CN116033835A

CN116033835A - 用于改善代谢健康的包含细菌菌株的组合物

Info

Publication number: CN116033835A
Application number: CN202180039774.3A
Authority: CN
Inventors: B·L·斯塔尔; S·福斯坦; O·哈塞尔旺德; A·A·希伯德; H·M·延森; H·M·A·凯恩; 金慧淑; R·库玛; A·乌维汉德; P·T·拉辛坎加; P·E·鲁维耶尔; Q·王
Original assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS
Current assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS
Priority date: 2020-04-03
Filing date: 2021-04-05
Publication date: 2023-04-28
Also published as: CA3174352A1; WO2021203083A3; US20230181653A1; AU2021246535A1; BR112022019932A2; KR20220164002A; WO2021203081A1; EP4125441A2; WO2021203083A2; JP2023542447A

Abstract

本文尤其提供了包含一种或多种生物纯的细菌菌株的组合物以及制备并使用这些组合物治疗和/或预防有需要的受试者的一种或多种肥胖相关障碍的方法。

Description

用于改善代谢健康的包含细菌菌株的组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年4月3日提交的美国临时专利申请号63/004,617的优先权，该申请的公开内容通过引用以其全文并入本文。

技术领域

本文尤其提供了可用于改善受试者代谢健康的细菌组合物及其制备和使用方法。

背景技术

人胃肠道含有复杂多样的微生物生态系统。肠细菌不仅是共栖的，而且它们还与其宿主进行共生的共同进化。肠道微生物群和宿主之间的相互作用是复杂的。有益的肠细菌具有许多重要的功能，并且它们直接或间接影响宿主的各种生理功能，例如，它们为其宿主提供营养、预防肠病原体引起的感染并且调节正常的免疫应答。已经确定微生物群组成的失衡会导致宿主的各种疾病状态。因此，以实现、恢复和维持生态系统中有利平衡，以及胃肠道中存在的微生物的活性为目的进行的肠微生物群的改变对于维持和改善宿主的健康状况是必要的。

第一代益生菌是主要衍生自乳杆菌(Lactobacillus)属和双歧杆菌(Bifidobacterium)属的活微生物，它们通常是消化道的次要成分或由使用中获得，作为乳品发酵剂培养物。传统上，第一代益生菌主要针对肠道和免疫健康。已证明一些益生菌(如乳酸双歧杆菌(B.lactis)B420)也发挥与代谢健康相关的有益活性，例如，在体脂质量的减少和对血糖和胰岛素的一些改善方面。然而，目前的第一代益生菌似乎没有提供葡萄糖和胰岛素代谢方面的最佳解决方案，即，作为2型糖尿病、糖尿病前期或代谢综合征的潜在治疗剂或预防剂。

因此，需要的是如下另外的微生物，这些微生物基于其在代谢健康个体的消化道中的天然存在而鉴定，并且基于其维持和优化代谢健康以及预防疾病的能力而选择。

本文公开的主题解决了这些需求，并且还提供了另外的益处。

发明内容

本文尤其提供了包含一种或多种生物纯的细菌菌株的组合物和制备并使用这些组合物治疗和/或预防有需要的受试者的一种或多种肥胖相关障碍的方法，该一种或多种肥胖相关障碍如但不限于肥胖、代谢综合征、糖尿病、胰岛素缺乏相关障碍、胰岛素抵抗相关障碍、葡萄糖耐受不良、异常脂质代谢、非酒精性脂肪性肝病、肝脂肪变性、瘦素抵抗、抵抗素水平下降和/或心血管疾病。

因此，在一些方面，本文提供了一种组合物，其包含以下中至少一种或多种：(a)生物纯的挑剔真杆菌(Eubacterium eligens)菌株；(b)生物纯的马赛肠单胞菌(Intestinimonas massiliensis)菌株；(c)具有与保藏在德国微生物菌种保藏中心(DSM)编号为DSM 33457的人体普氏菌(Prevotella copri)的16S核糖体RNA序列显示出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列的细菌菌株；和/或(d)生物纯的阿克曼菌属物种(Akkermansia sp.)菌株，其中所述阿克曼菌属物种不是(i)嗜粘蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)；或(ii)嗜聚糖阿克曼菌(Akkermansia glycaniphilia)。在一些实施例中，所述阿克曼菌属物种与(i)嗜粘蛋白阿克曼菌；或(ii)嗜聚糖阿克曼菌之间的全基因组平均核苷酸同一性(gANI)小于约95％。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该组合物包含(a)具有与保藏在DSM、编号为DSM 33458的挑剔真杆菌(E.eligens)的16S核糖体RNA序列显示出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列的细菌菌株；和/或(b)具有与保藏在DSM、编号为DSM 33460的马赛肠单胞菌(I.massiliensis)的16S核糖体RNA序列显示出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列的细菌菌株。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该组合物包含(a)保藏在DSM、编号为DSM 33458的挑剔真杆菌菌株或具有该保藏在DSM、编号为DSM 33458的挑剔真杆菌菌株的所有鉴定特征的活菌株；(b)保藏在DSM、编号为DSM 33460的马赛肠单胞菌菌株或具有该保藏在DSM、编号为DSM33460的马赛肠单胞菌菌株的所有鉴定特征的活菌株；(c)保藏在DSM、编号为DSM 33457的人体普氏菌(P.copri)菌株或具有该保藏在DSM、编号为DSM 33457的人体普氏菌菌株的所有鉴定特征的活菌株；和/或(d)保藏在DSM、编号为DSM 33459的阿克曼菌属物种或具有该保藏在DSM、编号为DSM 33459的阿克曼菌属物种的所有鉴定特征的活菌株，这些菌株(A)是单独的；和/或(B)与衍生自这些菌株中的一种或多种的培养上清液组合。在一些实施例中，该组合物包含(b)生物纯的马赛肠单胞菌菌株；和(d)生物纯的阿克曼菌属物种菌株，其中所述阿克曼菌属物种不是(i)嗜粘蛋白阿克曼菌；或(ii)嗜聚糖阿克曼菌(Akkermansiaglycaniphilia)。在一些实施例中，该组合物包含(b)具有与保藏在DSM、编号为DSM 33460的马赛肠单胞菌的16S核糖体RNA序列显示出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列的细菌菌株。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，所述阿克曼菌属物种与(i)嗜粘蛋白阿克曼菌；或(ii)嗜聚糖阿克曼菌之间的全基因组平均核苷酸同一性(gANI)小于约95％。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该组合物包含(b)保藏在DSM、编号为DSM 33460的马赛肠单胞菌菌株或具有该保藏在DSM、编号为DSM 33460的马赛肠单胞菌菌株的所有鉴定特征的活菌株；和(d)保藏在DSM、编号为DSM 33459的阿克曼菌属物种或具有该保藏在DSM、编号为DSM 33459的阿克曼菌属物种的所有鉴定特征的活菌株。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该组合物配制用于口服施用。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该组合物是冻干或冷冻干燥的。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该组合物是包入胶囊内的或包衣的。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该组合物是食品产品、食品成分、膳食补充剂或药物。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，至少约1x10⁴CFU/g组合物到至少约1x10¹²CFU/g组合物的细菌存在于该组合物中。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该组合物是益生菌。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该组合物已经过巴氏灭菌或热处理。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该组合物是药物组合物，并且进一步包含至少一种药学上可接受的载体和/或赋形剂。

在进一步的方面，本文提供了一种包含分离的细菌细胞外囊泡(EV)的组合物，这些分离的细菌细胞外囊泡衍生自以下中至少一种或多种：(a)生物纯的挑剔真杆菌菌株；(b)生物纯的马赛肠单胞菌(Intestinimonas massiliensis)菌株；(c)具有与保藏在德国微生物菌种保藏中心(DSM)编号为DSM 33457的人体普氏菌(Prevotella copri)的16S核糖体RNA序列显示出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列的细菌菌株；和/或(d)生物纯的阿克曼菌属物种(Akkermansia sp.)菌株，其中所述阿克曼菌属物种不是(i)嗜粘蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)；或(ii)嗜聚糖阿克曼菌(Akkermansiaglycaniphilia)。在一些实施例中，该组合物进一步包含来自(a)、(b)、(c)和/或(d)的一种或多种细菌。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，所述阿克曼菌属物种与(i)嗜粘蛋白阿克曼菌；或(ii)嗜聚糖阿克曼菌之间的全基因组平均核苷酸同一性(gANI)小于约95％。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该组合物包含(a)衍生自如下细菌菌株的EV，该细菌菌株具有与保藏在DSM、编号为DSM 33458的挑剔真杆菌的16S核糖体RNA序列显示出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列；和/或(b)衍生自如下细菌菌株的EV，该细菌菌株具有与保藏在DSM、编号为DSM 33460的马赛肠单胞菌的16S核糖体RNA序列显示出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该组合物包含(a)EV，这些EV衍生自保藏在DSM、编号为DSM 33458的挑剔真杆菌菌株或具有该保藏在DSM、编号为DSM 33458的挑剔真杆菌菌株的所有鉴定特征的活菌株；(b)EV，这些EV衍生自保藏在DSM、编号为DSM 33460的马赛肠单胞菌菌株或具有该保藏在DSM、编号为DSM 33460的马赛肠单胞菌菌株的所有鉴定特征的活菌株；(c)EV，这些EV衍生自保藏在DSM、编号为DSM 33457的人体普氏菌菌株或具有该保藏在DSM、编号为DSM 33457的人体普氏菌菌株的所有鉴定特征的活菌株；和/或(d)EV，这些EV衍生自保藏在DSM、编号为DSM33459的阿克曼菌属物种或具有该保藏在DSM、编号为DSM 33459的阿克曼菌属物种的所有鉴定特征的活菌株，这些菌株(A)是单独的；和/或(B)与衍生自这些菌株中的一种或多种的培养上清液组合。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该组合物包含(b)衍生自生物纯的马赛肠单胞菌菌株的EV；和(d)衍生自生物纯的阿克曼菌属物种菌株的EV，其中所述阿克曼菌属物种不是(i)嗜粘蛋白阿克曼菌；或(ii)嗜聚糖阿克曼菌(Akkermansiaglycaniphilia)。在一些实施例中，该组合物包含(b)衍生自如下细菌菌株的EV，该细菌菌株具有与保藏在DSM、编号为DSM 33460的马赛肠单胞菌的16S核糖体RNA序列显示出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，所述阿克曼菌属物种与(i)嗜粘蛋白阿克曼菌；或(ii)嗜聚糖阿克曼菌之间的全基因组平均核苷酸同一性(gANI)小于约95％。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该组合物包含(b)EV，这些EV衍生自保藏在DSM、编号为DSM 33460的马赛肠单胞菌菌株或具有该保藏在DSM、编号为DSM 33460的马赛肠单胞菌菌株的所有鉴定特征的活菌株；和(d)EV，这些EV衍生自保藏在DSM、编号为DSM 33459的阿克曼菌属物种或具有该保藏在DSM、编号为DSM33459的阿克曼菌属物种的所有鉴定特征的活菌株。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该组合物配制用于口服施用。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该组合物是冻干或冷冻干燥的。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该组合物是包入胶囊内的或包衣的。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该组合物是食品产品、食品成分、膳食补充剂或药物。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，至少约1x10⁴CFU/g组合物到至少约1x10¹²CFU/g组合物的细菌存在于该组合物中。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该组合物是益生菌。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该组合物已经过巴氏灭菌或热处理。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该组合物是药物组合物，并且进一步包含至少一种药学上可接受的载体和/或赋形剂。

在其他方面，本文提供了包含本文公开的任何组合物(如益生菌组合物)的片剂、延长释放胶囊剂、延长释放颗粒剂、粉剂、小袋剂或粘性剂。

在更进一步的方面，本文提供了一种试剂盒，其包含(a)(i)本文公开的任何组合物(如益生菌组合物)；或(ii)本文公开的片剂、延长释放胶囊剂、延长释放颗粒剂、粉剂、小袋剂或粘性剂中的任一种，和b)针对受试者的书面施用说明书。

在又一方面，本文提供了一种用于治疗和/或预防有需要的受试者的一种或多种肥胖相关障碍的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的本文公开的组合物中的任一种或本文公开的片剂、延长释放胶囊剂、延长释放颗粒剂、粉剂、小袋剂或粘性剂中的任一种。在一些实施例中，该肥胖相关障碍是选自由以下组成的组的一种或多种障碍：肥胖、代谢综合征、糖尿病、胰岛素缺乏相关障碍、胰岛素抵抗相关障碍、葡萄糖耐受不良、异常脂质代谢、非酒精性脂肪性肝病、肝脂肪变性、瘦素抵抗、抵抗素水平下降和/或心血管疾病。

在另外的方面，本文提供了一种用于制备组合物的方法，该方法包括将生物纯的马赛肠单胞菌菌株和生物纯的阿克曼菌属物种菌株组合，其中所述阿克曼菌属物种不是(i)嗜粘蛋白阿克曼菌；或(ii)嗜聚糖阿克曼菌(Akkermansia glycaniphilia)。在一些实施例中，所述阿克曼菌属物种与(i)嗜粘蛋白阿克曼菌；或(ii)嗜聚糖阿克曼菌之间的全基因组平均核苷酸同一性(gANI)小于约95％。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，马赛肠单胞菌包含与保藏在DSM、编号为DSM 33460的马赛肠单胞菌的16S核糖体RNA序列显示出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，马赛肠单胞菌包含保藏在DSM、编号为DSM 33460的马赛肠单胞菌菌株或具有保藏在DSM、编号为DSM 33460的马赛肠单胞菌菌株的所有鉴定特征的活菌株；并且其中所述阿克曼菌属物种包含保藏在DSM、编号为DSM 33459的阿克曼菌属物种或具有保藏在DSM、编号为DSM 33459的阿克曼菌属物种的所有鉴定特征的活菌株。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该方法进一步包括将该组合物冷冻干燥或冻干。

在其他方面，本文提供了一种用于预防和/或治疗有需要的受试者的一种或多种肥胖相关障碍的组合物，该组合物包含用于受试者的本文公开的任何组合物(如益生菌组合物)或本文公开的片剂、延长释放胶囊剂、延长释放颗粒剂、粉剂、小袋剂或粘性剂中的任一种。在一些实施例中，该肥胖相关障碍是选自由以下组成的组的一种或多种障碍：肥胖、代谢综合征、糖尿病、胰岛素缺乏相关障碍、胰岛素抵抗相关障碍、葡萄糖耐受不良、异常脂质代谢、非酒精性脂肪性肝病、肝脂肪变性、瘦素抵抗、抵抗素水平下降和/或心血管疾病。在其他方面，本文提供了一种用于为肠道中胍丁胺的产生提供来源以治疗和/或预防以下疾病的方法，这些疾病为糖尿病、炎症、氧化应激、神经创伤和神经系统变性疾病、阿片类成瘾、情绪障碍、认知障碍和癌症，该方法包括向受试者施用本文公开的任何组合物(如益生菌组合物)或本文公开的片剂、延长释放胶囊剂、延长释放颗粒剂、粉剂、小袋剂或粘性剂中的任一种。

本文所述的方面和实施例中的每个能够一起使用，除非明确地或清楚地从实施例或方面的上下文中排除。

在整个说明书中，引用了各种专利、专利申请和其他类型的出版物(例如，期刊文章、电子数据库条目等)。出于所有目的，本文所引用的所有专利、专利申请和其他出版物的公开内容通过引用以其全文特此并入。

附图说明

图1A描绘了瘦的健康个体与肥胖糖尿病前期个体对比测量的差异丰度的粪便16SrRNA运算分类单元(OTU)及使用斯皮尔曼(Spearman)相关系数分析获得的这些个体与临床代谢标志物的相应关联。图1B描绘了从如下临床研究中鉴定的分类学上定义为肠单胞菌属、普氏菌属、真杆菌属和阿克曼菌属物种的OTU，该临床研究比较了瘦的健康个体与肥胖糖尿病前期(BMI、胰岛素和葡萄糖升高)个体，结果表明这些菌属物种与代谢健康呈正相关。

图2描绘了由菌株AF3360009和来自于Ouwerkerk等人,2016中包括的疣微菌纲(Verrucomicrobiae)的菌株组成的系统发生树。该系统发生树是用1000次自举的邻接法重建的。数字代表自举值。图例条指示5％的序列趋异。沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)用作外群。

图3描绘了菌株AF3360009的扫描电子显微镜术图像。与(右)YCFA相比，当生长在(左)YCFA和粘蛋白上时，它们是椭圆形或细长的，具有丝状结构。

图4描绘的图示出了DIO小鼠模型中挑剔真杆菌、马赛肠单胞菌、人体普氏菌、阿克曼菌属物种和马赛肠单胞菌+阿克曼菌属物种对胰岛素水平的影响。

图5描绘的图示出了DIO小鼠模型中挑剔真杆菌、马赛肠单胞菌、人体普氏菌、阿克曼菌属物种和马赛肠单胞菌+阿克曼菌属物种对瘦素水平的影响。

图6A和图6B描绘的图示出了DIO小鼠模型中挑剔真杆菌、马赛肠单胞菌、人体普氏菌、阿克曼菌属物种和马赛肠单胞菌+阿克曼菌属物种对葡萄糖耐量的影响。

图7描绘的图示出了DIO小鼠模型中挑剔真杆菌、马赛肠单胞菌、人体普氏菌、阿克曼菌属物种和马赛肠单胞菌+阿克曼菌属物种对胆固醇水平的影响。

图8描绘的图示出了DIO小鼠模型中挑剔真杆菌、马赛肠单胞菌、人体普氏菌、阿克曼菌属物种和马赛肠单胞菌+阿克曼菌属物种对抵抗素水平的影响。

图9描绘了比较嗜粘蛋白阿克曼菌(A.muciniphila)、嗜聚糖阿克曼菌(A.glycaniphilia)和菌株AF3360009的公开可获得的基因组的阿克曼菌属gANI树状图。

图10描绘了DIO模型中马赛肠单胞菌和阿克曼菌属物种(冷冻的、巴氏灭菌的和冻干的)对体重的影响。

图11描绘了马赛肠单胞菌和阿克曼菌属物种(冷冻的、巴氏灭菌的和冻干的)对体脂重量的影响。

图12描绘了马赛肠单胞菌和阿克曼菌属物种(冷冻的、巴氏灭菌的和冻干的)对肝脏重量的影响。

图13描绘了DIO模型中马赛肠单胞菌和阿克曼菌属物种(冷冻的、巴氏灭菌的和冻干的)对胰岛素水平的影响。

图14描绘了通过HOMA-IR对胰岛素抵抗的测量。

图15描绘了DIO模型中马赛肠单胞菌和阿克曼菌属物种(冷冻的、巴氏灭菌的和冻干的)对瘦素水平的影响。

图16描绘了DIO模型中马赛肠单胞菌和阿克曼菌属物种(冷冻的、巴氏灭菌的和冻干的)对纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI 1)水平的影响。

图17描绘了DIO模型中马赛肠单胞菌和阿克曼菌属物种(冷冻的、巴氏灭菌的和冻干的)对抵抗素水平的影响。

图18描绘了阿克曼菌属物种和马赛肠单胞菌的SCFA产生。

图19描绘了胍丁胺的CE-TOFMS相对峰面积的样本比较。

图20描绘了阿克曼菌属菌株对细胞外ATP的去除。

具体实施方式

许多先前的研究表明，益生菌细菌(例如来自乳杆菌属和双歧杆菌属)支持有益的肠道细菌菌落的生长，但似乎某些有益的益生菌菌株也可以正向改变宿主的代谢途径。微生物有机体产生的生物活性物质影响碳水化合物和脂质代谢并调节肠和全身炎症过程。因此，人们越来越感兴趣的是鉴定对控制肥胖和肥胖相关障碍有效的营养补充剂和益生菌食品。

本申请的发明人已经惊奇地发现，通常使用的益生菌乳杆菌属和双歧杆菌属之外的微生物可以成功改变肠道代谢并且减轻与肥胖相关的病症。发现这些有益微生物在正常体重的健康人的消化系统中富集，而在患有一种或多种肥胖相关障碍的个体中缺乏。向模拟人类肥胖的小鼠的饮食中补充一种或多种有益微生物可显著改善与肥胖相关负面病症相关的一种或多种指标。

I.定义

如本文所用，“微生物(microorganism或microbe)”是指细菌、真菌、病毒、原生动物、和其他微生物或微观有机体。

如本文所用，术语“益生菌”是指供动物消耗的组合物(即作为动物饲料或动物饲料的组分)，其含有有活力的(即活的)微生物，即能够生存和繁殖的微生物，这些微生物以足够的量施用时赋予受试者健康益处(参见Hill等人2014 Nature Revs Gastro&Hep[自然综述·胃肠病学与肝病学]11,506-514，其通过引用以其全文并入本文)。益生菌可能包含本文所述的任何微生物菌株中的一种或多种(如1、2、3或4中的任一者)。益生菌区别于已例如通过巴氏灭菌或热处理杀死的细菌组合物。在本文公开的方法的某些实施例中，还考虑了施用无活力的细菌组合物来治疗一种或多种代谢障碍。

如本文所用，细菌“菌株”是指在生长或繁殖时遗传上保持不变的细菌。包括许多相同的细菌。

“至少一种菌株”意指单一菌株，但也指包含至少两种微生物菌株的菌株混合物。“至少两种菌株的混合物”意指两种、三种、四种、五种、六种或甚至更多种菌株的混合物。在菌株混合物的一些实施例中，比例可以在1％至99％之间变化。当混合物包含多于两种菌株时，菌株能以基本上相等的比例或以不同的比例存在于混合物中。

出于本公开的目的，“生物纯的菌株”意指不包含足以干扰菌株的复制或可通过正常的细菌学技术检测到的量的其他细菌菌株的菌株。当与本文所述的有机体和培养物结合使用时，“分离”不仅包括生物纯的菌株，而且还包括除自然界中发现的那些之外生长或维持的有机体的任何培养物。在一些实施例中，这些菌株是以下菌株的突变体、变体或衍生物：挑剔真杆菌、马赛肠单胞菌、人体普氏菌和/或阿克曼菌属物种，其中该阿克曼菌属物种不是也提供与以下菌株所提供的益处相当益处的嗜粘蛋白阿克曼菌或嗜聚糖阿克曼菌：挑剔真杆菌、马赛肠单胞菌、人体普氏菌和/或阿克曼菌属物种，其中该阿克曼菌属物种不是嗜粘蛋白阿克曼菌或嗜聚糖阿克曼菌。在一些实施例中，这些菌株是具有以下菌株的所有鉴定特征的菌株：挑剔真杆菌、马赛肠单胞菌、人体普氏菌和/或阿克曼菌属物种，其中该阿克曼菌属物种不是嗜粘蛋白阿克曼菌或嗜聚糖阿克曼菌。此外，每种单独的菌株(挑剔真杆菌、马赛肠单胞菌、人体普氏菌和/或阿克曼菌属物种，其中该阿克曼菌属物种不是嗜粘蛋白阿克曼菌或嗜聚糖阿克曼菌)或这些菌株的任何组合也可以提供本文所述的益处中的一种或多种。还将清楚的是，添加其他微生物菌株、载体、添加剂、酶、酵母等也将在受试者中提供一种或多种益处或改善一种或多种代谢病症，并且不会构成实质上不同的细菌菌株。

术语“16S rRNA”或“16S核糖体RNA”意指构成原核生物核糖体小亚基的rRNA。在细菌中，该序列可用于鉴定和表征运算分类单元。

如本文所用，术语“序列同一性”或“序列相似性”意指两个多核苷酸序列(候选序列和参考序列)在候选序列的长度上是相同的(即100％序列同一性)或相似的(即在逐个核苷酸的基础上)。在将候选序列与参考序列进行比较时，如与用于两个序列的最佳比对的参考序列(其不包含添加或缺失)相比，候选序列可包含添加或缺失(即，空位)。用于确定序列同一性的最佳序列比对可以使用本领域已知的任何数量的公开可获得的局部比对算法(如ALIGN或Megalign(DNASTAR公司))、或通过检查来进行。

如本文关于参考序列所用的术语“百分比(％)序列同一性”或“百分比(％)序列相似性”定义为在对序列进行最佳比对并在必要时引入空位以实现最大百分比序列同一性之后，候选序列中与参考多核苷酸序列中的残基相同的核苷酸残基的百分比。

如本文所用，术语“受试者”或“患者”意指哺乳动物(例如，人)。在一些实施例中，受试者患有相关疾病、障碍或病症，如但不限于一种或多种代谢障碍，例如肥胖、代谢综合征、糖尿病、胰岛素缺乏相关障碍、胰岛素抵抗相关障碍、葡萄糖耐受不良、异常脂质代谢、非酒精性脂肪性肝病、肝脂肪变性、瘦素抵抗、抵抗素水平下降和/或心血管疾病。在一些实施例中，受试者易患疾病、障碍或病症。在一些实施例中，受试者显示出疾病、障碍或病症的一种或多种症状或特征。在一些实施例中，受试者不显示疾病、障碍或病症的任何症状或特征。在一些实施例中，受试者是具有如下一种或多种特性的人，该一种或多种特性的典型特征是易感疾病、障碍或病症或有该疾病、障碍或病症风险。在一些实施例中，受试者是患者。在一些实施例中，受试者是接受和/或已经接受诊断和/或疗法施用的个体。

如本文所用，“预防(prevent、preventing、prevention)”及其语法变体是指部分或完全延迟或阻止障碍或病症(如一种或多种代谢障碍，例如肥胖、代谢综合征、糖尿病、胰岛素缺乏相关障碍、胰岛素抵抗相关障碍、葡萄糖耐受不良、异常脂质代谢、非酒精性脂肪性肝病、肝脂肪变性、瘦素抵抗、抵抗素水平下降和/或心血管疾病)和/或其一种或多种伴随症状的发作或复发，或阻止受试者获得或再获得某种障碍或病症，或降低受试者获得或再获得某种障碍或病症或其一种或多种伴随症状的风险的方法。

如本文所用，关于特定性状、特征、特性、生物过程、或现象的术语“减少”是指特定性状、特征、特性、生物过程、或现象的减少。性状、特征、特性、生物过程、或现象可以降低5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或大于100％。

如本文所用,“施用(administer或administering)”意指如通过喂食或口服将包含一种或多种微生物菌株的一种或多种组合物引入受试者的动作。含有一种或多种微生物菌株的组合物也能以一个或多个剂量施用。

如本文所用，“有效量”意指含有一种或多种微生物菌株的组合物改善受试者的一种或多种指标的量。可以如本文所述或通过本领域已知的其他方法来测量受试者的一种或多种指标的改善(如但不限于治疗和/或预防肥胖、代谢综合征、糖尿病、胰岛素缺乏相关障碍、胰岛素抵抗相关障碍、葡萄糖耐受不良、异常脂质代谢、非酒精性脂肪性肝病、肝脂肪变性、瘦素抵抗、抵抗素水平下降和/或心血管疾病中的任何一种)。

某些范围在本文以前面有术语“约”的数值呈现。术语“约”在本文用于为其后面的准确数字以及接近或近似于该术语后面的数字的数字提供字面支持。在判定数字是否接近或近似于特定叙述的数字时，接近或近似的未叙述的数字可以是在呈现其的上下文中提供特定叙述的数字的实质性等效物的数字。例如，关于数值，术语“约”是指数值的-10％至+10％的范围，除非术语在上下文中另有特别定义。

如本文所用，除非上下文另外明确指出，否则单数术语“一个/种(a、an)”、和“该/所述”包括复数个指示物。

还需注意的是，权利要求书可以经撰写而排除任何任选的要素。因此，该陈述旨在作为使用与权利要求要素的叙述有关的排他性术语如“单独”、“仅”等或使用“否定型”限定的前提基础。

仍需注意的是，如本文所用的术语“基本上由……组成(consisting essentiallyof)”是指组合物，其中该术语之后的一种或多种组分在存在其他已知的一种或多种组分的情况下为总组合物的小于30重量％的总量，并且不会影响或干扰一种或多种组分的作用或活性。

进一步注意到，如本文所用的术语“包含(comprising)”意指包括但不限于在术语“包含”之后的一种或多种组分。在术语“包含”之后的一种或多种组分是必需的或强制性的，但是包含该一种或多种组分的组合物可以进一步包括其他非强制性或任选的一种或多种组分。

还要注意的是，如本文所用的术语“由……组成(consisting of)”意指包括且限于术语“由……组成”之后的一种或多种组分。因此，术语“由……组成”之后的一种或多种组分是必需的或强制性的，且组合物中不存在一种或多种其他组分。

在本说明书通篇中给出的每一最大数值限度旨在包括每一较低数值限度，如同此类较低数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书通篇中给出的每一最小数值限度将包括每一较高数值限度，如同此类较高数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书通篇中给出的每一数值范围将包括落入此类较宽数值范围内的每一较窄数值范围，如同此类较窄数值范围在本文中全部明确写出一样。

除非本文另外定义，否则本文所用的所有技术与科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

术语的其他定义可在本说明书通篇出现。

II.组合物

A.菌株

本文公开的含有益微生物的组合物可以用作补充剂、食品添加剂和治疗剂以供施用于处于生理应激期(疾病状态、代谢状态等)的受试者，或作为每日营养方案的一部分，以预防疾病且促进健康的肠道代谢。益生菌是可以用于这些含有有活力微生物的组合物的另一个术语。术语“有活力的微生物”意指具有代谢活性或能够分化的微生物。在一些实施例中，本文公开的含有益微生物的组合物包括有活力的益生菌产品和/或，在特定实施例中，包括含有无活力细菌的组合物(如经热处理或巴氏灭菌的组合物)。

本文提供的菌株包括生物纯的挑剔真杆菌菌株、生物纯的马赛肠单胞菌菌株；生物纯的人体普氏菌菌株和生物纯的阿克曼菌属物种菌株，其中所述阿克曼菌属物种不是嗜粘蛋白阿克曼菌；或嗜聚糖阿克曼菌。

挑剔真杆菌菌株、马赛肠单胞菌菌株、人体普氏菌菌株和阿克曼菌属物种菌株于2020年3月4日保藏于德国微生物菌种保藏中心(DSM)(德国布伦瑞克38124因霍夫芬大街7B(Inhoffenstraβe 7B,38124 Braunschweig,GERMANY))，且保藏编号分别为DSM 33458、DSM33460、DSM 33457和DSM 33459。保藏是根据国际承认用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约的规定进行的。在一个非限制性实施例中，本文提供的一种或多种菌株可以用作益生菌。

含微生物的组合物(如益生菌组合物)可以包括那些含有挑剔真杆菌的一种或多种菌株(如约1、2、3、4、5、6、7或8种或更多种菌株中的任一者)(如挑剔真杆菌菌株DSM33458)的组合物。挑剔真杆菌是真杆菌科中的一种革兰氏阳性细菌，其特征是刚性细胞壁。含有益微生物的组合物可以进一步包括那些含有以下的组合物：挑剔真杆菌的一种或多种菌株和马赛肠单胞菌、人体普氏菌和/或阿克曼菌属物种的一种或多种菌株(如约1、2、3、4、5、6、7或8种或更多种菌株中的任一者)。

含微生物的组合物(如益生菌组合物)可以包括那些含有马赛肠单胞菌的一种或多种菌株(如约1、2、3、4、5、6、7或8种或更多种菌株中的任一者)(如马赛肠单胞菌菌株DSM33460)的组合物。马赛肠单胞菌是一种不运动的革兰氏阴性杆菌，平均直径为0.5μm，长度为1.8μm，没有产孢子活性(Durand等人,2017,New Microbes New Infect.[新微生物和新感染],15:1-2)。含有益微生物的组合物可以进一步包括那些含有以下的组合物：马赛肠单胞菌的一种或多种菌株和挑剔真杆菌、人体普氏菌和/或阿克曼菌属物种的一种或多种菌株(如约1、2、3、4、5、6、7或8种或更多种菌株中的任一者)。在一些实施例中，含有益微生物的组合物同时包括马赛肠单胞菌和阿克曼菌属物种(如不是嗜粘蛋白阿克曼菌或嗜聚糖阿克曼菌的阿克曼菌属物种，例如阿克曼菌属菌株DSM 33459)。此外，当一起培养或施用时，一种或多种马赛肠单胞菌菌株(如马赛肠单胞菌菌株DSM 33460)和一种或多种阿克曼菌属物种(如阿克曼菌属菌株DSM 33459)表现出一种或多种生理或代谢特性，该一种或多种生理或代谢性质是单独培养的马赛肠单胞菌(如马赛肠单胞菌菌株DSM 33460)和阿克曼菌属物种(如阿克曼菌属菌株DSM 33459)所没有的。这些性质可以包括但不限于所产生的有机酸的量和/或类型的变化、代谢特征的变化和/或细菌一起培养的培养基的组成的变化。

含微生物的组合物(如益生菌组合物)可以包括那些含有人体普氏菌的一种或多种菌株(如约1、2、3、4、5、6、7或8种或更多种菌株中的任一者)(如人体普氏菌菌株DSM33457)的组合物。人体普氏菌是一种常见于肠道的革兰氏阴性细菌。含有益微生物的组合物可以进一步包括那些含有以下的组合物：人体普氏菌的一种或多种菌株和马赛肠单胞菌、挑剔真杆菌和/或阿克曼菌属物种的一种或多种菌株(如约1、2、3、4、5、6、7或8种或更多种菌株中的任一者)。

含微生物的组合物(如益生菌组合物)可以包括那些含有阿克曼菌属物种的一种或多种菌株(如约1、2、3、4、5、6、7或8种或更多种菌株中的任一者)的组合物，其中阿克曼菌属物种不是嗜粘蛋白阿克曼菌或嗜聚糖阿克曼菌(例如阿克曼菌属菌株DSM 33459)。直到2016年，该属只含有单一的已知物种，即嗜粘蛋白阿克曼菌。当年，从网纹巨蟒的粪便中首次分离出一种肠粘蛋白降解菌嗜聚糖阿克曼菌(Ouworkerk等人,2016,InternationalJournal of Systematic and Evolutionary Microbiology.[国际系统与进化微生物学杂志]66(11):4614-4620)。如将在下文更详细描述的，不受理论的束缚，基于分离的阿克曼菌属物种与嗜粘蛋白阿克曼菌及嗜聚糖阿克曼菌之间的全基因组平均核苷酸同一性(gANI)低于95％同一的物种界限截止值(Goris等人,2007,Int J Syst Evol Microbiol[国际系统与进化微生物学杂志],57,81-91)，本发明的发明人相信已经鉴定了阿克曼菌属的新物种。在一些实施例中，与嗜粘蛋白阿克曼菌的基因组相比，本文公开的含微生物的组合物中的阿克曼菌属物种(例如阿克曼菌属菌株DSM 33459)具有小于95％(如约94％、93％、92％、91％、90％、89％或88％(如87.58％)中的任一者)的gANI。在另一个实施例中，与嗜聚糖阿克曼菌的基因组相比，本文公开的含微生物的组合物中的阿克曼菌属物种(例如阿克曼菌属菌株DSM 33459)具有小于95％(如约94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％或71％(如70.17％)中的任一者)的gANI。含有益微生物的组合物可以进一步包括那些含有以下的组合物：阿克曼菌属物种的一种或多种菌株和马赛肠单胞菌、挑剔真杆菌和/或人体普氏菌的一种或多种菌株(如约1、2、3、4、5、6、7或8种或更多种菌株中的任一者)。

本文公开的含微生物的组合物(如益生菌组合物)可以包括具有16S核糖体RNA序列的一种或多种挑剔真杆菌菌株，该16S核糖体RNA序列与包含SEQ ID NO:1的16S核糖体RNA序列显示出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％或100％序列相似性中的任一者)。含有益微生物的组合物(如益生菌组合物)可以包括具有16S核糖体RNA序列的一种或多种马赛肠单胞菌菌株，该16S核糖体RNA序列与包含SEQ IDNO:2的16S核糖体RNA序列显示出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％或100％序列相似性中的任一者)。含有益微生物的组合物(如益生菌组合物)可以包括具有16S核糖体RNA序列的一种或多种人体普氏菌菌株，该16S核糖体RNA序列与包含SEQ ID NO:3的16S核糖体RNA序列显示出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％或100％序列相似性中的任一者)。

本文公开的含微生物的组合物(如益生菌组合物)可以包括一种或多种挑剔真杆菌菌株(如挑剔真杆菌菌株DSM 33458)、一种或多种马赛肠单胞菌菌株(如马赛肠单胞菌菌株DSM 33460)、一种或多种阿克曼菌属物种菌株、和/或一种或多种人体普氏菌菌株(如人体普氏菌菌株DSM 33457)(即这些组合物包括来自这些菌株的实际细菌(有活力的或无活力的))和/或衍生自这些菌株的培养(单独或共培养)的一种或多种培养上清液，其中该阿克曼菌属物种不是嗜粘蛋白阿克曼菌或嗜聚糖阿克曼菌(例如阿克曼菌属菌株DSM33459)。

B.配制品

通常，本文公开的含微生物的组合物(如益生菌组合物)包含细菌，如一种或多种细菌菌株。在本发明的一些实施例中，该组合物配制成冷冻干燥或冻干形式。例如，含微生物的组合物可以包含颗粒剂或明胶胶囊剂，例如硬明胶胶囊剂，其包含本文公开的细菌菌株。

在一些实施例中，本文公开的含微生物的组合物包含冻干细菌。细菌的冻干是本领域中一种成熟的规程。可替代地，含微生物的组合物可以包含活的活性细菌培养物。

在一些实施例中，本文公开的任何含微生物的组合物被包入胶囊内以使细菌菌株能够递送到肠。包入胶囊内保护该组合物在递送至靶位置之前免于降解，降解的途径例如为由于化学或物理刺激(如压力、酶活性或物理崩解，其可能是由pH变化触发的)而破裂。可以使用任何合适的包入胶囊内方法。示例性的包入胶囊内技术包括在多孔基质内的截留、固体载体表面上的附着或吸附、通过絮凝或用交联剂的自聚集、以及微孔膜或微胶囊的机械遏制。

本文公开的含微生物的组合物可以口服施用并且可以是片剂、胶囊剂或粉剂的形式。其他成分(例如像，维生素C或矿物质)可以作为氧清除剂和益生元底物被包括，以改善体内的递送和/或部分或全部定植和存活。可替代地，本文公开的含微生物的组合物(如益生菌组合物)可以作为食品或营养产品(如奶或乳清基发酵乳制品)或作为药品口服施用。

本文公开的含微生物的组合物可以被配制为益生菌。可替代地，本文公开的含微生物的组合物可以被配制为无活力的细菌组合物，如经巴氏灭菌或热处理的细菌组合物。

本文公开的含微生物的组合物包括治疗有效量的本文公开的细菌菌株。治疗有效量的细菌菌株足以对患者产生有益的作用。治疗有效量的细菌菌株可足以导致递送至受试者肠和/或受试者肠的部分或全部定植。

例如对于成年人而言，细菌的合适日剂量可以是约1x10³至约1X10¹¹菌落形成单位(CPU)；例如，约1x10⁷至约1x10¹⁰CPU；在另一个实例中，约1x10⁶至约1x10¹⁰GPU；在另一个实例中，约1x10⁷至约1x10¹¹CPU；在另一个实例中，约1x10⁸至约1x10¹⁰CPU；在另一个实例中，约1x10⁸至约1x10¹¹CPU。在某些实施例中，细菌的剂量是每天至少10⁹个细胞，如每天至少10¹⁰、至少10¹¹或至少10¹²个细胞。

在某些实施例中，相对于组合物的重量，含微生物的组合物含有约1x10⁶至约1x10¹¹CFU/g的量的细菌菌株；例如，约1x10⁸至约1x10¹⁰CFU/g。该剂量可以是例如1g、3g、5g和10g。

在某些实施例中，相对于组合物的重量，细菌菌株的量是每克约1x10³至约1x10¹¹个菌落形成单位。

在某些实施例中，本文公开的任何含微生物的组合物按以下剂量施用：在500mg与l000mg之间、在600mg与900mg之间、在700mg与800mg之间、在500mg与750mg之间或在750mg与l000mg之间。在某些实施例中，本文公开的任何含微生物的组合物中的冻干细菌按以下剂量施用：在500mg与l00mg之间、在600mg与900mg之间、在700mg与800mg之间、在500mg与750mg之间或在750mg与l000mg之间。

通常，益生菌任选地与至少一种合适的益生元化合物组合。益生元化合物通常是不可消化的碳水化合物，如低聚糖或多糖或糖醇，其不在上消化道中降解或吸收。已知的益生元包括如菊粉和反式低聚半乳糖等商业产品。

在某些实施例中，本文公开的益生菌组合物被配制为包括益生元化合物，该益生元化合物的量为相对于组合物总重量的约1重量％至约30重量％(例如5重量％至20重量％)。碳水化合物可选自由以下组成的组：低聚果糖(或FOS)、短链低聚果糖、菊粉、低聚异麦芽糖、果胶、低聚木糖(或XOS)、壳寡糖(或COS)、人乳低聚糖、β-葡聚糖、阿拉伯树胶改性淀粉和抗性淀粉、聚葡萄糖、D-塔格糖、阿拉伯胶纤维、角豆树、燕麦和柑橘纤维。在一个方面，益生元是短链低聚果糖(为简单起见，在本文下文示为FOSs-c.c)；所述FOSs-c.c不是可消化的碳水化合物，通常通过甜菜糖的转化获得并且包括结合三个葡萄糖分子的蔗糖分子。在一些实施例中，本文公开的任何益生菌可以与衍生自乳杆菌属和双歧杆菌属(如乳酸双歧杆菌B420)的另外的益生菌一起配制。

本文公开的含微生物的组合物可以进一步包含药学上可接受的赋形剂或载体。用于治疗用途的可接受载体或稀释剂在药学领域是众所周知的。合适载体的实例包括但不限于乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露醇、山梨醇等。合适的稀释剂的实例包括但不限于乙醇、甘油和水。药物载体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据预期的施用途径和标准药物实践来选择。药物组合物可以包含或除了载体、赋形剂或稀释剂之外，任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂(如在到达小肠或大肠之前不会溶解或降解的耐胃肠溶包衣剂)或增溶剂。合适的粘合剂的实例包括但不限于淀粉，明胶，天然糖如葡萄糖，无水乳糖，自由流动乳糖，β-乳糖，玉米甜味剂，天然和合成树胶如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸钠，羧甲基纤维素和聚乙二醇。合适的润滑剂的实例包括但不限于油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。防腐剂、稳定剂、染料甚至调味剂可以提供于药物组合物中。防腐剂的实例包括但不限于苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸的酯。也可以使用抗氧化剂和悬浮剂。

本文公开的含微生物的组合物可以配制为食品产品。例如，除了本发明的治疗效果(如营养补充剂中)外，食品产品还可以提供营养益处。类似地，可以配制食品产品以增强本发明组合物的味道，或通过更类似于普通食品而不是药物组合物来使组合物更有消费吸引力。在某些实施例中，含微生物的组合物被配制为奶基产品。如本文所用，术语“奶基产品”意指具有不同脂肪含量的任何液体或半固体奶基或乳清基产品。奶基产品可以是例如牛奶、山羊奶、绵羊奶、脱脂奶、全脂奶、由奶粉和乳清重组而成的未经任何加工的奶，或加工产品，如酸乳、凝结奶、凝乳、酸性奶、酸性全脂奶、酪乳和其他酸性奶产品。另一个重要的组包括奶饮料，如乳清饮料、发酵奶、炼奶、婴儿或幼儿奶；调味奶、冰淇淋；糖果等含奶食品。

在某些实施例中，本文公开的含微生物的组合物含有单种细菌菌株或物种，并且不含任何其他细菌菌株或物种。此类组合物可以仅包含微量或生物学上无关量的其他细菌菌株或物种。此类组合物可以是基本上不含其他有机体物种的培养物。在某些实施例中，本发明的组合物由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16种细菌菌株或物种组成。在某些实施例中，这些组合物由1至10种(如1至5种)细菌菌株或物种组成。

根据本文公开的方法使用的含微生物组合物可能需要或可能不需要上市许可。

在一些情况下，冻干的细菌菌株在施用前重构。在一些情况下，通过使用本文所述的稀释剂进行重构。

本文公开的含微生物的组合物可以包含药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

在某些实施例中，本文提供了一种药物组合物，其包含：本文公开的细菌菌株；和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂；其中该细菌菌株的量足以在施用于有需要的受试者时治疗障碍；并且其中该障碍选自由以下组成的组：肥胖、代谢综合征、糖尿病、胰岛素缺乏相关障碍、胰岛素抵抗相关障碍、葡萄糖耐受不良、异常脂质代谢、非酒精性脂肪性肝病、肝脂肪变性、瘦素抵抗、抵抗素水平下降和/或心血管疾病。

在某些实施例中，本发明提供了上述药物组合物，其包含载体，该载体选自由以下组成的组：乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露醇和山梨醇。

在某些实施例中，本发明提供了上述药物组合物，其包含稀释剂，该稀释剂选自由以下组成的组：乙醇、甘油和水。

在某些实施例中，本发明提供了上述药物组合物，其包含赋形剂，该赋形剂选自由以下组成的组：淀粉、明胶、葡萄糖、无水乳糖、自由流动乳糖、β-乳糖、玉米甜味剂、阿拉伯胶、黄蓍胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇、油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠和氯化钠。

在某些实施例中，本发明提供了上述药物组合物，其进一步包含防腐剂、抗氧化剂和稳定剂中的至少一种。

在某些实施例中，本发明提供了上述药物组合物，其包含防腐剂，该防腐剂选自由以下组成的组：苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸的酯。

在某些实施例中，本发明提供了上述药物组合物，其中所述细菌菌株是冻干的。

在某些实施例中，上述药物组合物，其中当该组合物储存在约4℃或约25℃的密封容器中且将该容器置于具有50％相对湿度的气氛中时，如以菌落形成单位测量的细菌菌株的至少80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％在至少约1个月、3个月、6个月、1年、1.5年、2年、2.5年或3年的时间段后仍然存在。

可以使用标准微生物学技术(如实例部分中描述的技术或本领域众所周知的技术)来培养本文公开的细菌菌株。

在另外的实施例中，本文公开的细菌菌株中的一种或多种可以被配制为包含细菌细胞外囊泡(EV)的组合物(如药物组合物)。如本文所用，术语“细胞外囊泡”或“EV”是指衍生自细菌的组合物，包含纳米颗粒中含有的细菌脂质以及细菌蛋白质和/或细菌核酸和/或碳水化合物部分。这些EV可以含有1、2、3、4、5、10或超过10种不同的脂质种类。EV可以含有1、2、3、4、5、10或超过10种不同的蛋白质种类。EV可以含有1、2、3、4、5、10或超过10种不同的核酸种类。EV可以含有1、2、3、4、5、10或超过10种不同的碳水化合物种类。如本文所用，术语“经纯化的EV组合物”或“EV组合物”是指包含EV的制剂，这些EV已经与源材料或用于产生该制剂的任何方法中与EV缔合的任何材料中发现的至少一种缔合物质分离(例如，与至少一种其他细菌组分分离)。它还指已经显著富集或浓缩的组合物。在一些实施例中，EV被浓缩2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、100倍、1000倍、10,000倍或超过10,000倍。

本文所述的EV可以使用本领域已知的任何方法来制备。在一些实施例中，在没有EV纯化步骤的情况下制备EV。例如，在一些实施例中，使用保持细菌EV完整的方法杀死包含本文所述的EV的细菌，并且所得的细菌组分，包括EV，用于本文所述的方法和组合物中。在一些实施例中，使用抗生素(例如，使用本文所述的抗生素)杀死细菌。在一些实施例中，使用UV辐照杀死细菌。在一些实施例中，本文所述的EV纯化自一种或多种其他细菌组分。用于从细菌纯化EV的方法为本领域中已知。在一些实施例中，EV通过使用S.Bin Park等人PLoSONE.[公共科学图书馆·综合]6(3):el7629(2011)或G.Norheim等人,PLoS ONE.[公共科学图书馆·综合]10(9):e0134353(2015)中描述的方法从细菌培养物制备，其各自通过引用以其全文特此并入。在一些实施例中，将细菌培养至高光密度，然后离心以沉淀细菌(例如，在4℃以10,000x g离心30分钟)。在一些实施例中，然后使培养上清液通过过滤器以排除完整细菌细胞(例如，0.22μm过滤器)。在一些实施例中，将经过滤的上清液离心以沉淀细菌EV(例如，在4℃以100,000-150,000x g离心1-3小时)。在一些实施例中，通过以下进一步纯化EV：重悬所得的EV沉淀(例如，在PBS中)，并且将经重悬的EV施加到蔗糖梯度(例如，30％-60％的不连续蔗糖梯度)，然后离心(例如，在4℃以200,000x g离心20小时)。可以收集EV带，并用(例如，用PBS)洗涤，并离心以沉淀EV(例如，在4℃以150,000x g离心3小时)。可以将经纯化的EV储存在例如-80℃直至使用。在一些实施例中，通过用DNA酶和/或蛋白酶K处理对EV进行进一步纯化。

例如，在一些实施例中，本文公开的细菌培养物可以在4℃以11,000x g离心20-40分钟，以使细菌沉淀。可使培养上清液通过0.22μm过滤器以排除完整细菌细胞。然后可使用可包括但不限于硫酸铵沉淀、超速离心或过滤的方法浓缩经过滤的上清液。例如，就硫酸铵沉淀而言，可将1.5-3M硫酸铵缓慢添加至经过滤的上清液，同时在4℃搅拌。沉淀可以在4℃孵育8-48小时，然后在4℃以11,000x g离心20-40分钟。所得沉淀物含有细菌EV及其他碎片。

使用超速离心，可以将经过滤的上清液在4℃以100,000-200,000x g离心1-16小时。该离心的沉淀物包含细菌EV和其他碎片。在一些实施例中，使用过滤技术，如通过使用Amicon Ultra自旋过滤器或通过切向流过滤，可对上清液进行过滤以便于保留分子量>50或100kDa的种类。

可替代地，通过将生物反应器连接到交替切向流(ATF)系统(例如，来自Repligen公司的XCell ATF),可以在生长期间连续地或在生长期间的选定时间点从细菌培养物中获得EV。该ATF系统保留完整细胞(>0.22μm)于生物反应器中，并允许较小组分(例如，EV、游离蛋白质)通过过滤器以供收集。例如，可对该系统进行配置，使得<0.22um滤液然后通过100kDa的第二过滤器，使得如在0.22μm与100kDa之间的EV的种类得以收集，并将小于100kDa的种类泵送回生物反应器中。可替代地，该系统可以被配置为允许在培养物生长期间补充和/或改变生物反应器中的培养基。通过这种方法收集的EV可以通过如上文针对经过滤的上清液所述的超速离心或过滤进一步纯化和/或浓缩。

通过本文提供的方法获得的EV可通过基于尺寸的柱色谱法、通过亲和色谱法及通过梯度超速离心，使用可包括但不限于使用蔗糖梯度或Optiprep梯度的方法加以进一步纯化。简言之，在使用蔗糖梯度方法时，如果使用硫酸铵沉淀或超速离心来浓缩经过滤的上清液，则将沉淀物重悬于60％蔗糖、30mM Tris(pH 8.0)中。如果使用过滤来浓缩经过滤的上清液，则使用Amicon Ultra柱将浓缩物缓冲液交换至60％蔗糖、30mM Tris(pH 8.0)中。将样品施加至35％-60％不连续蔗糖梯度中并在4℃以200,000x g离心3-24小时。简言之，在使用Optiprep梯度方法时，如果使用硫酸铵沉淀或超速离心来浓缩经过滤的上清液，则将沉淀物重悬于PBS中的35％ Optiprep中。在一些实施例中，如果使用过滤来浓缩经过滤的上清液，则使用60％ Optiprep将浓缩物稀释至最终浓度为35％Optiprep。将样品施加至35％-60％不连续蔗糖梯度中并在4℃以200,000x g离心3-24小时。

在一些实施例中，为证实EV制剂的无菌性及分离，将EV连续稀释至琼脂培养基(其用于测试中的细菌的例行培养)上，并使用例行条件进行孵育。使未经灭菌的制剂通过0.22μm过滤器以排除完整细胞。为进一步增加纯度，分离的EV可用DNA酶或蛋白酶K处理。

III.方法

A.用于治疗或预防疾病的方法

本文进一步提供了用于治疗和/或预防有需要的受试者的一种或多种肥胖相关障碍的方法，这些方法包括向受试者施用治疗有效量的本文公开的任何含微生物和/或含EV的组合物，该一种或多种肥胖相关障碍包括肥胖、代谢综合征、糖尿病、胰岛素缺乏相关障碍、胰岛素抵抗相关障碍、葡萄糖耐受不良、异常脂质代谢、非酒精性脂肪性肝病、肝脂肪变性、瘦素抵抗、抵抗素水平下降和/或心血管疾病。

体重指数(BMI)(以千克体重除以米为单位的身高的平方计算)是最普遍接受的超重和/或肥胖的测量指标。在成人中，BMI超过25被视为是超重，而肥胖被定义为BMI为30或以上，其中BMI为35或以上被视为是严重的共病，而BMI为40或以上被视为是病态肥胖。出于本发明的目的，“肥胖”应指BMI为30或以上。

每五个超重的人中就有一个受“代谢综合征”的影响。代谢综合征是美国增长最快的肥胖相关健康问题之一，其特征在于一系列健康问题，包括肥胖、高血压、异常血脂水平和高血糖。根据疾病控制与预防中心(CDC)，代谢综合征影响美国人口的近四分之一(22％)，估计有4700万人。特征为包含代谢综合征的这一系列问题可能增加患者出现更严重健康问题的风险，如糖尿病、心脏病和中风。

超重和肥胖的人心脏病的发病率增加，因此比那些保持健康体重指数的人更容易患心脏病发作、充血性心力衰竭、心脏性猝死、心绞痛和心律异常。由于肥胖对血脂水平的负面影响，肥胖通常会增加心脏病的风险，血脂水平在肥胖患者中增加，然后进而增加甘油三酯水平并降低高密度脂蛋白(也称为HDL)。体脂过量的人血液中具有较高水平的甘油三酯和低密度脂蛋白(也称为LDL或“坏胆固醇”)，以及较低水平的HDL胆固醇。这种组合为发生动脉粥样硬化性心脏病创造了最佳条件。

超重或肥胖会增加患高血压的风险。高血压(Hypertension或high bloodpressure)极大地增加了心脏病发作、中风和肾衰竭的风险。事实上，血压随体重的增加而升高。即使减掉10磅也能降低血压——减肥对那些超重并且已经患有高血压的人影响最大。

肥胖与糖尿病的发生有关。超过80％患有2型糖尿病(该疾病最常见的形式)的人肥胖或超重。当在体内组织和器官中胰岛素抵抗的情况下，胰腺产生胰岛素受损时，2型糖尿病就会发生。由于肥胖降低了胰岛素控制血糖(葡萄糖)的能力，因此患糖尿病的风险增加，因为身体开始过度产生胰岛素以调节血糖水平。随着时间的推移，身体不再能够将血糖水平保持在正常范围内。最终，无法实现健康的血糖平衡导致了2型糖尿病的发生。此外，肥胖通过增加胰岛素抵抗和葡萄糖耐受不良使2型糖尿病的管理和治疗变得复杂，这使得对该疾病的药物治疗效果减弱。在许多情况下，体重降至正常范围会使血糖正常化，并且恢复胰岛素敏感性。

儿童肥胖也是一个主要的公共健康问题，尤其是在西方国家。将BMI大于95％的2-18岁儿童视为肥胖。尽管政策旨在降低其流行率，但在过去30年中，儿童肥胖增加了一倍多，并且在青少年中增加了两倍。与成人一样，儿童期肥胖引起高血压、血脂异常(异常脂质代谢)、慢性炎症、凝血倾向增加、内皮功能障碍和高胰岛素血症。这一系列心血管疾病风险因素已经在最小5岁的儿童中确定。

本文公开的方法涉及预防、抑制和治疗肥胖相关障碍。如本文所用，“肥胖相关障碍”包括但不限于肥胖、不期望的体重增加和过度进食障碍(例如，暴饮暴食、贪食症、强迫性饮食或缺乏食欲控制，其中的每一种都可任选地导致不期望的体重增加或肥胖)、代谢综合征、糖尿病、胰岛素缺乏相关障碍、胰岛素抵抗相关障碍、葡萄糖耐受不良、异常脂质代谢、非酒精性脂肪性肝病、肝脂肪变性、瘦素抵抗、抵抗素水平下降和/或心血管疾病。如本文所用，“肥胖(Obesity和obese)”是指世界卫生组织定义的I类肥胖、II类肥胖、III类肥胖和肥胖前期(例如“超重”)。

预计体脂的降低将在受试者中(例如，在被诊断患有与肥胖相关的并发症如肥胖相关障碍的受试者中)提供各种主要和/或次要益处，例如像，胰岛素反应性增加或葡萄糖耐受不良降低(例如，在被诊断患有II型糖尿病的受试者中)；血压偏高减轻；胆固醇水平和/或LDL和/或VLDL偏高减轻；以下疾病的减轻(或降低风险或进展)：心血管疾病(包括缺血性心脏病、动脉血管疾病、心绞痛、心肌梗死和/或中风)、偏头痛、充血性心力衰竭、深静脉血栓形成、肺栓塞、胆结石、胃食道反流病、阻塞性睡眠呼吸暂停、肥胖低通气综合征、哮喘、痛风、活动能力差、背痛、勃起功能障碍、尿失禁、肝损伤(例如，脂肪性肝病、肝硬化、酒精性肝硬化、内毒素介导的肝损伤)、慢性肾衰竭、瘦素抵抗和抵抗素水平偏高。

在另一个实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向受试者施用有效量的本文公开的任何含微生物和/或含EV的组合物(如益生菌组合物)以减轻肥胖。在一些实施例中，相对于未施用本文公开的一种或多种含微生物和/或含EV的组合物的肥胖受试者，受试者的肥胖降低约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％中的任一者，包括落在这些百分比之间的所有值。肥胖的减轻可以通过本领域已知的任何方法来衡量，如BMI的降低。

在另一个实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向受试者施用有效量的本文公开的任何含微生物和/或含EV的组合物(如益生菌组合物)以减轻代谢综合征、糖尿病(包括II型糖尿病)、胰岛素抵抗和/或葡萄糖耐受不良中的一种或多种。在一些实施例中，相对于未施用本文公开的一种或多种含微生物和/或含EV的组合物的被诊断患有代谢综合征、糖尿病(包括II型糖尿病)、胰岛素抵抗和/或葡萄糖耐受不良中的一种或多种的受试者，这些病症中的一种或多种的比率降低了约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％中的任一者，包括落在这些百分比之间的所有值。代谢综合征、糖尿病(包括II型糖尿病)、胰岛素抵抗和/或葡萄糖耐受不良中的一种或多种的减轻可以通过本领域已知的任何方法来确定，如血糖测量和A1C确定。

在另一个实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向受试者施用有效量的本文公开的任何含微生物和/或含EV的组合物(如益生菌组合物)以治疗一种或多种肝脏障碍(包括但不限于异常脂质代谢、非酒精性脂肪性肝病和/或肝脂肪变性)。在一些实施例中，相对于未施用本文公开的一种或多种含微生物和/或含EV的组合物的肝脏障碍受试者，该肝脏障碍的发病率降低了约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％中的任一者，包括落在这些百分比之间的所有值。一种或多种肝脏障碍的减轻可以通过本领域已知的任何方法来确定。

在另一个实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向受试者施用有效量的本文公开的任何含微生物和/或含EV的组合物(如益生菌组合物)以治疗瘦素抵抗和/或抵抗素水平下降。在一些实施例中，相对于未施用本文公开的一种或多种含微生物和/或含EV的组合物的患有瘦素抵抗和/或抵抗素水平下降的受试者，瘦素抵抗降低了和/或抵抗素水平增加了约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％或110％中的任一者，包括落在这些百分比之间的所有值。瘦素抵抗和/或抵抗素水平下降可以通过本领域已知的任何方法来确定。

在另一个实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向受试者施用有效量的本文公开的任何含微生物和/或含EV的组合物(如益生菌组合物)，以治疗一种或多种与心血管疾病相关的障碍(包括但不限于缺血性心脏病、动脉血管疾病、心绞痛、心肌梗死和/或中风)。在一些实施例中，相对于未施用本文公开的一种或多种含微生物和/或含EV的组合物的患有一种或多种与心血管疾病相关障碍的受试者，肝脏障碍的发病率降低了约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％中的任一者，包括落在这些百分比之间的所有值。与心血管疾病相关的一种或多种障碍的减轻可以通过本领域已知的任何方法来确定。

在又一个实施例中，向受试者施用的本文公开的任何含微生物和/或含EV的组合物(如益生菌组合物)包含具有16S核糖体RNA序列的一种或多种挑剔真杆菌菌株，该16S核糖体RNA序列与包含SEQ ID NO:1的16S核糖体RNA序列显示出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％或100％序列相似性中的任一者)。含有益微生物和/或含EV的组合物(如益生菌组合物)可以包括具有16S核糖体RNA序列的一种或多种马赛肠单胞菌菌株，该16S核糖体RNA序列与包含SEQ ID NO:2的16S核糖体RNA序列显示出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％或100％序列相似性中的任一者)。含有益微生物和/或含EV的组合物(如益生菌组合物)可以包括具有16S核糖体RNA序列的一种或多种马赛肠单胞菌菌株，该16S核糖体RNA序列与包含SEQ ID NO:3的16S核糖体RNA序列显示出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％或100％序列相似性中的任一者)。

在一些实施例中，按以下比率向受试者施用一种或多种(如1、2、3、4、5、6、7或8种)挑剔真杆菌、马赛肠单胞菌、人体普氏菌和阿克曼菌属物种菌株：至少约1×10⁴CFU/受试者/天到至少约1x10¹²CFU/受试者/天，如约1×10⁴CFU/受试者/天、1×10⁵CFU/受试者/天、1×10⁶CFU/受试者/天、1×10⁷CFU/受试者/天、1×10⁸CFU/受试者/天、1×10⁹CFU/受试者/天、1×10¹⁰CFU/受试者/天、1×10¹¹CFU/受试者/天或1×10¹²CFU/受试者/天中的任一者，包括落入这些测量值之间的所有值。

B.用于制备微生物组合物的方法

本文还提供了用于制备含微生物和/或含EV的组合物(如益生菌组合物)的方法，这些方法包括将生物纯的马赛肠单胞菌菌株与生物纯的阿克曼菌属物种菌株组合，其中所述阿克曼菌属物种不是嗜粘蛋白阿克曼菌或嗜聚糖阿克曼菌。该阿克曼菌属物种不同于其他已知阿克曼菌属物种的全基因组平均核苷酸同一性(gANI)为至少95％。该马赛肠单胞菌可以包含与保藏在DSM、编号为DSM 33460的马赛肠单胞菌的16S核糖体RNA序列显示出至少97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％或100％序列相似性中的任一者)的16S核糖体RNA序列。

此外，用于制备组合物的方法可进一步包括冻干或冷冻干燥微生物组合物。该方法可以另外包括包装饲料添加剂组合物用于储存或运输的另外的步骤。

C.施用

优选地，本文公开的含微生物和/或含EV的组合物将被施用至胃肠道，以便能够使本发明的细菌菌株递送至肠和/或部分或全部定植于肠。通常，本发明的组合物是口服施用的，但是它们也可以通过直肠、鼻内或经颊或舌下途径施用。

在某些实施例中，本文公开的含微生物和/或含EV的组合物可以作为泡沫剂、喷剂或凝胶剂施用。

在某些实施例中，本发明的本文公开的含微生物和/或含EV的组合物可以作为栓剂施用，如直肠栓剂，例如可可油(可可脂)、合成硬脂肪(例如suppocire、witepsol)、甘油明胶、聚乙二醇或甘油皂组合物的形式。

在某些实施例中，本文公开的含微生物和/或含EV的组合物经管(如鼻胃管、口胃管、胃管、空肠造口术管(J管)、经皮内镜胃造瘘术(PEG))或端口(如可通往脂肪胃(tirestomach)、空肠和其他合适的进入端口的胸壁端口)施用于胃肠道。

本文公开的含微生物和/或含EV的组合物可以一次施用，或者它们可以作为治疗方案的一部分依次施用。在某些实施例中，本发明的组合物将每天施用。

在本发明的某些实施例中，根据本文公开的方法用本文公开的含微生物和/或含EV的组合物治疗伴随着对受试者肠道微生物群的评估。如果本发明的菌株未递送成功和/或未实现部分或全部定植，使得未观察到功效，则可以重复治疗，或者如果递送和/或部分或全部定植成功，并且观察到功效，则可以停止治疗。在某些实施例中，本发明的组合物可以施用于妊娠动物，例如哺乳动物(如人)，以防止其孩子在子宫内和/或出生后出现病症。

本发明的组合物可以施用于以下患者：其已被诊断患有由组蛋白脱乙酰酶活性介导的疾病或病症，或已被鉴定为处于由组蛋白脱乙酰酶活性介导的疾病或病症的风险中。这些组合物也可以作为预防措施施用，以防止健康患者中由组蛋白脱乙酰酶活性介导的疾病或病症的发生。

本文公开的含微生物和/或含EV的组合物可以施用于已被鉴定为具有异常肠道微生物群的受试者。例如，患者体内挑剔真杆菌、马赛肠单胞菌、人体普氏菌和/或阿克曼菌属物种的定植可能减少或没有定植，其中所述阿克曼菌属物种不是嗜粘蛋白阿克曼菌或嗜聚糖阿克曼菌。

本文公开的含微生物和/或含EV的组合物可以作为食品产品(如营养补充剂)施用。

通常，本文公开的含微生物和/或含EV的组合物用于治疗人类受试者，尽管它们可用于治疗动物，包括单胃哺乳动物如家禽、猪、猫、狗、马或兔或多胃动物(如反刍动物)。本发明的组合物可用于增强动物的生长和表现。施用于动物时，可以采用口服管饲法。

IV.试剂盒

本文进一步提供了试剂盒，其含有一种或多种微生物菌株和/或衍生自本文公开的一种或多种微生物菌株的EV。这些试剂盒可包括一种或多种(如1、2、3或4中的任一者)菌株和/或衍生自本文提供的一种或多种微生物菌株的EV以及用于正确储存、维护和用于施用于受试者以治疗或预防一种或多种肥胖相关障碍的说明书，该一种或多种微生物菌株包括阿克曼菌属物种、挑剔真杆菌菌株(例如挑剔真杆菌菌株DSM 33458)、马赛肠单胞菌菌株(例如马赛肠单胞菌菌株DSM 33460)和/或人体普氏菌菌株(例如人体普氏菌菌株DSM33457)，其中该阿克曼菌属物种不是嗜粘蛋白阿克曼菌或嗜聚糖阿克曼菌(例如阿克曼菌属菌株DSM 33459)。在一个实施例中，该试剂盒可包括阿克曼菌属菌株DSM 33459和马赛肠单胞菌菌株DSM 33460。

通过参照以下实例可以进一步理解本发明，这些实例是为了说明而提供的，而不是为了限制。

实例

实例1：菌株的分离

马赛肠单胞菌的分离：如通过对所有临床粪便样本进行16S群落分析所确定的，具有较高的马赛肠单胞菌种群的临床粪便样本用于富集方案，所有工作均在厌氧条件下进行。将样品在基础碳酸氢盐缓冲培养基中以1:100稀释，将总共25ml经接种的培养基密封在50ml玻璃小瓶中。小瓶在37℃厌氧条件下孵育。每天取出大约5ml培养物，分配到4个管中，2个用于DNA提取且2个用于菌株分离。在开始富集后的第4、5、6、7、8和11天取样。每天从样品中提取DNA，并进行16S群落分析测序以确定细菌种群。已确定第11天的样品具有最高百分比的马赛肠单胞菌，因此将来自第11天的菌株分离样品之一用于稀释并且铺板在基础碳酸氢盐缓冲培养基琼脂板上。基础碳酸氢盐缓冲培养基：0.53g/L磷酸氢二钠、0.41g/L磷酸二氢钾、0.3g/L氯化铵、0.11g/L氯化钙、0.1g/L七水硫酸镁、0.3g/L氯化钠、4g/L碳酸氢钠、0.48g/L硫化钠水合物、5X Wolfe氏微量矿物质、1X标准维生素溶液、80mM乳酸盐、80mM乙酸盐。

人体普氏菌的分离：通过将经稀释的粪便物质直接铺板在BHIB琼脂板上厌氧孵育24小时来分离人体普氏菌菌株。BHIB：补充10％绵羊血的脑心浸出液琼脂。(商业购买，BD221843)在液体肉汤中生长时，使用BHIS。BHIS：补充酵母提取物、维生素K1和氯化血红素(hemin)的脑心浸出液。

阿克曼菌属物种的分离：通过将经稀释的粪便物质直接铺板在含有10g/L粘蛋白的YCFA培养基上，从临床粪便样品中分离出阿克曼菌属菌株。

挑剔真杆菌的分离：通过将经稀释的粪便物质直接铺板在BHIB琼脂板上厌氧孵育24小时来分离挑剔真杆菌菌株。BHIB：补充10％绵羊血的脑心浸出液琼脂。(商业购买，BD221843)在液体肉汤中生长时，使用BHIS。BHIS：补充酵母提取物、维生素K1和氯化血红素的脑心浸出液。

基因组测序：所有菌株都通过同样的方法来提供基因组序列。使菌株在BHIB或YCFA琼脂板上生长。用一个大环从琼脂板上去除生长物，小心不要去除琼脂。生长物的量决定了加工用于DNA提取的孔的数量。对于1个孔，将生长物重悬于750μl的DNA提取试剂盒中使用的第一溶液，PowerMag珠溶液中。如果有足够的生长物扩增到多个孔，则使用另外的体积。将细胞重悬，并且将重悬后的细胞分配到所需数量的孔中。使用试剂盒说明书遵循DNA提取方案。对于洗脱，每孔使用稍少的洗脱缓冲液以获得更高的DNA浓度。DNA提取完成后，将类似的孔进行合并。使用来自英杰公司(Invitrogen)的Quant-It PicoGreen DSDNA检测试剂盒确定DNA浓度。

从健康供体的粪便样品中分离候选菌，并通过全基因组测序进行鉴定。通过统计分析进行排名，统计分析包括相关分析值(胰岛素、BMI、葡萄糖、DXATotFAT)、丰度百分比和携带候选菌的瘦个体样本数量。基于相关分析和分离可用性来选择候选菌。选择了这些候选菌中的四种进行进一步研究(图1A和图1B)。

实例2：阿克曼菌属新物种的鉴定

除非另有说明，否则使用N2/CO2/H2(85/10/5％)的混合气体在厌氧室内进行所有工作。

在第二轮分离过程中分离菌株AF33600009，第二轮分离是在一轮通常的分离后进行的，其中目标是任何排名靠前的候选菌。根据先前分析的16S群落分析，为这一轮分离选择的临床样本显示具有更高丰度的排名靠前的候选菌。该菌株分离自粪便样本F015V3。在这一轮中使用的分离方法是在含有10g/L粘蛋白的YCFA培养基上进行选择。

在该轮分离中使用的试样先前由来自样本F015V3的粪便物质与甘油混合制成，使得最终甘油浓度为25％。在需要使用前，这些试样都储存在-80℃。从冷冻室中取出一份试样，放入厌氧室中，并置于室温解冻约10分钟。除非另有说明，否则所有工作均在厌氧室内进行。取出经测量的部分，并且在不含粘蛋白的YCFA肉汤中连续稀释。从10^-4、10^-5和10^-6稀释液中取100μl试样铺板到omni盘中的YCFA+粘蛋白琼脂上。使用约十二个无菌玻璃珠将细菌细胞铺展，以将稀释试样均匀地铺展在琼脂表面上。在37℃，将板在带有小袋剂的厌氧箱形成的厌氧环境中孵育约72小时。

将脱氧生长培养基，即YCFA+10g/L粘蛋白，分配到1ml深孔板中，每孔350μl。挑取单菌落并接种到具有预分配培养基的板中，每孔1个菌落。板上覆盖有透气的覆盖物，允许气体交换。将板在37℃孵育大约216小时。使用96孔头Integra移液器轻轻混合培养物。取一份培养物试样用于16S PCR分析，剩余的培养物与无菌、脱氧的50％甘油+1g/L L-半胱氨酸混合，使得最终的甘油浓度为25％。将这些培养物移至适当的长期储存小瓶中，储存于-80℃。

16S鉴定：用无菌水将用于PCR的细胞培养物试样以大约1:100稀释。将这种水稀释液用作16S PCR反应中的模板。用于扩增16S基因的PCR引物是：8F:AGA GTT TGA TYM TGGCTC和1492R:CGG TTA CCT TGT TAC GAC TT。聚合酶Q5的PCR反应条件和热循环仪设置是标准的。16S PCR反应的试样在凝胶上运行，以确认预期大小的16S PCR产物的存在。使用用于PCR纯化试剂盒的ExoSAP-IT Express对16S PCR反应的试样进行酶法纯化。然后，将该样本送往外部第三方供应商进行桑格(sanger)测序。最常用于16S桑格测序的16C引物是515F:GTG CCA GCM GCC GCG GTA A。

然后将16S序列与排名靠前候选菌列表中的16S扩增子序列进行比较。这些结果表明，最接近的匹配候选菌是嗜粘蛋白阿克曼菌。将对应于含有所需菌株的孔的小瓶从冷冻室中取出，并且放入厌氧室中，以便可以从小瓶中取出一小部分经冷冻的培养物，并在YCFA+10g/L粘蛋白琼脂板上划线。将该板在37℃在具有小袋剂的厌氧箱中孵育，直到有足够的生长物来制备冷冻原液并提取DNA。

菌株AF33600009的基因组：使用的DNA提取试剂盒是凯杰公司(Qiagen)

DNA KF(King Fisher)试剂盒。从YCFA+10g/L粘蛋白琼脂板上刮下最近划线的生长物，并将细胞重悬于来自DNA提取试剂盒的第一溶液中。通过轻轻移液，将细胞轻轻重悬以破碎细胞团块。将该细胞重悬液均匀分布到PowerMag珠板的多个孔中。孔的数量根据细胞悬浮液中细胞的量和密度来确定。然后遵循制造商的方案提取DNA。DNA提取完成后，将类似的孔合并为一个DNA样品，并使用英杰公司Quant-iT PicoGreendsDNA定量试剂盒确定DNA浓度。然后将DNA送往全基因组测序。

用Nextera Flex试剂盒(依诺米那公司(Illumina))制备测序库，并以成对读取2x150nt在MiSeq(依诺米那公司)上进行测序。使用内部途径汇编基因组测序数据。简而言之，基于质量对读数进行过滤和修整，然后使用BFC校正(Li,2015)。使用具有kmer长度选项“31,55,77,99,121”的SPAdes汇编器(Bankevich等人,2012)来汇编经校正的读数。使用Pilon对汇编进行了校正(Walker等人,2014)。汇编后，通过Prokka(Seemann,2014)预测并注释可读框(ORF)。通过Barrnap预测16S rRNA基因，并且通过RDP成对比对工具(Fish等人,2013)进行最接近的物种鉴定。

菌株AF33600009的基因组草图由31个N50为331,405bp且覆盖率为125x的重叠群组成。基因组大小为3.19Mb，大于其他两种阿克曼菌属物种：嗜粘蛋白阿克曼菌Muc^T(2.66Mbp)和嗜聚糖阿克曼菌Pyt^T(3.07Mb)的模式菌株的基因组大小。基因组DNA的G+C含量为57.7％。由于目前在阿克曼菌属中仅已知两个物种，因此用这三种菌株和来自描述嗜聚糖阿克曼菌的出版物(Ouwerkerk等人,2016)中包括的疣微菌纲的一些菌株重建了系统发生树。

系统发生分析表明菌株AF33600009是阿克曼菌属的成员，与嗜粘蛋白阿克曼菌Muc^T的亲缘关系最近(图2)。菌株AF33600009与嗜粘蛋白阿克曼菌Muc^T之间的全基因组平均核苷酸同一性(gANI)为87.58％，而菌株AF33600009与嗜聚糖阿克曼菌Pyt^T之间的全基因组平均核苷酸同一性仅为70.17％。基于gANI值低于95％的物种界限截止值(Goris等人,2007年)，菌株AF33600009被提议为阿克曼菌属内的新物种。

使用大量最接近嗜粘蛋白阿克曼菌模式菌株基因组GCF_000020225.1的公开可获得的基因组，以及两个嗜聚糖阿克曼菌公开可获得的基因组和菌株AF33600009的基因组，生成了阿克曼菌属gANI树状图(图9)。将来自嗜粘蛋白阿克曼菌的所有基因组聚类在一起，两个嗜聚糖阿克曼菌公开可获得的基因组聚类在一起，而AF3360009形成了不同于其他两个物种的单独的簇。

细胞脂肪酸的脂肪酸甲酯(FAME)分析(Welch,1991.Applications of cellularfatty-acid analysis.[细胞脂肪酸分析的应用]Clin.Microbiol.Rev.[临床微生物学评述]4:422-438)由微生物鉴定公司(Microbial ID Inc)(美国特拉华州(DE,USA))进行，其中菌株AF33600009和嗜粘蛋白阿克曼菌ATCC菌株BAA835通过在BHIA上生长进行标准样本制备以提取脂肪酸甲酯用于鉴定。然后将样品装载到气相色谱仪上进行分析。使用

模式识别软件，生成了样本FAME图谱。然后比较样本以确定相似性。如表1所示，FAME图谱显示出菌株AF3360009和ATCC菌株BAA835之间的显著差异。

表1：菌株BAA835和AF3360009的比较性FAME特征。

菌株AF33600009的细胞呈椭圆形或细长形。当细胞在含有粘蛋白的培养基上生长时，观察到更多细长形。与仅YCFA相比，当在YCFA+粘蛋白培养基上生长时，细胞更多地呈聚集体并且形成更多的细丝(图3)。

实例3：用于评价候选菌功效的小鼠模型

采用饮食诱导肥胖(DIO)小鼠模型来评价如下候选菌的功效：实例2中描述的挑剔真杆菌、马赛肠单胞菌、人体普氏菌和阿克曼菌属物种。

在DIO小鼠模型中评价了挑剔真杆菌、马赛肠单胞菌、人体普氏菌和阿克曼菌属物种改善代谢障碍的功效。对于动物研究，到达时，将第1组动物维持于PMI营养国际有限责任公司(PMI Nutrition International)认证的啮齿动物食物5号CR4。将第2-9组动物维持于研究饮食(Research Diet)D12492。将动物单个圈养在含适当垫料的聚碳酸酯笼子里。在研究的第-1天，将动物分配到表2中提及的治疗组，以产生在体重和非禁食血糖(基于第-1天的测量结果)方面没有显著差异的队列。

表2：实验设计

每天制备供试品挑剔真杆菌、马赛肠单胞菌、人体普氏菌、阿克曼菌属物种和马赛肠单胞菌+阿克曼菌属物种并在配制一小时内施用。从第1天至第36天，经口服管饲法每天一次施用媒介物(第2组)。每只动物的剂量体积为100μl。从第1天至第36天，经口服管饲法每天一次施用供试品(第2-7组)。每只动物的剂量体积为100μl。使用附有管饲套管的注射器施用每种剂量。

从第1天至第36天，将对照品(第8组)每天一次经皮下注射施用到合适的动物的肩胛间区域。每只动物的剂量体积基于最新体重测量结果。使用注射器/针头将每个剂量施用到划定的区域内。将给药的第一天指定为第1天。

研究参数包括死亡率/垂死状态检查、日常观察、体重测量结果、食物消耗量、粪便样本、血糖测量结果、口服葡萄糖耐量试验、qNMR评估、细胞因子评估和临床化学参数。在整个给药阶段的指定时间点和预定的安乐死日采集血样，用于生物标志物评价。

测量从不同组的小鼠获得的血清中的胰岛素水平。与媒介物对照相比，马赛肠单胞菌管饲组显示胰岛素水平下降了12％。人体普氏菌、阿克曼菌属物种和马赛肠单胞菌+阿克曼菌属物种管饲组显示胰岛素水平分别上升了50％、50％和64％(图4)。

测量从不同组的小鼠获得的血清中的瘦素水平。与媒介物对照相比，挑剔真杆菌管饲组显示胰岛素水平下降了21％。人体普氏菌、阿克曼菌属物种和马赛肠单胞菌+阿克曼菌属物种管饲组显示瘦素水平分别上升了20％、15％和25％(图5)。

禁食2小时后，向所有小鼠腹膜内给药2.0g/kg葡萄糖(10mL/kg)。在相对于葡萄糖剂量的以下时间：0(葡萄糖前剂量，15、30、60、90和120分钟)，使用手持式血糖仪经尾剪(tail snip)检查血糖。人体普氏菌、阿克曼菌属物种和马赛肠单胞菌+阿克曼菌属物种管饲组显示葡萄糖耐量分别提高了9.5％、10％和8.5％(图6A和图6B)。

测量从不同组的小鼠获得的血清中的胆固醇水平。阿克曼菌属物种管饲组显示胆固醇水平上升了11％(图7)。

测量从不同组的小鼠获得的血清中的抵抗素水平。与媒介物对照相比，挑剔真杆菌管饲组显示抵抗素水平下降了19％。人体普氏菌、阿克曼菌属物种和马赛肠单胞菌+阿克曼菌属物种管饲组显示胰岛素水平上升了14％、11％和14％(图8)。

实例4：用于评价配制品的小鼠模型

在DIO小鼠模型中评价了马赛肠单胞菌和阿克曼菌属物种(冷冻的、巴氏灭菌的和冻干的)改善代谢障碍的功效。对于动物研究，到达时，将第1组动物维持于PMI营养国际有限责任公司认证的啮齿动物食物5号CR4。将第2-7组动物维持于研究饮食D12492。将动物单个圈养在含适当垫料的聚碳酸酯笼子里。在研究的第-1天，将动物分配到表3中提及的治疗组，以产生在体重和非禁食血糖(基于第-1天的测量结果)方面没有显著差异的队列。

表3：实验设计

每天制备供试品马赛肠单胞菌和阿克曼菌属物种(冷冻的、巴氏灭菌的和冻干的)并且在配制一小时内施用。从第1天至第84天，经口服管饲法每天一次施用媒介物(第2组)。每只动物的剂量体积为100μl。从第1天至第84天，经口服管饲法每天一次施用供试品(第2-6组)。每只动物的剂量体积为100μl。使用附有管饲套管的注射器施用每种剂量。

从第1天至第84天，将对照品(第7组)每天一次经皮下注射施用到合适的动物的肩胛间区域。每只动物的剂量体积基于最新体重测量结果。使用注射器/针头将每个剂量施用到划定的区域内。将给药的第一天指定为第1天。

研究参数包括死亡率/垂死状态检查、日常观察、体重测量结果、食物消耗量、粪便样本、血糖测量结果、qNMR评估和临床化学参数。

在研究期间，每周测量体重。如图10所示，与仅食物组相比，媒介物对照显示体重显著增加。从第43天至第84天，接受冷冻形式的阿克曼菌属物种的组显示出9％至14％的体重增加。

通过qNMR(Bruker NMR LF90II)进行身体组成分析。在研究开始时(第-2天和第-1天)和结束时(第83天和第84天)确定身体组成。如图11所示，与仅食物组相比，媒介物对照显示动物体内显著的脂肪堆积。与对照相比，接受冷冻形式的阿克曼菌属物种的组显示脂肪堆积减少了25％。冻干和巴氏灭菌形式的阿克曼菌属物种也显示脂肪堆积减少(分别为5.5％和5％)。

在研究结束时(第84天)测定肝脏重量。如图12所示，与仅食物组相比，媒介物对照显示动物的肝脏重量增加。与对照相比，接受冷冻形式的阿克曼菌属物种的组显示脂肪堆积减少了37％。

测量从不同组的小鼠获得的血清中的胰岛素水平。在研究期间，每2周进行一次测量。基于研究期间获得的值计算曲线下面积。如图13所示，与食物组相比，媒介物对照显示动物的胰岛素水平增加。与对照相比，接受马赛肠单胞菌的组显示胰岛素水平下降了17％，而接受冷冻形式的阿克曼菌属物种的组显示胰岛素水平下降了22％。冻干和巴氏灭菌形式的阿克曼菌属物种也显示胰岛素水平下降(分别为5％和17％)。

通过HOMA-IR测量胰岛素抵抗。基于空腹血糖和胰岛素值进行测量。基于研究期间获得的值计算曲线下面积。如图14所示，与食物组相比，媒介物对照显示动物的胰岛素抵抗增加。与对照相比，接受马赛肠单胞菌的组显示胰岛素水平下降了10％，而接受冷冻形式的阿克曼菌属物种的组显示胰岛素水平下降了20％。巴氏灭菌形式的阿克曼菌属物种也显示胰岛素水平下降了12％。

测量从不同组的小鼠获得的血清中的瘦素水平。如图15所示，阿克曼菌属物种(巴氏灭菌形式)管饲组显示瘦素水平上升了21％。冻干形式的阿克曼菌属物种也显示瘦素水平下降了(7％)。

测量从不同组的小鼠获得的血清中的PAI1水平。如图16所示，阿克曼菌属物种(冷冻形式)管饲组显示PAI1水平上升了15％。阿克曼菌属物种(巴氏灭菌形式)显示PAI1水平上升了8％。

测量从不同组的小鼠获得的血清中的抵抗素水平。如图17所示，与媒介物对照相比，马赛肠单胞菌管饲组显示抵抗素水平下降了16％。冷冻形式、巴氏灭菌和冻干形式的阿克曼菌属物种分别显示抵抗素水平上升31％、17％和32％。

通过使细菌在RCM中生长72小时来分析阿克曼菌属物种和马赛肠单胞菌对SCFA的产生。收集上清液、过滤并且通过HPLC检测SCFA。在培养基中，阿克曼菌属物种显示产生丙酸盐，并且马赛肠单胞菌显示产生丁酸盐(图18)。已经证明丙酸盐和丁酸盐在调节宿主代谢健康方面都起着关键作用(Chambers等人2018,Ríos-Covián等人2016)。

在该模型中，阿克曼菌属物种(冷冻形式)显示了体重、脂肪堆积、肝脏重量、胰岛素抵抗和抵抗素水平的显著上升。巴氏灭菌形式的阿克曼菌属物种显示了相似的但不太明显的活性，表明活细菌的施用可能是优选的。虽然阿克曼菌属物种以冻干形式施用时不如冷冻形式有效，但其仍显示抵抗素和瘦素水平的上升，以及脂肪堆积和胰岛素水平的一些改善。不受理论的束缚，冻干形式不能一样有效的原因可能是由于以这种形式给药时细胞的水合时间不足。由于在小鼠中的短暂时间是3-4小时，并且在该模型中冻干形式可能不足以进行足够的水合作用和转录活性来驱动相同的功效。

实例5：阿克曼菌属物种菌株AF3360009的代谢分析

为了比较在YCFAC培养基中生长的菌株阿克曼菌属物种和嗜粘蛋白阿克曼菌模式菌株BAA835的代谢能力。向YCFAC培养基接种1％过夜培养物，并在生长24小时后收集上清液。通过以10,000rpm离心5分钟分离细胞，然后通过0.2μM过滤器过滤。

收获无细胞上清液并通过CE-TOF-MS进行分析。阳离子条件：使用50mbar，10秒将样品注射到安捷伦公司(Agilent)CE-TOF系统(美国加利福尼亚州圣克拉拉市安捷伦科技有限公司(Agilent Technologies Inc.,Santa Clara,CA,USA))上的熔融石英毛细管(内径50μm x 0cm)上。使用阳离子缓冲溶液(1M甲酸)和30kV的CE电压。正模式质谱仪条件：MS毛细管电压：4.0V，ESI正电离模式，m/z范围50-1000。阴离子条件：使用50mbar，22秒将样品注射到安捷伦公司CE-TOF系统(安捷伦科技有限公司)上的熔融石英毛细管(内径50μm x0cm)上。使用阴离子缓冲溶液(50mM乙酸铵，pH 7.5)和30kV的CE电压。负模式质谱仪条件：MS毛细管电压：3.5V，ESI负电离模式，m/z范围50-1000。

代谢物胍丁胺(N-(4-氨基丁基)胍)以m/z 131.130m.u、保留时间4.23分钟以阳离子模式检测，并根据已知标准进行鉴定。报告的量是峰面积。

胍丁胺通过酶精氨酸脱羧酶EC 4.1.1.19(Piletz等人,2013，Taksande等人,2016)由精氨酸代谢。如图19所示，与嗜粘蛋白阿克曼菌ATCC BAA 835(2.4E10-5)和YCFAC生长培养基(4.0E10-5)相比，阿克曼菌属物种(8.7E10-5)中胍丁胺的水平更高。所测量的两种菌株和培养基水平之间的差异表明阿克曼菌属物种在从精氨酸产生胍丁胺，而嗜粘蛋白阿克曼菌ATCC BA835则在消耗胍丁胺。

已证明细胞外ATP诱发炎症(Cauwels等人2014)。评价了阿克曼菌属物种和嗜粘蛋白阿克曼菌BAA835从生长培养基中去除ATP的能力。向含粘蛋白(10g/l)的YCFAC培养基接种1％过夜培养物，并掺入1mM ATP。接种后立即和生长8小时后收集上清液。使用标准技术测量ATP水平。通过以10,000rpm离心5分钟分离细胞，然后通过0.2μM过滤器过滤。收获无细胞上清液并分析ATP水平。

在时间0(图20A)和生长8小时后(图20B)，针对嗜粘蛋白阿克曼菌ATCC BAA 835检测上清液中的ATP量。类似地，在时间0(图20C)和生长8小时后(图20D)估计来自阿克曼菌属物种的上清液中的ATP。与嗜粘蛋白阿克曼菌ATCC BAA 835相比，阿克曼菌属物种能够更高效地去除ATP。

使用全基因组比较，编码参与维生素B12合成的酶机制的可能的操纵子存在于阿克曼菌属物种并且不存在于模式菌株嗜粘蛋白阿克曼菌ATCC BAA835(表4)。合成这种重要辅因子的能力表明与模式菌株相比，阿克曼菌属物种具有更广泛的代谢能力。

表4：为确定咕啉环生物合成基因簇存在的阿克曼菌属物种与嗜粘蛋白阿克曼菌ATCC BAA835之间的基因组比较。

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序列

TTATGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGAAGCATTTGCAACAGATTTCTTCGGGATGAAGTTGCTTATGACTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGTAACCTGCCTTGTACTGGGGGATAGCAGCTGGAAACGGCTGGTAATACCGCATAAGCGCACAATGTTGCATGACATGGTGTGAAAAACTCCGGTGGTATAAGATGGACCCGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGAGATAACAGCCCACCAAGGCGACGATCAGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGAGGAAACTCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGTGAAGAAGTAATTCGTTATGTAAAGCTCTATCAGCAGGGAAGATAGTGACGGTACCTGACTAAGAAGCTCCGGCTAAATACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTATGGAGCAAGCGTTATCCGGATTTACTGGGTGTAAAGGGAGTGTAGGTGGCCATGCAAGTCAGAAGTGAAAATCCGGGGCTCAACCCCGGAACTGCTTTTGAAACTGTAAGGCTAGAGTGCAGGAGGGGTGAGTGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTAGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGACTGTAACTGACACTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATACTAGGTGTCGGGGCCCATAAGGGCTTCGGTGCCGCAGCAAACGCAATAAGTATTCCACCTGGGGAGTACGTTCGCAAGAATGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGTCTTGACATCCCACTGACCGGACAGTAATGTGTCCTTTCCTTCGGGACAGTGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCCTTAGTAGCCAGCAGTAAGATGGGCACTCTAGGGAGACTGCCAGGGATAACCTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGTAAACAAAGTGAAGCGAAGTCGTGAGGCCAAGCAAATCACAAAAATAACGTCTCAGTTCGGATTGTAGTCTGCAACTCGACTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCAGATCAGAATGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTCGAAAATGCCCGAAGTCGGTGACCTAACGTAAGAAGGAGCCGCCGAAGGCAGGTTTGATAACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTT(SEQ ID NO:1)

TATTGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGAACGCCAAGGAAAGAGTTTTCGGACAATGGAATTGGCTGTTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGAGTAACCTGCCTTGGAGTGGGGAATAACACAGTGAAAACTGTGCTAATACCGCATGACATATTGGTGTCGCATGGCGCTGATATCAAAGATTTATCGCTCTGAGATGGACTCGCGTCTGATTAGATAGTTGGCGGGGTAACGGCCCACCAAGTCGACGATCAGTAGCCGGACTGAGAGGTTGGCCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGGCAATGGGCGCAAGCCTGACCCAGCAACGCCGCGTGAAGGAAGAAGGCTTTCGGGTTGTAAACTTCTTTTAACAGGGACGAAGTAAGTGACGGTACCTGTTGAATAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTACTGGGTGTAAAGGGCGTGTAGGCGGGACTGCAAGTCAGATGTGAAAACTATGGGCTCAACCCATAGCCTGCATTTGAAACTGTAGTTCTTGAGTGTCGGAGAGGCAATCGGAATTCCGTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATACGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGATTGCTGGACGATAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGATACTAGGTGTGGGGGGTCTGACCCCCTCCGTGCCGCAGCTAACGCAATAAGTATCCCACCTGGGGAGTACGATCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGGCTTGACATCCTACTAACGAACCAGAGATGGATTAGGTGCCCTTCGGGGAAAGTAGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCTACGCAAGAGCACTCTAGCGAGACTGCCGTTGACAAAACGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCCTGGGCCACACACGTACTACAATGGCGGTTAACAGAGGGAGGCAAAGCCGCGAGGCAGAGCAAACCCCTAAAAGCCGTCCCAGTTCGGATTGCAGGCTGAAACCCGCCTGTATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTCGGGAACACCCGAAGTCCGTAGCCTAACTGCAAAGGGGGCGCGGCCGAAGGTGGGTTCGATAATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTT(SEQ IDNO:2)

GAGATTAAAGATTTATCGGTGATGGATGGGGATGCGTCTGATTAGCTTGTTGGCGGGGTAACGGCCCACCAAGGCAACGATCAGTAGGGGTTCTGAGAGGAAGGTCCCCCACATTGGAACTGAGACACGGTCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGACGAGAGTCTGAACCAGCCAAGTAGCGTGCAGGATGACGGCCCTATGGGTTGTAAACTGCTTTTATAAGGGAATAAAGTGAGTCTCGTGAGACTTTTTGCATGTACCTTATGAATAAGGACCGGCTAATTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAAGGTCCGGGCGTTATCCGGATTTATTGGGTTTAAAGGGAGCGTAGGCCGGAGATTAAGCGTGTTGTGAAATGTAGACGCTCAACGTCTGCACTGCAGCGCGAACTGGTTTCCTTGAGTACGCACAAAGTGGGCGGAATTCGTGGTGTAGCGGTGAAATGCTTAGATATCACGAAGAACTCCGATTGCGAAGGCAGCTCACTGGAGCGCAACTGACGCTGAAGCTCGAAAGTGCGGGTATCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCGCACGGTAAACGATGGATGCCCGCTGTTGGTCTGAACAGGTCAGCGGCCAAGCGAAAGCATTAAGCATCCCACCTGGGGAGTACGCCGGCAACGGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGAGGAACATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCCGGGCTTGAATTGCAGAGGAAGGATTTGGAGACAATGACGCCCTTCGGGGTCTCTGTGAAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTCGGCTTAAGTGCCATAACGAGCGCAACCCCTCTCCTTAGTTGCCATCAGGTCAGGCTGGGCACTCTGGGGACACTGCCACCGTAAGGTGTGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCAGCACGGCCCTTACGTCCGGGGCTACACACGTGTTACAATGGCAGGTACAGAGAGACGGTTGTACGTAAGTACGATCAAATCCTTAAAGCCTGTCTCAGTTCGGACTGGGGTCTGCAACCCGACCCCACGAAGCTGGATTCGCTAGTAATCGCGCATCAGCCATGGCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCCATGAAAGCCGGGGGCGCCTAAAGTCCGTGACCGTAAGGAGCGGCCTAGGGCGAAACTGGTAATTGGGGCTAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGAACACCTCCTTT(SEQ ID NO:3)

Claims

1.一种组合物，其包含以下中至少一种或多种：(a)生物纯的挑剔真杆菌(Eubacteriumeligens)菌株；(b)生物纯的马赛肠单胞菌(Intestinimonas massiliensis)菌株；(c)具有与保藏在德国微生物菌种保藏中心(DSM)编号为DSM 33457的人体普氏菌(Prevotellacopri)的16S核糖体RNA序列显示出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列的细菌菌株；和/或(d)生物纯的阿克曼菌属物种(Akkermansia sp.)菌株，其中所述阿克曼菌属物种不是(i)嗜粘蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)；或(ii)嗜聚糖阿克曼菌(Akkermansia glycaniphilia)。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述阿克曼菌属物种与(i)嗜粘蛋白阿克曼菌；或(ii)嗜聚糖阿克曼菌之间的全基因组平均核苷酸同一性(gANI)小于约95％。

3.如权利要求1或权利要求2所述的组合物，其包含(a)具有与保藏在DSM、编号为DSM33458的挑剔真杆菌(E.eligens)的16S核糖体RNA序列显示出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列的细菌菌株；和/或(b)具有与保藏在DSM、编号为DSM 33460的马赛肠单胞菌(I.massiliensis)的16S核糖体RNA序列显示出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列的细菌菌株。

4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其包含(a)保藏在DSM、编号为DSM 33458的挑剔真杆菌菌株或具有所述保藏在DSM、编号为DSM 33458的挑剔真杆菌菌株的所有鉴定特征的活菌株；(b)保藏在DSM、编号为DSM 33460的马赛肠单胞菌菌株或具有所述保藏在DSM、编号为DSM 33460的马赛肠单胞菌菌株的所有鉴定特征的活菌株；(c)保藏在DSM、编号为DSM 33457的人体普氏菌(P.copri)菌株或具有所述保藏在DSM、编号为DSM 33457的人体普氏菌菌株的所有鉴定特征的活菌株；和/或(d)保藏在DSM、编号为DSM 33459的阿克曼菌属物种或具有所述保藏在DSM、编号为DSM 33459的阿克曼菌属物种的所有鉴定特征的活菌株，所述菌株(A)是单独的；和/或(B)与衍生自这些菌株中的一种或多种的培养上清液组合。

5.如权利要求1所述的组合物，其包含(b)生物纯的马赛肠单胞菌菌株；和(d)生物纯的阿克曼菌属物种菌株，其中所述阿克曼菌属物种不是(i)嗜粘蛋白阿克曼菌；或(ii)嗜聚糖阿克曼菌。

6.如权利要求5所述的组合物，其包含(b)具有与保藏在DSM、编号为DSM 33460的马赛肠单胞菌的16S核糖体RNA序列显示出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列的细菌菌株。

7.如权利要求5或权利要求6所述的组合物，其中所述阿克曼菌属物种与(i)嗜粘蛋白阿克曼菌；或(ii)嗜聚糖阿克曼菌之间的全基因组平均核苷酸同一性(gANI)小于约95％。

8.如权利要求5-7中任一项所述的组合物，其包含(b)保藏在DSM、编号为DSM 33460的马赛肠单胞菌菌株或具有所述保藏在DSM、编号为DSM 33460的马赛肠单胞菌菌株的所有鉴定特征的活菌株；和(d)保藏在DSM、编号为DSM 33459的阿克曼菌属物种或具有所述保藏在DSM、编号为DSM 33459的阿克曼菌属物种的所有鉴定特征的活菌株。

9.一种包含分离的细菌细胞外囊泡(EV)的组合物，所述分离的细菌细胞外囊泡衍生自以下中至少一种或多种：(a)生物纯的挑剔真杆菌菌株；(b)生物纯的马赛肠单胞菌菌株；(c)具有与保藏在德国微生物菌种保藏中心(DSM)编号为DSM 33457的人体普氏菌的16S核糖体RNA序列显示出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列的细菌菌株；和/或(d)生物纯的阿克曼菌属物种菌株，其中所述阿克曼菌属物种不是(i)嗜粘蛋白阿克曼菌；或(ii)嗜聚糖阿克曼菌。

10.如权利要求9所述的组合物，其进一步包含来自(a)、(b)、(c)和/或(d)的一种或多种细菌。

11.如权利要求9或权利要求10所述的组合物，其中所述阿克曼菌属物种与(i)嗜粘蛋白阿克曼菌；或(ii)嗜聚糖阿克曼菌之间的全基因组平均核苷酸同一性(gANI)小于约95％。

12.如权利要求9-11中任一项所述的组合物，其包含(a)衍生自如下细菌菌株的EV，所述细菌菌株具有与保藏在DSM、编号为DSM33458的挑剔真杆菌的16S核糖体RNA序列显示出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列；和/或(b)衍生自如下细菌菌株的EV，所述细菌菌株具有与保藏在DSM、编号为DSM 33460的马赛肠单胞菌的16S核糖体RNA序列显示出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列。

13.如权利要求9-12中任一项所述的组合物，其包含(a)EV，所述EV衍生自保藏在DSM、编号为DSM 33458的挑剔真杆菌菌株或具有所述保藏在DSM、编号为DSM 33458的挑剔真杆菌菌株的所有鉴定特征的活菌株；(b)EV，所述EV衍生自保藏在DSM、编号为DSM 33460的马赛肠单胞菌菌株或具有所述保藏在DSM、编号为DSM 33460的马赛肠单胞菌菌株的所有鉴定特征的活菌株；(c)EV，所述EV衍生自保藏在DSM、编号为DSM 33457的人体普氏菌菌株或具有所述保藏在DSM、编号为DSM 33457的人体普氏菌菌株的所有鉴定特征的活菌株；和/或(d)EV，所述EV衍生自保藏在DSM、编号为DSM 33459的阿克曼菌属物种或具有所述保藏在DSM、编号为DSM 33459的阿克曼菌属物种的所有鉴定特征的活菌株，所述菌株(A)是单独的；和/或(B)与衍生自这些菌株中的一种或多种的培养上清液组合。

14.如权利要求9或权利要求10所述的组合物，其包含(b)衍生自生物纯的马赛肠单胞菌菌株的EV；和(d)衍生自生物纯的阿克曼菌属物种菌株的EV，其中所述阿克曼菌属物种不是(i)嗜粘蛋白阿克曼菌；或(ii)嗜聚糖阿克曼菌。

15.如权利要求14所述的组合物，其包含(b)衍生自如下细菌菌株的EV，所述细菌菌株具有与保藏在DSM、编号为DSM 33460的马赛肠单胞菌的16S核糖体RNA序列显示出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列。

16.如权利要求14或权利要求15所述的组合物，其中所述阿克曼菌属物种与(i)嗜粘蛋白阿克曼菌；或(ii)嗜聚糖阿克曼菌之间的全基因组平均核苷酸同一性(gANI)小于约95％。

17.如权利要求14-16中任一项所述的组合物，其包含(b)EV，所述EV衍生自保藏在DSM、编号为DSM 33460的马赛肠单胞菌菌株或具有所述保藏在DSM、编号为DSM 33460的马赛肠单胞菌菌株的所有鉴定特征的活菌株；和(d)EV，所述EV衍生自保藏在DSM、编号为DSM33459的阿克曼菌属物种或具有所述保藏在DSM、编号为DSM33459的阿克曼菌属物种的所有鉴定特征的活菌株。如权利要求1-16中任一项所述的组合物，其中所述组合物配制用于口服施用。

18.如权利要求1-17中任一项所述的组合物，其中所述组合物是冻干或冷冻干燥的。

19.如权利要求1-18中任一项所述的组合物，其中所述组合物是包入胶囊内的或包衣的。

20.如权利要求1-19中任一项所述的组合物，其中所述组合物是食品产品、食品成分、膳食补充剂或药物。

21.如权利要求1-20中任一项所述的组合物，其中至少约1x 10⁴CFU/g组合物到至少约1x 10 ¹²CFU/g组合物的细菌存在于所述组合物中。

22.如权利要求1-21中任一项所述的组合物，其中所述组合物是益生菌。

23.如权利要求1-22中任一项所述的组合物，其中所述组合物已经过巴氏灭菌或热处理。

24.如权利要求1-23中任一项所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物，并且进一步包含至少一种药学上可接受的载体和/或赋形剂。

25.一种片剂、延长释放胶囊剂、延长释放颗粒剂、粉剂、小袋剂或粘性剂，其包含如权利要求1-24中任一项所述的组合物。

26.一种试剂盒，其包含(a)(i)如权利要求1-24中任一项所述的组合物；或(ii)如权利要求25所述的片剂、延长释放胶囊剂、延长释放颗粒剂、粉剂、小袋剂或粘性剂和b)针对受试者的书面施用说明书。

27.一种用于治疗和/或预防有需要的受试者的一种或多种肥胖相关障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1-24中任一项所述的组合物或如权利要求25所述的片剂、延长释放胶囊剂、延长释放颗粒剂、粉剂、小袋剂或粘性剂。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述肥胖相关障碍是选自由以下组成的组的一种或多种障碍：肥胖、代谢综合征、糖尿病、胰岛素缺乏相关障碍、胰岛素抵抗相关障碍、葡萄糖耐受不良、异常脂质代谢、非酒精性脂肪性肝病、肝脂肪变性、瘦素抵抗、抵抗素水平下降和/或心血管疾病。

29.一种用于制备组合物的方法，所述方法包括将生物纯的马赛肠单胞菌菌株和生物纯的阿克曼菌属物种菌株组合，其中所述阿克曼菌属物种不是(i)嗜粘蛋白阿克曼菌；或(ii)嗜聚糖阿克曼菌。

30.一种用于制备组合物的方法，所述方法包括从生物纯的马赛肠单胞菌菌株和生物纯的阿克曼菌属物种菌株衍生细胞外囊泡(EV)并将其组合，并且其中所述阿克曼菌属物种不是(i)嗜粘蛋白阿克曼菌；或(ii)嗜聚糖阿克曼菌。

31.如权利要求29或权利要求30所述的方法，其中所述阿克曼菌属物种与(i)嗜粘蛋白阿克曼菌；或(ii)嗜聚糖阿克曼菌之间的所述全基因组平均核苷酸同一性(gANI)小于约95％。

32.如权利要求29-31中任一项所述的方法，其中所述马赛肠单胞菌包含与保藏在DSM、编号为DSM 33460的马赛肠单胞菌的16S核糖体RNA序列显示出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列。

33.如权利要求29-32中任一项所述的方法，其中所述马赛肠单胞菌包含保藏在DSM、编号为DSM 33460的马赛肠单胞菌菌株或具有所述保藏在DSM、编号为DSM 33460的马赛肠单胞菌菌株的所有鉴定特征的活菌株；并且其中所述阿克曼菌属物种包含保藏在DSM、编号为DSM 33459的阿克曼菌属物种或具有保藏在DSM、编号为DSM 33459的阿克曼菌属物种的所有鉴定特征的活菌株。

34.如权利要求29-33中任一项所述的方法，其进一步包括将所述组合物冷冻干燥或冻干。

35.一种用于在有需要的受试者中预防和/或治疗一种或多种肥胖相关障碍的组合物，所述组合物包含用于所述受试者的如权利要求1-24中任一项所述的组合物或如权利要求25所述的片剂、延长释放胶囊剂、延长释放颗粒剂、粉剂、小袋剂或粘性剂。

36.如权利要求35所述的组合物，其中所述肥胖相关障碍是选自由以下组成的组的一种或多种障碍：肥胖、代谢综合征、糖尿病、胰岛素缺乏相关障碍、胰岛素抵抗相关障碍、葡萄糖耐受不良、异常脂质代谢、非酒精性脂肪性肝病、肝脂肪变性、瘦素抵抗、抵抗素水平下降和/或心血管疾病。