será adicionalmente descrita com referência aos Exemplos não limitantes seguintes:
EXEMPLOS EXEMPLO 1
[00120] Crescimento de Lactobacillus reuteri em “substrato do intestino simulado”
Material e método
[00121] O crescimento de L. reuteri DSM 17938 em diferentes combinações de açúcar e aceptores de elétron foi avaliado em “Substrato intestinal simulado” (SIS).
Figure img0001
Figure img0002
Tabela A
[00122] As células de Lactobacillus reuteri da cepa DSM 17938 foram primeiro crescidas por toda a noite em caldo MRS (Oxóide) a 37°C. Após lavagem em salina tamponada com fosfato (PBS), as bactérias foram diluídas 10 x em PBS. 10 Dl de suspensão bacteriana foram em seguida inoculados a 10 mL de SIS (com adição de açúcar e aceptor de elétron), e as bactérias foram cultivadas por 16 h a 37°C em condições anaeróbicas e sem agitação.
Cultivo de L. REUTERI DSM 1738 em SIS com adição de lactose e citrate
[00123] O crescimento de Lactobacillus reuteri DSM 17938 em SIS com lactose e citrato como o par do aceptor de elétron e açúcar é avaliado da mesma maneira descrita anteriormente para GOS e citrato como o aceptor de elétron. O substrato descrito anteriormente (SIS) é usado. O Lactobacillus reuteri DSM 17938 cresceu tão eficientemente na combinação lactose-citrato quanto na GOS-citrato (dados não mostrados).
EXEMPLO 2
[00124] Formulação de um produto adequado a ser usada para alimentar por tubo um bebê prematuro em risco de desenvolver NEC, usando a invenção aqui.
[00125] O pó de IBP-9414 para suspensão oral é um pó liofilizado branco a branco gelo fornecido em um frasco de vidro claro que contém aproximadamente 1 x 109 CFU de L. reuteri DSM 17938 por dose e citrato e outros excipientes como na tabela a seguir. Ele é feito fresco, congelado, seco e congelado, seco por pulverização, etc. como conhecido na indústria. Formulação por dose
Figure img0003
Tabela B
EXEMPLO 3
[00126] Formulação de um produto adequado a ser usada na alimentação por tubo de um bebê prematuro em risco de desenvolver NEC, usando a invenção aqui.
[00127] O pó de IBP-9414 para suspensão oral é um pó liofilizado branco a branco gelo fornecido em um frasco de vidro claro que contém aproximadamente 1 x 1010 CFU de L. reuteri DSM 17938 por dose e citrato e outros excipientes como na tabela a seguir. Ele é feito fresco, congelado, seco e congelado, seco por pulverização etc. como conhecido na indústria. Formulação por dose
Figure img0004
Figure img0005
Tabela C
EXEMPLO 4
[00128] Adição de citrato no lioprotetor reduzido o tempo de ativação de Lactobacillus reuteri DSM 17938 liofilizada
Métodos Cultivo:
[00129] Um tubo falcon com 9 mL de meio de crescimento (vide Tabela 1) foi inoculado com Lactobacillus reuteri DSM 17938 de um estoque congelado. A pré-cultura foi incubada a 37°C por 16 horas. Isto foi seguido por uma segunda etapa de pré-cultura onde 5 mL da primeira pré- cultura foram adicionados a 45 mL de meio fresco. A segunda pré-cultura foi deixada atingir uma densidade óptica (600 nm) de >13 (~24 horas).
[00130] Um fermentador com a capacidade de 1,5 litro foi preparado e esterilizado por autoclave a 121°C por 20 minutos. Todos os componentes exceto glicose foram adicionados a 875 mL de dH2O e autoclavados com o fermentador. Uma solução de glicose foi produzida com os 125 mL restantes e autoclavada separadamente e, em seguida, adicionada ao fermentador. O fermentador foi ajustado a uma temperatura de 37°C e pH 5,5 (controlado por adição de NaOH) com uma agitação a 100 rpm. O fermentador funcionou naturalmente por toda a noite para determinar possíveis contaminações. Depois disso, 50 mL da segunda pré-cultura foram injetados e o fermentador funcionou por 15 horas, atingindo uma densidade óptica final de 14,3.
[00131] A cultura foi bombeada pelo fermentador para um frasco esterilizado (levou ~2,5 horas), dividida em duas partes, que foram centrifugadas a 3.200 rpm por 10 minutos. Os dois precipitados (13,4 e 15,2 g) foram lavados com tampão de glutamato de sódio (45,2 g de glutamato de sódio em 1,8 litro de dH2O, filtrados através de um filtro estéril de 0,2 μm) seguido por suspensão em quantidades iguais (13,4 e 15,2 mL) de tampão de glutamato de sódio. As suspensões bacterianas foram adicionalmente misturadas com um volume igual de tampão de liofilização com (C) ou sem (N) adição de citrato (vide Tabela 2). Tabela 1. Composição de meio de crescimento
Figure img0006
Tabela 2. Composição de meio de liofilização
Figure img0007
*O motivo para uma diferença em concentração de glutamato de sódio é ajustar o pH, concentração de sódio e concentração iônica.
Liofilização:
[00132] Antes de liofilização as suspensões bacterianas foram aliquotadas em volumes de 1 mL em frascos de secagem por congelamento de 5 mL com rolhas de borracha. O programa de liofilização seguinte foi corrido: Tabela 3. Programa de liofilização
Figure img0008
[00133] Após o término da segunda etapa de secagem, os frascos foram vedados sem vácuo na presença de gás de nitrogênio.
Quantificação:
[00134] Amostras para quantificação de bactérias foram tiradas da cultura antes da distribuição em duas partes. Para determinar a taxa de sobrevivência, esses resultados foram comparados posteriormente com análises de amostras liofilizadas.
Preparação do DNA de cultura fermentadora:
[00135] DNeasy® Blood & Tissue Handbook (cat. no. 69504) (de acordo com protocolo: Pretratamento para Bactérias Gram-Positivas, com ligeiras modificações)
[00136] Células da cultura fermentadora (1 mL) foram colhidas por centrifugação por 10 minutos a 5.000 x g (7.500 rpm). O sobrenadante foi descartado e o precipitado bacteriano foi ressuspenso em 180 μL de tampão de lise enzimático e incubado por 60 minutos a 37°C. Isto foi seguido por uma etapa de bater glóbulo usando 0,25 mL de glóbulos de zircônia/silica 0,1 mm (BioSpec: Cat. No. 11079101z) em um Micro tubo PP de 2 mL (Sarstedt: Order no. 72.694.006) a velocidade 5,0 para 3 x 45 s (FastPrep®-24 Instrument, MP Biomedicals). As amostras batidas de glóbulo foram incubadas por 30 minutos a 56°C. O resto das etapas foi realizado de acordo com o protocolo. PCR: Oligonucleotídeos iniciadores: DSM17f2 (TACGGGGAACGAGTTATTGC) e DSM17r2 (GGACGGCTTAACAAAACAGC); tamanho do produto 216 bp
[00137] DreamTaq Green PCR Mastermix (2X Thermo Scientific, número do artigo K1081) foi usado para as reações em PCR. Reações em PCR de acordo com isso: Mastermix com oligonucleotídeos iniciadores Volume por reação Água (qualidade da PCR) 3,0 μL Oligonucleotídeo iniciador, direto (10 pmol/μL) 1,0 μL Oligonucleotídeo iniciador, inverso (10 pmol/μL) 1,0 μL BSA (conc. final 0,1 μg/μL) 2,5 μL DreamTaq 12,5 μL
[00138] 20 μL de Mastermix foram misturados com 5 μL de amostra de DNA e o programa seguinte foi corrido: 98°C 5 minutos// 2x(95°C 30s, 68°C 30s, 72°C 20s) //2x(95°C 30s, 66°C 30s, 72°C 20s) //2x(95°C 30s, 64°C 30s, 72°C 20s) // 2x(95°C 30s, 62°C 30s, 72°C 20s) //35x(95°C 30s, 62°C 30s, 72°C 20s) //72°C 5 minutos //16°C.
Avaliação do tempo de ativação
[00139] O tempo de ativação em meio intestinal simulado (STMmod 3, vide Tabela 4) das duas variantes de DSM 17938 liofilizadas (C e N) foi analisado usando um incubador/leitor/agitador controlado por computador (BioScreen C MBR) que mede a mudança em turbidez com o tempo. O meio STMmod 3 foi usado para imitar as condições no intestino.
[00140] 200 μL de STMmod 3 foram adicionados a cada poço. Em seguida, diferentes volumes (100, 60, 40, 30, 25 μL) de suspensão bacteriana (frascos com bactérias liofilizadas suspensas em 1 mL de dH2O) foram adicionados. Volumes foram ajustados a 300 μL com dH2O. A análise de cada volume de inoculação foi feita em triplicata. A análise BioScreen foi corrida a 37°C por 24 horas com um intervalo de 15 minutos entre as medições (OD 600 nm), com a adição de uma etapa de agitação de 10 s antes de cada ponto de medição. Tabela 4. Composição de meio intestinal simulado (STMmod 3)
Figure img0009
Resultados PCR:
[00141] Uma PCR com os oligonucleotídeos iniciadores específicos de DSM 17938 foi corrida nas extrações de DNA na cultura fermentadora, para confirmar que as bactérias corretas foram cultivadas. Os resultados certamente mostram que DSM 17938 foi cultivada no fermentador (Figura 2).
Quantificação:
[00142] A taxa de sobrevivência de DSM 17938 após a liofilização foi determinada em aproximadamente 13% para as bactérias liofilizadas com citrato (C) e 12% para as bactérias liofilizadas sem citrato (N) (vide Tabela 5). Tabela 5. Quantificação, taxa de sobrevivência e densidade óptica de fermentador e culturas secadas por congelamento de DSM 17938.
Figure img0010
Avaliação do tempo de ativação:
[00143] Os resultados do experimento de turbidez revelaram que culturas secadas por congelamento de DSM 17938 atingiram um aumento de 3 % na OD em tempo mais curto quando o lioprotetor conteve citrato (vide Figura 3). Resumidamente: os resultados revelam que a adição de citrato (usado por L. reuteri como um aceptor de elétron) na formulação do produto diminui o tempo de ativação de Lactobacillus reuteri DSM 17938 em meio intestinal simulado.

Claims (7)

1. Preparação, caracterizada pelo fato de que compreende (i) uma bactéria viva de LACTOBACILLUS REUTERI que tem a capacidade de utilizar citrato como um aceptor de elétron externo, e (ii) citrato, para uso no tratamento terapêutico de um sujeito com uma condição que se beneficiará da administração de uma bactéria viva de LACTOBACILLUS REUTERI ativada mais rapidamente após dormência ou uma bactéria com uma taxa de crescimento melhorada após dormência; em que as bactérias na preparação são congeladas, liofilizadas ou secadas por congelamento, em que dita preparação congelada, liofilizada ou secada por congelamento é reconstituída em um solução aquosa apropriada para administração ao sujeito antes da administração ao dito sujeito; em que dito sujeito é um sujeito humano e é um recém- nascido, ou uma criança de até um ano de idade, ou é um sujeito que nasceu prematuramente; em que dita condição é uma condição na qual o récem-nascido, criança ou sujeito prematuro tem dificuldade de alimentação oral, é incapaz de amamentação no peito ou alimentação oral, ou requer nutrição parenteral ou intravenosa, ou na qual a quantidade de nutrientes no intestino foi deliberadamente restrita por motivos médicos; em que dito uso não altera significativamente o estado nutricional do recém-nascido, criança ou sujeito prematuro em que o referido citrato está presente em uma concentração de 0,01 mg/ml a 10,0 mg/ml, de preferência de 0,01 mg/ml a 5,0 mg/ml ou 0,01 mg/ml a 2,0 mg/ml, e em que a L. REUTERI viva reconstituída na presença de citrato tem uma taxa de ativação mais rápida após a dormência em comparação com a taxa de ativação após a dormência para a mesma L. REUTERI que é reconstituída na ausência de citrato e a taxa de ativação mais rápida é um aumento mais rápido em crescimento no mesmo período de tempo.
2. Preparação para uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o citrato está presente na dita preparação congelada, liofilizada ou secada por congelamento, e/ou em que dito citrato está presente na formulação final para administração ao dito sujeito.
3. Preparação para uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a bactéria é exposta a um açúcar ou a preparação ainda compreende açúcar, preferivelmente em que dito açúcar é lactose.
4. Preparação para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que dito citrato e, opcionalmente, dito açúcar estão presentes em uma preparação de bactérias dormentes que são então ativadas.
5. Preparação para uso de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que a preparação compreende uma razão de citrato para lactose de 1:10 a 1:600, preferivelmente 1:60 a 1:600 ou 1:30 a 1:300.
6. Preparação para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que dita Lactobacillus reuteri é LACTOBACILLUS REUTERI DSM 17938.
7. Preparação para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que dito sujeito é um sujeito tendo enterocolite necrosante (NEC) ou está em risco de desenvolver NEC.
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