CN104918626A - 阿克曼氏菌属用于治疗代谢病症的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗有需要的受试者的代谢病症的嗜粘蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)或其片段。本发明还涉及用于治疗代谢病症的包含嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段的组合物、药物组合物和药剂。本发明还涉及嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段用于促进有需要的受试者的重量减轻的用途。

Description

阿克曼氏菌属用于治疗代谢病症的用途
技术领域
本发明涉及代谢病症的治疗，所述代谢病症例如与超重和肥胖症相关的代谢病症，例如，糖尿病或高胆固醇。本发明更具体地涉及用于治疗代谢病症的包含阿克曼氏菌属的种(Akkermansia spp)或其片段的组合物。
背景技术
肥胖症是世界性问题，肥胖症成人的估计数量为约2亿5千万。这一肥胖症流行病与肥胖症相关病症的发生率大幅度增加相关，所述肥胖症相关病症例如糖尿病、高血压、心脏病(cardiac pathology)和肝病。由于这些高度失能性疾病，因此肥胖症目前在西方国家被视为最重要的公共健康问题之一。因此，真正需要用于治疗或预防肥胖症和/或肥胖症相关病症的组合物和方法。
肥胖症和肥胖症相关疾病与以下相关：(i)代谢功能障碍(例如对葡萄糖稳态和脂质代谢具有影响)；(ii)与较高的血液脂多糖(LPS)水平相关的低级炎症状态(还被称作代谢性内毒素血症)；和(iii)受损的肠道屏障功能(即增加的肠道渗透性)。为了治疗肥胖症，因此需要影响这3种因素中的至少一种、优选2种且更优选3种。
人肠道被多种多样的复杂且动态的微生物群定殖，所述微生物群代表了超过1000个与宿主不断相互作用的不同种(Zoetendal,Rajilic-Stojanovic和de Vos,Gut 2008,57:1605-1615)。肠道微生物群的稳态取决于宿主特征(年龄、性别、遗传背景……)和环境条件(应力、药物、胃肠道手术、感染原和毒性剂……)，而且还取决于每日饮食变化。增长的证据支持肠道微生物群在肥胖和相关病症的发展中的作用(Delzenne和Cani,Annu.Rev.Nutr.2011,31:15-31)。
因此，用靶向肠道微生物群的产品进行治疗表现为用于治疗肥胖症和相关病症的有前景的治疗工具。这些产品可例如在多数益生菌的情况下由活微生物组成，或含有死微生物或其片段。另外，这些产品可例如在益生元的情况下包含被肠道微生物群利用的底物，或含有改变肠内微生物群的平衡的化合物，例如特异性抗微生物化合物。
例如，WO 2008/076696描述了作为用于治疗肥胖症和相关病症的治疗靶的肠道微生物群。WO 2008/076696具体地描述了通过向受试者施用抗生素和/或益生菌来改变该受试者的肠道中拟杆菌属(Bacteroides)和/或硬壁菌门(Firmicutes)的丰度的方法。
此外，EP 2 030 623涉及通过调节肠道中肠杆菌的量来预防和/或治疗代谢病症，例如，肥胖症相关病症。EP 2 030 623公开了通过施用益生菌来降低肠道中肠杆菌的量，所述益生菌例如双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)或乳杆菌属(Lactobacillus)。
此外，申请人描述了益生元治疗的肥胖症小鼠中，肠道微生物群被改变(Everard等，Diabetes，2011年11月；60(11):2775-86)。此外，益生元(1)改善肥胖症小鼠中的葡萄糖和脂质代谢，(2)降低肥胖症小鼠中的血浆LPS并且改善其肠道屏障功能(例如减少炎症)，(3)诱导肥胖症小鼠中的肠内分泌L细胞数增加，并且(4)改善饮食诱导性肥胖症和糖尿病小鼠中的瘦素敏感性和葡萄糖稳态。
由对肥胖症小鼠的益生元治疗诱导的改变中，有相当大变化的是肠道微生物群组成，其特征在于(i)拟杆菌门(Bacteroidetes)、乳杆菌属的种和拟杆菌属-普雷沃氏菌属(Bacteroides-Prevotella)群细菌的降低的丰度；以及(ii)双歧杆菌属的种、直肠真杆菌(E.rectale)/球形梭菌(C.coccoides)群的细菌和属于疣微菌门(Verrucomicrobia)的嗜粘蛋白阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila)的增加的丰度。嗜粘蛋白阿克曼氏菌(首先由申请人于2004年鉴别的细菌)占健康成人的总微生物群的约1％到3％(Derrien等，International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2004,54:1469-1476；Derrien等，Applied Environmental Microbiology 2008,74,1646-1648.)。
间接证明表明了嗜粘蛋白阿克曼氏菌的丰度与肠功能障碍或肥胖症相关病症之间的关系。例如，WO 2011/107481描述受试者的肠道中不存在嗜粘蛋白阿克曼氏菌以及存在多毛拟杆菌(Bacteroides capillosus)和柔嫩梭菌(Clostridium leptum)指示该受试者正罹患溃疡性结肠炎。此外，Hansen和同事证明，向新生NOD小鼠(NOD小鼠模型是糖尿病模型)施用抗生素万古霉素抑制糖尿病的临床发作并且使嗜粘蛋白阿克曼氏菌繁殖(Hansen等，Diabetologia,2012年8月；55(8):2285-94)。然而，这可能是由于肠阿克曼氏菌属的种对所用抗生素的不敏感性所致的间接效果。
因此，这些结果表明在小鼠中施用益生元后，肠道微生物群的完全组成被改变。更具体地，没有证据表明一个种的细菌(例如，嗜粘蛋白阿克曼氏菌)在对益生元施用的有益反应中的特定作用。此外，据申请人所知，还从未描述或提示过直接施用嗜粘蛋白阿克曼氏菌的有益作用。
这里，本申请人惊讶地证明，重复施用单独的嗜粘蛋白阿克曼氏菌影响与肥胖症和相关病症相关的三种潜在的功能障碍，即代谢功能障碍、与较高的血液脂多糖(LPS)水平相关的低级炎症状态和受损的肠道屏障功能。因此，本发明涉及嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段用于治疗肥胖症和相关病症的用途。
发明内容
因此，本发明涉及用于治疗有需要的受试者的代谢病症的、或在所述治疗中被使用的嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段。在本发明的一个实施方案中，所述代谢病症是肥胖症。在本发明的另一实施方案中，所述代谢病症选自包含以下各项的组：代谢综合征、胰岛素缺乏或胰岛素抵抗相关的病症、糖尿病(例如，2型糖尿病)、葡糖耐受不良、异常脂质代谢、动脉粥样硬化、高血压、心脏病、中风、非酒精性脂肪肝病、高血糖症、肝性脂肪变性、血脂异常、与超重和肥胖症相关的免疫系统功能障碍、心血管疾病、高胆固醇、升高的甘油三酸酯、哮喘、睡眠呼吸暂停、骨关节炎、神经变性、胆囊疾病、X综合征、炎症性和免疫性病症、致动脉粥样化性血脂异常和癌症。
本发明还涉及用于增加受试者的能量消耗的嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段，优选地不影响所述受试者的食物摄入。本发明还涉及用于增加受试者的饱腹感的嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段。
在本发明的一个实施方案中，向有需要的受试者施用嗜粘蛋白阿克曼氏菌的活细胞。
在本发明的一个实施方案中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌被口服施用。
在本发明的一个实施方案中，向受试者施用约1.102cfu到约1.1015cfu、优选约1.104cfu到约1.1012cfu、更优选约1.105cfu到约1.1010cfu且甚至更优选约1.106cfu到约1.109cfu范围的量的嗜粘蛋白阿克曼氏菌。在本发明的另一实施方案中，向受试者施用约1.104cfu到约1.1012cfu、更优选约1.105cfu到约1.1011cfu且甚至更优选约1.106cfu到约1.1010cfu范围的量的嗜粘蛋白阿克曼氏菌。
在本发明的一个实施方案中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌被施用至少每日一次。在本发明的一个实施方案中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌被施用至少每周三次。在本发明的另一实施方案中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌被施用至少每周一次。
在本发明的一个实施方案中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌与另一益生菌菌株和/或与一种或多种益生元共同施用。
本发明的另一目标是用于治疗受试者的代谢病症或在所述治疗中被使用的、或用于增加受试者的能量消耗或用于增加受试者的饱腹感的组合物，所述组合物包含如上文所述的嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段以及赋形剂。在一个实施方案中，所述组合物是营养组合物。在本发明的一个实施方案中，所述组合物被口服施用。
本发明还涉及用于治疗受试者的代谢病症或在所述治疗中被使用的、或用于增加受试者的能量消耗或用于增加受试者的饱腹感的药物组合物，所述药物组合物包含与药学上可接受的媒介物联合的如上文所述的嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段。
本发明的另一目标是用于治疗受试者的代谢病症或在所述治疗被使用的、或用于增加受试者的能量消耗或用于增加受试者的饱腹感的药剂，所述药剂包含如上文所述的嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段。
本发明的另一目标是嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段用于促进有需要的受试者的重量减轻的用途。
本发明还涉及用于促进有需要的受试者的重量减轻的包含嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段的美容组合物。
定义
在本发明中，以下术语具有以下含义：
-“治疗(treatment)”意指防止(即阻止发生)、降低或缓解疾病、病症或健康状况(condition)的至少一种不利影响或症状。因此，该术语是指治疗性处理和预防性或防止性措施两者；其中目标是预防或减慢(减轻)靶定病理病况或病症。在本发明的一个实施方案中，那些需要治疗的受试者包括那些已经患病的受试者以及那些易患病的受试者或那些待预防病症的受试者。
-“有效量”是指在不引起对靶标的显著的负面副作用或不利副作用的情况下旨在以下的药剂水平或药剂量：(1)延迟或防止代谢病症的发作；(2)减慢或停止代谢病症的一种或多种症状的进展、加重或恶化；(3)使代谢病症的症状减轻；(4)降低代谢病症的严重性或发病率；(5)治愈代谢病症；或(6)恢复嗜粘蛋白阿克曼氏菌在待治疗受试者肠道中的正常量和/或比例。有效量可在代谢病症发作前被施用，用于预防性或防止性作用。或者或另外，有效量可在代谢病症起始后被施用，用于治疗性作用。
-“嗜粘蛋白阿克曼氏菌”是指由Derrien(Derrien等，InternationalJournal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2004,54:1469-1476)鉴别的严格厌氧的粘蛋白降解细菌。细胞是椭圆形的、非运动性的和革兰氏染色阴性的。嗜粘蛋白阿克曼氏菌还可被称作阿克曼氏菌属的种或阿克曼氏菌样细菌。它属于衣原体科(Chlamydiae)/疣微菌门(Verrucomicrobia)群；疣微菌门。如果分类学变化，则本领域技术人员将了解如何适应分类学的变化以推断可用于本发明中的菌株。此外，申请人已确定嗜粘蛋白阿克曼氏菌的完整基因组(van Passel等，PLoS One 6,2011:e16876)。通常认为具有约70％的基因组相似性的菌株可被视为相同种。
-“益生菌”是指当以有效量施用时，提供对受试者的保健或健康有益作用的微生物细胞制剂(例如，活微生物细胞)或微生物细胞组分。根据定义，所有益生菌都具有被证明的非病原特性。在一个实施方案中，这些健康益处与改进胃肠道中人或动物的微生物群平衡和/或恢复正常微生物群相关。
-“益生元”是指可能不被人消化、可被肠道微生物群细菌使用并且意在促进肠中益生菌生长的物质，例如，食品物质。
-“超重”是指如下的受试者状况，其中所述受试者的体重指数(BMI)在25到30范围内。如本文所用的，BMI被定义为个体的体重(kg)除以其身高(米)的平方。“肥胖”是指如下的受试者状况，其中所述受试者的BMI高于或等于30。
-“受试者”是指动物，优选哺乳动物，更优选人。在一个实施方案中，受试者是雄性。在另一实施方案中，受试者是雌性。在本发明的一个实施方案中，受试者还可指宠物，例如狗、猫、豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠、雪貂、兔等。
-“约”在数字之前意指所述数字的值加或减20％、优选10％。
-“片段”可指源于嗜粘蛋白阿克曼氏菌代谢的细胞组分、代谢物、分泌的分子和化合物以及诸如此类。可例如通过回收嗜粘蛋白阿克曼氏菌培养物的上清液或通过从嗜粘蛋白阿克曼氏菌培养物提取细胞组分或细胞级分、代谢物或分泌的化合物获得片段。术语片段还可指降解产物。片段可对应于来自嗜粘蛋白阿克曼氏菌的分离形式的组分、或来自嗜粘蛋白阿克曼氏菌的一种或多种组分的任何混合物。在一个实施方案中，片段可对应于存在于嗜粘蛋白阿克曼氏菌中的一种或多种此类组分，所述组分是以另一种方式(例如使用重组DNA技术)在微生物宿主中或在任何其它(生物)合成过程中产生的。
-“代谢病症”是指由以下引起或特征在于以下的病症、疾病和病况：异常的重量增加、能量使用或消耗；对摄取的或内源性营养素、能源、激素或机体内的其它信号传导分子的反应改变；或碳水化合物、脂质、蛋白质、核酸的代谢改变；或其组合。代谢病症可与导致碳水化合物、脂质、蛋白质和/或核酸的代谢失衡的代谢途径缺乏或过量相关。代谢病症的示例包括但不限于代谢综合征、胰岛素缺乏或胰岛素抵抗相关的病症、糖尿病(例如，2型糖尿病)、葡糖耐受不良、异常脂质代谢、动脉粥样硬化、高血压、心脏病、中风、非酒精性脂肪肝病、高血糖症、肝性脂肪变性、血脂异常、与超重和肥胖症相关的免疫系统功能障碍、心血管疾病、高胆固醇、升高的甘油三酸酯、哮喘、睡眠呼吸暂停、骨关节炎、神经变性、胆囊疾病、X综合征、炎症性和免疫性病症、致动脉粥样化性血脂异常和癌症。
具体实施方式
本发明涉及用于治疗有需要的受试者的代谢病症、或在所述治疗中被使用的嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段。
如本文所用的，代谢病症是与改变的代谢稳态(例如，改变的糖类或脂质稳态)相关的病症。
在本发明的一个实施方案中，所述代谢病症是肥胖症。
其它代谢病症的示例包括但不限于代谢综合征、胰岛素缺乏或胰岛素抵抗相关的病症、糖尿病(例如，2型糖尿病)、葡糖耐受不良、异常脂质代谢、动脉粥样硬化、高血压、心脏病、中风、非酒精性脂肪肝病、高血糖症、肝性脂肪变性、血脂异常、与超重和肥胖症相关的免疫系统功能障碍、心血管疾病、高胆固醇、升高的甘油三酸酯、哮喘、睡眠呼吸暂停、骨关节炎、神经变性、胆囊疾病、X综合征、炎症性和免疫性病症、致动脉粥样化性血脂异常和癌症。
在另一实施方案中，所述代谢病症是超重和/或肥胖症相关的代谢病症，即可与超重和/或肥胖症相关或由超重和/或肥胖症引起的代谢病症。超重和/或肥胖症相关的代谢病症的示例包括但不限于代谢综合征、胰岛素缺乏或胰岛素抵抗相关的病症、糖尿病(例如，2型糖尿病)、葡糖耐受不良、异常脂质代谢、动脉粥样硬化、高血压、心脏病、中风、非酒精性脂肪肝病、高血糖症、肝性脂肪变性、血脂异常、与超重和肥胖症相关的免疫系统功能障碍、心血管疾病、高胆固醇、升高的甘油三酸酯、哮喘、睡眠呼吸暂停、骨关节炎、神经变性、胆囊疾病、X综合征、炎症性和免疫性病症、致动脉粥样化性血脂异常和癌症。
在一个实施方案中，所述代谢病症是糖尿病，优选2型糖尿病。在另一实施方案中，所述代谢病症是高胆固醇血症(还被称为高胆固醇)。在一个实施方案中，高胆固醇血症对应于高于或等于2g/L或5mmol/L的血浆胆固醇浓度。在另一实施方案中，高胆固醇血症对应于高于或等于4.5:1、优选5:1的总胆固醇的血浆浓度:HDL(高密度脂蛋白胆固醇)的血浆浓度的比率。
在本发明的一个实施方案中，在本发明中使用嗜粘蛋白阿克曼氏菌的活菌株，优选地，所述活菌株来自生长静止期的细胞。
在本发明的一个实施方案中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌可呈活细胞形式。在本发明的另一实施方案中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌可呈非活细胞形式。
在一个实施方案中，在本发明中使用代谢活性的嗜粘蛋白阿克曼氏菌细胞。在一个实施方案中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌菌株不是代谢灭活的，其中代谢灭活可源于例如高压釜处理。
在一个实施方案中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段是基本上纯化的。如本文所用的，术语“基本上纯化的”意指嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段包含于样品中，其中其占所述样品的细菌菌株或其片段的至少约50％、优选至少约60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或更高。
本发明还涉及用于治疗代谢病症、或在所述治疗中被使用的包含有效量的嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段的组合物。
在本发明的一个实施方案中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌的有效量对应于足以恢复嗜粘蛋白阿克曼氏菌在受试者的肠道内的正常量和/或比例的细菌的量。实际上，申请人证明，肥胖症或超重受试者的肠道贫乏嗜粘蛋白阿克曼氏菌(参见实施例)。在本发明的一个实施方案中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌的正常量和/或比例对应于存在于健康受试者的肠道中的嗜粘蛋白阿克曼氏菌的量和/或比例。
如本文所用的，术语“健康受试者”用于定义未受待治疗的疾病影响的受试者。例如，如果嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段被用于治疗肥胖症，则健康受试者未受肥胖症影响。优选地，健康受试者与待治疗的受试者共有共同的特征，例如，相同的性别(gender)、年龄、性别(sex)、饮食、药物摄入或地理位置(geolocation)。
在本发明的一个实施方案中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌在肠道中的正常比例在约0.1％到约10％(以嗜粘蛋白阿克曼氏菌细胞数对肠道细菌细胞总数表示)、优选约0.3％到约5％、更优选约1％到约3％的范围。
在本发明的一个实施方案中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌的有效量在约1.102cfu到约1.1015cfu、优选约1.104cfu到约1.1012cfu、更优选约1.105cfu到约1.1010cfu且甚至更优选约1.106cfu到约1.109cfu的范围，其中cfu代表“菌落形成单位”。
在本发明的另一实施方案中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌的有效量在约1.106cfu到约1.1010cfu、优选约1.108cfu到约1.1010cfu、更优选约1.109cfu到约1.1010cfu的范围。
在本发明的另一实施方案中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌的有效量在约1.106cfu到约1.1010cfu、优选约1.106cfu到约1.109cfu、更优选约1.108cfu到约1.109cfu的范围。
在本发明的一个实施方案中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌片段的有效量在来自约1.102cfu到约1.1015cfu、优选约1.104cfu到约1.1012cfu、更优选约1.105cfu到约1.1010cfu且甚至更优选约1.106cfu到约1.109cfu的一部分的范围，其中cfu代表“菌落形成单位”。在本发明的另一实施方案中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌片段的有效量在来自约1.106cfu到约1.1010cfu、优选约1.108cfu到约1.1010cfu、更优选约1.109cfu到约1.1010cfu的一部分的范围。在本发明的另一实施方案中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌片段的有效量在来自约1.106cfu到约1.1010cfu、优选约1.106cfu到约1.109cfu、更优选约1.108cfu到约1.109cfu的一部分的范围。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物包含如下范围的量的嗜粘蛋白阿克曼氏菌：约1.102cfu/g所述组合物到约1.1015cfu/g所述组合物、优选约1.104cfu/g所述组合物到约1.1012cfu/g所述组合物、更优选约1.105cfu/g所述组合物到约1.1010cfu/g所述组合物且甚至更优选约1.106cfu/g所述组合物到约1.109cfu/g所述组合物。在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物包含如下范围的量的嗜粘蛋白阿克曼氏菌：约1.102cfu/mL所述组合物到约1.1015cfu/mL所述组合物、优选约1.104cfu/mL所述组合物到约1.1012cfu/mL所述组合物、更优选约1.105cfu/mL所述组合物到约1.1010cfu/mL所述组合物且甚至更优选约1.106cfu/mL所述组合物到约1.109cfu/mL所述组合物。在本发明的另一实施方案中，本发明的组合物包含如下范围的量的嗜粘蛋白阿克曼氏菌：约1.106cfu/g或cfu/mL所述组合物到约1.1010cfu/g或cfu/mL所述组合物、优选约1.108cfu/g或cfu/mL到约1.1010cfu/g或cfu/mL、更优选约1.109cfu/g或cfu/mL到约1.1010cfu/g或cfu/mL。在本发明的另一实施方案中，本发明的组合物包含如下范围的量的嗜粘蛋白阿克曼氏菌：约1.106cfu/g或cfu/mL所述组合物到约1.1010cfu/g或cfu/mL所述组合物、优选约1.106cfu/g或cfu/mL到约1.109cfu/g或cfu/mL、更优选约1.108cfu/g或cfu/mL到约1.109cfu/g或cfu/mL。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物包含范围为来自如下范围的一部分的量的嗜粘蛋白阿克曼氏菌片段：约1.102cfu/g或mL所述组合物到约1.1015cfu/g或mL所述组合物、优选约1.104cfu/g或mL所述组合物到约1.1012cfu/g或mL所述组合物、更优选约1.105cfu/g或mL所述组合物到约1.1010cfu/g或mL所述组合物且甚至更优选约1.106cfu/g或mL所述组合物到约1.109cfu/g或mL所述组合物。在本发明的另一实施方案中，本发明的组合物包含范围为来自如下范围的一部分的量的嗜粘蛋白阿克曼氏菌片段：约1.106cfu/g或cfu/mL所述组合物到约1.1010cfu/g或cfu/mL所述组合物、优选约1.108cfu/g或cfu/mL到约1.1010cfu/g或cfu/mL、更优选约1.109cfu/g或cfu/mL到约1.1010cfu/g或cfu/mL。在本发明的另一实施方案中，本发明的组合物包含范围为来自如下范围的一部分的量的嗜粘蛋白阿克曼氏菌片段：约1.106cfu/g或cfu/mL所述组合物到约1.1010cfu/g或cfu/mL所述组合物、优选约1.106cfu/g或cfu/mL到约1.109cfu/g或cfu/mL、更优选约1.108cfu/g或cfu/mL到约1.109cfu/g或cfu/mL。
本发明还涉及包含有效量的嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在本发明的一个实施方案中，本发明的药物组合物用于治疗代谢病症。在本发明的另一实施方案中，所述药物组合物用于恢复嗜粘蛋白阿克曼氏菌在有需要的受试者的肠道中的正常比例。
如本文所用的，术语“药学上可接受的赋形剂”是指当施用于动物、优选人时不产生不利的、过敏的或其它不适当的反应的赋形剂。其可包括任何和全部的溶剂、分散介质、涂覆材料、等渗和吸收延迟剂等。对于人施用来说，制剂应当满足FDA生物制品标准局(FDA Office of Biologicsstandards)所要求的对无菌性、致热原性、整体安全性和纯度的标准。
本发明还涉及包含有效量的嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段的药剂。在本发明的一个实施方案中，本发明的药剂用于治疗代谢病症。在本发明的另一实施方案中，所述药剂用于恢复嗜粘蛋白阿克曼氏菌在有需要的受试者的肠道中的正常比例。
本发明还涉及用于治疗有需要的受试者的代谢病症的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用有效量的嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段。
本发明的另一目标是用于恢复嗜粘蛋白阿克曼氏菌在有需要的受试者的肠道中的正常比例的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用有效量的嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段。
在一个实施方案中，本发明的方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的组合物、药物组合物或药剂。
在本发明的一个实施方案中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段、或所述组合物、所述药物组合物或所述药剂至少每周一次，优选至少每周两次，更优选至少每周三次且甚至更优选每周三次被施用。在另一实施方案中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段、或所述组合物、所述药物组合物或所述药剂至少每日一次且优选至少每日两次被施用。
在一个实施方案中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段、或本发明的组合物、药物组合物或药剂在1周期间，优选在2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周或8周以上期间被施用。
在一个实施方案中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段、或本发明的组合物、药物组合物或药剂被施用持续直到实现所需结果(例如重量减轻、代谢病症治疗、胆固醇血浆水平降低……)的时期。
在一个实施方案中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段、或本发明的组合物、药物组合物或药剂的施用是终身的，即不在时间上受限制。
在本发明的一个实施方案中，每日施用的嗜粘蛋白阿克曼氏菌的每日量在1.102cfu/日到约1.1015cfu/日、优选约1.104cfu/日到约1.1012cfu/日、更优选约1.105cfu/日到约1.1010cfu/日且甚至更优选约1.106cfu/日到约1.109cfu/日的范围。
在本发明的另一实施方案中，每日施用的嗜粘蛋白阿克曼氏菌的每日量在1.106cfu/日到约1.1010cfu/日、优选约1.108cfu/日到约1.1010cfu/日、更优选约1.109cfu/日到约1.1010cfu/日的范围。
在本发明的另一实施方案中，每日施用的嗜粘蛋白阿克曼氏菌的每日量在1.106cfu/日到约1.1010cfu/日、优选约1.106cfu/日到约1.109cfu/日、更优选约1.108cfu/日到约1.109cfu/日的范围。
在本发明的一个实施方案中，每日施用的嗜粘蛋白阿克曼氏菌片段的每日量在来自1.102cfu/日到约1.1015cfu/日、优选约1.104cfu/日到约1.1012cfu/日、更优选约1.105cfu/日到约1.1010cfu/日且甚至更优选约1.106cfu/日到约1.109cfu/日的一部分的范围。在本发明的另一实施方案中，每日施用的嗜粘蛋白阿克曼氏菌片段的每日量在来自1.106cfu/日到约1.1010cfu/日、优选约1.108cfu/日到约1.1010cfu/日、更优选约1.109cfu/日到约1.1010cfu/日的一部分的范围。在本发明的另一实施方案中，每日施用的嗜粘蛋白阿克曼氏菌片段的每日量在来自1.106cfu/日到约1.1010cfu/日、优选约1.106cfu/日到约1.109cfu/日、更优选约1.108cfu/日到约1.109cfu/日的一部分的范围。
在本发明的一个实施方案中，受试者是超重的。在另一实施方案中，受试者是肥胖症的。
在本发明的一个实施方案中，受试者被诊断有代谢病症，例如，有超重和/或肥胖症相关的代谢病症。
在另一实施方案中，受试者处于发生代谢病症(例如，超重和/或肥胖症相关的代谢病症)的风险。在一个实施方案中，所述风险与受试者为超重或肥胖症的事实相关。在另一实施方案中，所述风险对应于易感性，例如，对代谢病症(例如，超重和/或肥胖症相关的代谢病症)的家族易感性。
在本发明的一个实施方案中，受试者呈现肠道微生物群组成的失调。优选地，所述受试者的肠道微生物群贫乏嗜粘蛋白阿克曼氏菌菌株。在一个实施方案中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌在受试者肠道中的比例低于1％，优选低于0.5％，更优选低于0.1％，所述比例以嗜粘蛋白阿克曼氏菌细胞数对肠道中细菌细胞总数表示。
本发明还涉及嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段用于促进受试者的重量减轻的美容用途。
因此，本发明的另一目标是包含美容有效量的嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段的美容组合物以及其用于促进受试者的重量减轻的用途。如本文所用的，“美容有效量”是指促进美容作用(例如，诱导受试者的重量减轻)所必需和足够的美容组合物的量。
本发明还涉及用于促进有需要的受试者的重量减轻的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用美容有效量的嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段。
在一个实施方案中，本发明的方法包括向受试者施用美容有效量的本发明的组合物或美容组合物。
在本发明的一个实施方案中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌的美容有效量在约1.102cfu到约1.1015cfu、优选约1.104cfu到约1.1012cfu、更优选约1.105cfu到约1.1010cfu且甚至更优选约1.106cfu到约1.109cfu的范围。在本发明的另一实施方案中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌的美容有效量在约1.106cfu到约1.1010cfu、优选约1.108cfu到约1.1010cfu、更优选约1.109cfu到约1.1010cfu的范围。在本发明的另一实施方案中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌的美容有效量在约1.106cfu到约1.1010cfu、优选约1.106cfu到约1.109cfu、更优选约1.108cfu到约1.109cfu的范围。
在本发明的一个实施方案中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌片段的美容有效量在来自约1.102cfu到约1.1015cfu、优选约1.104cfu到约1.1012cfu、更优选约1.105cfu到约1.1010cfu且甚至更优选约1.106cfu到约1.109cfu的一部分的范围。在本发明的另一实施方案中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌片段的美容有效量在来自约1.106cfu到约1.1010cfu、优选约1.108cfu到约1.1010cfu、更优选约1.109cfu到约1.1010cfu的一部分的范围。在本发明的另一实施方案中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌片段的美容有效量在来自约1.106cfu到约1.1010cfu、优选约1.106cfu到约1.109cfu、更优选约1.108cfu到约1.109cfu的一部分的范围。
在本发明的一个实施方案中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段、或所述组合物或所述美容组合物至少每周一次，优选至少每周两次，更优选至少每周三次且甚至更优选每周三次被施用。在另一实施方案中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段、或所述组合物或所述美容组合物至少每日一次且优选至少每日两次被施用。
在一个实施方案中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段、或本发明的组合物或美容组合物在1周期间，优选在2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周或8周以上期间被施用。
在一个实施方案中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段、或本发明的组合物或美容组合物被施用持续直到实现所需结果(例如重量减轻……)的时期。
在一个实施方案中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段、或本发明的组合物或美容组合物的施用是终身的，即在时间上不受限制。
在本发明的一个实施方案中，每日施用的嗜粘蛋白阿克曼氏菌的每日量在1.102cfu/日到约1.1015cfu/日、优选约1.105cfu/日到约1.1012cfu/日、更优选约1.108cfu/日到约1.1010cfu/日且甚至更优选约1.109cfu/日到约1.1010cfu/日的范围。在本发明的另一实施方案中，每日施用的嗜粘蛋白阿克曼氏菌的每日量在1.106cfu/日到约1.1010cfu/日、优选约1.108cfu/日到约1.1010cfu/日、更优选约1.109cfu/日到约1.1010cfu/日的范围。在本发明的另一实施方案中，每日施用的嗜粘蛋白阿克曼氏菌的每日量在1.106cfu/日到约1.1010cfu/日、优选约1.106cfu/日到约1.109cfu/日、更优选约1.108cfu/日到约1.109cfu/日的范围。
在本发明的一个实施方案中，每日施用的嗜粘蛋白阿克曼氏菌片段的每日量在来自约1.102cfu/日到约1.1015cfu/日、优选约1.105cfu/日到约1.1012cfu/日、更优选约1.108cfu/日到约1.1010cfu/日且甚至更优选约1.109cfu/日到约1.1010cfu/日的一部分的范围。在本发明的另一实施方案中，每日施用的嗜粘蛋白阿克曼氏菌片段的每日量在来自约1.106cfu/日到约1.1010cfu/日、优选约1.108cfu/日到约1.1010cfu/日、更优选约1.109cfu/日到约1.1010cfu/日的一部分的范围。在本发明的另一实施方案中，每日施用的嗜粘蛋白阿克曼氏菌片段的每日量在来自约1.106cfu/日到约1.1010cfu/日、优选约1.106cfu/日到约1.109cfu/日、更优选约1.108cfu/日到约1.109cfu/日的一部分的范围。
在一个实施方案中，所述受试者不是肥胖症受试者。在另一实施方案中，所述受试者是超重的。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物、所述药物组合物、所述美容组合物或所述药剂进一步包含另外的益生菌菌株或种，例如，细菌益生菌菌株或种；除细菌以外的原核生物益生菌；或真菌菌株或菌，优选酵母菌株或种。在一个实施方案中，所述另外的益生菌菌株或种选自天然存在于受试者的肠道中、优选存在于人肠道中、更优选存在于健康人受试者的肠道中的那些。
可用于本发明中的细菌益生菌菌株或种的示例包括但不限于乳杆菌属、乳球菌属、双歧杆菌属、韦荣球菌属(Veillonella)、德库菌属(Desemzia)、粪球菌属(Coprococcus)、柯林斯菌属(Collinsella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、Turicibacter、萨特氏菌属(Sutterella)、罕见小球菌属(Subdoligranulum)、链球菌属、孢杆菌属(Sporobacter)、Sporacetigenium、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、罗斯氏菌属(Roseburia)、变形杆菌属(Proteus)、丙酸杆菌属(Propionobacterium)、明串珠菌属(Leuconostoc)、魏斯氏菌属(Weissella)、片球菌属(Pediococcus)、链球菌属、普雷沃氏菌属、副拟杆菌属(Parabacteroides)、Papillibacter、颤螺菌属(Oscillospira)、蜜蜂球菌属(Melissococcus)、多尔氏菌属(Dorea)、小杆菌属(Dialister)、梭菌属(Clostridium)、西地西菌属(Cedecea)、Catenibacterium、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、布丘氏菌属(Buttiauxella)、Bulleidia、嗜胆菌属(Bilophila)、拟杆菌属、Anaerovorax、Anaerostopes、厌氧细杆菌属(Anaerofilum)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、硬壁细菌类(Fermicutes)、奇异菌属(Atopobium)、Alistipes、不动杆菌属(Acinetobacter)、Slackie、志贺菌属(Shigella)、斯瓦尼菌属(Shewanella)、沙雷氏菌属(Serratia)、马氏菌属(Mahella)、毛螺菌属(Lachnospira)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、海源菌属(Idiomarina)、梭杆菌属(Fusobacterium)、栖粪杆菌属(Faecalibacterium)、真杆菌属(Eubacterium)、肠球菌属、肠杆菌属(Enterobacter)、埃格特菌属(Eggerthella)。
可用于本发明中的原核生物菌株或菌种的示例包括但不限于古细菌(Archaea)、硬壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(例如，Allistipes、卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)、内脏拟杆菌(Bacteroides splachnicus)、粪便拟杆菌(Bacteroides stercoris)、副拟杆菌属、栖瘤胃普雷沃氏菌(Prevotellaruminicola)、紫单胞菌科(Porphyromondaceae)和相关属)、变形菌门(Proteobacteria)、β-变形菌纲(Betaproteobacteria)(例如，水杆菌属(Aquabacterium)和伯霍尔德杆菌属(Burkholderia))、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)(例如，黄单胞菌科(Xanthomonadaceae))、放线菌(Actinobacteria)(例如，放线菌科(Actinomycetaceae)和奇异菌属)、梭杆菌(Fusobacteria)、甲烷杆菌(Methanobacteria)、螺旋体(Spirochaetes)、丝状杆菌(Fibrobacters)、脱铁杆菌门/纲(Deferribacteres)、异常球菌属(Deinococcus)、栖热菌属(Thermus)、蓝细菌(Cyanobacteria)、Methanobrevibacteria、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、瘤胃球菌属、粪球菌属、罕见小球菌属、多尔氏菌属、Bulleidia、Anaerofustis、孪生球菌属(Gemella)、罗斯氏菌属、小杆菌属、Anaerotruncus、葡萄球菌属(Staphylococcus)、微球菌属(Micrococcus)、丙酸杆菌、肠杆菌科、栖粪杆菌属(Faecalibacteria)、拟杆菌属、副拟杆菌属、普雷沃氏菌属、真杆菌属、杆菌(Bacilli)(例如，唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius)和相关种、气球菌属(Aerococcus)、颗粒链菌属(Granulicatella)、牛链球菌(Streptococcusbovis)和相关属以及中链球菌(Streptococcus intermedius)和相关属)、梭菌属(例如，霍氏真杆菌(Eubacterium hallii)、淤泥真杆菌(Eubacterium limosum)和相关属)和丁酸弧菌属。
可用于本发明中的真菌益生菌菌株或菌种、优选酵母益生菌菌株或菌种的示例包括但不限于子囊菌纲(Ascomycetes)、接合菌纲(Zygomycetes)和半知菌纲(Deuteromycetes)，优选以下群：曲霉菌属(Aspergillus)、球拟酵母属(Torulopsis)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、念珠菌属(Candida)、酵母菌属(Saccharomyces)、棒孢酵母属(Clavispora)、酒香酵母属(Bretanomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、淀粉霉属(Amylomyces)、接合酵母属、内孢霉属(Endomycess)、生丝毕赤酵母属(Hyphopichia)、接合酵母属、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毛霉属(Mucor)、根霉菌属(Rhizopus)、亚罗酵母属(Yarrowia)、内孢霉属、德巴利酵母属(Debaryomyces)和/或青霉属(Penicillium)。
申请人在本文中证明，在嗜粘蛋白阿克曼氏菌施用后观察到的有益作用是该细菌菌株所特有的。实际上，实施例中显示施用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)WCSF-1不具有相同的有益作用。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物、所述药物组合物、所述美容组合物或所述药剂不包含细菌菌株乳杆菌属-肠球菌属、拟杆菌属和/或奇异菌属。
在本发明的一个实施方案中，包含于所述组合物、药物组合物、美容组合物或药剂中的唯一微生物菌株或种、优选细菌菌株或种是嗜粘蛋白阿克曼氏菌。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物、药物组合物、美容组合物或药剂由嗜粘蛋白阿克曼氏菌组成。
在本发明的另一实施方案中，所述组合物、药物组合物、美容组合物或药剂基本上由嗜粘蛋白阿克曼氏菌组成，其中“基本上由……组成”在本文中意指嗜粘蛋白阿克曼氏菌是包含于所述组合物、药物组合物、美容组合物或药剂中的唯一微生物菌株或种、优选唯一细菌菌株或种。
在本发明的一个实施方案中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段活化或抑制肠道微生物群的其它细菌菌株或种的生长和/或生物活性。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物、所述药物组合物、所述美容组合物或所述药剂进一步包含益生元。
可用于本发明中的益生元的示例包括但不限于菊粉和菊粉型果聚糖、低聚果糖、木糖、阿拉伯糖、阿拉伯糖基木聚糖、核糖、半乳糖、鼠李糖、纤维二糖、果糖、乳糖、水扬苷、蔗糖、葡萄糖、七叶苷、吐温80、海藻糖、麦芽糖、甘露糖、蜜二糖、粘液或粘蛋白、棉子糖、低聚果糖、低聚半乳糖、氨基酸、醇和其任何组合。
益生元的其它非限制性示例包括水溶性纤维素衍生物、水不溶性纤维素衍生物、未加工的燕麦片、欧车前亲水胶(metamucil)、全麸(all-bran)和其任何组合。
水溶性纤维素衍生物的示例包括但不限于甲基纤维素、甲基乙基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、阳离子羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素和羧甲基纤维素。
嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段、或本发明的组合物、药物组合物、美容组合物或药剂可通过几种施用途径被施用。适合的施用途径的示例包括但不限于口服施用、直肠施用、经食管胃十二指肠镜检查施用、经结肠镜检查施用、使用鼻胃管或口胃管施用等。
根据实施方案，嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段、或本发明的组合物、药物组合物、美容组合物或药剂呈适于口服施用的形式。根据第一实施方案，适于口服施用的形式是固体形式，其选自包含以下的组：片剂、丸剂、胶囊、软明胶胶囊、糖衣丸剂、口分散(orodispersing)/口分散片剂、泡腾片剂或其它固体。根据第二实施方案，适于口服施用的形式是液体形式(例如，可饮用溶液)、脂质体形式等。
在一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物、美容组合物或药剂进一步包含针对预期施用途径选择的赋形剂、稀释剂和/或载体。赋形剂、稀释剂和/或载体的示例包括但不限于水、磷酸盐缓冲液、无氧磷酸盐缓冲液、碳酸氢钠、汁、奶、酸乳、婴儿配方、乳制品、着色剂，例如，二氧化钛(E171)、二氧化铁(E172)和亮黑BN(E151)；调味剂；增稠剂，例如，单硬脂酸甘油酯；甜味剂；包衣剂，例如，精制菜籽油、大豆油、花生油、大豆卵磷脂或鱼明胶；稀释剂，例如，乳糖、单水合乳糖或淀粉；粘结剂，例如，聚维酮(povidone)、预胶化淀粉、树胶、蔗糖、聚乙二醇(PEG)4000或PEG 6000；崩解剂，例如，微晶纤维素或羧甲基淀粉钠，例如，A型羧甲基淀粉钠；润滑剂，例如，硬脂酸镁；流动剂，例如，胶体无水二氧化硅等……。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物、药物组合物、美容组合物或药剂呈营养组合物的形式，即包含液体或固体食物、饲料或饮用水。在本发明的一个实施方案中，所述组合物、药物组合物、美容组合物或药剂是食品，例如，乳制品、乳制饮品、酸乳、水果汁或蔬菜汁或其浓缩物、粉末、基于麦芽或大豆或谷物的饮料、早餐谷物(例如什锦谷物早餐片(muesli flake))、水果和蔬菜汁粉末、谷物和/或巧克力条、糖果、美味酱(spreads)、面粉、奶、果昔(smoothie)、糖果、奶制品、奶粉、复原奶、酸奶(cultured milk)、酸乳、饮用酸乳、凝固型酸乳、饮品、乳制饮品、奶制饮品、巧克力、凝胶、冰淇淋、谷物、复原水果产品、零食棒(snack bar)、食物棒(food bar)、什锦谷物早餐棒(muesli bar)、美味酱、调味酱(sauce)、沙司(dips)、乳制品(包括酸乳和奶酪)、饮品(包括基于乳和非基于乳的饮品)、运动补充剂(包括基于乳和非基于乳的运动补充剂)。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物、药物组合物、美容组合物或药剂呈食物添加剂、饮品添加剂、饮食补充剂、营养产品、医疗食物或营养食品组合物(nutraceutical composition)的形式。
嗜粘蛋白阿克曼氏菌是严格厌氧的细菌。因此，在使用能存活的或者活(viable或living)的菌株的实施方案中，应当避免与氧的长时间接触。用于避免与氧的长时间接触的手段的示例包括但不限于冷冻细菌细胞或包装在密封容器中等。
本申请人在本文中证明，肥胖症和相关病症与受试者的增加的肠道渗透性以及受损的粘液产生、上皮屏障、免疫系统和/或抗细菌化合物产生相关；并且证明施用嗜粘蛋白阿克曼氏菌可恢复这些参数。
因此，本发明还涉及用于降低肠道渗透性和/或用于恢复受损的粘液产生和/或用于恢复上皮屏障和/或用于恢复免疫系统和/或用于降低抗细菌化合物的产生的嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段。本发明的另一目标是用于在有需要的受试者中降低肠道渗透性和/或用于恢复受损的粘液产生和/或用于恢复上皮屏障和/或用于恢复免疫系统和/或用于降低抗细菌化合物的产生的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量或美容有效量的嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段。
本申请人惊讶地证明，施用嗜粘蛋白阿克曼氏菌通过调节粘液层厚度和结肠抗微生物肽(例如，RegIIIγ)的产生来控制肠道屏障。另外，他们还证明嗜粘蛋白阿克曼氏菌调节酰基甘油的产生，所述酰基甘油属于参与控制炎症、肠道屏障和肠肽分泌(GLP-1和GLP-2)的内源性大麻素家族。GLP-1和GLP-2参与众多种功能，包括改进胰岛素信号传导、减少炎症和促进饱腹感。
因此，本发明还涉及用于控制肠道屏障功能的嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段以及用于控制肠道屏障功能的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量或美容有效量的嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段。在一个实施方案中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段调节粘液层厚度(其在肥胖症或其它代谢病症中可减小)。在另一实施方案中，施用嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段诱导产生结肠抗微生物肽，例如，RegIIIγ。在另一实施方案中，施用嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段诱导产生内源性大麻素家族化合物，例如，选自包含2-油酰基甘油、2-棕榈酰基甘油和2-花生酰基甘油的组的酰基甘油。在另一实施方案中，施用嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段调节粘液周转。
本发明的另一目标涉及嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段用于治疗与代谢病症相关或由其引起的代谢功能障碍。因此,本发明的又一目标是用于治疗有需要的受试者的与代谢病症相关或由代谢病症引起的代谢功能障碍的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量或美容有效量的嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段。
本申请人还证明，施用嗜粘蛋白阿克曼氏菌控制脂肪储存和脂肪组织代谢。因此，本发明的另一目标涉及嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段用于控制脂肪储存和脂肪组织代谢。本发明的另一目标还是用于控制脂肪储存和脂肪组织代谢的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量或美容有效量的嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段。在一个实施方案中，所述控制不涉及食物摄入的任何变化。在本发明的一个实施方案中，施用嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段消除代谢性内毒素血症。在另一实施方案中，施用嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段降低脂肪量。在另一实施方案中，施用嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段增加脂肪细胞分化和脂质氧化的mRNA表达，优选不影响脂肪生成。
本申请人还证明，施用嗜粘蛋白阿克曼氏菌调节脂肪组织代谢和葡萄糖稳态。因此，本发明涉及嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段用于调节脂肪组织代谢和葡萄糖稳态；以及用于调节脂肪组织代谢和葡萄糖稳态的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量或美容有效量的嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段。在本发明的一个实施方案中，施用嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段逆转饮食诱导的空腹高血糖。在另一实施方案中，施用嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段诱导肝葡萄糖-6-磷酸酶表达至少10％、优选至少30％、更优选至少40％的降低。在另一实施方案中，施用嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段诱导胰岛素抵抗指数的降低。在一个实施方案中，所述胰岛素抵抗指数的降低为至少5％、优选至少10％、更优选至少15％的降低。
此外，本申请人证明，施用嗜粘蛋白阿克曼氏菌导致脂肪组织CD11c巨噬细胞亚群的正常化。该巨噬细胞群细胞的量在代谢病症(例如，肥胖症和2型糖尿病)中增加，并且是与这些代谢病症相关的炎症的标志。因此，本发明还涉及嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段用于治疗与代谢病症相关或由代谢病症引起的炎症、优选低度炎症；以及用于治疗与代谢病症相关的炎症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量或美容有效量的嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段。在本发明的一个实施方案中，施用嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段降低脂肪组织中CD11c巨噬细胞的量。
最后，本申请人证明，施用嗜粘蛋白阿克曼氏菌降低高脂肪饮食喂养小鼠中的血浆胆固醇。因此，本发明还涉及用于降低血浆胆固醇的嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段；以及用于降低血浆胆固醇的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量或美容有效量的嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段。
在本发明的一个实施方案中，对受试者施用嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段对所述受试者的食物摄入没有影响。
在本发明的一个实施方案中，向受试者施用嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段增加所述受试者的能量消耗，优选地不影响所述受试者的食物摄入。
因此，本发明还涉及增加受试者的能量消耗的方法，其包括向所述受试者施用嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段、或本发明的组合物、药物组合物、美容组合物或药剂，优选以治疗有效量或美容有效量。优选地，本发明的方法不包括或不进一步包括调节所述受试者的食物摄入。在本发明的一个实施方案中，本发明的方法增加能量消耗，由此诱导受试者的持久的重量减轻，并且由此治疗所述受试者的代谢病症，例如，肥胖症相关的代谢病症。
在一个实施方案中，向受试者施用嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段增加所述受试者的饱腹感。因此，根据该实施方案，本发明的方法增加受试者的饱腹感，由此诱导受试者的持久的重量减轻，并且由此治疗所述受试者的代谢病症，例如，肥胖症相关的代谢病症。
附图说明
图1是图表的组合，显示嗜粘蛋白阿克曼氏菌丰度在肥胖症和糖尿病小鼠中降低，而益生元治疗将其恢复到基础水平并且改善代谢性内毒素血症和相关病症。(a)在瘦素缺陷型(ob-ob)肥胖症小鼠(n＝5)和它们的瘦同胞仔(瘦的)(n＝5)的盲肠内容物中测量的嗜粘蛋白阿克曼氏菌丰度(Log10细菌/g盲肠内容物)。(b)在喂养正常食物饮食(ob-CT)或用益生元(ob-Pre)治疗5周的肥胖症小鼠(n＝10)的盲肠内容物中测量的嗜粘蛋白阿克曼氏菌丰度(Log10细菌/g盲肠内容物)。(c)在对照饮食喂养小鼠(CT)或用在自来水中添加的益生元治疗的CT饮食喂养小鼠(CT-Pre)和HF饮食喂养小鼠(HF)或用在自来水中添加的益生元治疗的HF饮食喂养小鼠(HF-Pre)的盲肠内容物中测量的嗜粘蛋白阿克曼氏菌丰度(Log10细菌/g盲肠内容物)，所述治疗持续8周(n＝10)。(d)门静脉血清LPS水平(n＝7-9)。(e)脂肪组织巨噬细胞浸润标记物CD11c mRNA(n＝10)。(f)门静脉LPS水平的对数值与嗜粘蛋白阿克曼氏菌丰度(Log10细菌/g盲肠内容物)之间的皮尔逊相关性(Pearson’scorrelation)，插入内容指示皮尔逊相关系数(r)和相应的P值。(g)通过时域核磁共振测量的总脂肪量增加(n＝10)。a-c中的数据显示为盒形图。*P<0.05，基于双尾学生t-检验。已在相同小鼠组中获得c-g中的数据。d、e和g中的数据显示为平均值±s.e.m。根据事后(post-hoc)ANOVA单因素统计分析，具有不同上标字母的数据显著不同(P<0.05)。
图2是图表和图像的组合，显示嗜粘蛋白阿克曼氏菌改变肠道微生物群组成，抵消饮食诱导的肠道屏障功能障碍，改变内源性大麻素的肠水平并且改善饮食诱导的肥胖症小鼠的代谢病症。小鼠通过每日经口管饲嗜粘蛋白阿克曼氏菌(2.108个细菌细胞悬浮于200μl无菌无氧磷酸盐缓冲液(PBS)中)治疗并且被喂养对照饮食(CT-Akk)或HF-饮食(HF-Akk)，与喂养对照饮食(CT)或高脂饮食(HF)并且通过每日经口管饲等体积的无菌无氧PBS处理的小鼠相比较，所述治疗持续4周(n＝10)。(a)来自对照组(CT和HF)和嗜粘蛋白阿克曼氏菌治疗组(CTA和HFA)的盲肠内容物的肠道微生物群的基于MIT芯片系统发育指纹的PCA分析。(b)门静脉血清LPS水平(n＝6-10)。(c)通过时域核磁共振测量的总脂肪量增加(n＝10)。(d)通过将在治疗4周后进行的口服葡萄糖负荷(2g葡萄糖/kg体重)后获得的血糖和血浆胰岛素两者的曲线下面积(0min到15min)相乘来确定胰岛素抵抗指数(n＝10)。(e)脂肪组织巨噬细胞浸润标记物CD11c mRNA(n＝10)。(f)在内脏脂肪库(肠系膜脂肪)中测量脂肪细胞分化(CCAAT/增强子结合蛋白-α，由Cebpa编码)、脂肪生成(乙酰基-CoA羧化酶，由Acc1编码；脂肪酸合酶，由Fasn编码)和脂质氧化(肉毒碱棕榈酰基转移酶-1，由Cpt1编码；酰基-CoA-氧化酶，由Acox1编码；过氧化物酶体增殖子活化的受体γ共活化剂，由Pgc1a编码；和过氧化物酶体增殖子活化的受体α，由Ppara编码)标记物mRNA表达(n＝10)。(g)回肠2-棕榈酰基甘油(2-PG)、2-油酰基甘油(2-OG)、2-花生酰基甘油(2-AG)(表示为对照的％)(n＝10)。(h)在阿辛蓝染色后通过组织学分析测量的粘液层厚度。用于粘液层厚度测量的代表性的阿辛蓝图像，柱条＝40μm(n＝7-8)。(i)结肠再生胰岛衍生3-γ(RegIIIγ，由Reg3g编码)mRNA表达(n＝10)。已在相同小鼠组中获得a-i中的数据。b-i中的数据显示为平均值±s.e.m。根据事后ANOVA单因素统计分析，具有不同上标字母的数据显著不同(P<0.05)。
图3是显示益生元治疗小鼠展现嗜粘蛋白阿克曼氏菌与脂肪组织巨噬细胞浸润或脂肪量增加之间的相反关系的图表和图像的组合。(a)脂肪组织CD11c mRNA水平与嗜粘蛋白阿克曼氏菌丰度(Log10细菌/g盲肠内容物)之间的皮尔逊相关性，所述丰度是在对照饮食喂养小鼠(CT)或用在自来水中添加的益生元治疗8周的CT饮食喂养小鼠(CT-Pre)和HF饮食喂养小鼠(HF)或用在自来水中添加的益生元治疗8周的HF饮食喂养小鼠(HF-Pre)的盲肠内容物中测量的，插入内容指示皮尔逊相关系数(r)和相应的P值。(b)皮下、肠系膜和附睾的脂肪库重量(g/100g体重)(n＝10)。(c)脂肪组织量的增加与盲肠内容物嗜粘蛋白阿克曼氏菌丰度(Log10细菌/g盲肠内容物)之间的皮尔逊相关性，插入内容指示皮尔逊相关系数(r)和相应的P值。已在相同小鼠组中获得a-c中的数据，并且显示为平均值±s.e.m。根据事后ANOVA单因素统计分析，具有不同上标字母的数据显著不同(P<0.05)。
图4是显示每日经口管饲嗜粘蛋白阿克曼氏菌增加这些细菌的盲肠丰度的图的组合。嗜粘蛋白阿克曼氏菌丰度表示为(a)总16S RNA的％或(b)Log10DNA拷贝，在通过每日经口管饲嗜粘蛋白阿克曼氏菌(2.108个细菌细胞悬浮于200μl无菌无氧磷酸盐缓冲液(PBS)中)治疗并且喂养对照饮食(CT-Akk)或HF-饮食(HF-Akk)的小鼠中测量，与在喂养对照饮食(CT)或高脂肪饮食(HF)并且通过每日经口管饲等体积的无菌无氧PBS治疗的小鼠中测量的相比较，所述治疗持续4周(n＝10)。
图5是显示嗜粘蛋白阿克曼氏菌治疗降低脂肪量而不影响食物摄入的图表和图像的组合。(a)通过每日经口管饲嗜粘蛋白阿克曼氏菌(2.108个细菌细胞悬浮于200μl无菌无氧磷酸盐缓冲液(PBS)中)治疗并且喂养对照饮食(CT-Akk)或HF-饮食(HF-Akk)的小鼠、或喂养对照饮食(CT)或高脂肪饮食(HF)并且通过每日经口管饲等体积的无菌无氧PBS治疗的小鼠的皮下、肠系膜和附睾的脂肪库重量(g/100g体重)，所述治疗持续4周(n＝10)。(b)经4周治疗的累积食物摄入(g)。(c)最终体重(n＝10)。(d)以最终体重的百分比表示并且使用7.5MHz时域NMR(LF50minispec；Bruker,n＝10)测量的最终的脂肪量和瘦物质量(lean mass)。数据显示为平均值±s.e.m。根据事后ANOVA单因素统计分析，具有不同上标字母的数据显著不同(P<0.05)。
图6是显示嗜粘蛋白阿克曼氏菌治疗使空腹血糖正常化并且降低空腹肝G6pc mRNA表达的图的组合。(a)空腹血糖，测量于通过每日经口管饲嗜粘蛋白阿克曼氏菌(2.108个细菌细胞悬浮于200μl无菌无氧磷酸盐缓冲液(PBS)中)处理并且喂养对照饮食(CT-Akk)或HF-饮食(HF-Akk)的小鼠、或喂养对照饮食(CT)或高脂肪饮食(HF)并且通过每日经口管饲等体积的无菌无氧PBS治疗的小鼠，所述治疗持续4周(n＝10)。(b)4周时期结束时在肝中测量的葡萄糖-6磷酸酶(由G6pc编码)mRNA表达水平(n＝10)。数据显示为平均值±s.e.m。根据事后ANOVA单因素统计分析，具有不同上标字母的数据显著不同(P<0.05)。
图7是显示嗜粘蛋白阿克曼氏菌治疗对回肠中的抗细菌肽含量和粪便中的IgA水平具有微小作用的图表的组合。在通过每日经口管饲嗜粘蛋白阿克曼氏菌(2.108个细菌细胞悬浮于200μl无菌无氧磷酸盐缓冲液(PBS)中)治疗并且喂养对照饮食(CT-Akk)或HF-饮食(HF-Akk)的小鼠、或喂养对照饮食(CT)或高脂肪饮食(HF)并且通过每日经口管饲等体积的无菌无氧PBS治疗的小鼠的回肠中测量的(a)再生胰岛衍生3-γ(RegIIIγ，由Reg3g编码)、(b)磷脂酶A2IIA群(由Pla2g2a编码)、(c)α-防御素(由Defa编码)和(d)溶菌酶C(由Lyz1编码)的抗细菌肽mRNA表达，所述治疗持续4周(n＝10)。(e)粪便IgA水平(μg/g粪便)。数据显示为平均值±s.e.m。根据事后ANOVA单因素统计分析，具有不同上标字母的数据显著不同(P<0.05)。
图8是直方图、图表和图像的组合，其显示热灭活的嗜粘蛋白阿克曼氏菌在饮食诱导的肥胖症小鼠中不抵消代谢性内毒素血症、饮食诱导的肥胖症、口服葡糖耐受不良，不改善脂肪组织代谢和肠道屏障功能。对照小鼠被喂养对照(CT)或HF饮食(HF)并且用含有无菌无氧PBS和甘油的每日经口管饲物每日治疗，持续4周。经治疗小鼠接受经口管饲活的嗜粘蛋白阿克曼氏菌(HF-Akk)或代谢灭活的嗜粘蛋白阿克曼氏菌(HF-K-Akk)(2.108个细菌细胞悬浮于200μl无菌无氧磷酸盐缓冲液(PBS)中的细菌细胞)并且被喂养HF饮食(n＝8)。(A)门静脉血清LPS水平(n＝6-7)。(B)通过时域核磁共振测量的总脂肪量增加(n＝7-8)。(C)自由移动的小鼠在2g/kg口服葡萄糖挑战(challenge)后的血浆葡萄糖曲线，并且(D)中的直方图显示在葡萄糖负荷后0min与120min之间测量的平均曲线下面积(AUC)(n＝7-8)。(E)在内脏脂肪库(肠系膜脂肪)中测量脂肪细胞分化(Cebpa)、脂肪生成(Acc1；Fasn)和脂质氧化(Cpt1；Acox1；Pgc1a；和Ppara)的标记物的mRNA表达(n＝8)。(F)在阿辛蓝染色后通过组织学分析测量的粘液层的厚度(CT n＝4,HF n＝6,HF-Akk和HF-K-Akk n＝5)。(G)用于粘液层厚度测量的代表性的阿辛蓝图像，柱条＝40μm。M＝粘膜，IM＝内粘液层。数据显示为平均值±s.e.m。根据事后ANOVA单因素统计分析，具有不同上标字母的数据显著不同(P<0.05)。
图9是显示热灭活的嗜粘蛋白阿克曼氏菌在服用HF饮食的小鼠中不降低皮下、肠系膜和附睾的脂肪量并且不增加结肠抗微生物肽的直方图的组合。(A)在喂养对照(CT)或HF饮食(HF)并且用含有无菌无氧PBS和甘油的每日经口管饲物每日治疗、持续4周的对照小鼠中测量的皮下、肠系膜和附睾的脂肪库重量(g/100g体重)。经治疗小鼠接受经口管饲活的嗜粘蛋白阿克曼氏菌(HF-Akk)或死的嗜粘蛋白阿克曼氏菌(HF-K-Akk)(2.108个细菌细胞悬浮于200μl无菌无氧PBS中)并且被喂养HF饮食(n＝8)。(B)结肠再生胰岛衍生3-γ(RegIIIγ，由Reg3g编码)mRNA表达的mRNA表达(n＝8-18)，数据代表来自两次嗜粘蛋白阿克曼氏菌研究的结果。数据显示为平均值±s.e.m。根据事后ANOVA单因素统计分析，具有不同上标字母的数据显著不同(P<0.05)。
图10是显示在8周期间每周用嗜粘蛋白阿克曼氏菌治疗3次的效率的直方图的组合。(A)在喂养对照饮食(CT)(n＝8)或HF饮食(HF)(n＝10)并且通过每周三次经口管饲含有甘油的无菌无氧PBS或嗜粘蛋白阿克曼氏菌(HF-Akk)(n＝10)治疗8周的对照小鼠中测量的体重(g)。(2.108个细菌细胞悬浮于200μl无菌无氧PBS中)。(B)皮下脂肪量。(C)内脏脂肪组织(肠系膜和附睾)。数据显示为平均值±s.e.m。根据事后ANOVA单因素统计分析，具有不同上标字母的数据显著不同(P<0.05)。
图11是显示嗜粘蛋白阿克曼氏菌降低喂养高脂饮食的小鼠中的血浆胆固醇的直方图。(CT)喂养对照饮食的小鼠；(Akk)通过每日经口管饲嗜粘蛋白阿克曼氏菌(2.108个细菌细胞悬浮于200μl无菌无氧磷酸盐缓冲液(PBS)中)治疗并且喂养对照饮食的小鼠；(HF)喂养高脂饮食的小鼠；(HF-Akk)通过每日经口管饲嗜粘蛋白阿克曼氏菌(109个细菌细胞悬浮于200μl无菌无氧磷酸盐缓冲液(PBS)中)治疗并且喂养HF-饮食的小鼠。
图12是显示植物乳杆菌WCFS1在饮食诱导的肥胖症小鼠中不降低脂肪量并且不改善脂肪组织代谢和肠道屏障功能的直方图的组合。对照小鼠被喂养对照饮食(CT)或HF饮食(HF)并且用含有无菌无氧PBS和甘油的每日经口管饲物治疗4周。经治疗小鼠接受经口管饲植物乳杆菌WCFS1(HF-LP)(2.108个细菌细胞悬浮于200μL无菌无氧PBS中)并且被喂养HF饮食(n＝7-8)。(A)通过时域NMR测量的最终脂肪量(n＝7-8)。皮下、肠系膜和附睾的脂肪库重量(g/100g体重)(n＝7-8)。(B)在内脏脂肪库(肠系膜脂肪)中测量脂肪细胞分化(Cebpa)、脂肪生成(Acc1；Fasn)和脂质氧化(Cpt1；Acox1；Pgc1a；和Ppara)的标记物的mRNA表达(n＝7-8)。(C)在阿辛蓝染色后通过组织学分析测量的粘液层的厚度(n＝4-6)。(D)门静脉血清LPS水平(n＝6-7)。(E)结肠RegIIIγ(由Reg3g编码)mRNA表达的mRNA表达(n＝8-18)。数据显示为平均值±s.e.m。根据事后ANOVA单因素统计分析，具有不同上标字母的数据显著不同(P<0.05)。
实施例
通过以下实施例进一步说明本发明。
材料和方法
小鼠
ob/ob实验：ob/ob相对于瘦的研究：将6周龄ob/ob(n＝5只/组)小鼠(C57BL/6背景，Jackson-Laboratory,Bar Harbor,ME,USA)以每笼2只或3只小鼠为一组圈养在受控环境(12-h日光周期，于6-pm关灯)中，并且可自由获取食物和水。对小鼠喂养对照饮食(A04,Villemoisson-sur-Orge,France)16周。收获盲肠内容物，将其浸入液氮中，并且储存在–80℃，用于进一步嗜粘蛋白阿克曼氏菌分析。
ob/ob益生元研究：将6周龄ob/ob(n＝10只/组)小鼠(C57BL/6背景，Jackson-Laboratory,Bar Harbor,ME,USA)以每笼2只小鼠为一组圈养在受控环境(12-h日光周期，于6-pm关灯)中，并且可自由获取食物和水。如先前所述，对小鼠喂养对照饮食(Ob-CT)(A04,Villemoisson-sur-Orge,France)或补充有益生元(例如低聚果糖)的对照饮食(Ob-Pre)(Orafti,Tienen,Belgium)，持续5周(Everard等Diabetes 60,2775-2786(2011))。该组小鼠先前已在Everard等(Everard等Diabetes 60,2775-2786(2011))中得到表征。
高脂益生元实验：将一组10周龄C57BL/6J小鼠(40只小鼠，n＝10只/组)(Charles River,Brussels,Belgium)以每笼5只小鼠为一组圈养，并且可自由获取食物和水。对小鼠喂养对照饮食(CT)(A04,Villemoisson-sur-Orge,France)、或对照饮食并且用在自来水中添加的益生元(例如低聚果糖(Orafti,Tienen,Belgium)(0.3g/小鼠/日))治疗(CT-Pre)、或高脂饮食(HF)(60％脂肪和20％碳水化合物(千卡/100g),D12492，研究饮食，New Brunswick,NJ,USA)、或HF饮食并且用在自来水中添加的低聚果糖(0.3g/小鼠/日)治疗(HF-Pre)。治疗持续8周。
HFD嗜粘蛋白阿克曼氏菌治疗：将一组10周龄C57BL/6J小鼠(40只小鼠，n＝10只/组)(Charles River,Brussels,Belgium)以每笼2只小鼠为一组圈养，并且可自由获取食物和水。对小鼠喂养对照饮食(CT)(AIN93Mi；研究饮食，New Brunswick,NJ,USA)或高脂肪饮食(HF)(60％脂肪和20％碳水化合物(千卡/100g)，D12492，研究饮食，New Brunswick,NJ,USA)。通过经口管饲2.108cfu/0.2ml的剂量口服施用嗜粘蛋白阿克曼氏菌(悬浮于无菌无氧磷酸盐缓冲液中)来治疗小鼠(CT-Akk和HF-Akk)，并且通过经口管饲等体积的无菌无氧磷酸盐缓冲液治疗对照组(CT和HF)。治疗持续4周。
如先前所述使嗜粘蛋白阿克曼氏菌MucT(ATTC BAA-835)厌氧生长在基于粘蛋白的基础培养基中(Derrien等Int J Syst Evol Microbiol 54,1469-1476(2004))，然后进行洗涤并且悬浮于无氧磷酸盐缓冲液(包含25％(v/v)甘油)中，直到1.1010cfu/ml的最终浓度。
HFD活嗜粘蛋白阿克曼氏菌治疗相对于热杀死的嗜粘蛋白阿克曼氏菌治疗和植物乳杆菌WCFS1治疗：将一组10周龄C57BL/6J小鼠(40只小鼠，n＝8只/组)(Charles River,Brussels,Belgium)以每笼2只小鼠为一组圈养，并且可自由获取食物和水。对小鼠喂养对照饮食(CT)(AIN93Mi；研究饮食，New Brunswick,NJ,USA)或高脂饮食(HF)(60％脂肪和20％碳水化合物(千卡/100g)，D12492，研究饮食，New Brunswick,NJ,USA)。每日通过经口管饲以2.108cfu/0.2ml的剂量口服施用嗜粘蛋白阿克曼氏菌(悬浮于无菌无氧磷酸盐缓冲液中)来治疗小鼠。通过高压蒸气灭菌(15min,121℃,225kPa)将嗜粘蛋白阿克曼氏菌热杀死/灭活。通过在含粘蛋白的培养基上培养进行活力检测以确认不存在任何活细胞。使植物乳杆菌WCFS1厌氧生长在MRS培养基(Difco乳酸杆菌MRS肉汤；BD)中，洗涤，浓缩，并且以与嗜粘蛋白阿克曼氏菌制备相同的方式处理。通过每日经口管饲等体积的无菌无氧PBS治疗两个对照组(CT和HF)，持续4周，所述无菌无氧PBS含有与治疗组类似的终浓度的甘油(2.5％)(用一滴100mM柠檬酸钛还原)。
每周一次记录食物和水的摄取。通过使用7.5MHz时域核磁共振(TD-NMR)(LF50minispec,Bruker,Rheinstetten,Germany)评价身体组成。
所有小鼠实验均经当地伦理委员会(the local ethics committee)批准并且依照当地伦理委员会的指南进行。圈养条件由2010年4月6日关于实验室动物保护的比利时法律(协议号LA1230314)详细说明。
组织取样
动物已在放血和组织取样前用异氟烷(Abbott,Queenborough,Kent,England)麻醉，然后通过颈椎脱位将小鼠杀死。将脂肪库(附睾脂肪库、皮下脂肪库和肠系膜脂肪库)、肝精确地解剖并称量；三种脂肪组织的相加对应于肥胖指数。将肠段(回肠、盲肠和结肠)、盲肠内容物和脂肪组织浸入液氮中，并且储存在–80℃，用于进一步分析。
粘液层厚度
立即将近端结肠段移出并且在卡诺伊溶液(Carnoy’s solution)(乙醇-乙酸-氯仿，6/3/1v/v/v)中在4℃固定2小时。然后将样品浸入100％乙醇中24小时，然后处理用于石蜡包埋。用阿辛蓝将5μm的石蜡切片染色。每个视野由对实验组不知情(blinded)的研究人员垂直于内粘液层进行最少20次不同测量。通过使用图像分析器(Motic-image Plus 2.0ML,Motic,China)对每个结肠分析5到19个随机选择的视野，总共进行2146次测量。
RNA制备和实时qPCR分析
使用TriPure试剂(Roche)从组织制备总RNA。通过在Agilent 2100生物分析器(Agilent RNA 6000 Nano Kit,Agilent)上运行1μl各样品进行总RNA的定量和完整性分析。
通过使用反转录系统试剂盒(Promega,Leiden,The Netherlands)反转录1μg总RNA来制备cDNA。利用StepOnePlusTM实时PCR系统和软件(AppliedBiosystems,Den Ijssel,The Netherlands)使用用于检测的Mesa Fast qPCRTM(Eurogentec,Seraing,Belgium)根据制造商说明书进行实时PCR。选择RPL19作为管家基因。所有样品均一式两份在单个96孔反应板中运行，并且根据2-ΔCT方法分析数据。通过在扩增结束时进行的对熔化曲线的分析来检查扩增产物的特性和纯度。用于靶定小鼠基因的引物序列呈现于下表1中。
胰岛素抵抗指数
通过将治疗4周(嗜粘蛋白阿克曼氏菌研究)后进行的口服葡萄糖负荷(2g葡萄糖/kg体重)后获得的血糖和血浆胰岛素两者的曲线下面积(0min和15min)相乘来确定胰岛素抵抗指数。在开始日光周期后两小时后移除食物，并且在6小时禁食期后治疗小鼠，如先前所述(Everard等Diabetes 60,2775-2786(2011))。
生物化学分析
通过使用基于鲎变形细胞溶解物(LAL)动态显色方法的Endosafe-MCS(Charles River Laboratories,Lyon,France)测量门静脉血LPS浓度，所述动态显色方法测量与样品中的内毒素浓度直接相关的色彩强度。用无内毒素的缓冲液将血清1/10稀释以将反应中的干扰(抑制或增强)最小化并且在70℃加热15min。用无内毒素的LAL试剂水(Charles River Laboratories)将每个样品以1/70或1/100稀释并且以一式两份处理且在确定中包括用于每个样品的两种掺料(spike)。所有样品均已验证回收和系数变异。检测下限是0.005EU/ml。使用ELISA试剂盒(Mercodia,Upssala,Sweden)根据制造商说明书在25μl血浆中确定血浆胰岛素浓度。
使用ELISA试剂盒(E99-103,Bethyl Laboratories,Montgomery,TX)确定粪便IgA水平。将新收集的粪便在-80℃冷冻,然后在50mM Tris(pH 7.4)、0.14M NaCl、1％牛血清白蛋白、0.05％ Tween 20中稀释。使用1/250稀释度通过ELISA依照制造商说明书来测量IgA。
从小鼠盲肠样品分离DNA
将死后收集的小鼠盲肠内容物储存在-80℃。使用QIAamp-DNA粪便小提试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)根据制造商说明书从盲肠内容物提取宏基因组DNA。
内源性大麻素肠内水平的测量
将回肠组织在CHCl3(10ml)中均浆，并且添加氘化标准物。如先前所述产生提取和校准曲线(Muccioli等，Mol Syst Biol,2010,6,392)，并且通过组织样品重量将数据归一化。
qPCR：引物和条件
用于检测嗜粘蛋白阿克曼氏菌的引物和探针基于16S rRNA基因序列：F-嗜粘蛋白阿克曼氏菌CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT(SEQ ID NO:29)、R-嗜粘蛋白阿克曼氏菌CAGCACGTGAAGGTGGGGAC(SEQ ID NO:30)。利用StepOnePlusTM实时PCR系统和软件(Applied Biosystems,Den Ijssel,TheNetherlands)使用Mesa Fast qPCRTM(Eurogentec,Seraing,Belgium)根据制造商说明书实现检测。在同一轮测定中一式两份进行每一测定。然后将每个样品的循环阈值与通过稀释基因组DNA(5倍连续稀释)(DSMZ,Braunshweig,Germany)得到的标准曲线(一式三份进行)进行比较。将数据表示为细菌/g盲肠内容物的对数(Log)。
MIT芯片：PCR引物和条件
使用小鼠肠道芯片(Intestinal Tract Chip)(MIT芯片)分析从盲肠内容物提取的DNA，所述小鼠肠道芯片是由3,580个靶向16S rRNA基因的两个超变区(V1区和V6区)的3,580个不同寡核苷酸探针组成的系统发育微阵列。如先前所述进行MIT芯片的分析(Everard等Diabetes 60,2775-2786(2011)；Geurts等Front Microbiol.2,149(2011))。简单地说，以对应于属样水平的水平2进行微生物群分析。通过如在CANOCO 4.5软件包(Biometris,Wageningen,The Netherlands)中以99个细菌组的平均信号强度(水平2)实施的代表性差异分析(RDA)进行多变量分析。所有环境变量均转换为log(1+X)。使用基于999个随机置换的蒙特卡罗(Monte-Carlo)置换检验来检验显著性。P值<0.05被视为显著的。
血浆胆固醇的测量
通过使用商业试剂盒(DiaSys,Condom,France)测量酯胆固醇酶促水解后存在的胆固醇来测定血浆样品的胆固醇。
统计学分析
数据表示为平均值±s.e.m。使用不成对双尾学生t-检验评价两个组之间的差异。通过ANOVA、之后的Newman-Keuls事后检验来评价涉及超过两个组的数据集。使用皮尔逊相关性分析相关性。根据事后ANOVA统计分析，具有不同上标字母的数据显著不同，P<0.05。使用用于windows的GraphPadPrism 5.00版(GraphPad Software,San Diego,CA,USA)分析数据。当P<0.05时，认为结果是统计学显著的。
结果
我们发现嗜粘蛋白阿克曼氏菌在瘦素缺陷型肥胖症小鼠中的丰度3300倍地低于它们的瘦同胞仔(图1a)。一致地，我们发现其在高脂肪(HF)喂养小鼠中100倍的降低(图1c)。在两种模型中，益生元均完全恢复嗜粘蛋白阿克曼氏菌计数(图1b、图1c)。在HF喂养小鼠中，益生元消除了代谢性内毒素血症(图1d)，使脂肪组织CD11c巨噬细胞亚群正常化(图1e)并且降低了脂肪量(图1g和图3b)。这些结果与嗜粘蛋白阿克曼氏菌显著负相关(图1f和图3a、3c)。然而，仍有待证实这些病症发作的潜在分子机制是否依赖于嗜粘蛋白阿克曼氏菌的缺乏以及相比之下在益生元治疗后的改进是否源于其较高的丰度。
为了解决该问题，在4周期间向对照或HF喂养小鼠口服施用嗜粘蛋白阿克曼氏菌，由此增加嗜粘蛋白阿克曼氏菌(图4a、图4b)。通过使用系统发育微陈列(MIT芯片)(Everard等Diabetes 60,2775-2786(2011)；Geurts等Front Microbiol.2,149(2011))，我们发现HF-饮食和嗜粘蛋白阿克曼氏菌定殖两者均显著地影响肠道微生物群组成内细菌之间的复杂关系，如通过主要组分分析(PCA)(图2a)所显示以及由不同分类群的相对变化所支持。
我们发现嗜粘蛋白阿克曼氏菌治疗使饮食诱导的代谢性内毒素血症、肥胖症和脂肪组织CD11c标记物正常化(图2b、图2c、图2e和图5a)，而无食物摄入的任何变化(图5b)。此外，嗜粘蛋白阿克曼氏菌治疗降低体重并且改善身体组成(即脂肪量/瘦物质量比率)(图5c和图5d)。因此，我们假设嗜粘蛋白阿克曼氏菌会影响脂肪组织代谢，并且发现在HF-饮食下，嗜粘蛋白阿克曼氏菌增加脂肪细胞分化和脂质氧化的标记物的mRNA表达，而不影响脂肪生成(图2f)。总之，这些数据进一步表明嗜粘蛋白阿克曼氏菌控制脂肪储存和脂肪组织代谢。
我们接下来发现嗜粘蛋白阿克曼氏菌的定殖通过与肝葡萄糖-6-磷酸酶表达的40％降低相关的机制完全逆转饮食诱导的空腹高血糖(图6a、图6b)，由此表明降低的糖质新生。值得注意地，胰岛素抵抗指数在治疗后以类似方式降低(图2d)。总之，这些结果表明嗜粘蛋白阿克曼氏菌有助于调节脂肪组织代谢和葡萄糖稳态。一种解释将是嗜粘蛋白阿克曼氏菌在对肠道屏障功能的调节的不同水平中起着关键作用。最近的数据表明肠细胞也通过分泌抗微生物肽、由此决定微生物群落来有助于维持肠道屏障(Pott等，EMBO Rep(2012))。
为了进一步阐明嗜粘蛋白阿克曼氏菌定殖如何影响肠道屏障功能；我们测量了回肠中潘氏(Paneth)细胞和上皮肤细胞的抗细菌标记物的表达。我们发现嗜粘蛋白阿克曼氏菌在对照饮食下增加Reg3g(再生胰岛衍生3-γ，RegIIIγ)表达，而在HF-fed小鼠中没有观察到该作用(图7a)。Pla2g2a,Defa表达在组间类似，而Lyz1表达在细菌施用后趋于较低(图7b、图7c、图7d)。IgA在肠腔中分泌并且已知其限制粘膜细菌渗透(Vaishnava,S.等Science334,255-258(2011))，这里我们发现粪便IgA水平不受治疗影响(图7e)。由此，表明嗜粘蛋白阿克曼氏菌通过涉及其上皮信号传导的其它机制控制肠道屏障功能(Derrien等Front Microbiol 2,166(2011))。我们不排除内源性大麻素系统在该背景下起着关键作用；因为我们发现嗜粘蛋白阿克曼氏菌治疗增加2-油酰基甘油、2-棕榈酰基甘油的2-花生酰基甘油的肠内水平(图2g)。重要地，2-油酰基甘油已被证明刺激高血糖素样肽-1(GLP-1)从肠L-细胞的释放，表明GLP-1和GLP-2两者均可在该背景下改进肠道屏障和葡萄糖稳态(Hansen等J Clin Endocrinol Metab 96,E1409-1417(2011))。此外，2-花生酰基甘油降低肠道渗透性并且2-棕榈酰基甘油(Alhouayek等FASEB J25,2711-2721(2011)；Ben-Shabat等Eur.J.Pharmacol.353,23-31(1998))增强2-花生酰基甘油抗炎作用。因此，很可能，在嗜粘蛋白阿克曼氏菌定殖后观察到的这三种内源性大麻素的增加的水平构成了关联这些代谢特征的分子事件。
最近的证据支持肠道微生物群与粘液层之间的相互作用是影响粘液屏障的生物学的动态系统(Belzer等，ISME J 6,1449-1458(2012)；Johansson等，Proc Natl Acad Sci U S A 108增刊1,4659-4665(2011))。因此，我们研究了嗜粘蛋白阿克曼氏菌定殖对内粘液层厚度的影响。显著地，我们发现HF喂养小鼠中46％薄的粘液层(图2h)，而嗜粘蛋白阿克曼氏菌定殖抵消该降低(图2h)。总之，这些新颖的发现支持粘液层内存在嗜粘蛋白阿克曼氏菌是控制粘液周转的关键机制的观念(Belzer等，ISME J 6,1449-1458(2012))。我们接下来检查了嗜粘蛋白阿克曼氏菌是否还影响结肠上皮细胞中的Reg3g表达。引人注目地，在HF-饮食下，Reg3g表达降低了约50％。嗜粘蛋白阿克曼氏菌完全减弱了该作用并且甚至使Reg3g表达相比于HF喂养小鼠增加了400％(图2i)。因此，这将嗜粘蛋白阿克曼氏菌对结肠而非回肠的定殖与基础免疫机制关联，RegIIIγ通过所述基础免疫机制促进宿主-细菌共生并且调节微生物群与宿主之间的空间关系(Vaishnava,S.等Science334,255-258(2011))。重要的是注意在无菌小鼠中嗜粘蛋白阿克曼氏菌诱导结肠而非回肠中的基因表达(Derrien等Front Microbiol 2,166(2011))。
为了进一步证实嗜粘蛋白阿克曼氏菌是否必须是活的以施加其代谢作用，我们比较了施用活的嗜粘蛋白阿克曼氏菌(2.108个细菌细胞悬浮于200μl无菌无氧磷酸盐缓冲液(PBS)中的细菌细胞)与热杀死/灭活的嗜粘蛋白阿克曼氏菌(高压蒸气灭菌，15分钟，121℃，225kPa)的影响。我们发现活的和代谢活性的嗜粘蛋白阿克曼氏菌以与第一组实验中观察到的类似的程度抵消饮食诱导的代谢性内毒素血症、脂肪量发展和改变的脂肪组织代谢(图8A、图8B、图8D和图9A)。重要地，在施用热灭活的嗜粘蛋白阿克曼氏菌后没有观察到这些作用(图8A、图8B、图8D和图9A)。另外，我们发现代谢活性的嗜粘蛋白阿克曼氏菌显著地降低口服葡萄糖耐量测试后的血浆葡萄糖水平(图8C)，而热灭活的嗜粘蛋白阿克曼氏菌展现与HF喂养小鼠类似的葡糖耐受不良(图8C)。最后，我们确认，代谢活性的嗜粘蛋白阿克曼氏菌恢复服用HF-饮食后的粘液层厚度，而我们发现，与HF相比，热灭活的嗜粘蛋白阿克曼氏菌未改善粘液层厚度(图8E和图8F)。值得注意的是，我们发现，从嗜粘蛋白阿克曼氏菌治疗小鼠的盲肠和结肠内容物中恢复的代谢活性的嗜粘蛋白阿克曼氏菌是HF和热灭活的细菌组的100倍(HF-Akk：9.5+/-1.02Log10细胞/mg内容物，HF和HF-K-Akk：6.8+/-0.51Log10细胞/mg内容物，P＝0.0059)，由此证明嗜粘蛋白阿克曼氏菌在口服施用后的活力。
因此，这些结果证实HF饮食诱导的肥胖症与肠道微生物群组成的变化相关，然而，回肠中的抗微生物肽不受治疗影响。相比之下，结肠上皮细胞中的Reg3g表达在HF和热灭活的嗜粘蛋白阿克曼氏菌治疗小鼠中显著地降低了约50％，而代谢活性的嗜粘蛋白阿克曼氏菌治疗完全减弱了该作用并且增加了服用HF饮食后的Reg3g表达(图9B)。
我们然后想要测试嗜粘蛋白阿克曼氏菌施用是否在延长的高脂饮食治疗(8周)期间仍然有效以及施用嗜粘蛋白阿克曼氏菌每周3次(而非每日一次)是否足以保护免于饮食诱导的肥胖症。嗜粘蛋白阿克曼氏菌的制剂以及剂量类似于使用每日经口管饲代谢灭活的嗜粘蛋白阿克曼氏菌的方案中所呈现的那些。
我们发现，尽管小鼠正在摄取高脂饮食，但嗜粘蛋白阿克曼氏菌治疗仍将体重增加减少了约30％(图10A)，而且在它们的粪便中无任何脂肪损失并且无任何食物摄取行为的变化。这还与脂肪组织重量(皮下脂肪组织)的约45％的降低(图10B)以及内脏脂肪库(肠系膜脂肪库和附睾脂肪库)的35％的减少(图10C)相关。因此，这组数据支持以下事实：嗜粘蛋白阿克曼氏菌的施用在延长治疗期间保持有效，并且如果嗜粘蛋白阿克曼氏菌每周3次而非每日一次被施用，所述治疗仍然有效。
为了确认这些结果是嗜粘蛋白阿克曼氏菌所特有的，我们然后用益生菌(即植物乳杆菌WCFS1)治疗HF喂养的小鼠。我们发现植物乳杆菌的施用不改变脂肪量发展、脂肪组织代谢、粘液层厚度、结肠Reg3g mRNA和代谢性内毒素血症(图12A-E)。
高胆固醇血症被称为参与心血管疾病的关键因素。因此，我们测试了嗜粘蛋白阿克曼氏菌施用对喂养高脂饮食的小鼠的血浆胆固醇的作用。如图11中所示，嗜粘蛋白阿克曼氏菌治疗显著地降低(约15％)血浆胆固醇，由此在LPS和其它代谢参数方面有助于改善心脏代谢风险概况。
总之，我们的发现不仅对于嗜粘蛋白阿克曼氏菌借以调节宿主与肠道微生物群之间的串扰(crosstalk)的错综复杂的机制提供了实质性见解，而且还为考虑研发一种使用该人粘液定殖物(colonizer)用于预防或治疗肥胖和相关代谢病症(例如，高胆固醇血症)的治疗提供了理论依据。

Claims (17)

1.用于治疗有需要的受试者的代谢病症的用于应用的嗜粘蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)或其片段。
2.根据权利要求1所述的用于治疗代谢病症的用于应用的嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段，其中所述代谢病症是肥胖症。
3.根据权利要求1所述的用于治疗代谢病症的用于应用的嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段，其中所述代谢病症选自包含以下各项的组：代谢综合征、胰岛素缺乏或胰岛素抵抗相关的病症、糖尿病(例如，2型糖尿病)、葡糖耐受不良、异常脂质代谢、动脉粥样硬化、高血压、心脏病、中风、非酒精性脂肪肝病、高血糖症、肝性脂肪变性、血脂异常、与超重和肥胖症相关的免疫系统功能障碍、心血管疾病、高胆固醇、升高的甘油三酸酯、哮喘、睡眠呼吸暂停、骨关节炎、神经变性、胆囊疾病、X综合征、炎症性和免疫性病症、致动脉粥样化性血脂异常和癌症。
4.用于增加受试者的能量消耗的嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段，优选地不影响所述受试者的食物摄入。
5.用于增加受试者的饱腹感的嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的用于应用的嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段，其中向有需要的所述受试者施用嗜粘蛋白阿克曼氏菌的活细胞。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的用于应用的嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段，其中嗜粘蛋白阿克曼氏菌被口服施用。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的用于应用的嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段，其中向所述受试者施用在约1.104cfu到约1.1012cfu、更优选约1.105cfu到约1.1011cfu且甚至更优选约1.106cfu到约1.1010cfu范围的量的嗜粘蛋白阿克曼氏菌。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的用于应用的嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段，其中嗜粘蛋白阿克曼氏菌至少每周三次被施用。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的用于应用的嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段，其中嗜粘蛋白阿克曼氏菌与另一益生菌菌株和/或与一种或多种益生元共同施用。
11.一种用于治疗受试者的代谢病症或用于增加受试者的能量消耗或用于增加受试者的饱腹感的用于应用的组合物，其包含根据权利要求1-10中任一项所述的嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段以及赋形剂。
12.根据权利要求11所述的用于应用的组合物，其中所述组合物是营养组合物。
13.根据权利要求11或12所述的用于应用的组合物，其中所述组合物被口服施用。
14.一种用于治疗受试者的代谢病症或用于增加受试者的能量消耗或用于增加受试者的饱腹感的药物组合物，其包含根据权利要求1-10中任一项所述的嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段以及药学上可接受的媒介物。
15.一种用于治疗受试者的代谢病症或用于增加受试者的能量消耗或用于增加受试者的饱腹感的药剂，其包含根据权利要求1-10中任一项所述的嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段。
16.嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段用于促进有需要的受试者的重量减轻的用途。
17.一种包含嗜粘蛋白阿克曼氏菌或其片段的美容组合物，其用于促进有需要的受试者的重量减轻。
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