CN117062543A - Gos预处理乳杆菌菌株和最终制剂中的gos - Google Patents
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Abstract
本发明总体上涉及增强哺乳动物中益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的存活和活性。乳杆菌(Lactobacillus)菌株，其包含与SEQ ID NO:1具有至少70％序列同一性的LacS转运蛋白序列，和/或包含GH42 B‑gal序列，其中该乳杆菌(Lactobacillus)菌株不是罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)菌株。本发明包括用于培养和制造益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的方法，以及含有此类菌株的产品。更具体地，本发明涉及包含益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的组合物，其通过以下步骤获得：在包含低聚半乳糖(GOS)的培养基中生长这些细菌(“预处理”)，并且将所述预处理细菌与GOS一起施用于该最终产品中。本发明人已经发现此类方法诱导益生菌的有益效果的增强，诸如在胃肠道中的存活。
Description
技术领域
本发明总体上涉及增强哺乳动物中益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的存活和活性。乳杆菌(Lactobacillus)菌株，其包含与SEQ ID NO:1具有至少70％序列同一性的LacS转运蛋白序列，和/或包含GH42 B-gal序列，其中该乳杆菌(Lactobacillus)菌株不是罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)菌株。本发明包括用于培养和制造益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的方法，以及含有此类菌株的产品。更具体地，本发明涉及包含益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的组合物，其通过以下步骤获得：在包含低聚半乳糖(GOS)的培养基中生长这些细菌(“预处理”)，并且将所述预处理细菌与GOS一起施用于该最终产品中。本发明人已经发现此类方法诱导了益生菌的有益效果的增强，诸如在胃肠道中的存活和代谢活性。
背景技术
益生菌定义为“当以足够的量施用时给宿主带来健康益处的活的微生物”。这是全世界广泛接受的科学定义(参见例如Hill等人，2014；《自然综述-胃肠病学与肝脏病学》，第11卷)。益生菌产品(其通常是膳食补充剂或食物)可以被推荐用于个体正在经历的不同病症或症状。乳酸生产细菌，诸如乳杆菌(Lactobacilli)，通常用作各种类型食物，例如酸奶中的益生菌。此类乳酸生产细菌可以通过其自身在肠道系统内的定植、通过可用营养物的竞争和/或通过降低肠道pH的特定物质(诸如过氧化氢、细菌素和/或有机酸，包括乳酸和乙酸)的产生，来防止有害微生物的生长和定植。众所周知，宿主和肠道微生物之间的相互作用对于宿主的健康和幸福是至关重要的。肠微生物群生成向宿主提供营养的代谢物，但也可能涉及免疫应答和宿主免疫系统的调节和发育以及减少炎症和预防过敏反应。
益生元是通过选择性地刺激有益微生物诸如细菌和真菌的生长和/或活性来诱导其生长或活性的化合物。因此，在胃肠道中，益生元可以改变肠道微生物群的组成。膳食益生元通常是不易消化的(参见例如https://en.wikipedia.org/wiki/Dietary_fiber)化合物，其未经消化地通过胃肠道的上部并且通过充当定居在大肠中的有利细菌的底物而刺激这些有利细菌的生长或活性。已经测试了多种化合物以确定它们作为益生元的功能。低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)和反式低聚半乳糖(TOS)是最常见的益生元。因此，食用某些益生元可以通过增加与人类健康相关联的微生物群体来改善免疫功能，并且动物和人类研究已显示益生元可以减少有害细菌的群体。因此，益生元是这样的成分：当由受试者肠道中的天然微生物区系或由与该益生元同时摄入的益生菌发酵时，其提供健康有益效果。
通常已知的是，组合特定类型的益生元和益生菌会引起某些协同效果。特别地，已经记载了组合的益生元低聚半乳糖(GOS)和益生菌微生物(诸如乳杆菌和双歧杆菌)的作用(参见例如YUTAKA KANAMORI，MD等人，《消化疾病与科学》第46卷，第9期(2001年9月)，第2010-2016页(2001))。已经证明，益生元和益生菌之间的合成素效果是由于益生菌在受试者胃肠道内消耗了益生元。
益生菌乳酸生产细菌的制造程序通常是标准化的，并且涉及在包含碳水化合物源(诸如糖，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖或葡萄糖)的生长培养基中发酵细菌的步骤。发酵后，益生菌通常被保护并冷冻或冻干并包装成最终产品。
益生菌乳酸菌的摄入在体内具有多种作用。一种此类重要效果是必需矿物质的生物利用度，其可以受到此类益生菌乳酸菌的存在的显著影响。尽管体内矿物质的含量主要取决于它们从食物摄取的供应，并且它们主要在胃肠道中被吸收，但是仅仅经由食物摄取提供矿物质并不必然导致足够的矿物质生物利用度。影响矿物质生物利用度的主要因素是食物中矿物质的含量、食物中和胃肠道中的矿物质之间的协同和拮抗相互作用、食物中络合或螯合化合物的存在、以及生物体的健康状态及其年龄。此外，肠道微生物区系、益生菌和益生元显著影响矿物质的生物利用度，并可以由此增加或减少此类矿物质的吸收。
通常益生菌的摄入(并且特别地乳酸菌的摄入)也与许多功能有关联，诸如消化道功能(消化功能和/或营养吸收)、免疫系统功能和婴儿的总体生长和发育，并且与受试者的健康微生物群的促进有关。
鉴于以上所述，因此本发明的一个目的是提供更有效的手段、方法和疗法以促进受试者的健康微生物群、促进消化功能、免疫功能和/或总体生长和发育。此外，一个目的是当向有此需要的受试者或患者施用此类益生菌时，改善益生菌微生物诸如乳杆菌的益生菌效果。
这些目的由以下所述的本发明解决。
发明内容
本发明在以下和独立权利要求中进行限定。在说明书和从属权利要求中限定本发明的另外的实施方案。
在第一方面，本发明提供了一种用于制备包含预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株和GOS的组合物的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
a)按照以下步骤预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株：
i)在生长培养基中在低聚半乳糖(GOS)的存在下培养益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株，从而预处理该益生菌乳杆菌
(Lactobacillus)菌株；以及
ii)任选地从生长培养基收获预处理益生菌乳杆菌
(Lactobacillus)菌株；
b)制备包含从步骤a)i)或aii)获得的预处理益生菌乳杆菌
(Lactobacillus)菌株的组合物并且将GOS添加到该组合物中，其中该益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株由至少一种乳杆菌(Lactobacillus)菌株提供，该乳杆菌菌株包含与SEQ ID NO:1具有至少65％或优选地70％的序列同一性的LacS转运蛋白序列，和/或包含GH42 B-gal序列，其中该乳杆菌(Lactobacillus)菌株不是罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)菌株。
在本发明方法中，在步骤a)i)中可以将GOS按在生长培养基中具有以下的量添加到生长培养基中：至少0.2重量％，优选地至少0.5重量％，甚至更优选地至少0.75重量％的GOS，并且优选地至多8重量％的GOS，诸如至多7重量％的GOS、至多6重量％的GOS或甚至至多5重量％的GOS，更优选地至多4重量％的GOS或甚至至多3％的GOS、至多2重量％的GOS或至多1重量％的GOS。这些上限和下限的任意组合也涵盖在本文中。更优选地，将GOS按以下范围添加到生长培养基中：0.2重量％至8重量％或甚至0.2重量％至7重量％或0.2重量％至6重量％的范围，更优选地0.5重量％至8重量％或甚至0.5重量％至7重量％或0.5重量％至6重量％的范围，甚至更优选地0.75重量％至8重量％或甚至0.75重量％至7重量％或0.75重量％至6重量％的范围，并且最优选地0.75重量％至7重量％的范围，0.75重量％至6重量％或甚至0.75重量％至5重量％的范围，诸如0.75重量％至5重量％或0.75重量％至4重量％的范围，优选地基于生长培养基(％w/w)计算。GOS的添加可以优选地在步骤a)i)中益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株培养的开始、中间或结束时进行，和/或一次性、逐步或连续进行。
此外，GOS可以优选地在步骤b)中按以下量添加到从步骤a)获得的预处理乳杆菌(Lactobacillus)菌株中：至少1或2g/日剂量，优选地至少3g/日剂量，同样优选地介于2至12g/日剂量或介于2至10g/日剂量、介于2至8g/日剂量、或介于2至7g/日剂量，更优选地介于3至12g/日剂量，同样更优选地介于3至10g/日剂量，诸如介于3至8g/日剂量、介于3至7g/日剂量、介于3至6g/日剂量，或约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12g/日剂量或由此形成的任何范围。
此外，在步骤b)中从步骤a)i)或a)ii)获得的预处理的益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株优选地按以下量存在于组合物中：介于103cfu至1012cfu/日剂量，同样优选地介于104cfu至1011cfu/日剂量，更优选地介于105cfu至109cfu/日剂量，甚至更优选地介于106cfu至109cfu/日剂量或108cfu至1010cfu/日剂量，最优选地约总计108cfu/日剂量，包括107至109或108至109cfu/日剂量。
此外，添加到本发明方法的步骤a)i)中的生长培养基中和/或添加到包含在本发明方法的步骤b)中制备的预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的组合物中的GOS优选地可以具有3-8的聚合度(DP)。本发明方法的步骤a)i)中的培养可以在多于5至18小时的时间段内进行，优选地7至14小时，并且更优选地10至13小时，并且甚至更优选地约12小时。根据优选的实施方案，本发明方法的步骤a)i)中的培养在介于25℃至45℃，优选地介于30℃至40℃，最优选地约37℃的温度下进行。在培养步骤a)期间的益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的预处理期间的pH可以是不进行控制的或者在整个培养步骤a)i)中被设定为恒定的pH值，通常在培养步骤a)期间进行监测和调节。因此，pH可以在3.0至7.0之间，特别是在益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的预处理过程中不控制pH的情况下。另选地，如果在培养步骤a)i)期间控制pH，则可以将pH调节至约5.0至7.0的范围，例如约5.0至6.0或约6.0至7.0，优选地将pH调节至约6.0至7.0的范围，更优选地调节至约6.6±0.4的范围，最优选地调节至约6.6±0.2的范围。
此外，用于制备预处理益生菌乳杆菌(Alternatively)菌株的本发明方法可以包括另外的步骤a)iii)：在收获步骤a)ii)之后洗涤预处理益生菌乳杆菌(Alternatively)菌株，优选地以去除痕量的生长培养基。本发明方法还可以包括另外的步骤a)iv)：干燥收获的预处理益生菌乳杆菌(Alternatively)菌株，步骤a)iv)在洗涤步骤a)iii)之后或在收获步骤a)ii)之后进行。干燥步骤a)iv可以使用以下方法进行：喷雾干燥、流化床干燥、空气对流干燥、大气压干燥、辊式干燥或冷冻干燥，并且更优选地喷雾干燥或冷冻干燥。在需要的情况下，干燥步骤之前可以用保护剂和/或载体处理收获的预处理益生菌乳杆菌(Alternatively)菌株。另选地或附加地，在步骤a)i、a)ii)或a)iii)或a)iv)中的任一步骤之后获得的预处理乳杆菌(Lactobacillus)菌株可以被包封用于进一步加工，优选地在干燥步骤a)iv)之前。乳杆菌(Lactobacillus)菌株优选地为嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus，L.acidophilus)菌株，更优选地嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，L.acidophilus)菌株NCC12，最优选地根据布达佩斯条约以保藏号ATCC-4356或DSM-20079保藏的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，L.acidophilus)菌株NCC 12。
根据第二方面，本发明提供了组合物，其包含有效量的预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株和附加地有效量的低聚半乳糖(GOS)，其中该组合物已经优选地根据如本文所定义的方法、优选地根据本发明的第一方面制备。本发明组合物可以包含以下量的预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株：介于103cfu至1012cfu，通常介于104cfu至1011cfu/日剂量，优选地介于105cfu至1010cfu/日剂量或105cfu至109cfu/日剂量，同样优选地介于106cfu至109cfu/日剂量、106cfu至108cfu/日剂量或108cfu至1010cfu/日剂量，更优选地约107cfu至109cfu/日剂量。优选的日剂量为约总计108cfu/日剂量，例如107至109cfu/日剂量或108至109cfu/日剂量。该组合物还可以包含以下量的GOS：至少1或2g/日剂量，优选地至少3g/日剂量，同样优选地介于2至12g/日剂量或2至10g/日剂量、介于2至8g/日剂量或介于2至7g/日剂量，更优选地介于3至12g/日剂量，同样更优选地介于3至10g/日剂量，诸如介于3至8g/日剂量、介于3至7g/日剂量、介于3至6g/日剂量，或约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12g/日剂量或由此形成的任何范围。
如本文概述的，本发明组合物还允许或用于改善例如乳杆菌(Lactobacillus)菌株在受试者肠道中的益生菌效果，用于促进受试者的肠道中的细菌存活和/或代谢活性和持久性，和/或用于促进受试者的肠道中的健康微生物群。根据具体实施方案，益生菌效果的改善或增加因此是促进优选地如本文所定义的乳杆菌菌株在结肠中的存活或代谢活性，并且优选地促进与乳杆菌菌株相关联的健康益处，和/或是促进健康受试者的肠道中的健康微生物群，优选地增加受试者的微生物群中的双歧杆菌和/或乳杆菌的存在。
本发明组合物还可以是固体或液体，和/或可以按粉末、片剂、胶囊的形式存在，或者可以是油制剂、乳液、水包油乳液(o/w乳液)或油包水乳液(w/o乳液)的形式。附加地，不限于此，本发明组合物可以是可施用的形式，优选地选自由以下组成的组：营养组合物、药物制剂、膳食补充剂、功能性食物产品、功能性饮料产品、用于婴儿或儿童的营养组合物诸如婴儿配方产品或较大婴儿配方产品及其组合，例如乳制品、基于奶的产品、基于乳清蛋白的饮料。
同样，乳杆菌(Lactobacillus)菌株优选地为嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus，L.acidophilus)菌株，更优选地嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，L.acidophilus)菌株NCC12，最优选地根据布达佩斯条约以保藏号ATCC-4356或DSM-20079保藏的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，L.acidophilus)菌株NCC 12。
在第三方面，本发明提供了包含有效量的补充有有效量的GOS的预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的本发明组合物的非治疗用途，该组合物根据本发明制备或如本文所述，用于增加或促进例如乳杆菌(Lactobacillus)菌株在健康受试者的消化道中的益生菌效果：益生菌效果的增加可以表现为例如改善健康受试者的肠道中的乳杆菌(Lactobacillus)菌株代谢活性和/或乳杆菌(Lactobacillus)菌株存活、增加受试者的肠道中的乳酸和/或乙酸产生、促进细菌存活和持续和/或促进健康受试者中的健康微生物群。
用于非治疗用途的本发明组合物优选地增加健康受试者的微生物群或肠道中双歧杆菌的存在和/或增加乳杆菌的存在、增加健康受试者的肠道中乳杆菌(Lactobacillus)菌株的存活和/或移入和/或生存力，和/或增加健康受试者的微生物群或肠道中的乳酸/乙酸的产生。因此，根据具体实施方案，用于非治疗用途的本发明组合物优选地涉及改善或增加益生菌效果，诸如促进乳杆菌菌株在结肠中的存活或代谢活性，并因此促进与乳杆菌菌株相关联的健康益处；和/或促进健康受试者的肠道中的健康微生物群，优选地增加健康受试者的微生物群或肠道中双歧杆菌和/或乳杆菌的存在。此外，健康受试者通常选自运动员、儿童、学步儿童或婴儿(称为婴儿或早产儿)、成人、老年人、孕妇、素食者、哺乳妇女、宠物、猫或狗。在本文中，健康受试者通常不患有任何疾病。本发明组合物可以是固体或液体，和/或按粉末、片剂、胶囊的形式存在，或者可以是油制剂、乳液、水包油乳液(o/w乳液)或油包水乳液(w/o乳液)的形式。此外，本发明组合物可以是可施用的形式，优选地选自由以下组成的组：营养组合物、药物制剂、膳食补充剂、功能性食物产品、功能性饮料产品、用于婴儿或儿童的营养组合物及其组合，例如乳制品、基于奶的产品、基于乳清蛋白的饮料。如前所述，乳杆菌(Lactobacillus)菌株优选地为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，L.acidophilus)菌株，更优选地嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，L.acidophilus)菌株NCC12，最优选地根据布达佩斯条约以保藏号ATCC-4356或DSM-20079保藏的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，L.acidophilus)菌株NCC 12。
根据第四方面，本发明提供了包含有效量的预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株和有效量的GOS的组合物，其优选地如根据本发明制备或如本文所述，用作药物。
根据第五方面，本发明提供了包含有效量的预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株和有效量的GOS的组合物，其优选地如根据本发明制备或如本文所定义，用于预防和/或治疗有此需要的患者的疾病中的用途。
在上述第一和第二医疗用途(第四和第五方面)中，患者优选地处于患有消化功能障碍、受损的微生物群的风险中，和/或具有此类消化功能障碍、受损的微生物群或需要促进微生物群的发育和/或生长的病症。
预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株和附加地GOS通常增加益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的益生菌效果，表现为例如：通过促进患者的肠道中的健康微生物群、增加患者微生物群中的乳杆菌的存在，和/或增加受试者的肠道中的细菌存活和持续，优选地受试者肠道中的益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的存活和持续。附加地或另选地，促进的益生菌效果可以涵盖促进消化功能、免疫功能和/或生长和发育，特别是在患有其微生物群损伤和/或具有需要此类促进的病症的受试者中。此类病症可以包括例如减少微生物群中(有益)细菌的量和/或功能的任何治疗或疾病，诸如免疫疗法、癌症疗法、抗生素的施用、患有腹泻、感染或炎症的患者，但也可以并且特别是涉及与受损的微生物群有关的任何此类和另外的病症或需要促进影响婴儿和小儿的微生物群的发育和/或生长的病症。
用于此类用途的本发明组合物可以是固体或液体，和/或可以按粉末、片剂、胶囊的形式存在，或者可以是油制剂、乳液、水包油乳液(o/w乳液)或油包水乳液(w/o乳液)的形式。用于此类用途的本发明组合物还可以是可施用形式，优选地选自由以下组成的组：营养组合物、药物制剂、膳食补充剂、功能性食物产品、功能性饮料产品及其组合，例如乳制品、基于奶的产品、基于乳清蛋白的饮料。特别优选地，乳杆菌(Lactobacillus)菌株为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，L.acidophilus)菌株，更优选地嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，L.acidophilus)菌株NCC12，最优选地根据布达佩斯条约以保藏号ATCC-4356或DSM-20079保藏的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，L.acidophilus)菌株NCC 12。
另外的优选的实施方案在以下和从属权利要求中进行描述。
附图说明
图1：示出了短SHIME结肠模型
图2：示出了在孵育48小时后，在存在或不存在GOS的情况下，罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)在结肠中的存活，特别是GOS对罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)的存活的积极效果，以及与未预处理罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)相比，在存在GOS的情况下预处理罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)的存活的改善。
图3A：示出了罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)DSM 17938的LacS序列(SEQ ID NO:1)
图3B：示出了罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)DSM 17938的LacA序列(SEQ ID NO:2)
图4：示出了嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)NCC12和嗜热链球菌(S.thermophilus)NCC2496以及它们的预处理对应物中的β-半乳糖苷酶活性。2小时孵育内X-gal底物的恒定转化所示，与其生长在葡萄糖上的对照菌株相比，预处理嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)NCC12和预处理嗜热链球菌(S.thermophilus)NCC2496菌株均表现出强大的β-半乳糖苷酶活性。
图5：示出了在存在和不存在GOS的情况下，预处理和未预处理嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)NCC12在结肠中的生存力。GOS促进嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)NCC12的生存力，与生长菌株的碳源无关。在存在GOS的情况下，预处理(GOS生长的)和未预处理(葡萄糖生长的)嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)NCC12两者均在结肠中存活得更好。预处理嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)NCC12在存在GOS的情况下比其在葡萄糖上生长的对应物在结肠中存活得更好，这表明了在存在GOS的情况下预处理步骤对嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)NCC12在结肠中的存活的积极效果。
图6：示出了在48小时孵育后，在存在或不存在GOS的情况下，罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)DSM17938、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)NCC12和嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)NCC2496在结肠中的存活，特别是GOS对罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)和嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)NCC12的存活的积极效果，以及GOS对嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)NCC2496的存活的消极效果。虽然嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)菌株两者均在GOS上生长并表现出强大的β-半乳糖苷酶活性(图4)，但只有预处理嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)在存在GOS的情况下在结肠中存活得更好。嗜热链球菌(S.thermophilus)碰巧缺失基因组中的Lac A。预处理嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)在结肠中存活良好，这也在预处理罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)中观察到。罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)和嗜酸乳杆菌两者均具有LacA基因，以及LacS的高同源性序列(>70％)。这意味着LacA基因以及LacS(与罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)DSM17938中发现的序列具有至少70％的序列同一性)的存在，是帮助预处理菌株在存在GOS的情况下在肠道中存活的特征。
具体实施方式
本发明旨在提供增加和促进健康微生物群和/或增加某些细菌在肠道中的存活或代谢活性的溶液、组合物和用途。具体地，此类溶液是在最终产品中包含低聚半乳糖(GOS)预处理的乳杆菌(Lactobacillu)菌株以及GOS的组合物。微生物群效果发生在胃肠道中，诸如在十二指肠、空肠、回肠和/或结肠中。
本发明还旨在提供用于在最终产品中制备预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillu)菌株以及GOS的方法，使得借助于此类预处理乳杆菌(Lactobacillu)菌株以及GOS在组合物中的组合，可以实现在胃肠道中的改善的微生物群和/或益生菌的存活或代谢活性。
本发明提供了一种增强乳杆菌(Lactobacillu)菌株在哺乳动物中的益生菌效果的方法，在生产益生菌乳杆菌(Lactobacillu)菌株时在发酵期间使用特定的底物组分并且进一步增加益生菌乳杆菌(Lactobacillu)菌株和添加到最终组合物中的GOS之间的合成素效果。本发明的发明人已经开发了一种方法，该方法包括在益生菌乳杆菌(Lactobacillu)菌株的培养期间使用低聚半乳糖(GOS)，即所谓的用GOS预处理，其令人惊讶地导致乳杆菌(Lactobacillu)菌株的增加的益生菌效果，特别是在施用如本文所述的预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillu)菌株后在受试者或患者的胃肠道内的改善的微生物群和/或益生菌的存活或代谢活性。在将作为益生元的GOS和预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillu)菌株组合施用于有此需要的受试者或患者后，该效果进一步增强。因此，本发明的主要目的涉及一种用于制备此类具有GOS的预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillu)菌株的方法，涉及预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillu)菌株以及GOS用于改善哺乳动物的胃肠道中的微生物群和/或益生菌的存活或代谢活性的非治疗和治疗用途。
微生物群和/或益生菌的存活或代谢活性的改善使得有可能更好地服用一定量的益生菌，以改善益生菌的功效并且还降低获得所寻求的健康效果所需的益生菌和另外的益生元诸如GOS的剂量和/或施用频率。
鉴于以上所述，公开了以下内容。
用于预处理益生菌乳杆菌菌株的方法
根据第一方面，本发明提供了一种用于制备包含预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株和GOS的组合物的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
a)按照以下步骤预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株：
i)在生长培养基中在低聚半乳糖(GOS)的存在下培养益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株，从而预处理该益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株；以及
ii)任选地从生长培养基收获预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株；
b)制备包含从步骤a)i)或a)ii)获得的预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的组合物并且将GOS添加到该组合物中，
其中该益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株由至少一种乳杆菌(Lactobacillus)菌株提供，该乳杆菌菌株包含与SEQ ID NO:1具有至少70％的序列同一性的LacS转运蛋白序列，和/或包含GH42 B-gal序列，其中该乳杆菌(Lactobacillus)菌株不是罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)菌株。
在本发明的上下文中，术语益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的“预处理”优选地意指在生产益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的过程期间，用GOS生长(诸如培养或发酵)益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株。
因此，本发明方法优选地包括作为第一步骤a)i)在存在GOS的情况下培养益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株，从而预处理乳杆菌(Lactobacillus)菌株。在本发明的上下文中，术语“培养”和“发酵”可互换使用。
在任选的步骤a)ii)中，然后从生长培养基收获预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株。术语“预处理乳杆菌(Lactobacillus)菌株”是指通过包括用GOS预处理步骤的本发明方法生产的益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株。此类GOS预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的收获是任选的，因为GOS预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株还可以直接用于步骤b)中，用于制备包含从步骤a)i)获得的预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的组合物并且将GOS添加到该组合物中。
此外，在本发明方法的步骤b)中，通过将从步骤a)获得的预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株组合并且进一步将GOS添加到最终组合物中来形成组合物。
在本发明整篇中使用的乳杆菌(Lactobacillus)菌株通常可以是任何乳杆菌(Lactobacillus)菌株，其包含与SEQ ID NO:1具有至少70％序列同一性的LacS转运蛋白序列，和/或包含GH42 B-gal序列，其中该乳杆菌(Lactobacillus)菌株不是罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)菌株。罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)也称为罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)。在本发明整篇中使用的乳杆菌(Lactobacillus)菌株通常是可公开获得和/或可商购获得的。
如上文所定义的乳杆菌(Lactobacillus)菌株优选地包括或涉及落入如在2020年4月15日周三之前应用的分类“乳杆菌”下的所有乳杆菌(Lactobacillus)菌株(前乳杆菌菌株)以及还有如在2020年4月15日周三发布的《国际系统和进化微生物学》期刊(IJSEM)中重新分类的所有那些前乳杆菌菌株和乳杆菌菌株，前提是乳杆菌(Lactobacillus)菌株不是罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)菌株，或者根据新分类是罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)菌株。该再分类将以前的乳杆菌菌株(前乳杆菌菌株)分类为在乳杆菌(Lactobacillus)、副乳杆菌(paralactobacillus)、片球菌(Pediococcus)和23个新属下分布的乳杆菌科(Lactobacillaceae)家族的物种(Zheng J，Wittouck S.，Salvetti E.等人，2020)。关于乳杆菌属的分类学注解：23个新属的描述，乳杆菌属Beijerink 1901的修订描述，以及乳杆菌科与明串珠菌科的联合(https://doi.org/10.1099/ijsem.0.004107)，基于若干遗传方法和标记(平均核苷酸同一性、平均氨基酸同一性、核心-基因氨基酸同一性、核心基因组系统发生、特征基因和代谢或生态标准)。
因此，根据本发明的乳杆菌(Lactobacilli)菌株至少包括：
德氏乳杆菌亚种德氏亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.delbrueckii)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、加氏乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、惰性乳杆菌(Lactobacillus iners)、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)和约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)，其仍属于乳杆菌属(Lactobacillus genus)，
干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，根据新分类法命名为干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus casei)、副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)和鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)，
唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)，现在称为唾液联合乳杆菌(Ligilactobacillus salivarius)
发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)，现在称为发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)
短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，现在称为短促生乳杆菌(Levilactobacillusbrevis)，和
开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri)，现在称为克菲利豆乳杆菌(Lentilactobacillus kefiri)等。
在本发明的优选实施方案中，如本文所用的乳杆菌(Lactobacillus)菌株由至少一种乳杆菌(Lactobacillus)菌株提供，该乳杆菌菌株包含与SEQ ID NO:1具有至少70％的序列同一性的LacS转运蛋白序列，和/或包含GH42 B-gal序列，其中该乳杆菌(Lactobacillus)菌株不是罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)菌株。。
GH42 B-gal序列通常是本领域技术人员已知的，并且可以优选地选自乳杆菌(Lactobacilli)中存在的GH42 B-gal序列，更优选地选自与SEQ ID NO:2具有至少70％序列同一性的序列的GH42 B-gal序列。因此，在本发明的优选的实施方案中，如本文所用，乳杆菌(Lactobacilli)菌株由至少一种乳杆菌(Lactobacilli)菌株提供，其包含与SEQ IDNO:1具有至少70％的序列同一性的LacS转运蛋白序列，和/或包含与SEQ ID NO:2具有至少70％的序列同一性的GH42 B-gal序列，同样前提条件是乳杆菌(Lactobacilli)菌株不是罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)菌株。
特别优选地，益生菌乳杆菌菌株是本领域技术人员已知的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，L.acidophilus)菌株，更优选地嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，L.acidophilus)菌株NCC12，最优选地根据布达佩斯条约以保藏号ATCC-4356或DSM-20079保藏的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，L.acidophilus)菌株NCC 12。
如本文所定义，术语“序列同一性”意指如下比较序列。为了确定两个氨基酸序列的同一性百分比，可以出于最佳比较目的比对序列(例如，可以在第一氨基酸序列的序列中引入间隙)。然后可以比较对应氨基酸位置处的氨基酸。当第一序列中的位置被与第二序列中对应位置相同的氨基酸占据时，则该分子在该位置是相同的。两个序列之间的同一性百分比是这些序列共有的相同位置数量的函数。例如，当特定肽被认为与限定长度的参考多肽具有特定同一性百分比时，该同一性百分比是相对于参考肽的。因此，与100个氨基酸长的参考多肽50％相同的肽可以是与参考多肽的50个氨基酸长的部分完全相同的50个氨基酸的多肽。也可能是100个氨基酸长的多肽，其在其整个长度上与参考多肽50％相同。当然，其他多肽将满足相同的标准。对两个序列的同一性百分比的此类确定可以使用数学算法来完成。用于比较两个序列而利用的数学算法的优选的非限制性示例是Karlin等人，(1993)《美国科学院院报》，90:5873-5877的算法。将此类算法并入NBLAST程序中，其可以用于识别与本发明的氨基酸序列具有所需同一性的序列。为了获得用于比较目的的间隙比对，可以如Altschul等人，(1997)《核酸研究》，25:3389-3402中所述利用间隙BLAST。当利用BLAST和间隙BLAST程序时，可以使用各自程序(例如NBLAST)的默认参数。序列还可以使用第9版Genetic Computing Group's GAP(全局比对程序)进行比对，使用缺省(BLOSUM62)矩阵(值-4至+11)，其中空位开放罚分(对于空位的第一个空)为-12并且空位扩展罚分(对于空位中的每个额外的连续空)为-4。比对后，通过将匹配数量表示为所要求保护的序列中氨基酸数量的百分比来计算同一性百分比。所描述的确定两个氨基酸序列的同一性百分比的方法可以对应地应用于核酸序列。
如本文所用，术语“GOS”意指“低聚半乳糖”。如本文所用，低聚半乳糖(GOS)通常由β-连接的半乳糖部分与还原端的半乳糖或葡萄糖组成。此类GOS含有β-(1→2)、β-(1→3)、β-(1→4)或β-(1→6)连接的半乳糖部分，并且可以具有3-8个半乳糖单元的聚合度(DP)。因此，术语GOS优选地是指包含至少三个半乳糖单元的低聚糖，更优选地是指包含至少四个半乳糖单元的低聚糖，在一个实施方案中，具有3-8或4-8个半乳糖单元的聚合度(DP)。寡糖天然存在于一些哺乳动物例如牛和人的奶中。GOS是可商购获得的，并且可以通过β-半乳糖苷酶的转-半乳糖苷酶活性从乳糖经由生物合成过程合成。高浓度乳糖或乳果糖、不完全的乳糖转换、低水活性和优先使用反式半乳糖苷化的酶通常有利于生物合成过程中的GOS形成。由此类过程产生的GOS的连接类型对用于生物合成的酶是特异性的。
在本文中可有利地用作GOS来源以生长益生菌的一种具体类型的碳水化合物混合物是GOS和牛乳低聚糖的混合物。特别地，优选地使用GOS与3'-唾液乳糖(3'-SL或3SL)和/或6'-唾液乳糖(6'-SL或6SL)的混合物。实际上，此类混合物含有一些类似于人乳的低聚糖，当本发明的组合物用作婴儿配方食品或婴儿的营养补充剂时，这是尤其有利的。此类有益效果描述于例如Simeoni等人的文章“Gut microbiota analysis reveals a markedshift to bifidobacteria by a starter infant formula containing a synbiotic ofbovine milk-derived oligosaccharides and Bifidobacterium animalis subsplactis CNCM I-3446”；《环境微生物学》,2016,18(7):2185-2195(肠道微生物区系分析显示，一种包含得自牛乳的低聚糖和动物双歧杆菌乳酸亚种CNCM I-3446的合生素的1段婴儿配方奶粉对双歧杆菌有明显的偏移，《环境微生物学》，2016年，第18卷第7期，第2185-2195页)。此类组合物的通常获得方式可以为，浓缩乳清渗透物粉以获得浓缩的牛乳低聚糖组合物，并且通过β-半乳糖苷酶的作用由乳糖的水解中原位添加GOS或生成GOS。
在本发明方法的步骤a)i中用于预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的GOS源和在步骤b)中进一步添加的用于制备包含预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株以及GOS的最终组合物的GOS源可以以基本上纯的GOS形式提供(即具有至少90％的GOS的成分)或作为包含GOS的混合物的一部分，诸如碳水化合物的混合物提供。
用GOS预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的基本方面是在生长培养基中提供足够量的GOS。根据一个实施方案，因此通常在用于制备预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的方法的步骤a)i)中将GOS源诸如按在生长培养基中具有以下的量添加到生长培养基中：至少0.2重量％，优选地至少0.5重量％，甚至更优选地至少0.75重量％的GOS。在一个优选的实施方案中，GOS以诸如在生长培养基中提供至多8重量％的GOS，诸如约7重量％GOS、6重量％GOS或甚至至多5重量％GOS，更优选地至多4重量％的GOS或甚至3重量％GOS的量提供，优选地基于生长培养基(％w/w)计算。这些上限和下限的任意组合也涵盖在本文中。优选地，将GOS按以下范围添加到生长培养基中：0.2重量％至8重量％或甚至0.2重量％至7重量％或0.2重量％至6重量％的范围，更优选地0.5重量％至8重量％或甚至0.5重量％至7重量％或0.5重量％至6重量％的范围，甚至更优选地0.75重量％至8重量％或甚至0.75重量％至7重量％或0.75重量％至6重量％的范围，并且最优选地0.75重量％至7重量％的范围，0.75重量％至6重量％或甚至0.75重量％至5重量％的范围，诸如0.75重量％至5重量％或0.75重量％至4重量％的范围，优选地基于生长培养基计算。
当将碳水化合物的混合物用作GOS源用于预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株时，或者当用GOS制备含有预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的最终组合物时，优选的是，在此类混合物中的GOS的量为至少20重量％，优选地至少30重量％，更优选地至少40重量％，甚至更优选地至少45重量％，最优选地至少48重量％，优选地基于含有GOS的混合物的干重计算。
虽然在发酵期间细菌不必仅消耗GOS作为碳来源，但GOS来源中高比例的GOS有利于细菌在发酵期间消耗GOS超过消耗其他碳水化合物，从而导致改善的预处理效果。较小的碳水化合物诸如二糖(例如乳糖)也可以存在并且被支持预处理效果的细菌消耗。因此，还优选的是，在预处理步骤期间，GOS源包含至多55重量％，优选地至多50重量％，更优选地至多45重量％，最优选地至多42重量％的单糖或二糖；和/或不超过40重量％、优选地不超过30重量％的乳糖，优选地基于含有GOS的混合物的干重计算。作为示例，在预处理步骤期间用作GOS来源的碳水化合物的混合物可以包含以上针对混合物所限定的量的GOS以及由乳糖、葡萄糖和/或半乳糖形成的剩余物，以及任选的3'SL和/或6'-SL。
在实施方案中，培养基还包含电子受体，诸如果糖、柠檬酸、甘油和/或1,2-丙二醇。
在实施方案中，培养基还包含果糖，诸如充当电子受体。在说明性但非限制性的示例中，培养基可以包含至少0.5重量％的果糖，优选地至少1重量％的果糖，并且更优选地至少2重量％的果糖，优选地基于培养基的干重计算。对应地，在说明性但非限制性的示例中，培养基优选地不包含超过20重量％的果糖，优选地不超过15重量％的果糖，并且更优选地不超过10重量％的果糖。
根据另外的实施方案，在用于制备预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的方法的步骤a)中将GOS添加到生长培养基中，可以在培养步骤a)i)的任何时间点进行，例如在益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的培养开始时、在步骤a)i)益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的培养中间或结束时，其中添加可以一次、逐步或连续地进行。
培养步骤a)i)以本领域技术人员众所周知的方式进行。步骤a)i)中的培养包括用限定量的细菌(cfu或afu)接种无菌标准生长培养基，然后在限定温度(通常为37℃)和pH下孵育的步骤。在该上下文中，用于开始接种无菌标准生长培养基的限定量的细菌(cfu或afu)可以由本领域技术人员根据本领域的公知常识和实践确定。合适的收率可以使用如上所述的包含GOS的生长培养基获得，与本领域技术人员将用于通过标准生长培养基培养相同菌株的方法相比，优选地不改变培养条件。
用于在本发明的步骤a)i)中培养/发酵乳杆菌(Lactobacillus)菌株的标准生长培养基可以是用于乳酸菌(LAB)的任何已知的标准生长培养基，诸如MRS培养基，或任何其他合适的培养基。此类标准生长培养基优选地可商购获得，但也可以根据众所周知的标准配方通过添加化合物来生产。用于乳杆菌(Lactobacillus)菌株的标准生长培养基通常可以含有碳水化合物，诸如单糖，选自例如葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖或乳糖；各种氮源，诸如蛋白胨、酵母提取物、牛肉提取物或乳清蛋白；矿物质，主要为Mn2+和Mg2+；以及缓冲剂，诸如乙酸钠(CH3COONa)、柠檬酸三钠(Na3C6H5O7)或甘油磷酸钠(C3H7Na2O6P)为LAB培养基中常用的缓冲液。已用于具有缓冲活性的标准生长培养基中的其他组分可以包括磷酸二钠(Na2HPO4)、柠檬酸铵(NH4C6H5O7)、磷酸三钠(Na3PO4)、磷酸氢二钾(KH2PO4)、磷酸三镁(Mg3(PO4)2)、碳酸钙((CaCO)3)和磷酸氢二钾(K2HPO4)。此类标准生长培养基还可以含有广泛的生长因子、表面活性剂，诸如卵磷脂或吐温(例如吐温20、80和85)。培养/发酵可以在厌氧或有氧条件下进行，具体取决于待产生的菌株，但优选地在厌氧条件下进行。另外，可控制或不控制pH，具体取决于已知最适合特定菌株生长的条件。培养步骤的温度和持续时间可以因菌株而异，并且益生菌乳杆菌(Lactobacillus)发酵也是本领域技术人员众所周知的。
根据一个实施方案，本发明方法的步骤a)i)中益生菌乳杆菌菌株的培养/发酵在相当长的时间段内进行，以允许在存在GOS的情况下对益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株进行预处理，通常持续至少1小时的时间段，优选地持续介于5至18小时的时间段，同样优选地介于7至14小时的时间段，更优选地持续介于10至13小时的时间段，并且甚至更优选地持续约12小时的时间段。
此外，根据另外的实施方案，本发明方法的步骤a)i)中益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的培养/发酵在介于25℃至45℃，优选地在30℃至40℃之间，甚至更优选地在35℃至39℃之间诸如约37℃的温度下进行。
附加地，在另外的实施方案中，本发明方法的步骤a)i)中益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的培养/发酵在3.0至7之间的pH下进行。在培养步骤a)期间的益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的预处理期间的pH可以是不进行控制的或者在整个培养步骤a)i)中被设定为恒定值，通常在培养步骤a)期间进行监测和调节。因此，pH可以在3.0至7之间，特别是在益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的预处理过程中不控制pH的情况下。另选地，如果在培养步骤a)i)期间控制pH，则可以将pH调节至约5.0至7.0的范围，例如约5.0至6.0或约6.0至7.0，优选地将pH调节至约6.0至7.0的范围，更优选地调节至约6.6±0.4的范围，最优选地调节至约6.6±0.2的范围。
在本发明方法的步骤a)i)中培养/发酵益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株后，由此在步骤a)ii)中收获预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株。收获步骤旨在将细菌细胞与生长培养基分离开来，该步骤也以本领域技术人员众所周知的方式进行，诸如通过浓缩细菌、离心、过滤、膜过滤、倾析等，优选地离心或浓缩益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株。通常，如上文针对步骤a)i)中的培养/发酵所定义的，在至少1小时的时间段之后，在步骤a)ii)中进行预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的收获。
在步骤a)ii)中收获预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株之后，可以在进一步加工之前在任选的步骤a)iii)中洗涤收获的细胞，通常以去除痕量的生长培养基(在培养/发酵之后)。洗涤可以用盐水、卤水或任何其他合适的液体进行。
在根据步骤a)ii)直接从生长培养基收获预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株或者在任选的洗涤步骤a)iii)之后，预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株可以经历干燥步骤a)iv)。此类干燥步骤a)iv)可以使用任何已知的方法进行，诸如喷雾干燥、流化床干燥、空气对流干燥、大气压干燥、辊式干燥或冷冻干燥，并且更优选地喷雾干燥或冷冻干燥。喷雾干燥也可以在存在保护剂的情况下进行，例如如WO 2017/001590中所述。
任选地，在从生长培养基收获后和/或在洗涤预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株后获得的预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株可以在干燥步骤之前进一步与保护剂，诸如保护剂、冷冻保护剂和/或载体混合，如本领域技术人员已知的并且视情况取决于待使用的干燥方法和待干燥的细菌。此类保护剂、冷冻保护剂和/或载体通常包括甘油、脱脂乳、血清白蛋白、蛋白胨、酵母提取物、蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、麦芽提取物、海藻糖等。可商购获得的保护剂或冷冻保护剂包括例如‘UnipectineTMRS 150等或如EP 14 744 005.1、US 2014/0004083 A1、US 2016/0298077 A1等中所述。
另选地或附加地，培养后、从生长培养基收获后或洗涤后或甚至干燥后获得的预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株，即在步骤a)i、a)ii)或a)iii)中的任一步骤后获得的预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株可以被包封用于进一步的保存和/或使用，例如通过使用常见的包封剂来形成含有预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的微球，该包封剂例如藻酸盐、藻酸盐/普鲁兰、淀粉、黄原胶、黄原胶-结冷胶混合物、明胶、醋酸纤维素酞酸酯、壳聚糖或任何其他合适的包封材料。包封是众所周知的，并且可以由本领域技术人员进行。
此外，用于制备包含预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株和GOS的组合物的本发明方法包括步骤b)：制备包含从步骤a)获得的预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的组合物并且将GOS添加到该组合物中。GOS可以按如上文所定义的量施用，既可以是纯的，也可以是如前面所定义的混合物。
根据优选的实施方案，GOS可以在本发明方法的步骤b)中按以下量添加到从步骤a)获得的预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株中，以制备(最终)组合物：至少1或2g/日剂量，优选地至少3g/日剂量，同样优选地介于2至12g/日剂量或介于2至10g/日剂量、介于2至8g/日剂量、或介于2至7g/日剂量，更优选地介于3至12g/日剂量，同样更优选地介于3至10g/日剂量，诸如介于3至8g/日剂量、介于3至7g/日剂量、介于3至6g/日剂量，或约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12g/日剂量或由此形成的任何范围。添加到包含步骤b)中制备的预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的组合物中的GOS可以具有3-8的聚合度(DP)。
包含预处理益生菌乳杆菌菌株和GOS的组合物
根据第二方面，本发明提供了组合物，其包含有效量的预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株以及附加地有效量的低聚半乳糖(GOS)，其中该组合物已经根据本发明方法制备/获得。在存在GOS的情况下，益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的此类预处理通常根据在本发明第一方面下在本文中所述并且也在所附权利要求中限定的本发明方法进行。如上文已经详细公开的，益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株在存在GOS的情况下的培养/发酵优选地在足以相应地预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的时间内进行，例如在至少一小时的时间段内，优选地根据本文所定义的方法进行。
通常，如本文所定义，“有效量”的用于组合物的预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌种可以包含通常以下量的预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株：介于103cfu至1012cfu，通常介于104cfu至1011cfu/日剂量，优选地介于105cfu至1010cfu/日剂量或105cfu至109cfu/日剂量，同样优选地介于106cfu至109cfu/日剂量、106cfu至108cfu/日剂量或108cfu至1010cfu/日剂量。优选的日剂量为约总计108cfu/日剂量，例如107至109或108至109cfu/日剂量。
如前所述，乳杆菌(Lactobacillus)菌株优选地是本领域技术人员已知的并且优选地如上文所定义的任何乳杆菌(Lactobacillus)菌株，其包含与SEQ ID NO:1具有至少70％序列同一性的LacS转运蛋白序列，和/或包含GH42 B-gal序列，其中该乳杆菌(Lactobacillus)菌株不是罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)菌株。特别优选地，乳杆菌(Lactobacillus)菌株为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，L.acidophilus)菌株，更优选地嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，L.acidophilus)菌株NCC12，最优选地根据布达佩斯条约以保藏号ATCC-4356或DSM-20079保藏的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，L.acidophilus)菌株NCC 12。GH42 B-gal序列通常是本领域技术人员已知的，并且可以优选地选自乳杆菌(Lactobacilli)中存在的GH42 B-gal序列，更优选地选自与SEQ ID NO:2具有至少70％序列同一性的GH42 B-gal序列。
此外，如本文所定义的用于组合物的低聚半乳糖(GOS)的“有效量”可以包含以下量的GOS：至少1或2g/日剂量，优选地至少3g/日剂量，同样优选地介于2至12g/日剂量或2至10g/日剂量、介于2至8g/日剂量或介于2至7g/日剂量，更优选地介于3至12g/日剂量，同样更优选地介于3至10g/日剂量，诸如介于3至8g/日剂量、介于3至7g/日剂量、介于3至6g/日剂量，或约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12g/日剂量或由此形成的任何范围。将GOS添加到如本文所定义的预处理益生菌乳杆菌(Lactobacilli)菌株中为最终产品提供了进一步改善的合生素特性。
因此，益生菌乳杆菌(Lactobacilli)菌株的预处理改变了益生菌乳杆菌(Lactobacilli)菌株，使得乳杆菌(Lactobacilli)菌株与未预处理益生菌乳杆菌(Lactobacilli)菌株相比具有不同的和改善的特性，即，不具有通过在存在GOS的情况下培养或培育而预处理的益生菌乳杆菌(Lactobacilli)菌株。这些不同的和改善的特性还包括上文列出的和示例中公开的特性。
如本文所定义，包含有效量的预处理益生菌乳杆菌(Lactobacilli)菌株和附加地有效量的低聚半乳糖(GOS)的本发明组合物可以是其中可以掺入益生菌的任何类型的组合物，诸如食物产品、饮料、动物饲料产品、用于人或动物的营养补充剂、药物组合物或化妆品组合物。更优选地，本发明组合物可以按可施用的形式提供，优选地选自由以下组成的组：食物产品、饮料、药物制剂、膳食或营养补充剂、功能性食物产品、功能性饮料产品、营养制品以及它们的组合。
本发明组合物可以是固体或液体。优选地，其以粉末、片剂、胶囊的形式存在，或者可以是油制剂、乳液例如水包油乳液(o/w乳液)、油包水乳液(w/o乳液)等的形式，如果以粉末形式存在，则其可以旨在以固体(诸如粉末形式)或半固体形式(例如以糊剂的形式)供最终消费者使用，或者另选地，在使用前重构成液体。
出于提供营养和/或愉悦的目的，如本文所定义，食物产品和饮料包括旨在由人类口服食用的所有产品。表达“食物产品”以及术语“饮料”通常意指滋养受试者的组合物。该“食物产品”通常为口服或非肠道施用，并且其通常包括脂质或脂肪源以及蛋白质源。同样，“饮料”通常经口摄取，是液体或半液体，并且可以包括脂质或脂肪源和蛋白质源。
如本文所定义，食物产品和饮料可以例如是营养组合物，优选地用于人类消费，诸如用于婴儿和/或幼儿，用于孕妇或哺乳期妇女或希望怀孕的妇女，用于因健康状况不佳需要特殊营养的个体，或用于老年人。更优选地，该营养组合物选自婴儿配方食品、婴儿谷物、二段或较大婴儿配方食品、成长奶、功能性牛奶、婴儿食物、婴儿谷物组合物以及用于孕妇和哺乳期妇女或希望怀孕的妇女的奶制品。食物产品和饮料的其他示例包括甜味和咸味小吃、粉末饮品、谷物产品和乳制品，诸如奶制品、基于乳清蛋白的产品等。根据一个特别优选的实施方案，本发明组合物是婴儿配方食品、较大婴儿配方食品、成长奶或用于怀孕或哺乳期妇女的产品。在一个实施方案中，本发明组合物可以是婴儿配方食品。
本发明组合物还可以是动物食物产品或用于动物的营养补充剂的形式。优选，该动物是哺乳动物。动物的示例包括牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠、鱼、鸟等。
如本文所用，表达“婴儿配方食品”是指旨在婴儿出生后前几个月用于特定营养用途，并且本身可满足这类人的营养需求的食品(符合欧盟委员会2006年12月22日针对婴儿配方食品和较大婴儿配方食品的第91/321/EEC 2006/141/EC号指令中第2(c)条的规定)。也是指旨在用于婴儿的营养组合物，并且如在食品法典委员会(法典STAN 72-1981)和婴儿特殊品(包括针对特殊医学目的的食物)中所定义。表述“婴儿配方食品”既涵盖“一段婴儿配方食品(starter infant formula)”，也涵盖“二段婴儿配方食品(follow-up formula)”或“较大婴儿配方食品(follow-on formula)”。
“二段婴儿配方食品”或“较大婴儿配方食品”从第6个月开始给予。婴儿配方食品构成了这类人逐渐多样化饮食中的主要液体元素。
表述“婴孩食物”是指旨在专用于供给不满1岁婴儿或幼儿营养的食料。
在本发明上下文中，术语“婴儿”意指年龄在12个月以下的儿童。此外，表达“幼儿”意指年龄在一岁至三岁之间的小孩，也称为学步儿童。
表述“婴儿谷物组合物”是指旨在专用于供给不满1岁婴儿或幼儿营养的食料。
该产品还可以呈动物食物产品或用于动物的营养补充剂的形式。优选，该动物是哺乳动物。动物的示例包括牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠、鱼、鸟等。
膳食或营养补充剂通常以液体形式存在，诸如冷冻液体、粉末或片剂或胶囊形式、油制剂、乳液，例如水包油乳液(o/w乳液)、油包水乳液(w/o乳液)等，如上文所提及。优选地，其为粉末、片剂、胶囊或油制剂的形式。粉末补充剂通常包含待溶解于液体中或喷洒在食品或饮料中的补充剂。此类补充剂旨在向食用它的受试者提供额外的营养和/或健康益处，以及其他有益成分，诸如本文定义和制备的预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株以及附加地有效量的低聚半乳糖(GOS)。因此，根据本发明的补充剂可以用于为人类以及动物提供营养物质和/或健康益处，如上文所定义。饮食或营养补充剂包括例如本文定义和制备的预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株和附加地有效量的低聚半乳糖(GOS)作为粉末补充剂添加到任何种类的饮食或营养组合物中。
药物产品包括旨在治疗或预防有此需要的受试者的不良医疗状况或促进有利健康状况的粉末、片剂或胶囊产品。
化妆品组合物通常旨在对身体具有美观效果，并且可用于局部用途或可通过口服途径以粉末、片剂或胶囊的形式施用。
包含预处理益生菌乳杆菌菌株和GOS的本发明组合物的应用
本发明旨在提供增加和促进健康微生物群和/或增加某些细菌在肠道中的存活或代谢活性的溶液、组合物和用途。具体地，此类溶液是如本文所述的组合物，其包含待施用于有此需要的受试者或患者的有效量的低聚半乳糖(GOS)预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株和附加地有效量的半乳糖寡糖(GOS)，例如该受试者或患者处于罹患消化功能障碍、受损的微生物群的风险，和/或是具有此类消化功能障碍、受损的微生物群或需要促进微生物群的发育和/或生长的病症的患者。微生物群效果发生在胃肠道中，诸如在十二指肠(小肠的第一部分)、空肠(小肠的中间部分)和/或结肠(大肠)中。
如本文所示，本发明组合物使得当制造益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株时，在发酵期间使用GOS作为特定底物组分，并且甚至进一步用低聚半乳糖(GOS)补充此类预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株，增强乳杆菌(Lactobacillus)菌株在哺乳动物中的益生菌效果。本文公开的方法通过在益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的培养期间使用低聚半乳糖(GOS)来特异性地预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株，使得除了添加GOS之外，体内发生乳杆菌(Lactobacillus)菌株增加的益生菌效果，特别是在如本文公开的非治疗和治疗施用期间。
观察到补充有低聚半乳糖(GOS)的益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的增加的代谢活性，并且可以例如通过在施用补充有低聚半乳糖(GOS)的预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株时增加的乳酸生产而变得明显，如本文所述。此类变化还表明，可以增加有益细菌(诸如双歧杆菌和其他乳杆菌)的群体和/或增加微生物群和/或代谢活性。给予有此需要的受试者和/或患者，通过预处理步骤获得并且补充有低聚半乳糖(GOS)的乳杆菌(Lactobacillus)菌株的益生菌的微生物群和/或存活或代谢活性的改善使得有可能降低获得所寻求的健康效果所需的益生菌的剂量和/或施用频次。
在下文中，不限于此，列出了示例性的治疗和非治疗应用(用途)。
·包含预处理益生菌乳杆菌菌株的组合物的非治疗用途
根据第三方面，本发明提供包含有效量的预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株和有效量的低聚半乳糖(GOS)的组合物的非治疗用途，该组合物根据本发明制备或如本文所述，通常以可施用组合物的形式，以增加或增强所述乳杆菌(Lactobacillus)菌株在健康受试者的消化道中的益生菌效果。在健康受试者的消化道中补充有低聚半乳糖(GOS)的预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株对益生菌效果的此类增加或促进通常可以通过与在有或没有补充低聚半乳糖(GOS)的健康受试者的消化道中的尚未预处理的益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株进行比较来确定。
在健康受试者的消化道中，通常所述益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的益生菌效果的增加或促进尤其但不排他地涉及健康微生物群的增加和促进和/或某些细菌在肠道中的存活的增加或代谢活性的增加。益生菌效果的增加可以表现为例如改善健康受试者的肠道中的乳杆菌(Lactobacillus)菌株代谢活性和/或乳杆菌(Lactobacillus)菌株存活、促进细菌存活和持续、促进健康受试者中的健康微生物群。
在该上下文中，作为该非治疗用途的主要目标的健康受试者可以选自运动员、儿童、学步儿童或婴儿、成人、老年人、孕妇、素食者、哺乳妇女、伴侣动物、猫或狗，优选地用于解决或甚至改善此类身体功能和身体过程。此类健康受试者通常不患有任何病症或疾病，例如，如本文所述，诸如消化功能异常、受损的微生物群和/或消化功能异常。
在这些受试者中，非治疗用途的作用可以是促进免疫功能、平衡或再平衡微生物群、促进肠功能或一般生长或发育。
如前文所讨论的用于预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的任何方法以及如本文所定义的包含补充有低聚半乳糖(GOS)的预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的组合物的任何特征加以必要的变更，同样适用于本发明的第三方面，即适用于如上所述的本发明组合物的非治疗用途。
这特别涉及预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的方法的特征，用补充有低聚半乳糖(GOS)的预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的组合物的制备，以及如用于包含预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的组合物的任何成分和量以及其他特征。该组合物可以按如上文所述的任何形式提供。
在该上下文中，例如需要注意的是，处于非治疗目的的本发明组合物可以是固体或液体，和/或按粉末、片剂、胶囊的形式存在，或者可以是油制剂、乳液、水包油乳液(o/w乳液)或油包水乳液(w/o乳液)的形式。
此外，处于非治疗目的的本发明组合物可以是可施用的形式，优选地选自由以下组成的组：营养组合物、药物制剂、膳食补充剂、功能性食物产品、功能性饮料产品、用于婴儿或儿童的营养组合物诸如婴儿配方产品或较大婴儿配方产品及其组合，例如乳制品、基于奶的产品、基于乳清蛋白的饮料。
如前所述，乳杆菌(Lactobacillus)菌株特别优选地是本领域技术人员已知的并且优选地如上文所定义的任何乳杆菌(Lactobacillus)菌株，其包含与SEQ ID NO:1具有至少70％序列同一性的LacS转运蛋白序列，和/或包含GH42 B-gal序列，其中该乳杆菌(Lactobacillus)菌株不是罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)菌株。特别优选地，乳杆菌(Lactobacillus)菌株为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，L.acidophilus)菌株，更优选地嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，L.acidophilus)菌株NCC12，最优选地根据布达佩斯条约以保藏号ATCC-4356或DSM-20079保藏的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，L.acidophilus)菌株NCC 12。
·包含预处理益生菌乳杆菌菌株和GOS的组合物作为药物的用途
根据第四方面，本发明还提供了包含有效量的补充有低聚半乳糖(GOS)的预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的组合物，其根据本发明制备或如本文所述，用作药物(第一医学用途)。
与前文类似，通常与未用GOS或益生元和益生菌的常见组合处理的益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的效果相比，此类组合物作为药物的效果特别与在需要此类药物的患者的消化道中增加合生素益生元和益生菌效果有关。
与本发明组合物作为药物的用途有关的治疗效果尤其解决了与任何本文所提及的疾病和应用有关的效果，特别是在处于风险中或已经患有任何此类疾病的患者中，特别是如本文在治疗应用的上下文中明确提及的疾病(也参见下文，第二医学用途)。此类患者可以例如处于患有消化功能障碍、受损微生物群的风险中，和/或具有消化功能障碍、受损微生物群或需要促进微生物群的发育和/或生长的病症。该药物还可以用于改善或增加患者的胃肠道中的益生菌效果，优选地益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株。此类改善或增加益生菌效果是例如促进患者的肠道中的健康微生物群，优选地增加患者的微生物群中双歧杆菌和/或乳杆菌的存在；和/或促进消化功能和/或免疫功能和/或生长。
如前文所讨论的用于预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的任何方法以及如本文所定义的包含补充有低聚半乳糖(GOS)的预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的组合物的任何特征加以必要的变更，同样适用于本发明的第四方面，即适用于本发明组合物作为药物的用途。
这特别涉及制备包含补充有低聚半乳糖(GOS)的预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的组合物的方法的特征，以及如用于上文所述的任何形式的本发明组合物的任何成分和量以及其他特征。
在该上下文中，特别优选的是，用作药物的本发明组合物可以是固体或液体，可以按粉末、片剂、胶囊的形式存在，或者可以是油制剂、乳液、水包油乳液(o/w乳液)或油包水乳液(w/o乳液)的形式。
同样，用作药物的本发明组合物可以是可施用形式，优选地选自由以下组成的组：营养组合物、药物制剂、膳食补充剂、功能性食物产品、功能性饮料产品及其组合，例如乳制品、基于奶的产品、基于乳清蛋白的饮料。
如前所述，乳杆菌(Lactobacillus)菌株特别优选地是本领域技术人员已知的并且优选地如上文所定义的任何乳杆菌(Lactobacillus)菌株，其包含与SEQ ID NO:1具有至少70％序列同一性的LacS转运蛋白序列，和/或包含GH42 B-gal序列，其中该乳杆菌(Lactobacillus)菌株不是罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)菌株。特别优选地，乳杆菌(Lactobacillus)菌株为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，L.acidophilus)菌株，更优选地嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，L.acidophilus)菌株NCC12，最优选地根据布达佩斯条约以保藏号ATCC-4356或DSM-20079保藏的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，L.acidophilus)菌株NCC 12。
·包含预处理益生菌乳杆菌菌株和GOS的组合物的治疗用途
根据第五方面，本发明提供了包含有效量的补充有低聚半乳糖(GOS)的预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的组合物，其优选地如根据本发明制备或如本文所述，用于在有此需要的患者中预防和/或治疗疾病中的用途。
如本文所用，术语“治疗”和“缓解”既包括预防性或防止性治疗(预防和/或延缓目标病理学病症或疾病的发展)，也包括治愈性、治疗性或疾病改善性治疗，包括治愈、延缓、减轻确诊的病理学病症或疾病的症状并/或中断其进展的治疗性措施；和治疗存在染病风险或怀疑已染病的患者，以及治疗患病或已经诊断为患有疾病或医学病症的患者。该术语不一定表示个体被治疗直至完全恢复。术语“治疗”还指维持和/或促进未患病但可能易于发展不健康状况等的个体的健康。术语“治疗”和“缓解”还旨在包括一种或多种主要的预防或治疗措施的增强或另外的增强。术语“治疗”和“缓解”还旨在包括疾病或病症的膳食管理或用于防止或预防疾病或病症的膳食管理。
本文使用的补充有低聚半乳糖(GOS)的预处理乳杆菌(Lactobacillus)菌株的特别积极的效果是改善的微生物群。因此提出，乳杆菌(Lactobacillus)菌株在待治疗的患者的肠道中的存活和/或移入和/或生存力的增加可以特异性地并且积极地影响任何本文所提及的疾病中的任何疾病的治疗。因此，本发明提供了本文所述的本发明组合物的医学用途，即，促进通常在任何此类病症中具有失衡的受试者、具有此类功能的缺陷或需要恢复此类功能的正常水平的受试者或需要改善任何此类功能的患者的免疫功能、消化功能、生长或发育。
本文所述的本发明组合物还可以用于改善或增加患者的胃肠道中的益生菌效果，优选地益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株。此类益生菌效果的改善或增加是例如促进患者的肠道中的健康微生物群，优选地增加患者的微生物群中双歧杆菌和/或乳杆菌的存在；和/或促进消化功能和/或免疫功能和/或生长。
通常，任何此类治疗的受试者或需要此类治疗的患者是哺乳动物，优选地是人，更优选地，其选自儿童、学步儿童或婴儿、老年人、孕妇、素食者、哺乳妇女、伴侣动物，以及伴侣宠物诸如猫或狗。任何此类受试者和患者群体都可以在本文中被治疗。此类患者可以例如处于患有消化功能障碍、受损微生物群的风险中，和/或具有消化功能障碍、受损微生物群或需要促进微生物群的发育和/或生长的病症。此外，在该上下文中，如前文讨论的用于制备包含补充有低聚半乳糖(GOS)的预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的组合物的任何方法以及如本文定义的包含预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的组合物的任何特征加以必要的变更，同样适用于本发明的第五方面，即适用于本发明组合物在任何本文定义的治疗中的任何治疗中的第二医疗用途。
这特别涉及制备包含补充有低聚半乳糖(GOS)的预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的组合物的方法的特征，以及如用于包含预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株的组合物的任何成分和量以及其他特征。该组合物可以按如上文所述的任何形式提供。
在该上下文中，特别优选的是，用于第二医疗用途的本发明组合物可以是固体或液体，可以按粉末、片剂、胶囊的形式存在，或者可以是油制剂、乳液、水包油乳液(o/w乳液)或油包水乳液(w/o乳液)的形式。
同样，用于第二医疗用途的本发明组合物可以是可施用形式，优选地选自由以下组成的组：营养组合物、药物制剂、膳食补充剂、功能性食物产品、功能性饮料产品及其组合，例如乳制品、基于奶的产品、基于乳清蛋白的饮料。
如前所述，乳杆菌(Lactobacillus)菌株特别优选地是本领域技术人员已知的并且优选地如上文所定义的任何乳杆菌(Lactobacillus)菌株，其包含与SEQ ID NO:1具有至少70％序列同一性的LacS转运蛋白序列，和/或包含GH42 B-gal序列，并且其中乳杆菌(Lactobacillus)菌株不是罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)菌株。特别优选地，乳杆菌(Lactobacillus)菌株为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，L.acidophilus)菌株，更优选地嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，L.acidophilus)菌株NCC12，最优选地根据布达佩斯条约以保藏号ATCC-4356或DSM-20079保藏的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，L.acidophilus)菌株NCC 12。
应当理解，本文所公开的详细说明的各个方面和实施方案是制造和使用本发明的具体方式的示例，当结合权利要求书和本文的详细说明进行考虑时这些内容并不限制本发明的范围。还应当理解，本发明的各方面和实施方案的特征可与本发明的相同或不同的方面和实施方案的其他特征组合。
如在具体实施方式和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物，除非上下文另外明确规定。
所描述的所有范围旨在包括所述范围内包含的所有数字(整数或分数)。
实施例
实施例1-用于用GOS预处理嗜酸乳杆菌(L. acidophilus)的方法
内部产生的嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)NCC12冷冻发酵剂用于接种含有4％ GOS作为碳源、4％果糖、3％酵母提取物作为氮源、0.3％吐温80、1％碳酸钙粉末、0.001％硫酸锰和0.001％硫酸镁(％基于干物质)的发酵培养基。在37℃下培养过夜嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)用于接种新鲜发酵培养基，其含有4％ GOS作为碳源、4％酵母提取物作为氮源、0.6％吐温80、1.5％碳酸钙粉末、0.0020％硫酸锰和0.002％硫酸镁(％基于干物质)。发酵在37℃和不进行控制的pH下进行。标准(未预处理)嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)NCC12通过在发酵培养基中用4％葡萄糖替换4％ GOS来进行。在喷雾干燥前发酵约10小时后通过离心收获预处理嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)细胞。
用作GOS源的高度纯化的GOS由最少93％ GOS(g/100g干物质)组成。
通过倾注平皿来确定嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)细胞计数。简言之，在胰蛋白胨盐(Oxoid，LP0042)溶液中执行喷雾干燥样品的连续十进制稀释。随后，将100μL的适当稀释液转移到培养皿并且与MRS琼脂(法国布鲁兹AES Chemunex)混合。一式两份地执行分析。然后在37℃的厌氧条件下，孵育平皿48小时。通过确定它们的算术平均值，由在具有适当稀释度的平皿上计数的菌落数计算每克菌落形成单位(cfu/g)。
此外，根据任选的步骤，将GOS添加到收获的预处理益生菌嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)中。
实施例2-用于制备包含补充有附加的GOS的预处理嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)
的组合物的方法
通过添加量为5×106cfu/克预处理益生菌嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)以及量为0.5至10g的GOS/L常规可商购获得的重组的成长奶组合物，制备含有适于年龄组的矿物质的基于牛奶的学步儿童饮料，也称为成长奶。
实施例3-包含补充有附加的GOS的预处理嗜酸乳杆菌(L. acidophilus)的组合物
增加在结肠中的存活。
a)SHIME模型
在该实验中，使用人类微生物生态系统的连续模拟器的简化模拟。该模型已经广泛用于科学和工业两方面的项目长达超过20年，并且已经用体内参数进行了验证(参见例如Van den Abbeele等人，Arabinoxylo-Oligosaccharides andInulin Impact Inter-Individual Variation on Microbial Metabolism andComposition，Which Immunomodulates Human cells,《农业与食品化学杂志》，2018，66，5，1121-1130)。
对于本组实验，使用模拟上胃肠道(上GIT、胃和小肠)和结肠条件的两阶段分批系统作为简化的系统。在这些研究中使用含有适于年龄组的矿物质的基于牛奶的学步儿童饮料，也称为成长奶。/>
图1示出了这些研究中使用的简化的模型。
为了模拟在学步儿童小肠中发生的吸收过程，通过使用具有14kDa截留的纤维素膜来应用透析方法。通过将小肠悬浮液引入透析膜内，分子诸如消化的氨基酸、糖、微量营养素和矿物质逐渐从上胃肠基质中去除。
此外，在1小时的孵育期间，在胃孵育期间从5.5至3.0逐渐降低pH以模拟学步儿童的胃pH。此外，在小肠孵育(十二指肠)的前30分钟期间，实施4.5的固定pH以使得可用矿物质得到最佳吸收。随后145分钟的小肠相(空肠+回肠)，引入pH 7。将暴露于胃和小肠条件后的奶基质转移到含有学步儿童粪便样品的结肠室中。
从12个月大的婴儿供体收集新鲜粪便。制备粪便悬浮液并与保护剂混合。在短期结肠孵育开始时，将测试成分(罗伊氏乳杆菌(L.Reuteri)菌株、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)菌株和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)菌株)添加到含有存在于结肠(例如来源于宿主的甘氨酸，诸如粘蛋白)中的基础营养物质的糖耗尽的营养培养基中。
将罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)菌株、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)菌株和嗜热链球菌(S.thermophilus)菌株接种于1E+09CFU/反应器。
执行以下孵育：
-没有益生菌的对照孵育(仅消化奶)
-上层GIT消化奶+罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)菌株DSM 17938
-上层GIT消化奶+GOS+罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)菌株DSM 17938
-上层GIT消化奶+GOS+预处理罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)菌株DSM 17938
-上层GIT消化奶+预处理嗜热链球菌(S.thermophilus)NCC2496
-上层GIT消化奶+GOS+预处理嗜热链球菌(S.thermophilus)NCC2496
-上层GIT消化奶+嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)NCC12
-上层GIT消化奶+GOS+嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)NCC12
-上层GIT消化奶+预处理嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)NCC12
-上层GIT消化奶+GOS+预处理嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)NCC12以相当于4gGOS/L消化奶的量使用高度纯化的GOS(>93％纯度)来模拟到达大肠的GOS结构。
将内部产生的嗜热链球菌(S.thermophilus)NCC2496冷冻发酵剂用于接种含有3％葡萄糖作为碳源、2.5％酵母提取物作为氮源和0.1％吐温80的发酵培养基。将嗜热链球菌(S.thermophilus)在37℃下培养过夜，用于接种含有4％葡萄糖作为碳源、2.5％酵母提取物作为氮源和0.1％吐温80的新鲜发酵培养基。发酵在40℃下进行，pH控制维持在5.8，添加30％ NaOH。通过在发酵培养基中用4％高度纯化的GOS(>93％)代替3％葡萄糖来完成嗜热链球菌(S.thermophilus)NCC2496的预处理。
内部产生的嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)NCC12冷冻发酵剂用于接种含有4％葡萄糖作为碳源、4％果糖、3％酵母提取物作为氮源、0.3％吐温80、1％碳酸钙粉末、0.001％硫酸锰和0.001％硫酸镁(％基于干物质)的发酵培养基。将嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)在37℃下培养过夜，用于接种含有4％葡萄糖作为碳源、4％酵母提取物作为氮源、0.6％吐温80、1.5％碳酸钙粉末、0.0020％硫酸锰和0.002％硫酸镁(％基于干物质)的新鲜发酵培养基。发酵在37℃和不进行控制的pH下进行。通过在发酵培养基中用4％高度纯化的GOS(>93％)代替4％葡萄糖完成嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)NCC12的预处理。
内部产生的罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)冷冻发酵剂物(L.reuteri DSM 17938)用于接种含有4％葡萄糖作为碳源和4％果糖作为电子受体(基于干物质)的发酵培养基。将罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)培养过夜，用于接种含有8％葡萄糖作为碳源和8％果糖作为电子受体(基于干物质)的新鲜发酵培养基。发酵在无pH控制和37℃下进行。通过用6％ BMOS代替8％葡萄糖并用6％果糖代替8％果糖来完成罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)DSM17938的预处理。保持所有其他条件。
将发酵结束时的嗜热链球菌(S.thermophilus)接种于补充有乳糖的M17上，并在有氧条件下于37℃下孵育48小时以估计CFU/ml。
罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)和嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)菌株接种于MRS琼脂上，并在厌氧条件下于37℃下孵育48小时，以估计发酵结束时的CFU/ml。
在37℃和振荡(90rpm)条件下，在48小时期间执行结肠孵育。所有实验按一式三份执行以说明生物学变化。
微生物群落组成
执行qPCR以选择性地计数乳杆菌和链球菌。在结肠孵育0小时和48小时后执行qPCR。
B)参与GOS代谢的基因
已知几种基因参与GOS代谢。已知转运蛋白LacS和基因GH42β-gal(LacA)涉及一些细菌菌株。罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)DSM17938已经示出在含有GOS的BMOS上生长良好。罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)也已经示出能够被预处理。预处理罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)已经证明在短SHIME结肠系统中的更强的存活。
图2示出了罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)在48小时在结肠中存在或不存在GOS的情况下的存活。GOS促进罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)在结肠中的存活。预处理罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)与未预处理罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)相比，在存在GOS的情况下表现出更好的存活。
表1示出了嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)和嗜热链球菌(S.thermophilus)中基因LacS和LacA的存在，以及与罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)DSM17938序列的序列同源性％。嗜热链球菌(S.thermophilus)NCC2496不具有基因LacA。嗜热链球菌(S.thermophilus)NCC2496的LacS基因与来自罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)DSM17938的LacS具有36.8％的同源性。嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)NCC12具有与来自罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)的LacA 70％相同的基因LacA。嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)NCC12的LacS与罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)70％相同。因此，3个菌株之间的主要区别是在嗜热链球菌(S.thermophilus)NCC2496中不存在GH42β-gal(LacA)。嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)NCC12配备有LacS和LacA。LacS和LacA与罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)DSM17938序列具有多于70％的同源性。
表1：
参与GOS代谢的基因
图3A和图3B示出了罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)DSM 17938的对应LacS序列(SEQ IDNO:1)和LacA序列(SEQ ID NO:2)。
c)β-半乳糖苷酶的活化
β-半乳糖苷酶很可能在GOS、BMOS或乳糖上生长的细菌中被活化。嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)NCC12和嗜热链球菌(S.thermophilus)NCC2496的样品在葡萄糖(参照)或GOS(预处理)上发酵结束时取出。通过以5000g离心5分钟，用PBS洗涤样品两次。将沉淀重悬浮于PBS中，针对嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)至1E+8AFU/mL，针对嗜热链球菌(S.thermophilus)至1E+7AFU/mL。出于这一目的，通过流式细胞术确定AFU。
将X-Gal(Thermo Scientific，B1690)以0.77mg/mL的终浓度添加到样品中。
通过在分光光度计中在37℃下在420和670nm处进行达2小时的OD测量，跟踪X-gal向蓝色产物的酶促转化。通过测量酶转化的斜率来估计β-半乳糖苷酶的活性。
图4示出了嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)NCC12和嗜热链球菌(S.thermophilus)NCC2496以及它们的预处理对应物中的β-半乳糖苷酶的活性。2小时孵育内X-gal底物的恒定转化所示，与其生长在葡萄糖上的对照菌株相比，预处理嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)NCC12和预处理嗜热链球菌(S.thermophilus)NCC2496菌株均表现出强大的β-半乳糖苷酶活性。
图5示出了嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)NCC12(预处理的和未预处理的)在存在和不存在GOS的情况下在48小时孵育时在结肠中的生存力。GOS促进嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)NCC12的生存力，与生长菌株的碳源无关。在存在GOS的情况下，预处理(GOS生长的)和未预处理(葡萄糖生长的)嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)NCC12两者均在结肠中存活得更好。预处理嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)NCC12在存在GOS的情况下比其在葡萄糖上生长的对应物在结肠中存活得更好，这表明了在存在GOS的情况下预处理步骤对嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)NCC12在结肠中的存活的积极效果。
图6示出了在48小时孵育后，在存在或不存在GOS的情况下，罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)DSM17938、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)NCC12和嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)NCC2496在结肠中的存活，特别是GOS对罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)和嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)NCC12的存活的积极效果，以及GOS对嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)NCC2496的存活的消极效果。虽然嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)菌株两者均在GOS上生长并表现出强大的β-半乳糖苷酶活性(图4)，但只有预处理嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)在存在GOS的情况下在结肠中存活得更好。嗜热链球菌(S.thermophilus)碰巧缺失基因组中的Lac A。预处理嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)在结肠中存活良好，这也在预处理罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)中观察到。罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)和嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)两者均具有LacA基因，以及LacS的高同源性序列(>70％)。这意味着LacA基因以及LacS(与罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)DSM17938中发现的序列具有至少70％的序列同一性)的存在，是帮助预处理菌株在存在GOS的情况下在肠道中存活的特征。
序列表
<110> 雀巢产品有限公司（Société des Produits Nestlé S.A.）
<120> GOS预处理乳杆菌菌株和最终制剂中的GOS
<130> P57369/EP
<160> 2
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 1923
<212> DNA
<213> 乳杆菌
<220>
<223> >LACRE_NCC3025_CDS0114基因= 4126 6049直接产物=糖苷/戊糖苷/hexuronide转运蛋白
{ECO:0000313|EMBL:AEI56355.1}
<400> 1
atgacacata gccataagct cacggggaag cagcttattt ctcgtgcttc gttttgcttt 60
ggtaacttag gacactctgc attttatggg gtaatgagta cttactttat tatctttgta 120
acaagcggaa tgttcgcggg actaagcaaa acggttgcta ataaactaat tgggttgatt 180
actggtttga ttgtttctgt ccggattttg gaattattaa ttgatccgct gttaggaaat 240
attgttgata atactaaaac tcagtgggga aaatttaagc cgtggatttt aatgggaaat 300
atcgttagtg cgattctgct attaatcctc tttaccggaa tctttggctt agcaaaatat 360
aattgggttc tttttgccat tttatttgtt attattttca ttacgtttga tattttctac 420
tcattttctg atgtttcgta ttggggaatg gtgcccgctt taagtgaaga ttctgaagag 480
cggggcgttt ataccgctct cggtgccttt gcgggaacac ttggttggaa tggattaacg 540
attatcgtgg taccgattgt aacgaccttt acttatttag ctactggtca tcatcggcag 600
gggcctgctg gttggtttgc ctttgctgcc attatttcgg cattagctgt tatctgtgcc 660
ttggttgttt gtgttgggac gaaagaaaat tacaatgtga tccgtaagtc tgcccaggat 720
aagacaacta ttcgggaagt tttttcagca atttttcaca atgaccaaat cttatggcca 780
agtttggcat atttacttta ttcatgtgcc tatgttgtaa ctaatggtgt ccttttctac 840
ctttacaagt ttgttattgg taaacctggt gaattctgga ttgttggggt catcgctacg 900
attattggtt tctgtactag tcctctttat cctattttga ataaatttat tccacgaaaa 960
tggctattca ttggtggcca agtctgcatg agtttagcat atttaatctt tatttttgcc 1020
cgctctaatg ttttaatgat ggactttgga ttggtcttgt ttaacattaa ttttgcccaa 1080
ttggtaacag ttttaacatt aacggatgca attgaatatg gccaattaaa ttctggtcaa 1140
cgaaatgaag cggttgttct tgctgtgcga ccaatgattg ataaattaac aggggcgatc 1200
tcaaatggcc ttgtcggtta tatcgcaatc gcagccggaa tgacggggag cgcgactgct 1260
gctgacatga caggtcatga tattcggact ttcgatagta tggcattcta tatcccgctg 1320
gtattagcta ttttgtcaat ttttgtcttt ctttttaagg tgaaattgag tgaagaagtt 1380
catgcggaag tagttgaaga attaaaggat aaattagcac aaggagaact gacaagtgaa 1440
gcgtcgacat catcgactgg tcttaaagaa gaaacgattt atgccccaac agatggcgaa 1500
ttagttgcaa tgaaagaagt cgtcgatcgt gatggtcaac cgttccccgg aaagggcttt 1560
gtgattaggc caactagcga taaattgtac gccccatttg acgggaagat taactttacg 1620
tttggcaccc gtcatgcgtt tggtattact tctgacaggg gattagaaat gattgttcat 1680
attggtgtcg ggaccgtaaa catgcgtggt gaaggcttca atgcccatta taatgacggt 1740
caaatcgtta aaaaggggca gctactcttt gactttgatc gtgaattgat tagacaaaga 1800
gggtacgaag actgggtaat tactttcttt gcgcaaccac ataatattga agcaacggct 1860
ggttttactc ccggtaagct tattaagcat ggtgataagg tagtaacagt agaatttaaa 1920
taa 1923
<210> 2
<211> 2022
<212> DNA
<213> 乳杆菌
<220>
<223> >LACRE_NCC3025_CDS0115基因= 2098 4120直接产物=β-半乳糖苷酶β-半乳糖苷酶{ECO:0000256|PIRNR:PIRNR001084}；β
-半乳糖苷酶{ECO:0000256|PIRNR:PIRNR001084}； EC=3.2.1.23 {ECO:0000256|PIRNR:PIRNR001084}
<400> 2
ataatgatga agaaagaatt gcctcgtttc ttatatggtg gcgactataa tcccgaacag 60
tggccagaag aaacgtgggc tgaagatatt aaagtattta agcgggcaga tataaatacc 120
gccacgatca atgttttttc atgggccttg cttgaaccgc aggaaggaaa atacgatttt 180
accaagcttg ataaaattat caaagaatta acggctgctg attttgatat cgttcttgcc 240
acttcaaccg ccgcgatgcc cgcttggatg ttcaagaaat acccagatgt tgcgcgggtc 300
gactaccaag gacgccgcca tgtatttggt gcccggcata acttttgccc aagcagtaaa 360
aattatcggc gtttagcgaa aaatcttgtt gaacagctcg ctaaaagata tggcgataat 420
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tgccaaacag aatttcagca atggttgaag gcgcgctatc aaaccttaaa taatcttaat 540
catgcatgga atatgaatgt gtggagtcat acaatttatg actggaatga gattgttgtg 600
cctaatgaac ttggtgatgc atggggctca gaaggatcgg aaacaattgt cgccggactt 660
tcaattgatt atttacgttt tcaatcgacc caaatgcttg atttatttaa gatggaaaag 720
caaatcattg aaaagtatga tccaacgacc ttagtcacta ctaactttca tagtctgccc 780
aataaaatga ttgattatca gcagtgggct agtgcgcaag acattatatc atatgatagt 840
tatccggctt atgatgcacc ggtttatcag ccagcattct tatatgattt gatgcgttct 900
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atgcttgatt cgtgggatgt tgagatcttg gttcaagaat aa 2022
Claims (15)
1.一种用于制备包含预处理益生菌乳杆菌(Lactobacillus)菌株和GOS的组合物的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
a)按照以下步骤预处理益生菌乳杆菌菌株：
i)在生长培养基中在低聚半乳糖(GOS)的存在下培养益生菌乳杆菌菌株，从而预处理所述益生菌乳杆菌菌株；以及
ii)任选地从所述生长培养基收获所述预处理益生菌乳杆菌菌株；
b)制备包含从步骤a)i)或a)ii)获得的所述预处理益生菌乳杆菌菌株的组合物并且将GOS添加到所述组合物中，
其中所述益生菌乳杆菌菌株是包含与SEQ ID NO:1具有至少70％序列同一性的LacS转运蛋白序列，和/或包含GH42 B-gal序列的至少一种乳杆菌菌株，其中所述乳杆菌菌株不是罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)菌株。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤a)i)中将GOS按在所述生长培养基中具有以下的量添加到所述生长培养基中：至少0.2重量％，优选至少0.5重量％，甚至更优选至少0.75重量％的GOS，并且优选至多8重量％的GOS，诸如至多7重量％的GOS、至多6重量％的GOS或甚至至多5重量％的GOS，更优选至多4重量％的GOS或甚至至多3重量％的GOS，诸如在0.2重量％至8重量％或甚至0.2重量％至7重量％或0.2重量％至6重量％的范围内，更优选在0.5重量％至8重量％或甚至0.5重量％至7重量％或0.5重量％至6重量％的范围内，甚至更优选在0.75重量％至8重量％、或甚至0.75重量％至7重量％、或0.75重量％至6重量％的范围内，并且最优选地在0.75重量％至7重量％的范围内、在0.75重量％至6重量％的范围内、或甚至在0.75重量％至5重量％的范围内，诸如0.75重量％至5重量％或0.75重量％至4重量％的范围内，优选地基于所述生长培养基计算(％w/w)，优选地在步骤a)i)中的所述益生菌乳杆菌菌株培养开始、中间或结束时。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤b)中将GOS按以下量添加到从步骤a)i)或a)ii)获得的所述预处理益生菌乳杆菌菌株中：至少1或2g/日剂量，优选地至少3g/日剂量，同样优选地介于2至12g/日剂量或介于2至10g/日剂量、介于2至8g/日剂量、或介于2至7g/日剂量，更优选地介于3至12g/日剂量，同样更优选地介于3至10g/日剂量，诸如介于3至8g/日剂量、介于3至7g/日剂量、介于3至6g/日剂量，或约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12g/日剂量或由此形成的任何范围。
4.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中在步骤b)中从步骤a)i)或a)ii)获得的所述预处理益生菌乳杆菌菌株按以下量存在于所述组合物中：介于103cfu至1012cfu/日剂量，同样优选地介于104cfu至1011cfu/日剂量，更优选地介于105cfu至109cfu/日剂量，甚至更优选地介于106cfu至109cfu/日剂量或108cfu至1010cfu/日剂量，最优选地约总计108cfu/日剂量，包括107至109或108至109cfu/日剂量。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中在步骤a)i)的培养过程中的pH是进行控制的或不进行控制的，优选地其中在步骤a)i)的培养过程中的pH是不进行控制的并且通常是处于3.0至7.0之间的pH，或者另选地在步骤a)i)的培养过程中是进行控制的，并且优选地被调整至约5.0至7.0的范围，更优选地6.0至7.0的范围，同样更优选地约6.6±0.4，最优选地6.6±0.2。
6.根据权利要求1至5中任一项权利要求所述的方法，其中所述用于制备预处理益生菌乳杆菌菌株的方法包括
-进一步的步骤a)iii)：在收获步骤a)ii)之后洗涤所述预处理益生菌乳杆菌菌株，优选地以去除痕量的生长培养基，和/或
-进一步的步骤a)iv)：干燥所述收获的预处理益生菌乳杆菌菌株，
步骤a)iv)在洗涤步骤a)iii)之后或在收获步骤a)ii)之后进行，其中所述干燥步骤a)iii)可以使用喷雾干燥、流化床干燥、空气对流干燥、大气干燥、滚筒干燥或冷冻干燥、冻干，并且更优选地喷雾干燥或冷冻干燥来进行，和/或
其中所述干燥步骤a)iii)之前可以用保护剂和/或载体来处理所述收获的预处理益生菌乳杆菌菌株。
7.根据权利要求1至6中任一项权利要求所述的方法，其中所述益生菌乳杆菌菌株是嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)菌株，优选地嗜酸乳杆菌菌株NCC12，更优选地根据布达佩斯条约以保藏号ATCC-4356或DSM-20079保藏的嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)菌株NCC 12。
8.组合物，其包含：
(i)有效量的预处理益生菌乳杆菌菌株，和附加地
(ii)有效量的低聚半乳糖(GOS)，
其中所述组合物优选地已经根据权利要求1至13中任一项所述的方法制备，并且
其中所述益生菌乳杆菌菌株由至少一种乳杆菌菌株提供，所述乳杆菌菌株包含与SEQID NO:1具有至少70％的序列同一性的LacS转运蛋白序列，和/或包含GH42 B-gal序列，其中所述乳杆菌菌株不是罗伊氏乳杆菌菌株。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述组合物用于改善所述益生菌效果，优选地如权利要求14中所定义的乳杆菌菌株，更优选地益生菌乳杆菌菌株是嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)菌株，优选地嗜酸乳杆菌菌株NCC12，更优选地根据布达佩斯条约以保藏号ATCC-4356或DSM-20079保藏的嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)菌株NCC 12，优选地，
其中所述益生菌效果的改善或增加：
-是促进所述乳杆菌菌株在所述结肠中的所述存活或所述代谢活性，并且优选地促进与所述乳杆菌菌株相关联的所述健康益处，和/或
-是促进健康受试者的所述肠道中的健康微生物群，优选地增加受试者的所述微生物群中双歧杆菌和/或乳杆菌的存在。
10.根据权利要求8至9中任一项所述的组合物，
其中所述组合物是固体或液体，和/或以粉末、片剂、胶囊的形式存在，或者可以是油制剂、乳液、水包油乳液(o/w乳液)或油包水乳液(w/o乳液)的形式，和/或
其中所述组合物是可施用的形式，优选地选自由以下组成的组：营养组合物、药物制剂、膳食补充剂、功能性食物产品、功能性饮料产品、用于婴儿或儿童的营养组合物诸如婴儿配方产品或较大婴儿配方产品及其组合，例如乳制品、基于奶的产品、基于乳清蛋白的饮料。
11.包含有效量的补充有有效量的GOS的预处理益生菌乳杆菌菌株的组合物的非治疗用途，所述组合物根据权利要求1至7中任一项所述的制备或者是根据权利要求8至10中任一项所述的组合物，优选地用于改善或增加在健康受试者中的所述益生菌效果，
其中改善或增加所述益生菌效果：
-是优选地促进所述乳杆菌菌株在所述健康受试者的所述结肠中的所述存活或所述代谢活性，并且因此促进与所述乳杆菌菌株相关联的所述健康益处；和/或
-是优选地促进所述健康受试者的所述肠道中的健康微生物群，优选地增加所述健康受试者的所述肠道或所述微生物群中双歧杆菌和/或乳杆菌的存在。
12.根据权利要求11所述的非治疗用途，其中所述健康受试者选自运动员、儿童、学步儿童或婴儿、成人、老年人、孕妇、素食者、哺乳妇女、宠物、猫或狗。
13.根据权利要求11或12中任一项所述的非治疗用途，
其中所述组合物是可施用的形式，优选地选自由以下组成的组：营养组合物、药物制剂、膳食补充剂、功能性食物产品、功能性饮料产品、用于婴儿或儿童的营养组合物及其组合，例如乳制品、基于奶的产品、基于乳清蛋白的饮料。
14.根据权利要求1至7中任一项所述制备的包含有效量的预处理益生菌乳杆菌菌株和有效量的GOS的组合物或根据权利要求8至10中任一项所述的组合物，用于在有此需要的患者中预防和/或治疗疾病中的用途，其中所述患者优选地处于患有消化功能障碍、受损微生物群的风险中，和/或具有消化功能障碍、受损微生物群或需要促进所述微生物群的发育和/或生长的病症。
15.根据权利要求14所述用于所述用途的包含预处理益生菌乳杆菌菌株和GOS的所述组合物，其中所述预处理益生菌乳杆菌菌株和GOS用于改善或增加所述益生菌效果，优选地在所述患者的所述胃肠道中的所述益生菌乳杆菌菌株，
其中优选地改善或增加所述益生菌效果
-是促进所述患者的所述肠道中的健康微生物群，优选地增加所述患者的所述微生物群中双歧杆菌和/或乳杆菌的存在；和/或
-是促进所述消化功能和/或所述免疫功能和/或生长。
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