ES2952585T3 - Preparado de lactobacillus reuteri y citrato para uso médico - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a métodos para activar bacterias vivas de ácido láctico que comprenden exponer dichas bacterias a una preparación que comprende citrato, en donde dichas bacterias tienen la capacidad de utilizar citrato como aceptor externo de electrones. La presente invención se refiere además a métodos para mejorar la actividad de ciertas bacterias vivas en mamíferos. Más específicamente, la invención se refiere a mejorar la reactivación de ciertas bacterias del ácido láctico desde el estado liofilizado. La presente invención también se refiere a preparaciones que comprenden dichas bacterias activadas y usos terapéuticos de dichas bacterias activadas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Preparado de lactobacillus reuteri y citrato para uso médico
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a potenciar el inicio de la actividad de determinadas bacterias Lactobacillus reuteri vivas en mamíferos. Además, esta invención se refiere a preparaciones terapéuticas que comprenden citrato y determinadas bacterias Lactobacillus reuteri vivas, para mejorar la reconstitución y el crecimiento temprano de dichas bacterias.
Antecedentes de la invención
Las composiciones de leche que se usan para fines nutricionales y contienen bacterias vivas son conocidas en la técnica. Por ejemplo, el documento US 2012/0171166 describe composiciones nutricionales que incluyen oligosacáridos y probióticos de la leche humana. El documento US 2003/0017192 también describe composiciones lácteas que contienen probióticos, en particular bifidobacterias. El documento CN 104206539 describen una leche en polvo para lactantes que contiene probióticos, Lactobacillus reuteri DSM17938 y Bifidobacterium animalis Bb~12.
La eficacia de la terapéutica con bacterias vivas depende de la finalidad y de la cepa, y las distintas cepas pueden contribuir a la salud del huésped a través de mecanismos diferentes. Diferentes bacterias vivas pueden impedir o inhibir la proliferación de patógenos, suprimir la producción de factores de virulencia por parte de los patógenos, modular la respuesta inmunitaria de manera proinflamatoria o antiinflamatoria e influir en el huésped de otras muchas maneras.
Lactobacillus reuteri es una bacteria de ácido láctico heterofermentativa y se encuentra con frecuencia en el tracto gastrointestinal de seres humanos y otros animales. L. reuteri se considera un organismo endógeno del tracto gastrointestinal humano y está presente, por ejemplo, en la mucosa del cuerpo gástrico, el antro gástrico, el duodeno y el íleon. Diferentes cepas de L. reuteri tienen la capacidad de colonizar el intestino, actuar como un agente terapéutico de diarrea, modular la motilidad intestinal, funcionar como un inhibidor de patógenos bacterianos, modular inmunológicamente la mucosa gastrointestinal, funcionar como un agente antiinflamatorio en el estómago, etc.
Un problema con la administración oral de bacterias vivas es la cantidad insuficiente y/o la actividad de las bacterias vivas en lugares del tracto intestinal donde ejercerán sus efectos. Esto puede tener como consecuencia que haya que aumentar la dosis de bacterias vivas y/o que sea necesaria una administración más frecuente, y también podría provocar una pérdida de actividad. Esto conlleva costes innecesarios, una frecuencia de consumo no deseada y/o una disminución o inexistencia de beneficios para la salud.
En algunas aplicaciones específicas de las bacterias vivas es más importante tener rápidamente después de la administración bacterias vivas activas y metabolizadoras para los efectos deseados sobre la salud, y en algunas de esas aplicaciones las cantidades de nutrientes en el individuo pueden tener que ser deliberadamente restringidas por motivos médicos. Por lo tanto, el problema que hay que resolver es activar rápidamente las bacterias vivas seleccionadas para administrárselas a un individuo, pero con una influencia mínima en los nutrientes que se le administran. La invención en el presente documento pretende resolver este problema para determinadas bacterias.
Resumen de la invención
Un objeto principal de la presente invención es proporcionar un inicio de actividad mejorado de determinadas bacterias L. reuteri vivas en humanos, especialmente en neonatos. El inicio mejorado de la actividad se basa en la reconstitución mejorada (por ejemplo, más rápida o más veloz) y el crecimiento temprano (por ejemplo, crecimiento mejorado o tasa de crecimiento) de las bacterias vivas cuando se administran a dicho neonato sin alterar significativamente el contenido de nutrientes administrado al neonato. Los neonatos abarcan desde los nacidos prematuramente hasta los nacidos a término.
En la invención en el presente documento, para una rápida activación de la bacteria L. reuteri viva en, por ejemplo, el lactante prematuro, se ha desarrollado una nueva combinación de componentes de sustrato para añadir al producto. Los inventores encontraron sorprendentemente que la adición de sales de citrato, preferiblemente en combinación con una fuente de carbono, tal como lactosa, a la mezcla de formulación, mejoró la reconstitución y el crecimiento temprano de L. reuteri DSM 17938 y bacterias similares. Las cepas que pueden usar citrato como un aceptor de electrones en su metabolismo, con una influencia mínima en el contenido de nutrientes dado al bebé, deben usarse en la invención en el presente documento.
Más específicamente, el objeto de la presente invención es proporcionar preparaciones para su uso en tratamientos terapéuticos tal como se describe en el presente documento que comprende componentes de sustrato, incluyendo citrato y determinadas bacterias L. reuteri vivas, estando los componentes del sustrato específicamente diseñados para mejorar la reconstitución, la activación y el crecimiento temprano de dichas bacterias L. reuteri vivas.
La presente invención se basa en el sorprendente hallazgo de que la presencia de citrato (exposición al citrato) en el momento en que se activan determinadas bacterias L. reuteri (es decir, cuando pasan de una forma latente a una forma activa y metabolizadora) mejora su activación, por ejemplo en términos de mejora de la reconstitución, el despertar y/o el crecimiento. En otras palabras, la presencia de citrato (exposición al citrato) proporciona un “ impulso” a las bacterias cuando se activan.
Así, la presente invención utiliza un método de activación de bacterias L. reuterivivas, que comprende la exposición de dichas bacterias a una preparación que comprende citrato, en el que dichas bacterias tienen la capacidad de utilizar citrato como aceptor externo de electrones. En particular, dicha utilización de citrato da como resultado una tasa de crecimiento mejorada. Así, la presente invención utiliza un método de activación de bacterias L. reuteri vivas, que comprende la exposición de dichas bacterias a una preparación que comprende citrato, en el que dichas bacterias tienen la capacidad de utilizar citrato para una tasa de crecimiento mejorada.
La invención proporciona los usos terapéuticos de tales bacterias o preparaciones activadas por citrato tal como se describe en el presente documento.
Las realizaciones de la presente invención se definen en las reivindicaciones. En particular, la presente invención se refiere a una preparación que comprende (i) una bacteria Lactobacillus reuteri viva que tiene la capacidad de utilizar citrato como aceptor externo de electrones, y (ii) citrato, para su uso en el tratamiento terapéutico de un sujeto con una afección que se beneficiará de la administración de una bacteria Lactobacillus reuteri viva activada más rápidamente o de una bacteria Lactobacillus reuteri con una tasa de crecimiento mejorada;
en donde las bacterias en la preparación se congelan, se liofilizan o se secan por congelación, en donde dicha preparación congelada, liofilizada o secada por congelación se reconstituye en una solución acuosa apropiada para la administración al sujeto antes de la administración a dicho sujeto;
en donde dicho sujeto es un sujeto humano y es un neonato, o un bebé de hasta un año de edad, o es un sujeto que ha nacido prematuramente;
en el que dicha afección es una afección en la que el neonato, lactante o sujeto prematuro tiene dificultades para alimentarse por vía oral, es incapaz de amamantarse o alimentarse por vía oral, o requiere nutrición parenteral o intravenosa, o en la que la cantidad de nutrientes en el intestino se ha restringido deliberadamente por motivos médicos; y
en donde dicho uso no altera significativamente el estado nutricional del neonato, lactante o sujeto prematuro.
En realizaciones preferidas, dicho citrato está presente en dicha preparación congelada, liofilizada o secada por congelación, y/o dicho citrato está presente en la formulación final para su administración a dicho sujeto.
La administración de las bacterias o preparaciones bacterianas en dichos usos terapéuticos de la invención se realiza en cantidades farmacéutica o fisiológicamente eficaces, a sujetos (humanos) que necesitan tratamiento. Por lo tanto, dichos usos terapéuticos pueden implicar la etapa adicional de identificar a un sujeto que necesite tratamiento. Las realizaciones y características alternativas y preferidas de la invención que se describen en otras partes del presente documento se aplican igualmente a estos usos terapéuticos de la invención.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 es un gráfico que muestra el crecimiento de Lactobacillus reuteri DSM 17938 en “sustrato intestinal simulado” . Se probaron dos fuentes diferentes de carbohidratos en combinación con tres aceptores de electrones diferentes. Las bacterias no crecieron mucho sólo con carbohidratos pero cuando se añadieron aceptores de electrones, el crecimiento aumentó. El citrato como aceptor de electrones mostró el mayor efecto.
La figura 2 muestra los resultados de la electroforesis en gel que identifican el cultivo fermentador como DSM 17938: 1. Marcador (marcador de tamaño molecular GeneRuler 1 kb Plus DNA); 2. Muestra de fermentador 1 (66 ng/μl); 3. Muestra de fermentador 2 (6,6 ng/μl); 4. Control positivo (suspensión bacteriana de DSM 17938); 5. Control negativo (H2O); 6. Marcador
La figura 3 muestra los resultados de los experimentos de turbidez, revelando que un medio de liofilización que contiene citrato hace que DSM 17938 alcance un aumento de DO del 3 % más rápido en comparación con el medio de liofilización sin citrato. * = diferencia significativa (prueba de la t de Student, a = 0,05).
Descripción detallada de la invención
Realizaciones preferidas de la misma
Para facilitar la comprensión de la invención, a continuación se definen una serie de términos.
“ Neonatal o “ neonato” y “ recién nacido” se utilizan indistintamente y se refieren a un niño recién nacido y al periodo de tiempo inmediatamente posterior al nacimiento. Este término incluye desde los recién nacidos pretérmino o prematuros hasta los nacidos a término, así como el periodo de tiempo inmediatamente posterior al nacimiento.
“ Lactante” y “ bebé” se utilizan indistintamente y se refieren a un recién nacido y a su primer año de vida (hasta un año o hasta doce meses).
“ Pretérmino” y “prematuro” se refieren a un nacimiento que tiene lugar antes de la semana 37 de gestación (o el punto temporal equivalente en mamíferos no humanos).
“ Infección” se refiere a la invasión de un microorganismo causante de la enfermedad.
Una “ bacteria metabolizadora” es viable, lo que significa que crece y se replica utilizando componentes de sustrato adecuados, por ejemplo, lo que da lugar a la producción de metabolitos y significa que la bacteria puede utilizarse para fines específicos.
“Bacterias muertas” significa una bacteria no metabolizante que no se replica y no puede hacerse viable.
“ Bacteria latente” , una bacteria no metabolizante que no se replica pero que está viva y puede activarse (o reactivarse) para convertirse en una bacteria metabolizante. Ejemplos de tales bacterias latentes son las bacterias congeladas, liofilizadas o secadas por congelación (o secadas de otro modo, por ejemplo, por pulverización). A su vez, por “preparación latente” se entiende una preparación que comprende bacterias latentes, por ejemplo una preparación congelada o liofilizada o secada por congelación (o secada de otro modo, por ejemplo por pulverización).
“ Bacterias vivas” significa bacterias metabolizadoras o bacterias latentes que pueden activarse para metabolizar.
“Activación” de bacterias significa que el proceso de cambiar el estado de una bacteria de latente al estado de bacteria metabolizadora.
La presente invención puede utilizarse para mejorar el inicio de la actividad de determinadas bacterias L. reuteri vivas, especialmente cuando existen cantidades limitadas de nutrientes para las bacterias en el lugar de administración. Esto se realiza sin alterar significativamente otro estado nutricional del huésped.
En la presente invención se potencian las cantidades locales y/o la actividad metabólica de L. reuteri seleccionada, lo que permite, entre otras cosas, reducir la dosis de bacterias vivas y, además, obtener beneficios para la salud dirigidos al lugar.
NEC (enterocolitis necrotizante) es una afección médica observada principalmente en bebés prematuros. Se caracteriza por daño variable al tracto intestinal, que varía de lesión de la mucosa a necrosis y perforación de grosor completo donde partes del intestino experimentan necrosis debido a infección e inflamación en el intestino. Se produce postnatalmente y es la segunda causa más común de mortalidad en niños prematuros. Los síntomas iniciales incluyen intolerancia a la alimentación, residuos gástricos aumentados, distensión abdominal y heces de sangre. Para esta enfermedad impredecible y devastadora no hay tratamiento definitivo. Así pues, las estrategias de prevención de la NEC son vitales y se necesitan con urgencia, pero hasta la fecha ninguna ha tenido éxito ni se ha adoptado de forma generalizada como norma asistencial, y la profilaxis de la NEC sigue siendo una verdadera necesidad médica no cubierta. La implicación de una microbiota gastrointestinal anormal en la NEC incluye hallazgos de bacteriemia y endotoxemia en lactantes con NEC y hallazgos radiológicos de neumatosis intestinal, que probablemente representa gas submucoso producido por fermentación bacteriana.
Se ha demostrado que los lactantes prematuros con riesgo de recibir o desarrollar NEC, o que la padecen, se benefician de la presencia de L. reuteri DSM 17938 en su intestino para contrarrestar la infección masiva y la inflamación asociadas a la NEC. Este procedimiento ahorra potencialmente vidas en las UCI neonatales (unidades de cuidados intensivos neonatales). El producto debe administrarse al bebé a través de una sonda nasogástrica u orogástrica (NG/OG) directamente en el estómago.
En los primeros días de vida de un bebé prematuro con riesgo de desarrollar NEC, el suministro de nutrientes para mantenerlo con vida se realiza normalmente por vía parenteral, y normalmente no se administran inicialmente nutrientes al intestino. Esto se debe a que los nutrientes administrados de forma precoz a través de la alimentación enteral pueden inducir una NEC, por lo que la nutrición se administra por vía parenteral. A su vez, esto significa que no hay nutrientes en el intestino que favorezcan la activación y el crecimiento de las bacterias lácticas necesarias, sobre todo en los críticos primeros días de vida y especialmente en los bebés prematuros. Dado que el intestino es un medio vivo, puede haber algunos nutrientes y azúcares limitados disponibles, pero no en la medida necesaria para favorecer una activación rápida y un crecimiento precoz de las bacterias en esas condiciones.
La invención en el presente documento tiene por objeto proporcionar una solución mejorada al problema, permitiendo una activación rápida y selectiva de las bacterias vivas del ácido láctico o de cualquier otra bacteria viva adecuada ya cuando se está suministrando al intestino del bebé, por ejemplo, en ruta en el sistema de suministro de alimentación por sonda, con una influencia mínima en los nutrientes suministrados al bebé.
Normalmente, la leche humana es la principal fuente de nutrición de los recién nacidos sanos. Durante los primeros días de lactancia, la madre produce lo que se llama calostro, que es un líquido amarillento y fino rico en proteínas y anticuerpos para proporcionar al bebé un buen comienzo. Al cabo de unos días, el fluido cambiará gradualmente y se convertirá en leche madura que contiene proteínas, grasas, carbohidratos y minerales. Los carbohidratos consisten principalmente en lactosa. En el primer día de lactancia, las concentraciones de citrato y lactosa son normalmente las siguientes: citrato 0,25 mM y lactosa 76 mM, mientras que en el quinto día de lactancia las concentraciones son las siguientes: citrato 5 mM y lactosa 173 mM. Recalculada, esto da una razón entre citrato y lactosa de 1:30 a 1:300.
La lactancia de un recién nacido puede no ser posible por diversos motivos, como por ejemplo, aunque no exclusivamente, un parto prematuro, un parto complicado, problemas funcionales (por ejemplo, la madre no produce leche o produce una cantidad insuficiente, obstrucción de los conductos lácteos, mastitis), enfermedad de la madre, etc. En estos casos, el bebé necesita alimentarse por otras vías y normalmente se dispone de fórmulas infantiles que pueden administrarse a los bebés para compensar la lactancia. En situaciones críticas, por ejemplo en el caso de los recién nacidos prematuros, que no han tenido tiempo de desarrollarse adecuadamente en el útero y suelen presentar un intestino poco desarrollado, es fundamental establecer rápidamente un entorno en el intestino que frene una infección e inflamación en curso. Los recién nacidos prematuros son sensibles y necesitan cuidados especiales para poder adaptarse a una vida fuera del útero.
Para los neonatos diagnosticados o en riesgo de desarrollar ECN, el producto para uso de la invención en este documento, a menudo se administra a través de una sonda orogástrica o nasogástrica (OG/NG) directamente en el estómago y los nutrientes para mantener al bebé con vida se dan normalmente a través de la administración parenteral, lo que significa que normalmente no hay nutrientes dados inicialmente al intestino.
En la invención en el presente documento, para una rápida activación de las bacterias vivas en, por ejemplo, el lactante prematuro, se ha desarrollado una nueva combinación de componentes de sustrato para añadir a la preparación. Los inventores encontraron sorprendentemente que la adición de sales de citrato, preferiblemente en combinación con una fuente de carbono, tal como lactosa, a la mezcla de formulación, mejoró la reconstitución y el crecimiento temprano de L. reuteri DSM 17938.
Mediante esta invención, el citrato actúa como aceptor externo de electrones y libera el freno NAD(P)H en el metabolismo por las bacterias específicas.
En este sentido, la fermentación es un proceso que libera energía a partir de un azúcar y no requiere oxígeno ni una cadena de transporte de electrones. En su lugar se utiliza una molécula orgánica como aceptor de electrones, llevando a cabo la reoxidación del NAD(P)H producido durante la glucólisis. Lo más frecuente es que esta molécula orgánica sea piruvato, el producto final de la vía de Embden-Meyerhof (EMP), el tipo más común de glucólisis.
Los lactobacilos homofermentativos convierten los carbohidratos en lactato utilizando EPM, mientras que los lactobacilos heterofermentativos (tales como L. reuteri) utilizan la vía de la fosfocetolasa (PKP). La PKP tiene un rendimiento energético pobre comparado con el de EMP, pero esto puede compensarse mediante la adición de aceptores de electrones externos, que crean vías alternativas para la reoxidación del NAD(P)H. De este modo se gana un ATP adicional, lo que hace que la PKP sea tan eficaz como EMP. En la presente invención, el citrato se utiliza como aceptor externo de electrones y, por lo tanto, se seleccionan las bacterias L. reuteri que tienen la capacidad de utilizar el citrato como aceptor externo de electrones.
La fuente de carbono, como la lactosa, es específicamente eficaz para el crecimiento rápido de las cepas adaptadas a la leche materna humana y que son capaces de utilizar el citrato como aceptor de electrones, como L. reuteri DSM 17938.
El efecto observado por L. reuteri DSM 17938 y el citrato es específico de la cepa y, por ejemplo, otras cepas de Lactobacillus reuteri como L. reuteri ATCC PTA-4659, L. reuteri ATCC PTA-6475 y L. reuteri a Tc C PTA-5289 no son capaces de utilizar el citrato como aceptor de electrones y, por tanto, no son apropiadas para su uso en la presente invención. El citrato y la lactosa están presentes en la leche humana y son una de las bases para el crecimiento de L. reuteri DSM 17938 en la leche.
La presente invención se refiere a la adición de citrato en la razón adecuada con lactosa, u otra fuente de carbono adecuada (por ejemplo, otros azúcares como sacarosa, fructosa, glucosa o galacto-oligosacáridos (GOS)), en un producto que se administra a una persona que necesita una bacteria L. reuteri viva rápidamente activada, como L. reuteri DSM 17938, con una influencia mínima en los nutrientes administrados. Esto hará que la reconstitución y el crecimiento de L. reuteri DSM 17938 se parezcan más a las condiciones que se observan en el intestino del lactante amamantado en los primeros días de vida.
La presente invención pretende resolver los problemas de salud asociados a las afecciones de, por ejemplo, la NEC, proporcionando ciertas cepas bacterianas vivas y antiinflamatorias de L. reuteri, como L. reuteri DSM 17938, o cepas de L. reuteri con capacidad similar para utilizar citrato como aceptor de electrones, con una reconstitución mejorada y una capacidad de crecimiento precoz. El producto para uso de la invención también podría utilizarse para neonatos que tienen dificultades en la alimentación oral y reciben nutrición intravenosa sin que se les haya diagnosticado específicamente NEC. La invención puede utilizarse además en otros casos en los que una activación rápida de bacterias L. reuteri específicas sería beneficiosa desde el punto de vista de la salud, tal como se expone en las reivindicaciones.
La invención incorpora una rápida activación de la bacteria L. reuteri viva liofilizada en, por ejemplo, el lactante prematuro, mediante una nueva combinación de componentes de sustrato para añadir al producto final. La invención incorpora además el uso de componentes de sustrato que se seleccionan y mezclan en una proporción que serviría específicamente para apoyar el inicio mejorado de la actividad de las bacterias específicas.
Así pues, la presente invención utiliza un método de activación de bacterias L. reuteri vivas o de mejora de la activación de bacterias L. reuteri vivas mediante la adición o incorporación de citrato o exponiendo de otro modo dichas bacterias al citrato (y opcionalmente a otros componentes del sustrato). La activación de bacterias, tal como se describe en el presente documento, puede adoptar la forma de una reconstitución mejorada de una preparación bacteriana viva (por ejemplo, cuando se diluye y se activa para su uso una formulación de bacterias latentes secas, o de otro modo inactivas, y/o concentradas) que, a su vez, puede manifestarse como un crecimiento mejorado y/o más rápido de las bacterias vivas una vez que se ha producido la reconstitución, o el inicio mejorado (aumentado) o más rápido de otras actividades bacterianas, por ejemplo, el metabolismo o la colonización.
Así, las preparaciones para su uso de la invención, y la presencia de citrato (exposición al citrato) en las formulaciones de L. reuteri (por ejemplo, en las formulaciones finales para su administración al sujeto), dan lugar a la activación mejorada, por ejemplo, la reconstitución mejorada o más rápida y/o el crecimiento mejorado o más rápido o la tasa de crecimiento de las bacterias vivas, en comparación con las formulaciones bacterianas que no tienen citrato o una cantidad adecuada (es decir, una cantidad activadora) de citrato en la formulación. Este uso de citrato en formulaciones para activar bacterias L. reuteri vivas a partir de un estado latente (cuando dichas bacterias están congeladas, liofilizadas o secadas por congelación) no se había descrito antes, según el conocimiento de los inventores, y da lugar a un proceso mejorado para manipular dichas bacterias, especialmente para determinados tratamientos médicos descritos en el presente documento.
Por ejemplo, la rápida activación de las bacterias L. reuteri vivas latentes después (o antes o durante) la administración de las bacterias es importante en algunos sujetos, por ejemplo, porque los sujetos no suelen tener nutrientes en el estómago o el intestino que puedan utilizarse para activar eficazmente las bacterias vivas latentes, o porque los sujetos pueden tener cantidades de nutrientes deliberadamente restringidas por razones médicas (por ejemplo, bebés que tienen o corren el riesgo de tener NEC). También puede ser importante administrar una composición que tenga la mínima influencia sobre los nutrientes administrados al individuo (por ejemplo, en sujetos en los que los nutrientes están deliberadamente restringidos) o administrar una composición sin alterar significativamente otro estado nutricional del sujeto. En las formulaciones para el uso de la invención, hay suficiente nutrición en la formulación para que las bacterias se pongan en marcha (por ejemplo, al menos empiecen a activarse y a crecer), de modo que la bacteria L. reuteri no tenga que buscar los nutrientes limitados que puedan estar presentes en el intestino del sujeto, por ejemplo, el bebé prematuro. Esto puede ser importante, ya que las cantidades y el contenido de la nutrición administrada, por ejemplo, a un bebé que padece o corre el riesgo de padecer NEC deben regularse y equilibrarse cuidadosamente.
Por lo tanto, en estos sujetos, la bacteria L. reuteri debe activarse rápidamente sin depender de los nutrientes existentes en el intestino del sujeto, de modo que el beneficio terapéutico se consiga lo antes posible y antes de que se deteriore la salud del huésped. La activación rápida después (o antes o durante) la administración también es importante porque hay una falta de nutrientes naturales en el estómago del huésped que permitirá que la activación tenga lugar dentro del sujeto.
Las preparaciones para su uso de la invención aportan una solución a este problema proporcionando un método de activación de bacterias L. reuteri vivas utilizando citrato como componente de sustrato adecuado para las bacterias y, preferiblemente, proporcionando también una fuente de carbono adecuada para las bacterias, como un azúcar (por ejemplo, lactosa).
Alternativamente, los métodos de activación aquí descritos pueden considerarse como un método para cambiar el estado de una bacteria L. reuteri de latente a metabolizante (por ejemplo, el estado de crecimiento y replicación y, preferiblemente, de producción de metabolitos). Los métodos de activación descritos en el presente documento también pueden considerarse métodos de reconstitución o crecimiento de bacterias, por ejemplo, métodos para mejorar la reconstitución y/o el crecimiento o la tasa de crecimiento de bacterias vivas latentes.
Ventajosamente, dicha activación mejorada de las bacterias L. reuteri de acuerdo con la presente invención también puede dar lugar a una reducción de las dosis necesarias de bacterias, o dar lugar a una administración menos frecuente de bacterias, o dar lugar a una actividad mejorada de las bacterias una vez administradas (y, por tanto, a beneficios terapéuticos y para la salud).
Diferentes cepas y tipos de bacterias tienen diferentes capacidades. Las bacterias o microorganismos vivos de L. reuteri apropiados para su uso en la presente invención son aquellos que tienen la capacidad de utilizar citrato como aceptor externo de electrones. El término “ aceptor externo de electrones” en el contexto del crecimiento y metabolismo bacterianos es un término de la técnica. Por “externo” se entiende, por ejemplo, que el aceptor de electrones (citrato) se deriva de una fuente exógena a la bacteria y no se deriva de o es producido por la propia bacteria.
Las bacterias L. reuteri apropiadas también pueden tener la capacidad de utilizar (o consumir) citrato como nutriente o sustrato para el crecimiento (tener la capacidad de crecer en presencia de citrato), o de utilizar citrato como aceptor externo de electrones en su metabolismo (tener la capacidad de metabolizar citrato) o de tener la capacidad de utilizar citrato en una reacción de fermentación (ser fermentadoras de citrato).
Las bacterias L. reuteri vivas para usos de la invención son bacterias fermentativas. Las bacterias L. reuteri vivas son lactobacilos heterofermentativos, por ejemplo, que utilizan la vía de la fosfocetolasa (PKP) para convertir los carbohidratos, en particular la cepa Lactobacillus reuteri DSM 17938 o aquellas con capacidad similar para utilizar citrato como aceptor externo de electrones. La cepa Lactobacillus reuteri DSM 17938 se depositó en la DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig) el 30 de enero de 2006. En algunas realizaciones de la invención, no se utiliza la cepa Lactobacillus reuteri DSM 17938.
Las bacterias L. reuteri vivas para su uso en la presente invención también serán capaces de producir un beneficio para la salud del huésped o sujeto al que se administren en cantidades adecuadas. Por lo tanto, en la presente invención puede utilizarse cualquier microorganismo vivo de L. reuteri que sea útil para tratar enfermedades o afecciones o que tenga algún beneficio para la salud de un sujeto, en particular un lactante o neonato. Por ejemplo, tal como se describe en otra parte del presente documento, como los usos terapéuticos de la presente invención dan lugar a una activación mejorada de las bacterias, por ejemplo, en forma de reconstitución y crecimiento más rápidos, ventajosamente la invención puede permitir que se mejore el beneficio para la salud de las bacterias o la presente invención puede permitir que se utilicen dosis más bajas o menos frecuentes de las bacterias seleccionadas para lograr los mismos beneficios para la salud.
Así, por ejemplo, las bacterias L. reuteri que tienen una actividad antiinflamatoria (así como la capacidad de utilizar citrato como aceptor externo de electrones) se prefieren en algunas realizaciones. Lactobacillus reuteri DSM 17938 sería un ejemplo.
Tal como se describe en otras partes en el presente documento, la presente invención tiene un uso particular en el tratamiento de ciertas enfermedades o afecciones en un sujeto.
Las dosis apropiadas de las bacterias para su uso en las preparaciones para el uso de la invención tal como se describen en el presente documento pueden elegirse en función de la enfermedad o afección a tratar, el modo de administración y la formulación de que se trate.
Por lo tanto, preferiblemente dicha dosis es una dosis terapéuticamente eficaz que es apropiada para el sujeto humano y la condición que se está tratando y es apropiada para dar lugar a los efectos terapéuticos deseados o beneficios para la salud. Por ejemplo, pueden utilizarse dosis diarias de 105 a 1010, por ejemplo de 106 a 109, o de 106 a 108, o de 108 a 1010 UFC totales de bacterias. Una dosis diaria preferida es de unas 109 o 1010 UFC totales, por ejemplo, de 109 a 1010 UFC totales. Estas dosis también pueden equivaler a dosis ejemplares por ml, donde preferiblemente se administra una dosis de 1 ml.
La capacidad de una cepa bacteriana de L. reuteri para utilizar citrato como aceptor externo de electrones (por ejemplo, durante la fermentación de azúcares) sería bien comprendida por un experto en la materia y podría determinarse fácilmente utilizando técnicas estándar. Por ejemplo, una opción es comprobar dicha capacidad simplemente añadiendo citrato al medio de crecimiento y si eso resulta en un crecimiento o tasa de crecimiento más rápido, mejor o mejorado de la bacteria, entonces se puede concluir que la cepa bacteriana puede utilizar citrato como aceptor de electrones. Alternativamente, la utilización de citrato puede evaluarse midiendo si las bacterias consumen citrato, por ejemplo, midiendo si la concentración de citrato en el medio de cultivo se agota cuando crecen las bacterias.
Otra opción sería examinar cepas de bacterias para detectar la presencia de genes que codifiquen una o más (por ejemplo, 2 o más, 3 o más, 4 o más, etc., o todas) de las enzimas implicadas en el metabolismo del citrato, por ejemplo, en la conversión de citrato en succinato (por ejemplo, a través de oxaloacetato, malato o fumarato). De este modo, las cepas pueden examinarse para detectar la presencia de una o más (o preferiblemente todas) de las siguientes enzimas: EC:1.1.1.37: malato deshidrogenasa; EC:1.2.4.1; piruvato deshidrogenasa (que transfiere acetilo); EC:1.3.99.1:
succinato deshidrogenasa; EC:1.8.1.4: dihidrolipoil deshidrogenasa; EC:2.3.1.12: dihidrolipoilisina-residuo acetiltransferasa; EC:4.1.3.6: citrato (pro-3S)-liasa (3 subunidades representadas por 3 genes diferentes); EC:4.2.1.2: hidratos de fumarato. La presencia de la enzima citrato liasa es particularmente importante. Las cepas bacterianas también pueden examinarse para detectar la presencia de una enzima citrato permeasa.
El uso de bacterias L. reuteri que tienen la capacidad de utilizar citrato como aceptor externo de electrones significa que las formulaciones y preparaciones para el uso de la presente invención contienen fuentes de citrato, por ejemplo, iones citrato, por ejemplo sales de citrato como el citrato de sodio (por ejemplo, citrato trisódico dihidratado), u otras sales metálicas de citrato o ácido cítrico. Las sales preferidas son las que tienen una influencia mínima sobre el pH, por ejemplo, las que pueden estar presentes en soluciones tamponadas a un pH aproximadamente neutro, por ejemplo, pH 6,0 a 7,5.
Los presentes inventores han demostrado sorprendentemente que la presencia de citrato en las formulaciones bacterianas, es decir, la exposición de la bacteria L. reuteri a una preparación o formulación que contiene citrato, da como resultado una activación mejorada (por ejemplo, más rápida) de la bacteria, en particular en términos de una reconstitución mejorada de la bacteria, por ejemplo, a partir de una preparación liofilizada o inactiva, o un crecimiento mejorado de la bacteria, en comparación con las formulaciones y preparaciones que no contienen citrato.
Por lo tanto, el citrato debe estar en la formulación final en el momento de la administración al paciente (por ejemplo, para actuar como excipiente) para activaciones más rápidas en comparación con si no se incluye el citrato. Esto significa que una forma conveniente de poner en práctica la invención es añadir citrato a la preparación bacteriana húmeda o a la papilla justo antes de liofilizar o congelar o hacer latentes las bacterias (de modo que esté disponible cuando se activen las bacterias latentes). Una forma alternativa conveniente de poner en práctica la invención es añadir citrato como ingrediente seco a la formulación de bacterias ya secas (por ejemplo, liofilizadas o secadas por congelación), de modo que el citrato vuelva a estar presente en la formulación final y esté disponible cuando se activen las bacterias latentes. Alternativamente, el citrato puede añadirse o puede estar presente en el medio u otra solución utilizada para componer la formulación final para la administración al paciente (por ejemplo, utilizada para disolver o reconstituir o activar las bacterias congeladas, liofilizadas o secadas por congelación o latentes de otro modo).
Un experto en la técnica puede determinar la concentración adecuada de citrato para conseguir la activación, por ejemplo la activación mejorada, de la bacteria L. reuteri de acuerdo con la presente invención mediante cualquier método adecuado, por ejemplo exponiendo la bacteria a iones citrato a diferentes concentraciones y observando el efecto sobre la reconstitución y/o el crecimiento. Son adecuadas las concentraciones que, por ejemplo, actúan para estimular una mejora del crecimiento (o de la tasa de crecimiento), preferiblemente una mejora significativa del crecimiento (o de la tasa de crecimiento) de las bacterias. Las concentraciones a modo de ejemplo son de 0,01 o 0,05 mg/ml a 100 mg/ml, por ejemplo, de 0,05 o 0,1 mg/ml a 1,0, 2,0, 3,0, 5,0, 10,0, 20,0, 30,0 o 50,0 mg/ml. Las concentraciones alternativas podrían ser de 1,0, 2,0, 3,0, 5,0, 10,0, 20,0, 30,0 o 50,0 mg/ml a 100 mg/ml. Una concentración preferida podría ser de 0,05 o 0,1 mg/ml a 5,0 o 3,0 o 2,0 o 1,0 o 0,5 mg/ml, por ejemplo de 0,2 a 0,7 mg/ml, por ejemplo de 0,3 a 0,6 mg/ml. Estos valores también pueden ser apropiados para mg/dosis equivalentes administradas al sujeto.
Por ejemplo, los presentes inventores han demostrado que cuando el citrato está presente en una formulación, por ejemplo en una formulación bacteriana liofilizada o liofilizada de L. reuteri, entonces, en presencia de citrato, las bacterias muestran un crecimiento más rápido o mejorado (tasa de crecimiento), por ejemplo tardan menos tiempo en alcanzar una determinada densidad óptica (DO) en comparación con la ausencia de citrato. Por lo tanto, las concentraciones preferidas de citrato (iones citrato) son aquellas que pueden dar lugar a tales observaciones, por ejemplo, un crecimiento más rápido o mejorado o una tasa de crecimiento más rápida o mejorada en presencia frente a la ausencia de citrato. En particular, las concentraciones preferidas de citrato son aquellas que pueden dar lugar a que las cepas bacterianas alcancen un determinado aumento de DO o porcentaje de DO en un tiempo más corto, preferiblemente un tiempo significativamente más corto, que cuando no hay citrato. La metodología adecuada se muestra en los ejemplos y en la figura 3. Por ejemplo, convenientemente se puede medir el tiempo que tardan las bacterias en alcanzar un aumento del 1 %, 2 %, 3 %, 4 % o 5 %, o superior al 1 %, 2 %, 3 %, 4 % o 5 %, en la DO (por ejemplo, un aumento del 3 % o superior al 3 % en la DO), y observar las concentraciones de citrato en las que esto sucede más rápidamente, preferiblemente significativamente más rápidamente, con citrato presente frente a ausente (es decir, en presencia de citrato frente a la ausencia). Tales concentraciones de citrato serían apropiadas para su uso. Se puede usar cualquier medida apropiada de crecimiento bacteriano o tasa de crecimiento o números bacterianos. Por ejemplo, se puede utilizar cualquier técnica apropiada para medir la DO, por ejemplo experimentos apropiados de turbidez tal como se muestra en los ejemplos.
La capacidad de la bacteria L. reuteri de crecer más rápidamente o de mostrar una tasa de crecimiento mejorada en presencia de citrato es también un ejemplo de la activación de bacterias de acuerdo con la presente invención.
Las bacterias L. reuteri vivas para los usos de la presente invención pueden ser liofilizadas, recién preparadas, congeladas, secadas por congelación, secadas por pulverización o similares y pueden estar en cualquier producto formulado, incluido en un aceite, o solución acuosa, o suspensión, o emulsión o similar o cualquier otra formulación que se administre al neonato por vía enteral, por ejemplo en un sistema de administración por sonda, por vía oral o por vía rectal.
De acuerdo con la presente invención, el citrato debe estar presente en la formulación final que se administra a los pacientes.
En la invención, las bacterias L. reuteri que se van a activar están desecadas o inactivas de otro modo, y están congeladas, liofilizadas o secadas por congelación. Por tanto, en determinadas realizaciones preferidas, las preparaciones para el uso de la invención comprenden además una etapa en el que las bacterias se liofilizan o secan por congelación o se hacen inactivas de otro modo (por ejemplo, por congelación) antes de que se produzca la activación. Preferiblemente, el citrato (y opcionalmente la fuente de carbono o azúcar, por ejemplo, la lactosa) está presente en dichas formulaciones o preparaciones de bacterias latentes (en otras palabras, las bacterias están expuestas a dicho citrato y opcionalmente a dicha fuente de carbono).
En realizaciones particularmente preferidas, el citrato (y opcionalmente la fuente de carbono o azúcar, por ejemplo, la lactosa) está presente en la formulación liofilizada o de otro modo seca o sólida de bacterias latentes (por ejemplo, el citrato está presente en el medio de liofilización). Preferiblemente, el citrato se añade justo antes de la liofilización o de hacer latentes las bacterias, por ejemplo, se añade o forma parte del medio de liofilización o de congelación, en lugar de utilizarse, por ejemplo, en el medio de crecimiento utilizado para cultivar y expandir (hacer crecer) la población de bacterias L. reuteri vivas en las etapas previos a la liofilización o congelación (en otras palabras, preferiblemente el citrato no se utiliza durante el crecimiento de las bacterias).
Tales preparaciones de componentes secos (formulaciones secas) pueden prepararse de cualquier manera apropiada. Por ejemplo, los componentes individuales del producto final pueden combinarse juntos en una formulación líquida y luego liofilizarse o secarse, o los componentes individuales secos (o liofilizados), incluyendo las bacterias secas o liofilizadas, pueden mezclarse o mezclarse juntos para formar la formulación seca. Ambos tipos de formulación seca pueden reconstituirse para formar una solución o formulación final adecuada que contenga citrato y bacterias vivas L. reuteripara su administración a los pacientes.
Tal como se establece en cualquier otra parte en el presente documento, el citrato debe estar en la formulación final en el momento de la administración al paciente (por ejemplo, para actuar como excipiente) para activaciones más rápidas en comparación con si no se incluye el citrato. Esto significa que una forma conveniente de poner en práctica la invención y exponer las bacterias al citrato es añadir citrato a la preparación bacteriana húmeda o a la suspensión justo antes de la liofilización o congelación (para que esté disponible cuando se activen las bacterias latentes). Una forma alternativa conveniente de poner en práctica la invención es añadir citrato como ingrediente seco a la formulación de bacterias ya secas (por ejemplo, liofilizadas o secadas por congelación), de modo que el citrato vuelva a estar presente en la formulación final y esté disponible cuando se activen las bacterias latentes. Alternativamente, el citrato puede añadirse o estar presente en el medio (por ejemplo, medio de crecimiento) u otra solución utilizada para componer la formulación final para la administración al paciente (por ejemplo, utilizada para disolver o reconstituir o diluir el producto bacteriano congelado, desecado o liofilizado).
Así, en realizaciones preferidas de la invención, dicho citrato está presente en la preparación bacteriana congelada, liofilizada o secada por congelación, así como en la formulación final para su administración al sujeto.
Cuando las bacterias L. reuteri vivas se liofilizan o congelan, es una ventaja particular de la invención que la presencia de citrato permite una mejor activación de las bacterias cuando se reconstituyen a partir de la forma desecada o latente. Tal activación mejorada puede tomar la forma de una reconstitución o crecimiento más rápido. En otras palabras, la presencia de citrato ayuda a poner en marcha o mejora el despertar de las bacterias de su estado liofilizado (seco) o latente.
Por tanto, el concepto detrás de la presente invención es que el citrato esté presente en el momento o alrededor del momento en que la bacteria L. reuteri pasa de un estado inactivo (por ejemplo, congelado o liofilizado) a un estado activo, lo que significa que el citrato está en la formulación final que se administra al paciente (por ejemplo, como parte del medio o tampón utilizado para reconstituir o resuspender las bacterias latentes para su administración, o en la propia preparación liofilizada, congelada o latente, por ejemplo, el citrato se añade justo antes de la liofilización o se produce la congelación de las bacterias).
Tal como se describe en otro lugar en el presente documento, esto es particularmente ventajoso en sujetos que tienen nutrientes mínimos en el estómago o el intestino para proporcionar de otro modo nutrientes para la activación y el crecimiento de las bacterias. En algunas realizaciones de la invención, puede que ya se haya producido cierto crecimiento de la bacteria L. reuteri antes de que la formulación llegue al intestino del paciente, por ejemplo, durante su reconstitución y administración al paciente.
Aunque el citrato es un componente esencial (por ejemplo, un excipiente) en las formulaciones, composiciones y preparaciones para uso del producto de la invención (por ejemplo, en las formulaciones que se administrarán en el tracto gastrointestinal de los pacientes), también se proporcionan preferentemente otros componentes o excipientes.
Por ejemplo, la presencia de una o más fuentes de carbono apropiadas, por ejemplo que la bacteria L. reuteri viva pueda utilizar como sustrato de crecimiento, es un componente preferido. Las fuentes de carbono adecuadas pueden determinarse fácilmente en función de la naturaleza de las bacterias L. reuteri vivas en las formulaciones. Sin embargo, las fuentes de carbono preferidas son los hidratos de carbono, como los azúcares. La lactosa es un azúcar preferido para su uso. Sin embargo, puede utilizarse cualquier otro azúcar apropiado (siempre que favorezca el crecimiento de la bacteria L. reuteri), por ejemplo sacarosa, fructosa, glucosa o galacto-oligosacáridos (GOS).
Por tanto, en las realizaciones preferidas de la invención, la fuente de carbono o azúcar, por ejemplo, lactosa (por ejemplo, lactosa monohidrato) o azúcar alternativo, se pone en contacto con las bacterias vivas junto con el citrato. En otras palabras, las bacterias, el citrato y una fuente de carbono forman parte de la misma composición, formulación o preparación.
Por tanto, las preparaciones preferidas para el uso de la invención comprenden bacterias L. reuteri vivas tal como se define en otra parte en el presente documento, citrato y lactosa (u otro azúcar apropiado tal como se describió anteriormente, en particular GOS).
También pueden estar presentes otros componentes o excipientes, por ejemplo, componentes útiles para la estabilización u otras propiedades de la composición o la preparación, por ejemplo, cualquier crioprotector o estabilizador apropiado. Los ejemplos incluyen uno o más componentes seleccionados del grupo que consiste en: gelatina, glutamato sódico, maltodextrina y ácido ascórbico. El manitol es otro componente opcional.
En las preparaciones para uso de la invención se prefiere que los componentes usados estén en una forma pura o sustancialmente pura adecuada para la administración farmacéutica a seres humanos. Por tanto, los componentes individuales son preferiblemente de calidad farmacéutica y pueden estar presentes en una cantidad conocida o precisa en lugar de, por ejemplo, estar presentes o añadirse como parte de una mezcla de cantidades desconocidas o cantidades complejas de componentes. Por tanto, aunque las formulaciones para uso de la invención pueden administrarse después de mezclarlas o reconstituirlas en leche materna (u otros productos lácteos) que pueden contener citrato y lactosa entre otras muchas cosas, se prefiere que las formulaciones del producto para su administración a los pacientes contengan preparaciones adecuadamente puras de iones citrato, por ejemplo, en forma de sales de citrato, por ejemplo, citrato sódico tal como se describe en otro lugar del presente documento, y lactosa (por ejemplo lactosa monohidratada) u otros azúcares. Por tanto, en la invención, las formulaciones se reconstituyen (o diluyen) en agua o son formulaciones acuosas y no implican, por ejemplo, la reconstitución en o la presencia de un producto lácteo como la leche materna o la leche de fórmula. Por tanto, las formulaciones preferidas para el uso de la invención carecen de proteínas lácteas. Vistas de forma alternativa, las formulaciones preferidas para el uso de la invención contienen o están expuestas a citrato que no es proporcionado por un producto a base de leche como la leche materna o la leche de fórmula.
Las formulaciones para su uso también contienen generalmente un tampón o solución tampón para permitir que se mantenga un pH adecuado.
Las formulaciones preferidas para el uso de la invención (en particular en términos de concentraciones de lactosa y citrato) son las descritas en la tabla B o C. Otras formulaciones preferidas contendrían una bacteria que utiliza citrato alternativa a Lactobacillus reuteri DSM 17938. Una formulación preferida alternativa (en particular en términos de concentraciones de lactosa y citrato) para su uso es la formulación que contiene citrato descrita en la tabla 2. Una vez más, aunque una bacteria preferida para ser utilizada con dicha formulación es Lactobacillus reuteri DSM 17938, en realizaciones alternativas se pueden utilizar otras bacterias L. reuteri que utilicen citrato como se define en el presente documento. La formulación de la tabla 2 es particularmente útil como medio de liofilización (o lioprotector) para bacterias L. reuteri que utilizan citrato, ya que produce una mejor activación (por ejemplo, un mejor crecimiento) de las bacterias cuando se reconstituyen a partir de su forma liofilizada.
Tal como se mencionó anteriormente, en las realizaciones preferidas de la invención, tanto el citrato como la lactosa están presentes en las preparaciones bacterianas. Estos componentes pueden estar presentes en cualquier concentración o razón adecuada. El citrato está presente a una concentración en la que se produce la activación (o activación mejorada) de la bacteria L. reuteri viva, tal como se describe en el presente documento. La lactosa (u otro azúcar) suele estar presente en una cantidad tal que puede favorecer el crecimiento de la bacteria L. reuteri viva. En realizaciones preferidas de la invención, la preparación comprende una razón citrato/lactosa de 1:10 o 1:50 a 1:100, 1:200, 1:300, 1:400, 1:500 o 1:600, preferentemente 1:40 o 1:50 o 1:60 a 1:100, 1:200, 1:300, 1:400, 1:500 o 1:600; o de 1:30 a 1:100, 1:200, 1:300, 1:400, 1:500 o 1:600, preferiblemente de 1:60 a 1:600 o 1:30 a 1:300 o 1:50 a 1:70 o 1:50 a 1:60.
Por tanto, otro objeto de la invención es proporcionar una combinación óptima de una preparación para uso de la invención que comprenda citrato y lactosa (u otro azúcar), en una razón entre 1:10 y 1:600, al menos 1:60 y 1:600, preferentemente en una razón entre 1:30 y 1:300, o al menos 1:30 y 1:300 (o cualquier otra razón tal como se indica en el presente documento). Un ejemplo de la cantidad de citrato es de 0,3 mg por dosis de alrededor de 1 x 1010 UFC de bacterias L. reuteri vivas y la cantidad de lactosa es de 16,6 mg por la misma dosis. Otro ejemplo de la cantidad de citrato es de 0,6 mg por dosis de alrededor de 1 x 109 UFC de bacterias L. reuteri vivas y la cantidad de lactosa es de 35,7 mg por la misma dosis. Un ejemplo de la cantidad de citrato es 1 mg por dosis de alrededor de 1 x 109 UFC de bacterias L. reuteri vivas. El citrato puede estar en el intervalo de 0,01 mg a 100 mg por dosis (o en otras concentraciones descritas en el presente documento) y la cantidad de lactosa, u otro azúcar, puede calcularse de acuerdo con las proporciones mencionadas anteriormente.
Otro objeto de la invención es proporcionar una preparación para uso de la invención que comprenda componentes de sustrato y excipientes adecuados, por ejemplo lactosa, sacarosa, fructosa, glucosa, GOS, 1,2 propandediol, gelatina, glutamato sódico, maltodextrina, manitol, ácido ascórbico, citrato, citrato trisódico dihidratado y una bacteria L. reuteri, estando los componentes del sustrato específicamente diseñados para mejorar aún más la reconstitución y el crecimiento temprano de dichas bacterias a partir del estado liofilizado, fresco, congelado, liofilizado, atomizado o similar, y en el que dichas bacterias L. reuteri vivas comprenden una bacteria del ácido láctico que puede utilizar citrato como aceptor de electrones.
Otro objeto de la invención es proporcionar una preparación para uso de la invención que comprenda por ejemplo lactosa, sacarosa, fructosa, glucosa, GOS, 1,2 propandediol, gelatina, glutamato sódico, maltodextrina, manitol, ácido ascórbico, citrato, citrato trisódico dihidratado y una bacteria viva en la que dicha bacteria viva sea Lactobacillus reuteri DSM 17938.
Otro objeto de la invención es proporcionar una preparación para uso de la invención que comprenda, por ejemplo, lactosa monohidrato, gelatina hidrolizada, glutamato monosódico, maltodextrina, ácido ascórbico, citrato trisódico dihidrato y una bacteria viva en la que dicha bacteria viva sea Lactobacillus reuteri DSM 17938. Las concentraciones preferidas se describen en los ejemplos 2 y 3. Las concentraciones particularmente preferidas de citrato son o bien 0,3 mg/dosis o bien 0,6 mg/dosis, 0 por ejemplo un intervalo de desde 0,3 hasta 0,6 mg/dosis. Las concentraciones preferidas de bacterias son 1x109 UFC o 1 x1010 UFC por dosis, o por ejemplo un rango de 1 x109 UFC a 1 x1010 UFC por dosis. Se prefiere especialmente 1 x1010 UFC, opcionalmente en combinación con una concentración de citrato de 0,3 mg/dosis.
Otro objeto de la invención es proporcionar una combinación óptima de una preparación para uso de la invención que comprenda citrato y lactosa, u otro azúcar, en una razón comprendida entre 1:10 y 1:600, al menos 1:60 y 1:600.
Tal como se establece en otras partes en el presente documento, las formulaciones o preparaciones que contienen citrato se utilizan en el tratamiento terapéutico de un sujeto humano con una afección que se beneficiará de la administración de una bacteria L. reuteri viva activada más rápidamente o una bacteria L. reutericon una tasa de crecimiento mejorada. Por tanto, tales preparaciones para el uso en tales métodos de tratamiento de pacientes que lo necesitan forman realizaciones de la invención.
Las concentraciones preferidas de citrato y otras características preferidas de las preparaciones bacterianas de L. reuteri que se utilizarán en dichos métodos y usos terapéuticos se exponen en el presente documento. En particular, es importante que el citrato esté presente en la formulación final para su administración a dicho sujeto. Sin embargo, además, las bacterias L. reuteri o las preparaciones bacterianas están congeladas, liofilizadas o secadas por congelación, en cuyo caso se prefiere que dicho citrato esté presente en la preparación bacteriana congelada, liofilizada o secada por congelación. También es una realización preferida que dichas preparaciones se reconstituyan en agua antes de su administración a dicho sujeto.
Un sujeto preferido para los métodos y usos terapéuticos de la presente invención es un sujeto humano que carece o tiene nutrientes limitados en su intestino, o es un sujeto en el que la cantidad de nutrientes en el intestino se ha restringido deliberadamente, por ejemplo, por motivos médicos. Alternativamente, dicho sujeto es un sujeto que requiere nutrición parenteral o intravenosa (en otras palabras, requiere nutrición adicional o suplementaria por otras vías, por ejemplo, vías no orales, o no está recibiendo nutrientes directamente en el intestino). Esta situación es bastante frecuente, por ejemplo, en bebés prematuros o en bebés que padecen o corren el riesgo de padecer NEC. Dichos sujetos generalmente no tendrían suficientes nutrientes en su intestino para apoyar la activación y el crecimiento de una preparación administrada de bacterias L. reuteri a dicho sujeto, en particular generalmente no podrían apoyar la activación y el crecimiento de una preparación administrada de bacterias L. reuteri hasta tal punto que se observaría un beneficio para la salud conferido por las bacterias.
Así, puede verse que los sujetos serían neonatos, o lactantes de hasta un año de edad, o un sujeto que haya nacido prematuramente (es decir, un nacimiento prematuro o pretérmino).
Otros sujetos preferidos son los que tienen ECN o riesgo de desarrollarla, una afección que puede ser común en los bebés prematuros.
Otros sujetos preferidos son los sujetos incapaces de amamantar o de alimentarse por vía oral o los sujetos en los que la lactancia materna no es factible, tal como se describe en otras partes en el presente documento. Esta situación puede deberse a problemas de salud del bebé o de la madre, por ejemplo, pero sin limitarse a ellos, parto prematuro, parto complicado, problemas funcionales (por ejemplo, la madre no produce leche o produce una cantidad insuficiente, obstrucción de los conductos lácteos, mastitis), enfermedad de la madre, etc., con el resultado final de que el sujeto a tratar no puede ingerir suficientes nutrientes a través de la lactancia materna o incluso de otro tipo de alimentación oral para mantener la salud o, en última instancia, la vida.
El término “ paciente” o “ sujeto” tal como se usa en el presente documento se refiere a un sujeto humano.
La administración de las cepas bacterianas vivas de L. reuteri para los usos terapéuticos de la invención se realiza en cantidades farmacéutica o fisiológicamente eficaces, a sujetos (humanos) que necesitan tratamiento. Por lo tanto, dichos usos pueden implicar la etapa adicional de identificar a un sujeto que necesite tratamiento.
Como se desprende claramente de la divulgación en otras partes del presente documento, las preparaciones para el uso de la invención preventiva son adecuadas para la prevención de enfermedades o afecciones, así como para el tratamiento de enfermedades o afecciones, en particular, por ejemplo, la prevención de la ECN. Por tanto, el tratamiento profiláctico también está abarcado por la invención. Por este motivo, en las preparaciones para el uso de la presente invención, el tratamiento también incluye la profilaxis o la prevención cuando proceda.
Dichos aspectos preventivos (o protectores) pueden llevarse a cabo convenientemente en sujetos con riesgo de desarrollar las enfermedades o afecciones descritas en el presente documento, por ejemplo NEC, y pueden incluir tanto la prevención completa como la prevención significativa. La prevención significativa puede incluir el escenario en el que la gravedad de la enfermedad o los síntomas de la enfermedad se reducen (por ejemplo, se reducen de forma medible o significativa) en comparación con la gravedad o los síntomas que cabría esperar si no se administra ningún tratamiento.
Dicha reducción o alivio de afecciones, enfermedades o síntomas de las mismas (por ejemplo, síntomas clínicos o gravedad) puede medirse mediante cualquier ensayo apropiado, ejemplos de los cuales serían bien conocidos por un experto en la técnica. Preferiblemente, la reducción o alivio de las afecciones, enfermedades o síntomas es significativa, por ejemplo, clínicamente significativa o estadísticamente significativa, preferiblemente con un valor de probabilidad de ≤0,05. Dicha reducción o alivio de afecciones, enfermedades o síntomas se determina generalmente en comparación con un individuo o población de control apropiado, por ejemplo un mamífero o sujeto sano (o una población del mismo) o un mamífero o sujeto no tratado o tratado con placebo (o una población del mismo), o, si procede, el mismo sujeto individual antes del tratamiento.
Como las realizaciones preferidas de la invención se refieren al tratamiento de pacientes con nutrientes limitados o restringidos en el intestino y/o o que tienen dificultades para comer o alimentarse, una forma o modo preferido de administración es directo al estómago del sujeto, por ejemplo, por sonda bucal (orogástrica) o nasal (nasogástrica), o cualquier otra forma de administración enteral. Si el sujeto es capaz, entonces la administración oral también es adecuada. También se puede usar administración rectal.
Las composiciones para uso de la invención que contienen citrato pueden formularse o reconstituirse con cualquier solución acuosa apropiada para su administración al sujeto humano. Por ejemplo, la preparación puede reconstituirse o formularse con agua (por ejemplo, agua destilada) u otra solución acuosa, algún tipo de formulación que imita o replica condiciones en el intestino, por ejemplo, medio de sustrato intestinal simulado (SIS), o similar, por ejemplo, como se describe en los ejemplos.
Preferente y ventajosamente, puede utilizarse agua para reconstituir las formulaciones para uso de la invención, en particular una formulación que contenga citrato y azúcar (por ejemplo, lactosa), tal como se describe en el presente documento. A este respecto, el descubrimiento que han hecho los inventores de que la presencia de citrato (y opcionalmente un azúcar apropiado como la lactosa) en formulaciones secas (por ejemplo, secadas por congelación o liofilizadas) de bacterias latentes u otras formulaciones de bacterias latentes, puede dar lugar a una mejor activación de la bacteria L. reuteri viva cuando se reconstituye, significa que no hay necesidad de un medio de reconstitución más complicado, menos estable y menos disponible, como una formulación a base de leche (leche materna o de fórmula) u otra formulación para administración entérica. En otras palabras, la capacidad de utilizar agua para reconstituir las formulaciones preferidas para el uso de la invención, utilizando el conocimiento de que el citrato junto con la lactosa (u otro azúcar apropiado) puede activar las bacterias L. reuteri vivas más rápidamente, proporciona ventajosamente un medio de activación “estandarizado” utilizando agua sin necesidad de depender de ninguna otra fuente de reactivo.
Preferiblemente, cualquiera de las mejoras, realces o aumentos descritos en el presente documento (por ejemplo, los efectos positivos sobre el crecimiento, la tasa de crecimiento, la reconstitución o la activación, y de hecho cualquier otro efecto elevado como se menciona en otra parte del presente documento) son aumentos medibles, etc., (según corresponda), más preferiblemente son aumentos significativos, preferiblemente aumentos clínicamente significativos o estadísticamente significativos, por ejemplo con un valor de probabilidad de ≤0,05, en comparación con un nivel o valor de control o muestra adecuados. Por ejemplo, para la evaluación de los efectos del citrato, una comparación adecuada es con una muestra, preparación o sujeto, etc., donde no haya citrato.
Preferiblemente, cualquiera de las reducciones o disminuciones descritas en el presente documento (por ejemplo, los tiempos reducidos para alcanzar las DO adecuadas o la reducción de dosis o enfermedades o síntomas, y de hecho cualquier otro efecto reducido como se menciona en otra parte del presente documento) son reducciones medibles, más preferiblemente son reducciones significativas, preferiblemente reducciones clínicamente significativas o estadísticamente significativas, por ejemplo con un valor de probabilidad de ≤0,05, cuando se comparan con un nivel o valor de control o muestra adecuados. Por ejemplo, para la evaluación de los efectos del citrato, una comparación adecuada es con una muestra, preparación o sujeto, etc., donde no haya citrato.
La invención se describirá adicionalmente con referencia a los siguientes Ejemplos no limitantes:
Ejemplos
Ejemplo 1
Crecimiento de Lactobacillus reuteri en “ sustrato intestinal simulado”
Materiales y métodos
El crecimiento de L. reuteri DSM 17938 en diferentes combinaciones de azúcar y aceptores de electrones se evaluó en “ sustrato intestinal simulado” (SIS).
Tabla A
Figure imgf000012_0001
Figure imgf000013_0001
Las células de Lactobacillus reuteri de la cepa DSM 17938 se cultivaron en primer lugar durante la noche en caldo MRS (Oxoid) a 37 0C. Después de lavar en solución salina tamponada con fosfato (PBS), las bacterias se diluyeron 10 x en PBS. A continuación, se inocularon 10 □l de suspensión bacteriana en 10 ml de SIS (con adición de azúcar y aceptor de electrones), y las bacterias se cultivaron durante 16 h a 37 0C en condiciones anaerobias y sin agitación. Cultivo de L. reuteri DSM 1738 en SIS con adición de lactosa y citrato
El crecimiento de Lactobacillus reuteri DSM 17938 en SIS con lactosa y citrato como el par aceptor de azúcarazúcar se evalúa de la misma manera que se ha descrito anteriormente para GOS y citrato como aceptor de electrones. Se utiliza el sustrato descrito anteriormente (SIS). Lactobacillus reuteri DSM 17938 crece con la misma eficacia con lactosa-citrato que con la combinación GOS-citrato (datos no mostrados).
Ejemplo 2
Formulación de un producto adecuado para su uso en la alimentación por sonda de un lactante prematuro con riesgo de desarrollar ECN, utilizando la presente invención.
El polvo para suspensión oral IBP-9414 es un polvo liofilizado de color entre blanco y blanquecino que se presenta en un vial de vidrio transparente y contiene aproximadamente 1 x 109 UFC de L. reuteri DSM 17938 por dosis, así como citrato y otros excipientes, según se indica en la tabla siguiente. Se fabrica recién preparado, congelado, liofilizado, atomizado, etc., según se conozca en la industria.
Formulación por dosis
Tabla B
Figure imgf000013_0002
Ejemplo 3
Formulación de un producto adecuado para su uso en la alimentación por sonda de un lactante prematuro con riesgo de desarrollar ECN, utilizando la presente invención.
El polvo para suspensión oral IBP-9414 es un polvo liofilizado de color entre blanco y blanquecino que se presenta en un vial de vidrio transparente y contiene aproximadamente 1 x 1010 UFC de L. reuteri DSM 17938 por dosis, así como citrato y otros excipientes, según se indica en la tabla siguiente. Se fabrica recién preparado, congelado, liofilizado, atomizado, etc., según se conozca en la industria.
Formulación por dosis
Tabla C
Figure imgf000014_0002
Ejemplo 4
La adición de citrato al lioprotector acorta el tiempo de activación del Lactobacillus reuteri DSM 17938 liofilizado Métodos
Cultivo:
Se inoculó un tubo falcon con 9 ml de medio de cultivo (véase la tabla 1) con Lactobacillus reuteri DSM 17938 procedente de una reseva congelada. El precultivo se incubó a 37 0C durante 16 horas. Esto fue seguido por una segunda etapa de precultivo donde se añadieron 5 ml del primer precultivo a 45 ml de medio recién prepatado. Se dejó que el segundo precultivo alcanzara una densidad óptica (600 nm) de >13 (~24 horas).
Se preparó un fermentador con capacidad para 1,5 litros y se esterilizó en autoclave a 121 0C durante 20 minutos. Todos los componentes, excepto la glucosa, se añadieron a 875 ml de dH2O y se esterilizaron en autoclave con el fermentador. Se preparó una solución de glucosa con los 125 ml restantes, se esterilizó en autoclave por separado y se añadió al fermentador. El fermentador se ajustó a una temperatura de 37 0C y un pH de 5,5 (controlado mediante la adición de NaOH) con una agitación a 100 rpm. El fermentador se dejó funcionar toda la noche para determinar posibles contaminaciones. A continuación, se inyectaron 50 ml del segundo precultivo y se hizo funcionar el fermentador durante 15 horas, hasta alcanzar una densidad óptica final de 14,3.
El cultivo se bombeó del fermentador a un matraz esterilizado (tardó ~2,5 horas), se dividió en dos partes que se centrifugaron a 3200 rpm durante 10 min. Los dos sedimentos (13,4 y 15,2 g) se lavaron con tampón de glutamato sódico (45,2 g de glutamato sódico en 1,8 litros de dH2O, filtrado a través de un filtro estéril de 0,2 μm) seguido de una suspensión en cantidades iguales (13,4 y 15,2 ml) de tampón de glutamato sódico. Las suspensiones bacterianas se mezclaron además con un volumen igual de tampón de liofilización con (C) o sin (N) adición de citrato (véase la tabla 2). Tabla 1. Composición del medio de cultivo
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000015_0002
Tabla 2. Composición del medio de liofilización
Figure imgf000015_0001
Liofilización:
Antes de la liofilización, las suspensiones bacterianas se alicuotaron en volúmenes de 1 ml en viales de liofilización de 5 ml con tapones de goma. Se ejecutó el siguiente programa de liofilización:
Tabla 3. Programa de liofilización
Figure imgf000015_0003
Después de completar la segunda etapa de secado, los viales se sellaron sin vacío en presencia de gas nitrógeno. Cuantificación:
Se tomaron muestras para la cuantificación de bacterias del cultivo antes de la distribución en dos partes. Para determinar la tasa de supervivencia, estos resultados se compararon posteriormente con análisis de muestras liofilizadas.
Preparación de ADN del cultivo del fermentador:
DNeasy® Blood&Tissue Handbook (n.° de cat. 69504) (según con el protocolo: Pretratamiento para bacterias Gram positivas, con ligeras modificaciones)
Las células del cultivo fermentador (1 ml) se recogieron por centrifugación durante 10 min a 5000 x g (7500 rpm). El sobrenadante se desechó y el sedimento bacteriano se resuspendió en 180 μl de tampón de lisis enzimática y se incubó durante 60 min a 37 0C. Esto fue seguido de una etapa batido de perlas usando 0,25 ml de perlas de circonio/sílice de 0,1 mm (BioSpec: n.° de cat. 11079101z) en un microtubo de PP de 2 ml (Sarstedt: n.° de orden 72.694.006) a velocidad 5,0 durante 3 x 45 s (FastPrep®-24 Instrument, MP Biomedicals). Las muestras de batido con perlas se incubaron durante 30 min a 56 0C. El resto de las etapas se realizaron según el protocolo.
PCR:
Cebadores: DSM17f2 (TACGGGGAACGAGTTATTGC) y DSM17r2 (GGACGGCTTAACAAAACAGC); Tamaño del producto 216 pb
Se usó la mezcla maestra de PCR DreamTaq (2X Thermo Scientific, número de artículo K1081) para las reacciones de PCR. Reacciones de PCR según lo siguiente:
Mezcla maestra con cebadores Volumen por reacción
Agua (calidad para PCR) 3,0 μl
Cebador, directo (10 pmol/μl) 1,0 μl
Cebador, inverso (10 pmol/μl) 1,0 μl
BSA (conc. final 0,1 μg/μl) 2,5 μl
DreamTaq 12,5 μl
Se mezclaron 20 μl de mezcla maestra con 5 μl de muestra de ADN y se ejecutó el siguiente programa: 98 0C 5 min// 2x(95 0C 30 s, 68 0C 30 s, 72 0C 20 s) //2x(95 0C 30 s, 66 0C 30 s, 72 0C 20 s) //2x(95 0C 30 s, 64 0C 30 s, 72 0C 20 s) // 2x(95 0C 30 s, 620C 30 s, 72 0C 20 s) //35x(95 0C 30 s, 62 0C 30 s, 720C 20 s) //72 0C 5 min //16 0C.
Evaluación del tiempo de activación:
Se analizó el tiempo de activación en medio intestinal simulado (STMmod 3, véase la tabla 4) de las dos variantes de DSM 17938 liofilizado (C y N) usando un incubador/lector/agitador controlado por ordenador (BioScreen C MBR) que mide el cambio de turbidez con el tiempo. Se usó el medio STMmod 3 para imitar las condiciones en el intestino.
A cada pocillo se le añadieron 200 μl de STMmod 3. A continuación, se añadieron diferentes volúmenes (100, 60, 40, 30, 25 μl) de suspensión bacteriana (viales con bacterias liofilizadas suspendidas en 1 ml de dHzO). Los volúmenes se ajustaron a 300 μl con dH2O. El análisis de cada volumen de inoculación se realizó por triplicado. El análisis BioScreen se realizó a 37 0C durante 24 horas con un intervalo de 15 minutos entre mediciones (DO 600 nm), añadiendo un paso de agitación de 10 s antes de cada punto de medición.
Tabla 4. Composición del medio intestinal simulado (STMmod 3)
Figure imgf000016_0001
Resultados
PCR:
Se realizó una PCR con los cebadores específicos DSM 17938 en las extracciones de ADN del cultivo del fermentador, para confirmar que se habían cultivado las bacterias correctas. Los resultados muestran efectivamente que DSM 17938 se cultivó en el fermentador (figura 2).
Cuantificación:
Se determinó que la tasa de supervivencia de DSM 17938 tras la liofilización era de aproximadamente el 13 % para las bacterias liofilizadas con citrato (C) y del 12 % para las bacterias liofilizadas sin citrato (N) (véase la tabla 5). Tabla 5. Cuantificación, tasa de supervivencia y densidad óptica de cultivos fermentadores y liofilizados de DSM 17938.
Figure imgf000017_0001
Evaluación del tiempo de activación:
Los resultados del experimento de turbidez revelaron que los cultivos liofilizados de DSM 17938 alcanzaron un aumento del 3 % de la DO en un tiempo más corto cuando el lioprotector contenía citrato (véase la figura 3).
En resumen: los resultados revelaron que la adición de citrato (utilizado por L. reutericomo aceptor de electrones) en la formulación del producto, acorta el tiempo de activación de Lactobacillus reuteri DSM 17938 en medio intestinal simulado.

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Una preparación que comprende (i) una bacteria Lactobacillus reuteriviva que tiene la capacidad de utilizar citrato como aceptor externo de electrones, y (ii) citrato, para su uso en el tratamiento terapéutico de un sujeto con una afección que se beneficiará de la administración de una bacteria Lactobacillus reuteri viva activada más rápidamente o de una bacteria Lactobacillus reuteri con una tasa de crecimiento mejorada;
en donde las bacterias en la preparación se congelan, se liofilizan o se secan por congelación, en donde dicha preparación congelada, liofilizada o secada por congelación se reconstituye en una solución acuosa apropiada para la administración al sujeto antes de la administración a dicho sujeto; en donde dicho sujeto es un sujeto humano y es un neonato, o un bebé de hasta un año de edad, o es un sujeto que ha nacido prematuramente;
en el que dicha afección es una afección en la que el neonato, lactante o sujeto prematuro tiene dificultades para alimentarse por vía oral, es incapaz de amamantarse o alimentarse por vía oral, o requiere nutrición parenteral o intravenosa, o en la que la cantidad de nutrientes en el intestino se ha restringido deliberadamente por motivos médicos; y
en donde dicho uso no altera significativamente el estado nutricional del neonato, lactante o sujeto prematuro.
2. La preparación para uso según la reivindicación 1, en donde dicho citrato está presente en dicha preparación congelada, liofilizada o secada por congelación, y/o en donde dicho citrato está presente en la formulación final para la administración a dicho sujeto.
3. La preparación para su uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la bacteria está expuesta a un azúcar o la preparación comprende además un azúcar, preferiblemente en donde dicho azúcar es lactosa.
4. La preparación para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho citrato y opcionalmente dicho azúcar está presente en una preparación de bacterias latentes que luego se activan.
5. La preparación para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho citrato está presente a una concentración de 0,01 mg/ml a 10,0 mg/ml, preferiblemente de desde 0,01 mg/ml hasta 5,0 mg/ml o de 0,01 mg/ml a 2,0 mg/ml.
6. La preparación para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en donde la preparación comprende una razón de citrato con respecto a lactosa de 1:10 a 1:600, preferiblemente de 1:60 a 1:600 o de 1:30 a 1:300.
7. La preparación para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho Lactobacillus reuteri es Lactobacillus reuteri DSM 17938.
8. La preparación para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicho sujeto es un sujeto que tiene enterocolitis necrotizante (NEC) o está en riesgo de desarrollar NEC.
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