CN111372477B

CN111372477B - 在含有gos的培养基中预调理的益生菌及其用途

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Publication number: CN111372477B
Application number: CN201880048397.8A
Authority: CN
Inventors: B·伯吉塞维克; J·A·穆勒; N·帕日; G·E·M·普利奥特; W·斯贝斯马; T·沙塞; B·马尔索
Original assignee: Societe des Produits Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA
Priority date: 2017-08-04
Filing date: 2018-08-06
Publication date: 2024-05-24
Anticipated expiration: 2038-08-06
Also published as: US11779614B2; PH12019550231A1; EP3661371A1; BR112019027088A2; AU2018310705A1; CN111372477A; RU2020108088A3; US20210121507A1; AU2018310705B2; RU2020108088A; MX2019014315A; WO2019025637A1; CL2019003595A1

Abstract

本发明涉及一种组合物，该组合物包含低聚半乳糖(GOS)和益生菌，该益生菌通过包括在包含GOS的培养基中生长细菌的步骤的方法获得，此类组合物具有促进益生菌与GOS的合生效应的效果。还设想通过此类发酵方法获得的益生菌的健康有益效果。

Description

在含有GOS的培养基中预调理的益生菌及其用途

本发明涉及包含低聚半乳糖(GOS)和益生菌的组合物，该益生菌通过包括在包含GOS的培养基中生长细菌的步骤的方法获得，此类组合物具有促进益生菌与GOS的合生效应的效果。还设想通过此类发酵方法获得的益生菌的健康有益效果。

背景技术

益生菌诸如双歧杆菌长期以来被用于提供不同的健康有益效果，例如已经显示它们在调节免疫应答、预防和治疗感染、减少炎症以及减少过敏反应方面有效。

双歧杆菌具体地是革兰氏阳性的厌氧杆状细菌，其能够定殖在人类肠道中并水解复杂的碳水化合物。双歧杆菌属的成员在范围宽泛的产品(包括婴儿配方食品)中经常被用作益生微生物。

益生元也已被广泛地描述。益生元是诸如低聚糖的成分，当通过个体肠道中的天然微生物区系或通过与该益生元同时摄入的益生菌发酵时，其提供健康有益效果。益生元的有益效果的广泛描述可见于例如McFlane等人的Bacterial metabolism and health-related effects of galacto-oligosaccharides and other prebiotics，J ApplMicrobiol，2008，104：305-344(低聚半乳糖和其它益生元的细菌代谢和健康相关影响，《应用微生物学杂志》，2008年，第104期，第305-344页)。

特定类型的益生元和益生菌的组合产生协同效应。具体地，组合的益生元低聚半乳糖(GOS)和益生微生物诸如双歧杆菌的效应已广泛地记录在科学文章和专利中。例如，据描述益生菌和GOS的组合在以下方面是有益的：肠道微生物区系组合物的调节(参见例如Environ.Microbiol.，2016，18(7)：2185-2195(《环境微生物》，2016年，第18卷第7期，第2185-2195页))；和免疫应答调节，诸如免疫防御的增加(参见例如BrJ Nutr.，2014，111(11)：1945-1956(《英国营养杂志》，2014年，第111卷第11期，第1945-1956页))；感染预防(参见例如Dig.Dis.Sci.，2009，54(5)：1071-8(《消化道疾病与科学》，2009年，第54卷第5期，第1071-1078页)；J Clin Gastroenterology，2008，42(Supp 3，Part 2)：224-233(《临床胃肠病学杂志》，2008年，第42期(增补3，部分2)，第224-233页))；或过敏预防(参见例如Allergy.，2011，66(2)：170-177(《过敏》，2011年，第66卷第2期，第170-177页)，涉及患有过敏性皮炎的婴儿的哮喘样症状的预防)。此类合生素的效果尤其在婴儿中得到证实，因此包含例如GOS和益生菌的若干婴儿配方食品组合物已得到商业使用。

已经显示，合生效应是由于益生菌诸如双歧杆菌在个体胃肠道中消耗GOS所致。因此，已经对益生菌生长和消耗GOS的能力进行了进一步的研究。例如，Garrido等人(Utilization of galactooligosaccharides by Bifidobacterium longumsubsp.infantis isolates，Food Microbiol，2013，33(2)：262-270(婴儿长双歧杆菌亚种分离株对低聚半乳糖的利用，《食品微生物学》，2013年，第33卷第2期，第262-270页))研究了婴儿长双歧杆菌亚种的22个分离株在GOS上生长的能力。所有分离株显示在此低聚糖上旺盛生长。在Vernazza等人的文章(Carbohydrate preference，acid tolerance and biletolerance in five strains of Bifidobacterium；J Appl Microbiol，2006，100(4)：846：853(五个双歧杆菌属菌株中的碳水化合物偏好、酸耐受性和胆汁耐受性，《应用微生物学杂志》，2006年，第100卷第4期，第846-853页))中，从12种底物分析了五个双歧杆菌属菌株的碳水化合物偏好。使用最大生长速率来比较底物偏好。低聚半乳糖被所有测试物种充分利用。另外，在Watson等人的文章(Selective carbohydrate utilization bylactobacilli and bifidobacteria；J Appl Microbiol，2013，114(4)：1132-1146(乳杆菌和双歧杆菌对碳水化合物的选择性利用，《应用微生物学杂志)》2013年，第114卷第4期，第1132-1146页))中，测试了代表29个人源乳杆菌和39个双歧杆菌(人源和动物源均有)的68个细菌菌株代谢10种不同碳水化合物的能力。低聚半乳糖(GOS)和乳酮糖显示出支持最有利的生长特性。这些研究支持使用GOS与多种益生菌的合生素的可能性。

其它研究的重点是鉴定GOS消耗的分子机制。即，Motherway等人(Transcriptional and functional characterization of genetic elements involvedin galacto-oligosaccharide utilization bv Bifidobacterium breve UCC2003，Microbial Technology，2013，6(1)：67-79(短双歧杆菌UCC200利用低聚半乳糖所涉及的遗传元件的转录和功能表征，《微生物技术》，2013年，第6卷第1期，第67-79页))描述了短双歧杆菌UCC2003 gal基因座的功能表征，该基因座专用于半乳聚糖的利用，半乳聚糖是包含半乳糖的得自植物的多糖。此研究发现，对于GOS的消耗，短双歧杆菌UCC2003需要galCDEGR(A)操纵子。

持续需要鉴定另外的合生素组合物。不仅可用于鉴定靶向新有益效果的合生素组合物，而且能够提高已知提供有利健康效果的组合物的效率。因此，希望改善给定剂量的合生素组合物的效率和/或维持给定水平的活性，同时减小益生菌和/或益生元的剂量且不减少合生素对宿主的有益效果。本发明解决了这些问题。

发明内容

在第一方面，本发明提供包含有效量的低聚半乳糖以及包含galCDEGR(A)操纵子的益生菌的组合物，其中所述益生菌通过包括以下步骤的方法获得：

a.在包含低聚半乳糖和蛋白胨的细菌生长培养基中发酵所述益生菌；以及

b.收获所培养的益生菌。

在第二方面，本发明提供了一种益生菌，该益生菌包含galCDEGR(A)操纵子，该益生菌通过包括以下步骤的方法获得：

b.收获所培养的益生菌；

或本发明的组合物，用于治疗。

在第三方面，本发明提供用于提高包含低聚半乳糖以及包含galCDEGR(A)操纵子的益生菌的组合物的治疗效果的方法，该方法包括：

b.收获所培养的益生菌，

然后将该益生菌掺入合生素组合物中。

附图说明

图1：测试的在BMOS上过夜生长的双歧杆菌属菌株的平均OD曲线：乳酸动物双歧杆菌亚种NCC2818(A)、短双歧杆菌NCC466(B)，长双歧杆菌NCC435(C)、长双歧杆菌NCC3001(D)和长双歧杆菌NCC4020(E)。

图2：测试的在P-GOS上过夜生长的双歧杆菌属菌株(Bifidobacterium strains)的平均OD曲线：动物双歧杆菌乳酸亚种NCC2818(A)、短双歧杆菌NCC466(B)，长双歧杆菌NCC435(C)、长双歧杆菌NCC3001(D)和长双歧杆菌NCC4020(E)。

图3：经测试的双歧杆菌属菌株发酵后，在BM+BMOS(A)和BM+P-GOS(B)中的低聚糖的降低，单位为g/100g培养基。

图4：通过流式细胞术确定的在BM+BMOS和BM+P-GOS中生长的经测试的双歧杆菌属菌株的细胞计数。

图5：经5个双歧杆菌属菌株发酵后，在IM+BMOS(A)和IM+P-GOS(B)中的低聚糖的降低，单位为g/100g培养基。

图6：通过流式细胞术确定的在IM+BMOS和IM+P-GOS中生长的经测试的双歧杆菌属菌株的细胞计数。

图7：将BMOS用作GOS来源的预调理实验的实验设置。

图8：用Cinac监测的pH曲线，针对动物双歧杆菌乳酸亚种菌株NCC2818在BMOS上作为GOS来源(A)和在P-GOS上作为GOS来源(B)的预调理实验中的一个：(III)右旋糖上的生物质产生，(IV)GOS来源上的生物质产生，(I)暴露于GOS来源时右旋糖上的生物质生长，(II)再次暴露于GOS来源时GOS来源上的生物质生长。在再次暴露于GOS来源期间酸化的偏移由粗体水平箭头指示。

图9：通过流式细胞术确定的在IM+右旋糖和IM+BMOS培养基中增殖的双歧杆菌属菌株的细胞计数。

图10：通过流式细胞术确定的在暴露于胃液之前(t0)和之后(GJ)在右旋糖或BMOS上增殖的双歧杆菌属菌株的细胞计数。

图11：通过流式细胞术确定的在暴露于胃液之后，在再次暴露于BMOS时，在右旋糖或BMOS上增殖的双歧杆菌属菌株的细胞计数。

图12：用Cinac监测的pH曲线，针对短双歧杆菌菌株NCC466在BMOS上作为GOS来源的预调理实验中的一个：(III)右旋糖上的生物质产生，(IV)GOS来源上的生物质产生，(I)暴露于GOS来源时右旋糖上的生物质生长，(II)再次暴露于GOS来源时GOS来源上的生物质生长。在再次暴露于GOS来源期间酸化的偏移由粗体水平箭头指示。

图13：用Cinac监测的pH曲线，针对长双歧杆菌菌株NCC435在BMOS上作为GOS来源的预调理实验中的一个：(III)右旋糖上的生物质产生，(IV)GOS来源上的生物质产生，(I)暴露于GOS来源时右旋糖上的生物质生长，(II)再次暴露于GOS来源时GOS来源上的生物质生长。在再次暴露于GOS来源期间酸化的偏移由粗体水平箭头指示。

图14：用Cinac监测的pH曲线，针对长双歧杆菌菌株NCC3001在BMOS上作为GOS来源的预调理实验中的一个：(III)右旋糖上的生物质产生，(IV)GOS来源上的生物质产生，(I)暴露于GOS来源时右旋糖上的生物质生长，(II)再次暴露于GOS来源时GOS来源上的生物质生长。在再次暴露于GOS来源期间酸化的偏移由粗体水平箭头指示。

图15：用Cinac监测的pH曲线，针对长双歧杆菌菌株NCC4020在BMOS上作为GOS来源的预调理实验中的一个：(III)右旋糖上的生物质产生，(IV)GOS来源上的生物质产生，(I)暴露于GOS来源时右旋糖上的生物质生长，(II)再次暴露于GOS来源时GOS来源上的生物质生长。在再次暴露于GOS来源期间酸化的偏移由粗体水平箭头指示。

图16：在(再次)暴露于BMOS时，先前以不同百分比的BMOS(三角形)或右旋糖(正方形)作为碳来源生长的动物双歧杆菌乳酸亚种菌株NCC2818的细胞生长速度。

图17：在向培养基中施用0g/L或5g/L的BMOS作为GOS来源或者将动物双歧杆菌乳酸亚种菌株NCC2818或预调理的动物双歧杆菌乳酸亚种菌株NCC2818与GOS来源一起共同补充后，发酵6小时之后的总SCFA产量。因动物双歧杆菌乳酸亚种菌株NCC2818与GOS来源之间的协同效应导致的总SCFA的产量偏移由粗体箭头指示，而预调理的动物双歧杆菌乳酸亚种菌株NCC2818与GOS来源之间的协同效应由虚线箭头指示。

图18：在向培养基中施用0g/L或5g/L的BMOS作为GOS来源或者将动物双歧杆菌乳酸亚种菌株NCC2818或预调理的动物双歧杆菌乳酸亚种菌株NCC2818与GOS来源一起共同补充后，发酵6小时之后的乙酸盐产量。因动物双歧杆菌乳酸亚种菌株NCC2818与GOS来源之间的协同效应导致的乙酸盐的产量偏移由粗体箭头指示，而预调理的动物双歧杆菌乳酸亚种菌株NCC2818与GOS来源之间的协同效应由虚线箭头指示。

图19：在向培养基中施用0g/L或5g/L的BMOS作为GOS来源或者将动物双歧杆菌乳酸亚种菌株NCC2818或预调理的动物双歧杆菌乳酸亚种菌株NCC2818与GOS来源一起共同补充后，发酵6小时之后的乳酸盐产量。因动物双歧杆菌乳酸亚种菌株NCC2818与GOS来源之间的协同效应导致的乳酸盐的产量偏移由粗体箭头指示，而预调理的动物双歧杆菌乳酸亚种菌株NCC2818与GOS来源之间的协同效应由虚线箭头指示。

图20：在向培养基中施用0g/L或5g/L的BMOS作为GOS来源或者将动物双歧杆菌乳酸亚种菌株NCC2818或预调理的动物双歧杆菌乳酸亚种菌株NCC2818与GOS来源一起共同补充后，发酵24小时之后的铵产量。因动物双歧杆菌乳酸亚种菌株NCC2818与GOS来源之间的协同效应导致的铵的产量偏移由粗体箭头指示，而预调理的动物双歧杆菌乳酸亚种菌株NCC2818与GOS来源之间的协同效应由虚线箭头指示。

图21：用Cinac监测的pH曲线，针对经喷雾干燥的动物双歧杆菌乳酸亚种菌株NCC2818在BMOS上作为GOS的预调理实验中的一个。(I)暴露于GOS来源时右旋糖上的生物质生长，(II)再次暴露于GOS来源时GOS来源上的生物质生长。在再次暴露于GOS来源期间酸化的偏移由粗体水平箭头指示。

图22：用Cinac监测的pH曲线，针对约氏乳杆菌菌株NCC533在BMOS上作为GOS的预调理实验中的一个。(I)GOS来源上的生物质产生，(III)右旋糖上的生物质生长，(II)暴露于GOS来源时右旋糖上的生物质生长，(IV)再次暴露于GOS来源时GOS来源上的生物质生长。在再次暴露于GOS来源期间酸化的偏移由粗体水平箭头指示。

图23：在(再次)暴露于BMOS时，先前以不同百分比的BMOS(三角形)或右旋糖(正方形)作为碳来源生长的约氏乳杆菌菌株NCC533的细胞生长速度。

具体实施方式

本发明提供具有改善的治疗效果的合生素组合物。如将从本发明的示例中显而易见的那样，当通过包括在包含低聚半乳糖和蛋白胨的细菌生长培养基中发酵益生菌的步骤的方法获得益生菌时，包括包含galCDEGR(A)操纵子和GOS的益生菌的合生素组合物具有改善的效果。

针对工业用途的用于生产益生菌的现有技术方法涉及在包含糖诸如葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖或右旋糖的生长培养基中发酵细菌的步骤。另外，在此前的研究中已对GOS上的益生菌生长进行了评估。然而，这些研究均未描述在GOS上发酵结束后细菌再次暴露于GOS，并且这些研究均未设想在GOS上生长的益生菌可表现出有利的特性。现在本发明人已确定，当益生菌再次暴露于GOS时，先前在GOS上增殖的细菌与在糖诸如右旋糖上生长的细菌相比显示具有较短的滞后阶段。当益生菌已用GOS预调理(即，其在生产过程中已在GOS上生长)时，此类益生菌在暴露于个体胃肠道中的此低聚糖时于是能够更快速地开始消耗GOS。GOS的此类更快消耗与对消耗预调理的细菌和GOS的个体的提高的有益效果(尤其是增加的合生效应)相关联。

从本专利申请的示例可以看出，用GOS预调理的测试菌株与在右旋糖上生长的菌株相比显示出较短的滞后阶段。预调理的细菌和非预调理的细菌的滞后阶段持续时间之间的差异因菌株而异，但所有测试菌株均表现出显著缩短的滞后阶段。缩短的滞后阶段与预调理的细菌对GOS的更快吸收和提高的合生效应相关联。即，预调理的细菌已被确定为具有改善的效果以促进个体肠道中的健康微生物区系，并且表现出与更健康的微生物区系相关联的其它优点，诸如调节个体的免疫防御，促进个体的免疫防御，预防、治疗或减少个体的炎症，提高个体胃肠道中总短链脂肪酸、乙酸盐和/或乳酸的产生，或减少个体胃肠道中铵的产生。

定义

如本文所用，下列术语具有下列含义。

术语“婴儿”是指年龄在12个月以下的儿童。

表述“幼儿”是指年龄介于一岁和三岁之间的儿童，也称为学步儿童。

表述“营养组合物”是指供给个体养分的组合物。这种营养组合物通常为口服或静脉内施用，并且其通常包括脂质或脂肪源以及蛋白质源。

在一个具体实施方案中，本发明的组合物是低变应原营养组合物。表述“低变应原营养组合物”是指不大可能引起过敏反应的营养组合物。

在一个具体实施方案中，本发明的组合物是“合成营养组合物”。表述“合成的营养组合物”是指通过化学和/或生物方法所获得的混合物，该混合物的化学性质可能与哺乳动物乳汁中天然存在的混合物相同(也就是说，合成的组合物不是母乳)。

如本文所用，表述“婴儿配方食品”是指旨在专用于供给在生命的头几个月期间的婴儿营养，而且本身满足这类人的多种营养需求的食料(符合欧盟委员会2006年12月22日颁发的针对婴儿配方食品和较大婴儿配方食品的第91/321/EEC 2006/141/EC号指令中第2(c)条的规定)。也是指旨在用于婴儿的营养组合物，并且如在食品法典委员会(法典STAN72-1981)和婴儿特殊品(包括针对特殊医学目的的食物)中所定义。表述“婴儿配方食品”既涵盖“1段婴儿配方食品”，也涵盖“2段婴儿配方食品”或“较大婴儿配方食品”。

“2段婴儿配方食品”或“较大婴儿配方食品”从第6个月开始给予。婴儿配方食品构成了这类人逐渐多样化饮食中的主要液体元素。

表述“婴孩食物”是指旨在专用于供给在生命的头一年期间的婴儿或幼儿营养的食料。

表述“婴儿谷物组合物”是指旨在专用于供给在生命的头一年期间的婴儿或幼儿营养的食料。

术语“强化剂”是指适于与母乳或婴儿配方食品混合的液体或固体营养组合物。

表述“天龄/周龄/月龄/年龄”和“出生天数/周数/月数

/年数”可以互换使用。

“母乳”应理解为母亲的乳汁或初乳。

“低聚糖”为含有少量(通常三份至十份)普通糖(单糖)的糖类聚合物。

术语低聚半乳糖或“GOS”是指包含至少三个半乳糖单元的低聚糖。

术语“益生元”是指由赋予健康有益效果的宿主微生物选择性地利用的底物(专家共有文献：The International Scientific Association for Probiotics andPrebiotics(ISAPP)consensus statement on the definition and scope ofprebiotics，Nature Reviews Gastroenterology&Hepatology，2017，14，491-502(益生菌和益生元国际科学协会(ISAPP)关于益生元定义和范围的共识声明，《自然评论：胃肠病学与肝脏病学》，2017年，第14期，第491-502页))。

术语“益生菌”是指当以足够的量施用时向宿主赋予健康有益效果的活微生物(FAO/WHO，2002年)。微生物细胞一般为细菌或酵母。

术语“合生素”是指组合益生菌和益生元并且其中益生元选择性地支持益生菌的营养组合物或食物补充剂(参见DeVrese和Schrezenmeir，Probiotics，prebiotics andsynbiotics in food biotechnology，Springer Berlin Heidelberg，pp1-66(《食品生物技术中的益生菌、益生元和合生素》，柏林海德堡斯普林格出版社，第1-66页))。术语“合生效应”在本文中是指与单独的益生菌的效应相比，合生素的有利健康效应的增加。

术语“cfu”应理解为菌落形成单位。

术语“afu”应理解为活性荧光单位。

术语“预调理”益生菌是指在产生益生菌的过程中在GOS上生长益生菌。术语“预调理的益生菌”是指通过包括预调理步骤的方法产生的益生菌。

“galCDEGR(A)操纵子”是指其中所有的galC、galD、galE、galG和galR基因都存在并且其中galA任选地存在的操纵子。因此，其中缺失galA基因的益生菌应被理解为具有galCDEGR(A)操纵子。

术语“滞后阶段”是指细菌达到酸化速率(TM)最大值的时间。

术语“蛋白胨”是指来自蛋白质来源诸如酵母、肉、酪蛋白、明胶或植物来源的自溶产物或水解产物。“酵母蛋白胨”是来自酵母的自溶产物或水解产物。

除非另外指明，否则所有百分比均按重量计。

预调理的益生菌

本发明组合物中的益生菌具有galCDEGR(A)操纵子。此类基因先前已被鉴定为益生菌(诸如短双歧杆菌)在GOS上生长所必需的。参见例如Motherway等人的文章Transcriptional and functional characterization of genetic elements involvedin galacto-oligosaccharide utilization by Bifidobacterium breve UCC2003，Microbial Technology，2013，6(1)：67-79(短双歧杆菌UCC200利用低聚半乳糖所涉及的遗传元件的转录和功能表征，《微生物技术》，2013年，第6卷第1期，第67-79页)。

galCDEGR(A)操纵子是包含galC、galD、galE、galG和galR基因并且任选地包含galA基因的基因簇。基因galC、galD和galE对具体地内化具有低聚合度(DP)的GOS的ABC转运系统进行编码。它们随后被细胞内β-半乳糖苷酶水解，其中一个被galG编码。由此产生的葡萄糖直接喂入双歧分流，而半乳糖首先通过Leloir途径转化成葡萄糖，然后也被喂入双歧分流。galR是Lacl型DNA结合蛋白，其控制galCDEGR操纵子以及galA基因的转录。galA对内化之前DP高于3的细胞外内切葡聚糖酶降解GOS组分进行编码。由于操纵子的其它基因足以消耗DP为2至3的低聚糖(其在GOS中是十分丰富)，因此益生菌不需要galA也能够消耗GOS。以下示例将示出具有和不具有galA的细菌菌株表现出有利改善的合生特性。在一个示例中，益生菌具有galCDEGR(A)操纵子并且galA基因存在于细菌基因组中。

galCDEGR(A)操纵子的确切序列因菌株而略有不同。然而，这些序列的序列彼此充分相似，使得技术人员可容易地鉴定基因组已测序的一个特定菌株是否具有galCDEGR(A)操纵子。可以筛选益生菌基因组与galCDEGR(A)操纵子序列的序列同源性，如Motherway等人在Transcriptional and functional characterization of genetic elementsinvolved in galacto-oligosaccharide utilization by Bifidobacterium breveUCC2003，Microbial Technology，2013，6(1)：67-79(短双歧杆菌UCC200利用低聚半乳糖所涉及的遗传元件的转录和功能表征，《微生物技术》，2013年，第6卷第1期，第67-79页)中所述。该文档的教导内容据此以引用方式并入本文。此类筛选可例如用美国国家生物技术信息中心(NCBI)提供的(基本局部对齐搜索工具)执行。

优选地，包含galCDEGR(A)操纵子的益生菌是双歧杆菌或乳杆菌，更优选地，其选自动物双歧杆菌乳酸亚种、长双歧杆菌、短双歧杆菌和约氏乳杆菌。最优选地，其选自动物双歧杆菌乳酸亚种CNCM I-3446、长双歧杆菌ATCC BAA-999、长双歧杆菌ATCC15707、长双歧杆菌CNCM I-5259、短双歧杆菌CNCM I-3914和约氏乳杆菌CNCM I-1225。在另一个优选的实施方案中，包含galCDEGR(A)操纵子的益生菌为双歧杆菌，更优选地，其选自动物双歧杆菌乳酸亚种、长双歧杆菌和短双歧杆菌。最优选地，其选自动物双歧杆菌乳酸亚种CNCM I-3446、长双歧杆菌ATCC BAA-999、长双歧杆菌ATCC15707、长双歧杆菌CNCM I-5259和短双歧杆菌CNCM I-3914。

存在于本发明组合物中的益生菌必须是活益生菌，因为合生效应与消耗组合物的个体的胃肠道中的细菌对GOS的消耗相关联。当细菌能够在受控培养条件下繁殖并形成菌落或悬浮液时，或者当微生物代谢活性和/或膜完整性可使用本领域技术人员已知的方法(诸如例如流式细胞术)建立时，这些细菌被认为是“活”的。

已如上所述，包含在本发明组合物中的益生菌必须经过预调理，以使其在稍后用GOS消耗时具有改善的合生效应，即，其在其产生过程中必须在GOS上生长。优选地，益生菌通过包括在包含GOS来源的培养基中发酵益生菌的步骤的方法获得，并且更优选地，GOS来源是碳水化合物的唯一来源。更优选地，益生菌通过包括作为单个发酵步骤的方法获得，该步骤在包含GOS来源的培养基中发酵细菌。

用于生长益生菌的GOS来源可以基本上纯的GOS的形式提供，或作为包含GOS的混合物(诸如碳水化合物的混合物)的一部分提供。基本方面是在生长培养基中提供足量的GOS。在一个优选的实施方案中，GOS来源以诸如在发酵培养基中提供至少0.2％、优选至少0.25％、更优选至少0.6％的GOS的量加入。在一个优选的实施方案中，GOS来源以诸如在生长培养基中提供至多3％、优选至多2.8％的GOS的量提供。

当使用碳水化合物的混合物作为GOS来源时，优选此类混合物中GOS的量为至少20％，优选为至少30％，更优选为至少40％，甚至更优选为至少45％，最优选为至少48％。虽然在发酵期间细菌不必仅消耗GOS作为碳来源，但GOS来源中高比例的GOS有利于细菌在发酵期间消耗GOS超过消耗其它碳水化合物，从而导致改善的预调理效果。

可有利地用作GOS来源以生长益生菌的一种具体类型的碳水化合物混合物是GOS和牛乳低聚糖的混合物。具体地，优选使用GOS与3′-唾液酸乳糖和/或6′-唾液酸乳糖的混合物。实际上，此类混合物含有一些类似于人乳的低聚糖，当本发明的组合物用作婴儿配方食品或婴儿的营养补充剂时，这是尤其有利的。此类有益效果描述于例如Simeoni等人的文章“Gut microbiota analysis reveals a marked shift to bifidobacteria by astarter infant formula containing a synbiotic of bovine milk-derivedoligosaccharides and Bifidobacterium animalis subsp lactis CNCMI-3446”；Environ Microbiol，2016，18(7)：2185-2195(肠道微生物区系分析显示，一种包含得自牛乳的低聚糖和动物双歧杆菌乳酸亚种CNCM I-3446的合生素的1段婴儿配方奶粉对双歧杆菌有明显的偏移，《环境微生物学》，2016年，第18卷第7期，第2185-2195页)。此类组合物的通常获得方式可为，浓缩脱矿质乳清渗透物以获得浓缩的牛乳低聚糖组合物，然后添加GOS或通过具有水解和聚合酶活性的β-半乳糖苷酶的作用由乳糖的水解就地生成GOS。后者是优选的，因为由β-半乳糖苷酶水解乳糖形成GOS还减少了将用作GOS来源的最终成分的乳糖含量。

还优选的是用于产生益生菌的生长培养基中的GOS来源与本发明组合物中的益生菌组合的GOS成分相同。

除GOS来源之外，培养基的其它组分为在本领域中通常用于益生菌培养基的生长培养基中的那些，该生长培养基含有最低营养要求，如氮来源(蛋白胨)和矿物质。例如，可使用诸如MRS型培养基的培养基。因此，合适的生长培养基的一个示例为MRS型培养基，其经修饰以使得如上所述的GOS来源被用作碳水化合物的唯一来源。

为了使益生菌表现出来源于本文所述的预调理步骤的改善的合生效应，益生菌在其中生长的生长培养基必须含有至少一种蛋白胨作为氮来源。可使用任何常用于MRS型培养基中的蛋白胨，诸如酵母蛋白胨、肉蛋白胨和酪蛋白胨。要使用的优选蛋白胨因菌株而异。生长特定菌株的本领域的技术人员非常清楚哪种类型的蛋白胨是优选的。对于对干燥过程敏感的菌株，尤其是涉及使用热诸如喷雾干燥的干燥方法，蛋白胨是尤其有利的，因为在生长培养基中使用蛋白胨已被证明是有效的，可使菌株在此类方法期间更具抗性。基于生长培养基的总重量计，蛋白胨优选以0.1重量％至7重量％的量存在。

用于发酵益生菌的细菌生长培养基优选还包含酵母提取物，并且更优选还包含聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(80)、DATEM和卵磷脂中的至少一种。卵磷脂是尤其有利的，因为其可安全地用于大多数敏感消费者诸如婴儿包括早产婴儿或儿科个体的产品中。

除蛋白胨之外，还可使用另外的氮来源，诸如酵母提取物。此类酵母提取物是本领域的技术人员所熟知的。它是益生菌的一个优选氮来源，尤其适合以高收率生长益生菌。可使用通常用于益生菌的生长培养基中的任何类型的酵母提取物。最佳酵母提取物可因菌株而异。对于每种菌株，应根据本领域技术人员的知识来选择具体的酵母提取物。基于生长培养基的总重量计，酵母提取物优选以至多6重量％的量存在。

细菌生长培养基可包含本领域技术人员熟知的另外成分，诸如盐。可有利地存在于生长培养基中的盐的示例包括碳酸钙、柠檬酸二氢铵、乙酸钠、MgSO₄、MnSO₄或Na₂HPO₄。要使用的盐的选择取决于要制备的菌株，并且是本领域技术人员所熟知的。

发酵步骤以本领域技术人员熟知的方式进行。发酵包括用限定量的细菌(cfu或afu)接种无菌生长培养基，然后在限定温度(通常为37℃)和pH下温育的步骤。合适的收率可使用如上所述的包含GOS的发酵培养基获得，而与本领域的技术人员将用于通过标准生长培养基发酵相同菌株的方法相比，不改变发酵条件。

发酵可在厌氧或有氧条件下进行，具体取决于要产生的菌株。当益生菌为双歧杆菌属时，优选在厌氧条件下发酵。另外，可控制或不控制pH，具体取决于已知最适合特定菌株生长的条件。发酵步骤的温度和持续时间可因菌株而异，并且也是益生菌发酵领域的技术人员所熟知的。

收获步骤旨在将细菌细胞与生长培养基分离开来，该步骤也以本领域技术人员熟知的方式进行，诸如通过浓缩细菌。收获步骤可包括洗涤步骤，但优选的是尽可能在工业过程中避免洗涤步骤，以减少成本并促进方法的简单性。

任选地，益生菌在收获后进行干燥。干燥步骤可使用任何已知的方法进行，诸如喷雾干燥、流化床干燥、空气对流干燥、大气压干燥、辊式干燥或冷冻干燥，并且更优选的是喷雾干燥。

任选地，细菌还可在干燥步骤之前与保护试剂和/或载体混合，如本领域技术人员已知的那样并且视要使用的干燥方法和要干燥的细菌而定。

如果包含未知来源的galCDEGR(A)操纵子的益生菌是诸如本文所述的预调理的细菌，则可通过比较在其它发酵条件相同但存在特定类型的蛋白胨的情况下其在GOS上和右旋糖上的生长容易地鉴定。本发明的细菌在GOS上的生长将比在右旋糖上快，而正常细菌(即，未用GOS预调理的细菌)将在GOS上和右旋糖上以相同速率生长，或甚至在GOS上比在右旋糖上生长速度更慢。具体类型的蛋白胨为具有下列组成的得自酵母的自溶产物或水解产物：

-1.6至3.2的AN

-10至12的TN

-13至22的AN/TN

因此，在一个优选的实施方案中，包含galCDEGR(A)操纵子的益生菌能够在存在蛋白胨的情况下在GOS上比在右旋糖上更快地生长，其中所述益生菌通过包括在包含低聚半乳糖和蛋白胨的细菌生长培养基中发酵益生菌和收获培养的益生菌的步骤的方法获得。用于鉴定未知益生菌是否是如本文所述的细菌的详细方法提供于下文实施例5中。

包含预调理的益生菌和GOS的组合物

本发明涉及包含有效量(优选为治疗有效量)的GOS和预调理的益生菌(诸如上文所述的益生菌)的组合物。尤其有利的是，将GOS与如上所述的用GOS预调理的细菌组合，因为它们一起表现出比GOS与未预调理的相同细菌的合生效应更强的合生效应。

GOS以有效量优选以治疗有效量存在于组合物中。此类有效量或治疗有效量根据消耗组合物的个体以及所寻求的有益效果而异。技术人员知道如何根据待治疗的个体和期望的治疗效果来给药GOS的量。

优选地，组合物包含基于干物质的至少0.2％、优选至少1.5％的GOS。更优选地，组合物包含1.5％至8％、优选2％至7.5％、更优选3％至8％、更优选4％至7％、甚至更优选5％至6％、并且最优选5.5％至6％的GOS。

组合物中所含的GOS可由任何种类的GOS来源提供，前提条件是在组合物中提供有效量优选治疗有效量的如上定义的GOS。GOS来源优选如上文在专用于细菌生长培养基中使用的GOS来源的部分中所述。优选地，存在于本发明组合物中的GOS来源与用于细菌发酵的生长培养基中使用的GOS来源相同。

存在于本发明组合物中的益生菌是如上所定义的预调理的细菌。优选地，益生菌以按干重计至少5E+05、优选9E+05、更优选2E+06CFU/克产品的量存在于组合物中。

本发明的组合物可为可掺入益生菌的任何类型的组合物，诸如食物产品、饮料、动物饲料产品、人或动物的营养补充剂、药物组合物或化妆品组合物。产物可为固体或液体。优选地，组合物为粉末形式，在这种情况下，其可旨在由最终消费者以固体(诸如粉末形式)或半固体形式(诸如糊剂形式)使用，或者另选地，在使用前重构成液体。

出于提供营养和/或愉悦的目的，食物产品和饮料包括旨在由人类口服食用的所有产品。它可以例如是营养组合物，诸如用于婴儿和/或幼儿，用于孕妇或哺乳期妇女或希望怀孕的妇女，用于因健康状况不佳而需要特殊营养的个体，或用于老年人。更优选地，该营养组合物选自婴儿配方食品、婴儿谷物、较大婴儿配方食品、成长乳、功能乳以及用于孕妇和哺乳期妇女或希望怀孕的妇女的乳制品。食品和饮料产品的其它示例包括甜味和成味小吃、粉末状饮料、谷物产品和乳制品，诸如乳制品或酸奶。在一个实施方案中，该产品不是发酵产品。更优选地，该产品是婴儿配方食品、较大婴儿配方食品、成长乳或用于孕妇或哺乳期妇女的产品。最优选地，该产品是婴儿配方食品。

该产品还可以呈动物食物产品或用于动物的营养补充剂的形式。优选，该动物是哺乳动物。动物的示例包括牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠、鱼、鸟等。

营养补充剂通常以液体(诸如冷藏液体)、粉末或片剂或胶囊的形式存在。优选地，其为粉末、片剂或胶囊的形式。粉末补充剂通常包含待溶解于液体中或喷洒在食品或饮料中的补充剂。此类补充剂旨在为食用它的个体提供额外的营养物质和/或健康益处，以及其它有益成分，诸如有益微生物，例如益生菌。根据本发明的补充剂可用于为人类以及动物提供营养物质和/或健康益处，如上所定义。营养补充剂包括例如添加到母乳中的粉末补充剂，例如用于早产或低出生体重婴儿。它还包括用于孕妇或哺乳期妇女或希望怀孕的妇女的补充剂。

药物产品包括旨在治疗或预防有需要的个体的不良医疗状况或促进有利健康状况的粉末、片剂或胶囊产品。

化妆品组合物通常旨在对身体具有美观效果，并且可用于局部用途或可通过口服途径以粉末、片剂或胶囊的形式施用。

第一医疗用途

如上所述，预调理的益生菌或包含预调理的益生菌和GOS的组合物可有利地用于治疗中。因此，本发明还提供了此类益生菌和此类组合物在治疗中的用途。

本文中的治疗旨在治愈或预防身体疾病或失调，并且还涵盖预防性治疗，即预防不良医疗状况。治疗在本文中也旨在包括人和动物治疗。

如将在以下实施例中所示，事实是细菌已经过预调理(即，在它们的生产过程中在GOS上生长)，在细菌再次暴露于GOS后，提高益生菌与GOS的合生效应。这使得预调理的益生菌和上述组合物对于治疗目的非常有用。

尽管在现有技术中已经描述了益生菌在GOS上的生长，但没有文档教导或甚至暗示与在其它碳水化合物上生长的细菌相比，在GOS上生长的此类细菌可有利地在发酵后再次暴露于GOS，甚至更不会教导或暗示此类细菌将具有优异的治疗效果(即，在随后面临GOS时的优异合生效应)。

治疗效果仅受细菌暴露于与个体接触的GOS的影响，无论是例如在个体的胃肠道中还是在个体的皮肤上。优选地，治疗效果受细菌暴露于个体胃肠道中的GOS的影响。

在一个实施方案中，本发明提供一种用于治疗中的益生菌，所述益生菌包含galCDEGR(A)操纵子，其中所述益生菌通过包括以下步骤的方法获得：

b.收获所培养的益生菌，

其中益生菌暴露于待治疗个体中或个体上(优选在待治疗个体的胃肠道中)的GOS。

换句话讲，本发明涉及用于治疗个体的方法，该方法包括向个体施用有效量的包含galCDEGR(A)操纵子的益生菌，其中所述益生菌通过包括以下步骤的方法获得：

b.收获所培养的益生菌，

并且其中益生菌暴露于待治疗个体中或个体上(优选在待治疗个体的胃肠道中)的GOS。

另外，本发明提供一种用于治疗中的组合物，所述组合物包含有效量的低聚半乳糖以及包含galCDEGR(A)操纵子的益生菌，其中所述益生菌通过包括以下步骤的方法获得：

b.收获所培养的益生菌。

换句话讲，本发明涉及用于治疗个体的方法，该方法包括向个体施用有效量的包含有效量的低聚半乳糖以及包含galCDEGR(A)操纵子的益生菌的组合物，其中所述益生菌通过包括以下步骤的方法获得：

b.收获所培养的益生菌。

在另一个实施方案中，本发明涉及包含galCDEGR(A)操纵子的益生菌的用途，其中所述益生菌通过包括以下步骤的方法获得：

b.收获培养的益生菌用于制造药物。

优选地，该药物与GOS一起施用。

在另一个实施方案中，本发明涉及包含有效量的低聚半乳糖以及包含galCDEGR(A)操纵子的益生菌的组合物的用途，其中所述益生菌通过

包括以下步骤的方法获得

b.收获培养的益生菌用于制造药物。

其它医疗用途

本发明提供了如上所述的预调理的益生菌或组合物在以下具体治疗方法中的用途：

b)在调节个体免疫应答的方法中的用途；

c)在促进个体免疫防御的方法中的用途；

d)在预防、治疗或减少个体感染的方法中的用途；

e)在预防、治疗或减少个体炎症的方法中的用途；以及

f)在促进个体肠道中的健康微生物区系的方法中的用途。

上面列出的具体治疗用途全部与微生物区系的更快生长和胃肠道中更合适的微生物区系代谢相关联。

本发明还提供了如上所述的预调理的益生菌或组合物在以下具体治疗方法中的用途：

a)在改善个体胃肠道中的微生物区系活性的方法中的用途，优选改善微生物区系的代谢活性，优选改善婴儿或幼儿胃肠道中的微生物区系的代谢活性；

b)在提高个体胃肠道中的总短链脂肪酸产量的方法中的用途；

c)在提高个体胃肠道中的乙酸盐产量的方法中的用途；

d)在提高个体胃肠道中的乳酸产量的方法中的用途；或

e)在减少个体胃肠道中的铵产量的方法中的用途。

b.收获所培养的益生菌，

在以下方法中的用途

I.调节个体免疫应答的方法；

II.促进个体免疫防御的方法；

III.预防、治疗或减少个体感染的方法；

IV.预防、治疗或减少个体炎症的方法；或

V.促进肠道中的健康微生物区系的方法；

VI.改善个体胃肠道中的微生物区系活性的方法，优选改善微生物区系的代谢活性，优选改善婴儿或幼儿胃肠道中的微生物区系的代谢活性；

VII.提高个体胃肠道中的总短链脂肪酸产量的方法；

VIII.提高个体胃肠道中的乙酸盐产量的方法；

IX.提高个体胃肠道中的乳酸产量的方法；或

X.减少个体胃肠道中的铵产量的方法，

其中益生菌暴露于个体中或个体上(优选个体的胃肠道中)的GOS。

换句话讲，本发明涉及用于以下用途的方法

I.调节个体的免疫应答；

II.促进个体的免疫防御；

III.预防、治疗或减少个体的感染；

IV.预防、治疗或减少个体的炎症；或

V.促进个体肠道中的健康微生物区系；

VI.改善个体胃肠道中的微生物区系活性，优选改善微生物区系的代谢活性，优选改善婴儿或幼儿胃肠道中的微生物区系的代谢活性；

VII.提高个体胃肠道中总短链脂肪酸的产量；

VIII.提高个体胃肠道中乙酸盐的产量；

IX.提高个体胃肠道中乳酸的产量；

或

X.减少个体胃肠道中铵的产量，包括向个体施用有效量的包含galCDEGR(A)操纵子的益生菌，其中所述益生菌通过包括以下步骤的方法获得：

b.收获所培养的益生菌，

并且其中益生菌暴露于个体中或个体上(优选在个体的胃肠道中)的GOS。

本发明还提供包含有效量的低聚半乳糖以及包含galCDEGR(A)操纵子的益生菌的组合物，其中所述益生菌通过包括以下步骤的方法获得：

b.收获所培养的益生菌，

在以下方法中的用途

I.调节个体免疫应答的方法；

II.促进个体免疫防御的方法；

III.预防、治疗或减少个体感染的方法；

IV.预防、治疗或减少个体炎症的方法；或

V.促进肠道中的健康微生物区系的方法；

VII.提高个体胃肠道中的总短链脂肪酸产量的方法；

VIII.提高个体胃肠道中的乙酸盐产量的方法；

IX.提高个体胃肠道中的乳酸产量的方法；或

X.减少个体胃肠道中的铵产量的方法。

换句话讲，本发明涉及用于以下用途的方法

I.调节个体的免疫应答；II.促进个体的免疫防御；

III.预防、治疗或减少个体的感染；

IV.预防、治疗或减少个体的炎症；或

V.促进个体肠道中的健康微生物区系；

VII.提高个体胃肠道中总短链脂肪酸的产量；

VIII.提高个体胃肠道中乙酸盐的产量；

IX.提高个体胃肠道中乳酸的产量；

或

X.减少个体胃肠道中铵的产量，包括向个体施用有效量的低聚半乳糖以及包含galCDEGR(A)操纵子的益生菌的组合物，其中所述益生菌通过包括以下步骤的方法获得：

b.收获所培养的益生菌。

c.在包含低聚半乳糖和蛋白胨的细菌生长培养基中发酵该益生菌；以及

d.收获培养的益生菌，

用于制造针对以下目的药物

I.调节个体的免疫应答；II.促进个体的免疫防御；

III.预防、治疗或减少个体的感染；

IV.预防、治疗或减少个体的炎症；或

V.促进个体肠道中的健康微生物区系；

VII.提高个体胃肠道中总短链脂肪酸的产量；

VIII.提高个体胃肠道中乙酸盐的产量；

IX.提高个体胃肠道中乳酸的产量；

或

X.减少个体胃肠道中铵的产量；

优选地，该药物与GOS一起施用。

在另一个实施方案中，本发明涉及包含有效量的低聚半乳糖以及包含galCDEGR(A)操纵子的益生菌的组合物的用途，其中所述益生菌通过包括以下步骤的方法获得

d.收获培养的益生菌，

用于制造针对以下目的药物

I.调节个体的免疫应答；

II.促进个体的免疫防御；

III.预防、治疗或减少个体的感染；

IV.预防、治疗或减少个体的炎症；或

V.促进个体肠道中的健康微生物区系；

VII.提高个体胃肠道中总短链脂肪酸的产量；

VIII.提高个体胃肠道中乙酸盐的产量；

IX.提高个体胃肠道中乳酸的产量；

或

X.减少个体胃肠道中铵的产量；

方法

本发明还提供用于提高包含低聚半乳糖(GOS)以及包含galCDEGR(A)操纵子的益生菌的组合物的治疗效果的方法，该方法包括：

b.收获所培养的益生菌，

然后将该益生菌掺入合生素组合物中。

已如上所述并且如以下实施例中所证实，与在其它低聚糖诸如糖上生长的益生菌相比，当益生菌在作为碳水化合物来源的GOS上生长时，增加了包含galCDEGR(A)操纵子的益生菌与GOS的有益合生效应。

在一个优选的实施方案中，该方法是用于提高组合物调节个体的免疫防御，促进个体的免疫防御，预防、治疗或减少个体的感染，预防、治疗或减少个体炎症或促进个体肠道中的健康微生物区系的效果的方法。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于提高包含galCDEGR(A)操纵子的益生菌消耗GOS的能力的方法，该方法包括：

b.收获所培养的益生菌。

在一个优选的实施方案中，当益生菌在收获步骤后暴露于GOS时，更优选在益生菌与个体胃肠道中的GOS接触时，此类方法缩短益生菌开始消耗GOS所需的时间。个体可为人类或动物，优选为人类，更优选为婴儿或幼儿或孕妇或哺乳期母亲，最优选为婴儿。

现在将通过以下实施例更详细地描述本发明。

实施例1：所选双歧杆菌的预调理效应

通过基因组分析选择双歧杆菌属菌株

针对本试验选择与婴儿肠道微生物区系相关联的动物双歧杆菌菌种、短双歧杆菌和长双歧杆菌的菌株的选择，并且列于表1中。在基因组可用的情况下，使用WallGene 1.5(Genostar，Montbonnot-Saint-Martin，France)，筛选针对GOS消耗，是否存在短双歧杆菌UCC2003需要的galCDEGR(A)操纵子。

表1：选择用于基因组分析的菌株。

所有经筛选的其基因组可用的菌株具有负责GOS摄取和水解的galCDEGR(A)操纵子(表2)。另一方面，对内切葡聚糖酶进行编码的galA基因仅存在于一个长双歧杆菌菌株中，其中内切葡聚糖酶会降解聚合度(DP)＞5的GOS组分。

表2：在所选的双歧杆菌属菌株中存在(√)或不存在(×)的galCDEGR(A)操纵子和 galA基因(n/a：基因组序列不可用)

种	亚种	菌株	galCDEGR(A)	galA
					动物双歧杆菌	乳酸	NCC2818	√	×
短双歧杆菌		NCC466	√	√
					长双歧杆菌	长	NCC435	√	×
长双歧杆菌		NCC3001	√	×
					长双歧杆菌		NCC4020	√	√

2双歧杆菌属菌株在GOS上的生长

2.1细菌菌株

对于菌株NCC3001和NCC2818，使用内部产生的冷冻发酵剂培养物。对于其它15种菌株，在37℃下厌氧温育的de Man，Rogosa，Sharpe(MRS)发酵液(Oxoid，Hampshire，UK)+0.05％半胱氨酸(Sigma-Aldrich，St.Louis，USA，30120)中再活化冻干培养物。在气密箱中由小囊(Thermo Fisher Scientific，USA)产生厌氧条件，并且由指示条(Biom é rieux，France)控制。在MRS发酵液+0.05％半胱氨酸中再活化2至3次后，用培养物制备等分试样：无菌85％甘油(Merck，Germany，104094)，比率60∶40，然后保存在-80℃下。使用时，解冻冷冻培养物并且在实验前在厌氧条件下在MRS发酵液+0.05％半胱氨酸中进行一次过夜。

2.2双歧杆菌属菌株在GOS上的生长筛选

筛选双歧杆菌属菌株在两种不同GOS来源上生长的能力。评估两种不同的GOS来源：具有表3中提供的组成的碳水化合物混合物(BMOS；来源：Nestl é；48％GOS)和Purimune^TM GOS(来源：GTC Nutrition；最少90％GOS)。通过连续光密度(OD)测量来监测生长。用于选择菌株的基础生长培养基(BM)是MRS-API发酵液+0.05％半胱氨酸。添加30gBMOS(BM+BMOS；对应于14.4g纯GOS)或30g Purimune^TM GOS(BM+P-GOS；对应于27g纯GOS)/升作为碳来源，以修饰此基础培养基。表4中指定了用于制备用于此实验和进一步实验的培养基的MRS-API发酵液和原液的成分以及所应用的保存程序。用Purelab Ultra(ELGALabwater，High Wycombe，UK)(18.2MΩ-cm)纯化用于制备溶液的水。

表3：用作GOS来源的BMOS碳水化合物混合物的组成

在96孔板中的290μL每种生长培养基(BM、BM+BMOS和BM+P-GOS)中测量双歧杆菌属菌株的生长动力学，一式三份。在MRS发酵液+半胱氨酸中用10μL过夜培养物接种培养基。还包括含有非接种培养基的三个孔作为生长培养基中的每种的阴性对照物。将96孔板置于SpectraMax340PC384微板读取器(Molecular Devices，Sunnyvale，USA)中，并且施加如下动力学设置：温度37℃，运行时24小时，读取620nm波长处的吸光度，间隔15分钟，以及在读取之前和之后自体融合5秒钟。然后由所获得的值确定算术平均值和标准偏差，并且绘制不同菌株的平均曲线。

在BMOS和P-GOS上生长的测试的双歧杆菌属菌株的平均OD曲线分别示于图1和图2中。值的标准偏差＜0.05(数据未示出)。在BMOS和P-GOS上均观察到所有菌株的生长。在未针对任何菌株添加碳来源的情况下，在BM中未观察到OD增加(数据未示出)。

表4：为实验制备的溶液所用的成分、供应商和保存方法。

2.3所选双歧杆菌属菌株在BMOS和P-GOS上的过夜培养

双歧杆菌属菌株在20mL生长培养基(BM，BM+乳糖(20g/L乳糖，表4)，BM+BMOS，BM+P-GOS)中进行测试，该培养基填充在50mL无菌falcon管中。BM和BM+乳糖分别用作阴性和阳性生长对照物。在MRS发酵液+半胱氨酸中用600μL过夜培养物接种培养基。此外，包含20mL未接种的培养基作为阴性对照物。接种后，将管在37℃下厌氧温育20小时。温育后，以目视方式筛选所有管的浊度。对于含有BM+BMOS和BM+P-GOS的管，通过流式细胞术确定细胞计数，并且通过高效液相色谱法(HPLC)测量低聚糖的使用。

2.4通过流式细胞术测量细菌生长

细胞计数通过流式细胞术确定，如ISO 19344：2015(IDF 232)中所述。在第一步中，在胰蛋白胨盐(Oxoid，LP0042)溶液中进行样品的连续十进制稀释。将含有约10⁶cfu/mL的最佳值的100μL适当稀释液转移到96孔深孔板中的880μL磷酸盐缓冲盐水(PBS，Sigma，P4417)中。随后，加入10μL碘化丙啶(Thermo Fisher，P1304MP)的0.2mM水溶液和10μL Syto24(Thermo Fisher，S7559)的0.1mM水溶液。然后使用MixMate(Eppendorf AG，Hamburg，Germany)在1500rpm下将板充分混合30秒，然后在37℃的水浴中在没有光的情况下温育15分钟。使用Cytoflex S(Beckman Coulter Inc.，Brea，USA)测量标记的样品，采用如下设置：增益：FSC(120)、SSC(142)、Syto24(204)、PI(115)；主要阈值：信道FSC，5000(高度)，以及次要阈值：信道Syto24，11′000(高度)；宽度：信道FSC；混合1.5秒；反冲6秒；流速：30μL/分钟；在目标时间或300秒内记录10′000个事件。以此方式，确定样品的每mL活性荧光单位(afu/mL)。

2.5通过HPLC确定低聚糖的使用

用2-氨基苯甲酰胺(2-AB)进行标记，然后使用HPLC确定样品中总低聚糖的量，如Austin等人先前所述(Determination of beta-galactooligosaccharides by liquidchromatography；International Journal of Analytical Chemistry，2014：10(通过液相色谱法确定β-低聚半乳糖，《国际分析化学杂志》，2014年，第10期))，但有一些改动。将分别来自BM+3％BMOS和3％P-GOS中的过夜培养物的样品在5000g下离心10分钟(HeraeusMultifuge X1R，Thermo Fisher)。将上清液转移至2mL Eppendorf管中，在80℃下使用Dri-Block DB-2D(Techne Ltd.，Cambridge，UK)热处理15分钟，之后保存在-18℃下。在使用时，在由Milli-Q系统(Millipore，Billerica，USA)生产的去离子水(18MΩ)中稀释样品，以获得约2mg低聚糖/mL样品。向500μL稀释样品溶液中加入200μL昆布三糖(Sigma，L1664)溶液(0.3mmol/L)。涡旋混合物，之后将20μL等分试样转移至200μL 2-AB试剂，该试剂通过使用超声波浴将0.35mol/L 2-AB(Sigma，A89804)和1.0mol/L氰基硼氢化钠(Sigma，71435)完全溶解于含有30％乙酸(Merck，1.00063)的二甲基亚砜(Sigma，41640)中来制备。将此等分试样2-AB混合物充分涡旋，然后在65±1℃中在水浴中温育2小时±5分钟。反应后，将管混合，并且通过将管置于4℃下至少10分钟进行冷却。随后加入1.5mL乙腈(Merck，1.00030)/水(75/25)。然后涡旋管并在10′000xg下离心5分钟(Eppendorf 5424微型离心机)，然后将1mL上清液转移至适于HPLC自动取样机的小瓶中。

使用Ultimate 3000RS(Dionex，Sunnyville，USA)，采用Benet和Austin(2011年)所描述的配置，在TSK Gel Amide-80保护柱(3.2×15mm，3μm)和分析柱(4.6×150mm，3μm)柱(Tosoh Bioscience，Stuttgart，Germany)中分离标记的低聚糖。使用λex＝330nm和λem＝420nm，通过Dionex RF-2000进行检测。洗脱剂A和B分别为pH为4.4的100％乙腈和50mmol/L甲酸铵(氢氧化铵溶液(Merck，1.05432)，甲酸(Merck，1.00264))。将10μL的标记低聚糖溶液样品以1mL/分钟的流速在等度条件(98％A)下注射到保护筒上7.5分钟。然后将洗脱液从保护筒引导至保持在23℃的分析柱，并且在0.5分钟内将移动相置于84％A中。使用以下条件分离低聚糖：84％A 8分钟至16分钟，然后在50分钟内线性梯度至61％A。在51分钟时，通过将流速降低至0.8mL/分钟并将洗脱液组合物改变成20％A，洗涤柱3分钟。随后将洗脱液组合物在1分钟内恢复至90％A，之后将流速再次设置为1.0mL/分钟。应用这些条件6分钟，在此条件下柱再次取得平衡，之后将系统返回到适于后续样品的负载条件。

通过对所获得的荧光色谱图中的峰进行积分来确定低聚糖浓度。将峰面积(相对于内部标准)与校准曲线的峰面积进行比较，校准曲线是通过以昆布三糖作为内部标准来测量不同浓度的麦芽三糖(Sigma，M8378)而获得的。使用分子量将如此获得的每种组分的摩尔浓度转换成质量浓度(质谱先前通过Austin等人Determination of beta-galactooligosaccharides by liquid chromatography；International Journal ofAnalytical Chemistry，2014：10(通过液相色谱法确定β-低聚半乳糖，《国际分析化学杂志》，2014年，第10期)分配)。

使用Chromeleon 7.2色谱法数据系统软件(Dionex)整合并评估所获得的色谱。为了确定不同菌株使用的低聚糖的量，从针对发酵前的培养基获得的值中减去针对发酵后的培养基获得的值。所有测量均执行两次。对于由此获得的值，计算算术平均值以及标准偏差。

2.6结果

针对发酵前的BM+BMOS和BM+P-GOS培养基获得的色谱显示出轮廓的显著差异。BM+BMOS含有多得多的乳糖，并且因此与BM+P-GOS的每100g培养基1.73g相比具有合计为1.19g的更小的总低聚糖比例(表5)。

表5：每100g培养基的BM+BMOS和BM+P-GOS中的低聚糖级分的量。

虽然两种GOS成分主要包含DP为2至4的小低聚糖，但P-GOS显示出也以更大的量存在的更多种类的不同化合物。对于DP3和DP4低聚糖而言尤其如此。由于GOS成分之间的这些区别，在BMOS和P-GOS之间，双歧杆菌属菌株对低聚糖的使用也存在差异。此外，不同双歧杆菌属菌株表现出不同的使用模式。当NCC2818消耗特定化合物时，NCC435通过减少DP2和DP3的大部分峰显示出更通用的使用模式。此外，NCC435除代谢大量低聚糖之外，几乎消耗所有可用的乳糖，而NCC2818使用更少的乳糖和更少的低聚糖。

分析发酵期间低聚糖的累积降低表明，所有5个测试的双歧杆菌属菌株消耗存在于BMOS和P-GOS中的低聚糖。在BM+BMOS培养基中，动物双歧杆菌乳酸亚种NCC2818和短双歧杆菌菌株主要使用具有DP2和DP3的低聚糖(图3(A))。另一方面，除了DP2和DP3之外，长双歧杆菌菌株消耗还具有与DP4和DP5的更大低聚糖。此外，具有galA的长双歧杆菌菌株NCC4020与不具有该基因的菌株相比，不能代谢更多低聚糖。对于BM+P-GOS，除NCC2818之外的所有菌株均使用90％以上的具有DP2的可用低聚糖(图3(B))。此外，菌株主要代谢DP3级分和少量DP4。然而，一些菌株另外使用具有DP5的低聚糖，然而，没有相同种的菌株显示出通用消耗模式。另一方面，在P-GOS上生长的动物双歧杆菌乳酸亚种NCC2818对低聚糖的低消耗与其9.2log₁₀(afu/mL)的高细胞计数不相关。对于在BMOS和P-GOS上的生长，分别观察到所有菌株获得的细胞计数在值为8.8log₁₀至9.2log₁₀(afu/mL)和8.7log₁₀至9.2log₁₀(afu/mL)的相同范围内(图4)。

由于MRS-API发酵液不用于大规模发酵，并且所选菌株在用于商业生产动物双歧杆菌乳酸亚种NCC2818(IM)的工业培养基中显示出良好的生长，因此对于下列预调理实验，将生长培养基从BM变为IM。为了也确认低聚糖在新培养基中的使用，在IM中对所选菌株重复一次过夜培养实验以及针对低聚糖消耗的后续分析。在IM+BMOS中，长双歧杆菌菌株和动物双歧杆菌乳酸亚种显示出低聚糖的使用较低，总低聚糖消耗量为0.12至0.21g/100g培养基(图5)。另一方面，对于短双歧杆菌菌株，获得的结果类似于在BM中观察到的结果。在IM+P-GOS中，NCC2818和NCC4020也显示低聚糖的使用较低。剩余菌株的GOS代谢量类似于在BM中的情况，并且两个短双歧杆菌菌株显示出略高的消耗。对于除NCC4020(其达到8.4log₁₀(afu/mL))的较低细胞计数之外的所有菌株，测量的细胞计数在两个碳来源上介于8.9log₁₀和9.2log₁₀(afu/mL)之间(图6)。

3预调理实验

在第一步中，在发酵过程中在右旋糖或GOS成分(BMOS或P-GOS)上产生生物质。然后在发酵期间将其暴露于胃液，之后再暴露于GOS成分。图7示出了将BMOS用作GOS来源时的预调理实验的设置方案。类似的设置也适用于P-GOS，其中在该方案中将BMOS替换为P-GOS；Cinac由Wang进行修改(Pr é adaptation et cryotol é rance chez Lactobacillusacidophilus：effet des conditions op é ratoires；Paris，2005，Institut NationalAgronomique Paris-Grignon)。

3.1预调理

双歧杆菌属菌株在填充有50mL生长培养基(IM+右旋糖(30g/L右旋糖，表4)，IM+BMOS)的100mL无菌瓶中生长，一式三份。用10⁷(afu/mL)接种培养基，并且在水浴中于37℃下温育。使用Cinac pH监测系统(Ysebaert，Frepillon，France)监测发酵过程中的酸化，酸化可用作产生乳酸的细菌生长的指示(Spinnler和Corrieu，1989年)。在发酵后，通过流式细胞术和倾注平皿来确定细胞计数。此外，在IM+GOS中对菌株NCC2818重复相同的实验一次，使用流式细胞术测量细胞计数。

3.2模拟胃液

在发酵后从每个瓶中取出含有5×10⁹个细胞(通过流式细胞术确定)的体积并转移至无菌Eppendorf管。然后将这些样品用Biofuge pico离心机(Heraeus Instruments，Hanau，Germany)离心，在16060xg下离心5分钟。随后，丢弃上清液并将粒料再次悬浮于1mL0.9％NaCl(Sigma，S9888)溶液中。再重复此洗涤步骤一次以除去生长培养基的残余物。在由此获得的5×10⁹(afu/mL)的生物质悬浮液中，向2mL Eppendorf管中的1.8mL胃液中加入200μL。每升蒸馏水的胃液含有2.3g胃蛋白酶(Sigma，P7000)和5g NaCl(Sigma，S9888)。将其调节至4.5的pH以模拟婴儿条件。将具有生物质-胃液混合物的管充分涡旋，随后在37℃水浴中温育30分钟。在温育之前和之后，从管中取出100μL样品，以便如2.4章所述通过流式细胞术确定由于胃液引起的细胞计数的损失。

3.3将菌株再次暴露于GOS

在剩余的生物质-胃液混合物中，使用含有5×10⁸个细胞的体积接种50mL的IM+BMOS或IM+P-GOS培养基(10⁷(afu/mL))。随后进行温育，以与前述相同的方式通过Cinac执行pH和发酵后的细胞计数确定。

3.4倾注平皿

通过倾注平皿来确定细胞计数。简而言之，在胰蛋白胨盐(Oxoid，LP0042)溶液中执行样品的连续十进制稀释。随后，将100μL的适当稀释液转移至培养皿并与MRS琼脂(AESChemunex，Bruz，France)+0.5g/L半胱氨酸混合。一式两份地执行分析。然后在37℃的厌氧条件下，在气密箱中温育平皿48小时。通过确定它们的算术平均值，通过在具有适当稀释度的平皿上计数的菌落数计算每mL菌落形成单位(cfu/mL)。

3.5结果

3.5.1动物双歧杆菌乳酸亚种NCC2818

在第一生长通道期间，pH的发展在两个碳来源上非常相似，并且对于作为代表示出的三个平行测定中的一个，含有右旋糖和BMOS的培养基分别显示出4.3和4.4的最终pH(图8(A))。此外，对于发酵结束时达到的细胞计数，未观察到差异。对于在右旋糖上的生长，分别通过流式细胞术和倾注平皿确定出9.06±0.15log₁₀(afu/mL)和8.77±0.36log₁₀(cfu/mL)的细胞计数(表6)。对于在BMOS上的生长，流式细胞术方法测得的细胞计数合计为8.88±0.20log₁₀(afu/mL)(图9)，倾注平皿测得的细胞计数合计为8.78±0.05log₁₀(cfu/mL)。用胃液进行后续处理未导致在两个碳来源中的任一个上生长的动物双歧杆菌乳酸亚种的活细胞减少，并且log₁₀(afu/mL)的变化＜|0.05|(图10)。在将生物质再次暴露于BMOS后，先前在BMOS上增殖的细胞显示出比在右旋糖上生长的细胞短约2.5小时的滞后阶段(图8(A))。

滞后阶段的缩短是改善体内合生效应的关键，因为需要快速效果，尤其是考虑到平均每三个小时喂食的婴儿的喂食模式。

两种发酵均达到约4.4的相等最终pH，这与细胞增殖期间观察到的pH处于相同范围。此外，对于先前在右旋糖和预调理的细胞上生长的生物质，分别达到8.74±0.02log₁₀(afu/mL)/8.67±0.08log₁₀(cfu/mL)和8.73±0.12log₁₀(afu/mL)/8.73±0.17log₁₀(cfu/mL)的最终细胞计数(图11)。

表6：在预调理实验的发酵期间，通过流式细胞术和倾注平皿确定的动物双歧杆菌乳酸亚种NCC2818达到的细胞计数。

使用P-GOS作为GOS成分对菌株NCC2818重复实验。对于在右旋糖和P-GOS上的生长，细胞增殖所达到的最终pH分别为4.3和4.4(图8(B))。在右旋糖上的细胞计数达到9.16log₁₀(afu/mL)，在P-GOS上的细胞计数达到9.04log₁₀(afu/mL)(表7)。在暴露于胃液期间未观察到生物质损失，测得的变化为+0.04log₁₀(afu/mL)。在P-GOS上发酵后，对于预调理的和未预调理的两种生物质，均达到4.8的最终pH和8.9log₁₀(afu/mL)的细胞计数。预调理的细胞的滞后阶段缩短约3小时(图8(B))。然而，同时它比在P-GOS上产生生物质的先前发酵长6小时。

表7：在使用P-GOS的预调理实验的发酵期间，通过流式细胞术确定的动物双歧杆菌乳酸亚种NCC2818达到的细胞计数。

3.5.2其它菌株

其它菌株在右旋糖和BMOS上增殖后分别达到8.7log₁₀至9.1log₁₀(afu/mL)和8.5log₁₀至8.8log₁₀(afu/mL)的细胞计数，显示出在BMOS上生长时所有菌株具有略低的数量(图9)。当所获得的生物质暴露于胃液时，对于log₁₀(afu/mL)的变化＜|0.05|的菌株中的任一者，未观察到细胞计数的变化(图10)。在随后在BMOS上的细胞生长期间，菌株NCC466、NCC2950和NCC435达到8.8log₁₀(afu/mL)的细胞计数，无论它们是否在BMOS上进行预调理(图11)。这些值与针对生长至8.73±0.12log₁₀(afu/mL)的NCC2818获得的值处于相同范围。对于两种生物质，菌株NCC3001达到8.5log₁₀(afu/mL)的细胞计数。另一方面，长双歧杆菌NCC4020为对先前在BMOS上生长的生物质与在右旋糖上增殖的生物质相比测得更高细胞计数的唯一菌株，并且值合计为8.6log₁₀(afu/mL)和8.0log₁₀(afu/mL)。

对于菌株NCC466，对于在右旋糖和BMOS上的增殖，未观察到酸化的差异(图12)。然而，在将此生物质(再次)暴露于BMOS时，预调理的细胞显示比在右旋糖上生长的细胞短约4小时的滞后阶段。

对于不具有galA基因的长双歧杆菌菌株NCC435和NCC3001，在右旋糖和BMOS上的生物质生长之间未观察到显著差异。当这些细胞在暴露于胃液之后在BMOS上生长时，对于菌株NCC435(图13)和NCC3001(图14)，预调理的细胞显示具有约3小时和超过5小时的较短滞后阶段。

对于具有galA基因的长双歧杆菌菌株NCC4020，与右旋糖相比，观察到在BMOS上增殖的细胞具有略低的最终pH(图15)。在将所产生的生物质(再次)暴露于BMOS时，与在BMOS上的生物质生长期间测得的曲线相比，预调理的细胞显示具有相同形状但滞后阶段长约6小时的酸化曲线。然而，先前在右旋糖上生长的细胞具有甚至更长的滞后阶段，并且在5.3的pH下停止酸化。此观察对应于针对此发酵测得的低细胞计数。

概括地说，对于任何菌株，未观察到因暴露于胃液而导致的损失。此外，对于所有菌株，观察到特征在于先前在BMOS上生长的生物质具有较短滞后阶段的预调理效应。

实施例2：用各种GOS浓度预调理动物双歧杆菌乳酸亚种

如实施例1部分3中所述，通过在作为碳来源的BMOS和右旋糖上生长乳双歧杆菌NCC2818来执行预调理实验，但改变了发酵培养基中BMOS和右旋糖的浓度。BMOS以诸如提供0.28％、0.48％、0.95％、1.44％、1.92％、2.4％和2.88％的GOS的浓度使用。BMOS具有48％的GOS含量，纯GOS的这些浓度分别对应于0.6％、1％、2％、3％、4％、5％和6％的BMOS量。

动物双歧杆菌乳酸亚种菌株在填充有50mL生长培养基(IM+右旋糖(30g/L右旋糖，表4)，IM+BMOS)的100mL无菌瓶中生长，一式三份。用10⁷(afu/mL)接种培养基，并且在水浴中于37℃下温育。使用Cinac pH监测系统(Ysebaert，Frepillon，France)监测发酵过程中的酸化，酸化可用作产生乳酸的细菌生长的指示(Spinnler和Corrieu，1989年)。在发酵后，通过流式细胞术和倾注平皿来确定细胞计数。

然后将细菌细胞再次暴露于BMOS。在剩余的生物质-胃液混合物中，使用含有5×10⁸个细胞的体积接种50mL的IM+BMOS(10⁷(afu/mL))。随后进行温育，以与前述相同的方式通过Cinac执行pH和发酵后的细胞计数确定。

对于每个测试条件，预调理和(再次)暴露步骤中用于接种的细菌量、(再次)暴露步骤中的BMOS浓度、胃液步骤、培养基和温度始终相同。不同测试条件之间的唯一差异是碳来源(BMOS或右旋糖)和预调理步骤期间使用的碳来源的浓度。为了比较不同的条件，使用获得最大酸化速率(TM)的时间，即通过Cinac监测系统获得的pH曲线的拐点，因为它是评估细菌生长速度的客观参数。低TM意味着快速的细菌生长。

如图16中所示，对于再次暴露于BMOS后的动物双歧杆菌乳酸亚种的生长情况，先前在BMOS上生长的细菌比先前在右旋糖上生长的细菌的生长更快，这表明在宽泛的浓度范围内并且甚至在低至0.28％的浓度下实现了预调理效应。

实施例3：预调理的动物双歧杆菌乳酸亚种对婴儿微生物区系的效果

此实验的目的是评价不同制剂(具有或不具有GOS的预调理的或非预调理的益生菌)与阴性对照物在短期结肠温育(48小时)期间的促生和合生效应。这些结肠温育的目的是评估空白对照物、单独的益生菌以及益生菌与GOS对真实婴儿微生物区系的微生物活性(总短链脂肪酸(SCFA)、乙酸盐、乳酸盐和铵的产生)的施用的影响，以及评估当益生菌经预调理(即，通过用作为碳来源的GOS进行发酵产生)后的效果是否不同。为此，将测试成分添加到其中模拟婴儿的近侧结肠环境的反应器中。为了选择适当的供体进行实验，在实验之前筛选了五个3个月大的婴儿。

1.胃肠道的体外建模

在这些实验中，使用人类微生物生态系统的连续模拟器的简化模拟。模型已被广泛用于科学和工业项目超过20年，并且已使用体内参数进行了验证。在结肠不同区域中的微生物群落稳定后，在不同结肠区域的组成和功能方面不同的三个结肠隔室中建立代表性的微生物群落。在这些实验中使用模拟结肠病症的单阶段分批系统作为简化的/>系统。

2.短期结肠温育

收集来自五个3个月大婴儿供体的粪便并用冷冻保护剂保存。在收集所有粪便样品后，进行预筛选实验以为最终实验选择最合适的供体。此预筛选包括短期结肠温育，在此期间将BMOS添加到含有存在于结肠中的基础营养物质(例如来源于宿主的甘氨酸，诸如粘蛋白)的糖耗尽的营养培养基中。对于每个供体，包括仅含有糖耗尽的营养培养基(无纤维)的空白物以评估群落的背景活性。由于这是筛选实验，因此以单次重复执行温育。这得到如下表8中所示的实验设置。

表8：预筛选实验的实验设置

条件	供体	治疗/空白	BMOS
				1	A	治疗	5g/L
2	A	空白
				2	B	治疗	5g/L
4	B	空白
				5	C	治疗	5g/L
6	C	空白
				7	D	治疗	5g/L
8	D	空白
				9	E	治疗	5g/L
10	E	空白

预筛选实验的结果用于为最终实验选择最合适的供体。选择作为最终实验的供体的供体A，其特征在于具有最强的双歧效应，从而产生高乙酸盐和乳酸盐浓度。在这些最终的短期结肠温育开始时，将所有测试成分连同所选择的冷冻人类婴儿种菌一起添加到糖耗尽的营养培养基中(如上所述)。还包括一个空白对照物。为了说明生物可变性，将所有测试执行三次，得到如表9中所指定的30个独立温育。

预筛选实验和最终实验的温育条件考虑在37℃、振荡(90rpm)和厌氧条件下培养48小时。在两个实验中包含空白对照物，以评估测试成分对结肠微生物区系的代谢和群落组成特征的具体效果。

请注意，5g/L通常用作在体外分批发酵期间执行作用模式研究的最佳剂量。较高的剂量可能导致系统过载和微生物代谢物积聚过多，而显著低于5g/L的剂量将更难观察到明显的效应。

表9：最终实验的实验设置

3.短期温育的终点

以下分析用于比较不同益生元的细菌代谢物产生的动力学。

短链脂肪酸(SCFA)是微生物碳水化合物代谢(乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐)或蛋白质代谢(支链SCFA)的评估，并且可与正常GI微生物区系的典型发酵模式进行比较。在温育6小时后分析用于SCFA分析的样品。

总SCFA水平反映测试成分的总发酵情况。与单独的BMOS相比，与非预调理的细菌(在右旋糖上生长)一起施用BMOS提高了6小时后的总SCFA产量，这对应于GOS和动物双歧杆菌乳酸亚种的已知合生效应。如图17中所示，当与BMOS一起施用预调理的细菌(在BMOS上生长)时，总SCFA的产量进一步增加。因此，展示了提高的合生效应。总SCFA的增加主要是由于乙酸盐的增加，因为在图18中观察到乙酸盐浓度具有类似的图案。

乳酸盐分析：人肠携带产生乳酸盐和利用乳酸盐的细菌。乳酸盐由乳酸菌产生，并降低环境的pH，从而也起到抗微生物剂的作用。质子化乳酸可穿透微生物细胞，之后它解离并释放细胞内的质子，导致酸化和微生物细胞死亡。它也可通过其它微生物快速转化成特别是丁酸。在温育6小时后分析用于乳酸盐分析的样品。施用BMOS和在右旋糖上生长的动物双歧杆菌乳酸亚种时，观察到合生效应。当对所施用的动物双歧杆菌乳酸亚种进行预调理(在BMOS上生长)时，此类效应进一步提高，如图19中所示。

铵是蛋白水解降解的产物，并且也可用作底物可用性的间接标记。在开始温育24小时后分析用于铵分析的样品。图20示出，与施用在右旋糖上生长的细菌相比，当施用预调理的动物双歧杆菌乳酸亚种时，铵产量降低。铵作为蛋白水解发酵的结果产生，这与有毒化合物诸如对甲酚的产生相关联。因此，高铵含量与结肠中的有害健康影响相关联。因此，此代谢物的含量减少被认为是有益的。

这表明，由于具有GOS来源的益生菌的发酵，获得提高的合生效应，因为碳来源转化为婴儿的各种健康有益效果，诸如更健康的微生物区系和相关联的有益效果。在六小时的时间范围内观察到的效应的动力学也与婴儿喂食模式一致，因为婴儿通常平均每三个小时喂食一次。

实施例4：喷雾干燥的动物双歧杆菌乳酸亚种NCC2818的预调理效应

实施例1部分3的预调理实验，并且不同之处在于，在再次暴露于GOS来源之前，在从发酵培养基收获之后对动物双歧杆菌乳酸亚种进行喷雾干燥。

按如下方式对细菌进行喷雾干燥：用微波和红外湿度分析仪(SMART Turbo，CEMCorporation，USA)评估生物质的总固体百分比，以便了解要称量的保护剂粉末(PA)的量。然后将保护剂(具有下表10中所述的组成)用无菌水再次悬浮，并且在60℃浴中搅拌直至完全溶解，然后与生物质混合。然后将生物质-PA混合物在冰桶中搅拌1小时，并且用30％的NaOH将pH调节至7.0，之后进行喷雾干燥。喷雾干燥步骤使用微型喷雾干燥机B 290(Buchi，Switzerland)执行，入口温度低于115℃，出口温度低于80℃。

表10：保护剂的组成

成分	变体M
		麦芽糖糊精DE6	52.00
抗坏血酸钠	23.80
		L-赖氨酸盐酸盐	10.00
L-半胱氨酸盐酸盐	4.20
		L-丙氨酸	10.00
总计	100.00

在再次暴露于BMOS之前，将细菌在0.9％的NaCl溶液中以1∶100的比例再水合。如实施例1的第2.4部分中所述通过流式细胞术确定细胞计数，并且使用含有5×10⁸个细胞的体积接种50mL的IM+BMOS(10⁷(afu/mL))。随后进行温育，执行Cinac pH监测和发酵后的细胞计数确定。

如图21上所示，与在右旋糖上生长的细菌相比，预调理的细菌的滞后阶段显著缩短。这些结果表明，经受干燥步骤的细菌保持其有益效果。

实施例5：所选乳杆菌菌株的预调理

重复实施例1部分3中所述的预调理实验，使用约氏乳杆菌NCC533(保藏为CNCM-I1225)并且采用BMOS作为GOS来源。

在此实验中选择了约氏乳杆菌NCC533，因为它包含完整的galCDEGR(A)操纵子，不包括galA。

结果提供于图22中。在BMOS和右旋糖上的初始增殖分别用曲线I和III表示。虽然在BMOS上的初始增殖开始更缓慢，但在720分钟时获得合适的生长，类似于将右旋糖用作碳来源时获得的生长。曲线II和IV示出再次暴露于BMOS时的生长曲线。如先前对于实施例1中双歧杆菌属菌株所演示的那样，预调理的细菌的滞后阶段显著短于在右旋糖上增殖的细菌的滞后阶段。这些结果证实预调理的益生菌的有益效果不是属特异性的，前提条件是在细菌基因组中存在galCEDEGR(A)操纵子。

也用约氏乳杆菌NCC533重复实施例2的实验，并且将0.6％至2.04％浓度的GOS作为GOS来源。BMOS用作碳来源并且具有48％的GOS含量，这些浓度分别对应于1.25％、1.75％、2.25％、2.75％、3.25％、3.75％和4.25％的BMOS量。如图23中所示，对于再次暴露于BMOS后的约氏乳杆菌NCC533的生长情况，先前在BMOS上生长的细菌比先前在右旋糖上生长的细菌的生长更快，这表明在宽泛的浓度范围内实现了预调理效应。

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Claims

1.一种组合物，所述组合物包含有效量的低聚半乳糖以及包含galCDEGR(A)操纵子的益生菌，其中所述益生菌通过包括以下步骤的方法获得：

a.在包含低聚半乳糖和蛋白胨的细菌生长培养基中发酵所述益生菌，其中所述细菌生长培养基还包括3'-唾液酸乳糖或6'-唾液酸乳糖中的至少一种；以及

b.收获所培养的益生菌；

以及

c.将步骤b中获得的益生菌与低聚半乳糖组合，其中所述益生菌选自动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis ssp.lactis)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)和约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii.)。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述益生菌选自保藏为CNCMI-3446的动物双歧杆菌乳酸亚种、保藏为ATCC BAA-999的长双歧杆菌、保藏为ATCC 15707的长双歧杆菌、保藏为CNCM I-5259的长双歧杆菌、保藏为CNCM I-3914的短双歧杆菌和保藏为CNCM I-1225的约氏乳杆菌。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，所述组合物包含基于干物质计至少0.2％的低聚半乳糖。

4.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述益生菌以至少5E+05cfu/g的量存在。

5.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述组合物选自食物产品、动物饲料产品、人或动物的营养补充剂、药物组合物和化妆品组合物。

6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述食物产品是饮料。

7.根据权利要求5所述的组合物，所述组合物选自婴儿配方食品、婴儿谷物、较大婴儿配方食品、成长乳以及用于孕妇和哺乳期妇女或希望怀孕的妇女的乳制品。

8.根据权利要求1或2所述的组合物，所述组合物是药物组合物，用于治疗，其中所述药物组合物包含含有galCDEGR(A)操纵子的益生菌，所述益生菌通过包括以下步骤的方法获得：

b.收获所培养的益生菌；

以及

c.将步骤b中获得的益生菌与低聚半乳糖组合，

其中所述益生菌选自动物双歧杆菌乳酸亚种、长双歧杆菌、短双歧杆菌和约氏乳杆菌。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述组合物用于调节个体免疫应答的方法中。

10.根据权利要求8所述的组合物，其中所述组合物用于促进个体免疫防御的方法中。

11.根据权利要求8所述的组合物，其中所述组合物用于预防、治疗或减少个体感染的方法中。

12.根据权利要求8所述的组合物，其中所述组合物用于预防、治疗或减少个体炎症的方法中。

13.根据权利要求8所述的组合物，其中所述组合物用于促进个体胃肠道中健康的微生物区系的方法中。

14.根据权利要求8所述的组合物，其中所述组合物用于提高个体胃肠道中的总短链脂肪酸产量的方法中。

15.根据权利要求8所述的组合物，其中所述组合物用于提高个体胃肠道中的乙酸盐产量的方法中。

16.根据权利要求8所述的组合物，其中所述组合物用于提高个体胃肠道中的乳酸产量的方法中。

17.根据权利要求8所述的组合物，其中所述组合物用于减少个体胃肠道中的铵产量的方法中。

18.根据权利要求8所述的组合物，其中所述组合物用于改善个体胃肠道中的微生物区系的活性的方法中。

19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述组合物用于改善所述微生物区系的代谢活性。

20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述组合物用于改善婴儿或幼儿胃肠道中的所述微生物区系的代谢活性。

21.根据权利要求8所述的组合物，其中所述组合物用于预防个体的过敏反应的方法中。

22.一种用于提高组合物的治疗效果的方法，所述组合物包含低聚半乳糖以及包含galCDEGR(A)操纵子的益生菌，所述方法包括：

b.收获所培养的益生菌；

以及

c.将步骤b中获得的益生菌与低聚半乳糖组合，

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述治疗效果为这样的效果：调节个体的免疫防御，促进个体的免疫防御，预防、治疗或减少个体的感染或预防、治疗或减少个体的炎症，预防个体的过敏反应或促进个体肠胃道中的健康微生物区系，提高个体胃肠道中的总短链脂肪酸产量，提高个体胃肠道中的乙酸盐产量，在个体的胃肠道中提高乳酸产量或改善个体胃肠道中的微生物区系的活性。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述治疗效果是改善所述微生物区系的代谢活性。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述治疗效果是改善婴儿或幼儿胃肠道中的所述微生物区系的代谢活性。

26.一种用于提高益生菌消耗低聚半乳糖的能力的方法，所述益生菌包含galCDEGR(A)操纵子，所述方法包括：

b.收获所培养的益生菌；

以及

c.将步骤b中获得的益生菌与低聚半乳糖组合，