CN105176822B - 一种人类肠道益生菌的优化分离方法 - Google Patents

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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Abstract

本发明提出了一种人类肠道益生菌的优化分离方法，包括以下步骤：步骤一，基础培养基的制备：制备粘蛋白液体培养基和粘蛋白固体培养基；步骤二：筛选：收集粪便标本并接种于所述粘蛋白液体培养基中，厌氧培养得到菌液，取菌液作为模板进行PCR实验，挑选PCR反应阳性管中的菌液接种于粘蛋白固体培养基上厌氧培养出菌落，将粘蛋白固体培养基上的菌落接种于巧克力平板上厌氧培养出菌落，将巧克力平板上的菌落接种于哥伦比亚血平板上进行纯化培养出菌落，取哥伦比亚血平板上的菌落通过16sRNA通用引物进行PCR测序验证，分离出人类肠道益生菌。本发明的人类肠道益生菌的优化分离方法实用、简单、直观和便捷。

Description

一种人类肠道益生菌的优化分离方法
技术领域
本发明涉及人类肠道微生物分离领域，特别是指一种人类肠道益生菌的优化分离方法。
背景技术
益生菌与人体健康密切相关。目前在微生物领域还未有成熟且便捷的分离纯化益生菌的方法。2004年欧洲分离出第一株C-IFH菌株并命名为Akkermansia muciniphila,此菌在欧洲成人定值率约100％，具有明显的减肥降糖作用。他们分离此菌使用的方法复杂，所设计的技术较繁琐且昂贵，故后续此菌其它亚型的纯菌至今未见报道。如何快速分离纯化此类相关细菌成为探索C-IFH菌与疾病的相关性的关键技术突破点。
发明内容
本发明提出一种人类肠道益生菌的优化分离方法，解决了益生菌分离速度慢的难题。
本发明的技术方案是这样实现的：一种人类肠道益生菌的优化分离方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一，基础培养基的制备：制备粘蛋白液体培养基和粘蛋白固体培养基；
步骤二：筛选：收集粪便标本并接种于所述粘蛋白液体培养基中厌氧培养得到菌液，取菌液作为模板进行PCR实验，挑选PCR反应阳性管中的菌液接种于粘蛋白固体培养基上厌氧培养出菌落，将粘蛋白固体培养基上的菌落接种于巧克力平板上厌氧培养出菌落，将巧克力平板上的菌落接种于哥伦比亚血平板上进行纯化培养出菌落，取哥伦比亚血平板上的菌落通过16sRNA通用引物进行PCR测序验证，分离出人类肠道益生菌。
优选的，所述粘蛋白液体培养基及所述粘蛋白固体培养基中的粘蛋白为纯化后的粘蛋白。
优选的，所述PCR实验所用的PCR反应液包括引物一和引物二；其中，引物一的序列为CAGCACGTGAAGGTGGGGAC，其中，引物二的序列为CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT。
优选的，粪便标本接种于所述粘蛋白液体培养基中厌氧培养的温度为37℃，时间为4天。
优选的，菌液接种于粘蛋白固体培养基上厌氧培养的温度为37℃，时间为3天。
优选的，将粘蛋白固体培养基上的菌落接种于巧克力平板上厌氧培养的温度为37℃，时间为2天.
优选的，将巧克力平板上的菌落接种于哥伦比亚血平板上进行纯化培养的重复次数为3次，每次培养的温度为37℃，时间为5天。
优选的，所述纯化后的粘蛋白是通过以下方法对粘蛋白进行纯化：
步骤一，试剂准备：
无水乙醇(4℃预冷)；
A液：无水NaH2PO40.2g；Na2HPO4·12H2O 7g；NaCL 6g；调节pH为7.8，定容到1000ml，高压125℃30min，常温保存；
B液：NaCL 5.85g；调节pH为7.0，定容到1000ml，高压125℃30min，常温保存；
步骤二：称取粘蛋白粉末10-15g，加入到500ml A液的烧瓶中，在磁力搅拌器上均匀搅拌2h后，用1M氢氧化钠调整溶液pH为7.2±0.2，滴加500-1000ul甲苯，继续在磁力搅拌器上均匀搅拌18h，3000rpm离心10min，收集上清至另一高压过的烧瓶中，弃去沉淀，向溶液中加入预冷的无水乙醇，使其浓度约为60％。4℃冰箱中放置30min，3000rpm离心10min，收集沉淀，弃掉上清，将沉淀溶于200ml B液中，搅拌6h后，3000rpm离心10min，收集上清至另一高压过的烧瓶中，弃去沉淀，向溶液中加入预冷的无水乙醇，使其浓度约为60％。4℃冰箱中放置30min，3000rpm离心10min，收集沉淀，弃掉上清，将沉淀溶于100ml蒸馏水中，4℃密封保存。
优选的，所述粘蛋白液体培养基的制备方法如下：
试剂准备：
酸性微量元素：FeCL2·4H2O 1.491g；H3BO40.06g；ZnCL20.068g；CuCL2·7H2O0.1725g；MnCL20.0635g；CoCL2·6H2O 0.0119g；NiCL2·6H2O 0.0235g；37％HCL 4.18ml,蒸馏水定容到100ml；
碱性微量元素：Na2SeO30.01729g；Na2MoO4·2H2O 0.0242g；NaOH 0.4g，蒸馏水定容到100ml；
维生素液：生物素0.02g；Vit B3 0.21；Vit B6 0.5g；Vit B2 0.1g；Vit B1 0.2g；Vit B12 0.25g；泛酸0.1g，蒸馏水定容到100ml；
1液：CaCL2 1.1g；MgCL2 1.0g；酸性微量元素1ml；碱性微量元素1ml，蒸馏水定容到100ml，高压125℃30min，常温密封保存；
2液：Na2HPO4 5.3g；NaCL 3g；KH2PO4 4g，蒸馏水定容到100ml，高压125℃30min，常温密封保存；
3液：NaHCO3 2g；维生素液2ml，定容到100ml，0.22μm滤膜过滤，4℃密封保存；
4液：Na2S 2.5g,蒸馏水定容到100ml，0.22μm滤膜过滤，4℃密封保存；
取200ml无菌蒸馏水盛于高压过的广口瓶中，在超净工作台中加入2ml的1液、2ml的2液、1ml的3液、2ml的4液及纯化后的粘蛋白溶液30-40ml，每加入一种液体后需摇匀，用电动移液器吸取5ml的液体分装于15ml的离心管中，盖紧管盖，4℃密封保存。
优选的，所述粘蛋白固体培养基制备方法如下：
试剂准备：
酸性微量元素：FeCL2·4H2O 1.491g；H3BO4 0.06g；ZnCL2 0.068g；CuCL2·7H2O0.1725g；MnCL2 0.0635g；CoCL2·6H2O 0.0119g；NiCL2·6H2O 0.0235g；347％HCL 4.18ml,蒸馏水定容到100ml；
碱性微量元素：Na2SeO3 0.01729g；Na2MoO4·2H2O 0.0242g；NaOH 0.4g，蒸馏水定容到100ml；
维生素液：生物素0.02g；Vit B3 0.21；Vit B6 0.5g；Vit B2 0.1g；Vit B1 0.2g；Vit B12 0.25g；泛酸0.1g，蒸馏水定容到100ml；
1液：CaCL2 1.1g；MgCL2 1.0g；酸性微量元素1ml；碱性微量元素1ml，蒸馏水定容到100ml，高压125℃30min，常温密封保存；
2液：Na2HPO4 5.3g；NaCL 3g；KH2PO4 4g，蒸馏水定容到100ml，高压125℃30min，常温密封保存；
3液：NaHCO3 2g；维生素液2ml，定容到100ml，0.22μm滤膜过滤，4℃密封保存；
4液：Na2S 2.5g,蒸馏水定容到100ml，0.22μm滤膜过滤，4℃密封保存；
称取2g琼脂(OXIOD，英国)于200ml蒸馏水中，高压125℃30min后，立即在超净工作台中加入2ml的1液、2ml的2液、1ml的3液、2ml的4液及纯化后的粘蛋白溶液30-40ml，每加入一种液体后需摇匀；倒入无菌平皿中，每个平皿20ml；待冷却凝固后置于无菌塑料袋内，4℃密封保存。
本发明的有益效果为：本发明的人类肠道益生菌的优化分离方法实用、简单、直观和便捷。此方法通过普通PCR方法为指导，经过三次选择性培养基的筛选，最后能直观的在巧克力培养基上识别并挑选出益生菌菌落。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一种人类肠道益生菌的优化分离方法中粘蛋白纯化前后的对不同波长的吸光度；
图2为本发明一种人类肠道益生菌的优化分离方法中粘蛋白液体培养基的示意图；
图3为本发明一种人类肠道益生菌的优化分离方法中粘蛋白固体培养基的示意图；
图4为本发明一种人类肠道益生菌的优化分离方法中菌液进行PCR实验后的PCR产物凝胶成像的结果示意图；
图5为本发明一种人类肠道益生菌的优化分离方法中巧克力平板上的菌落挑选示意图；
图6为本发明一种人类肠道益生菌的优化分离方法中哥伦比亚血平板上的培养出的菌落形态的示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
发明人根据本发明提供的内容对人类肠道益生菌进行优化分离，具体分离方法如下：
步骤一，基础培养基的制备：制备粘蛋白液体培养基和粘蛋白固体培养基，其中粘蛋白液体培养基及粘蛋白固体培养基中的粘蛋白为纯化后的粘蛋白，其中，粘蛋白的纯化方法如下：
试剂准备：
无水乙醇(4℃预冷)；
A液：无水NaH2PO40.2g；Na2HPO4·12H2O 7g；NaCL 6g；调节pH为7.8，定容到1000ml，高压125℃30min，常温保存；
B液：NaCL 5.85g；调节pH为7.0，定容到1000ml，高压125℃30min，常温保存；
称取粘蛋白粉末10-15g，加入到500ml A液的烧瓶中，在磁力搅拌器上均匀搅拌2h后，用1M氢氧化钠调整溶液pH为7.2±0.2，滴加500-1000ul甲苯，继续在磁力搅拌器上均匀搅拌18h，3000rpm离心10min，收集上清至另一高压过的烧瓶中，弃去沉淀，向溶液中加入预冷的无水乙醇，使其浓度约为60％。4℃冰箱中放置30min，3000rpm离心10min，收集沉淀，弃掉上清，将沉淀溶于200ml B液中，搅拌6h后，3000rpm离心10min，收集上清至另一高压过的烧瓶中，弃去沉淀，向溶液中加入预冷的无水乙醇，使其浓度约为60％，4℃冰箱中放置30min，3000rpm离心10min，收集沉淀，弃掉上清，将沉淀溶于100ml蒸馏水中，4℃密封保存。纯化后的粘蛋白去掉了不溶杂质，浓度明显增高。纯化后粘蛋白在A230处出现了盐峰。如图1所示。
步骤二：筛选：
粘蛋白液体培养基和粘蛋白固体培养基的制作。
试剂准备：
酸性微量元素：FeCL2·4H2O 1.491g；H3BO4 0.06g；ZnCL2 0.068g；CuCL2·7H2O0.1725g；MnCL2 0.0635g；CoCL2·6H2O 0.0119；NiCL2·6H2O 0.0235g；HCL 4.18ml,蒸馏水定容到100ml；
碱性微量元素：Na2SeO3 0.01729g；Na2MoO4·2H2O 0.0242g；NaOH 0.4g，蒸馏水定容到100ml；
维生素液：生物素0.02g；Vit B3 0.21；Vit B6 0.5g；Vit B2 0.1g；Vit B1 0.2g；Vit B12 0.25g；泛酸0.1g，蒸馏水定容到100ml；
1液：CaCL2 1.1g；MgCL2 1.0g；酸性微量元素1ml；碱性微量元素1ml，蒸馏水定容到100ml，高压125℃30min，常温密封保存；
2液：Na2HPO4 5.3g；NaCL 3g；KH2PO4 4g，蒸馏水定容到100ml，高压125℃30min，常温密封保存；
3液：NaHCO3 2g；维生素液2ml，定容到100ml，0.22μm滤膜过滤，4℃密封保存；
4液：Na2S 2.5g,蒸馏水定容到100ml，0.22μm滤膜过滤，4℃密封保存；
粘蛋白液体培养基的制作：取200ml无菌蒸馏水盛于高压过的广口瓶中，在超净工作台中加入2ml的1液、2ml的2液、1ml的3液、2ml的4液及纯化后的粘蛋白溶液30-40ml，每加入一种液体后需摇匀，用电动移液器吸取5ml的液体分装于15ml的离心管中，盖紧管盖，4℃密封保存。如图2所示。
粘蛋白固体培养基的制作：称取2g琼脂(OXIOD，英国)于200ml蒸馏水中，高压125℃30min后，立即在超净工作台中加入2ml的1液、2ml的2液、1ml的3液、2ml的4液及纯化后的粘蛋白溶液30-40ml，每加入一种液体后需摇匀；倒入无菌平皿中，每个平皿20ml；待冷却凝固后置于无菌塑料袋内，4℃密封保存。如图3所示。粘蛋白固体培养基应当平整、半透膜、呈云雾状，厚度约为5mm。
(一)粪便标本的收集：
收集正常人粪便标本1-2g，立即接种于粘蛋白液体培养基中，进行10倍稀释，由10-1稀释到10-6，做好标记，立即置于37℃厌氧手套箱中培养4天。注意在厌氧箱中将盖帽拧松，以便气体进行交换。
(二)粘蛋白液体培养基的选择鉴定：
1、摇匀培养基中的液体，将所有粘蛋白液体培养基在厌氧环境下分别吸取200μL的菌液置于无菌的1.5ml的EP管中，并做好标记。
2、将EP管置于金属浴中100℃放置15min。依此为模板进行后续的PCR实验。
3、按照以下浓度配制PCR反应液：
特异引物1：CAGCACGTGAAGGTGGGGAC
特异引物2：CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT
4、按照以下程序进行PCR反应
5、PCR产物凝胶成像
吸取10μl产物进行电泳，135V 35min。进行凝胶成像，若在300bp左右有明显条带即视为阳性，如图4，阳参使用的是ATCC BAA-835标准菌株。
(三)接种于粘蛋白平板：
1、挑选PCR反应阳性管，丢弃阴性管。每个标本选取最高稀释度阳性管进行下一步的实验。
2、在厌氧环境中摇匀菌液，并用一次性接种环(2μl)将菌液接种在粘蛋白平板上，每个平板通过连续划线法分为6-8个区。
3、37℃厌氧培养3天。
(四)接种于巧克力平板：
1、直接从粘蛋白平板上挑取菌落一环，并接种于巧克力平板上，每个平板可以连续划线4区。
2、37℃厌氧培养2天后进行观察，挑选在菌落之间散在的较为细小的菌落，接种于哥伦比亚血平板上。具体菌落形态如图5。挑取菌落时，挑取夹杂在大湿菌落菌落之间或者独立存在的凸起、圆形、湿性、边缘平整的白色小菌落。如箭头所示。
(五)在哥伦比亚血平板上进行纯化：
挑选单个菌落在哥伦比亚血平板上进行纯化培养，约5天后再挑选单个菌落进行培养，如此3次。最终得到纯化后的凸起、圆形、白色、半透明小菌落，见图6。
(六)再次通过特异引物进行PCR验证：
使用菌落PCR方法进行验证，具体方法如上述，模板使用一环菌落代替。
(七)通过16sRNA通用引物进行测序验证：
引物1:1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT
引物2:27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCA
按照以下程序进行PCR反应：
PCR产物凝胶成像：
吸取10μl产物进行电泳，135V 35min。进行凝胶成像，若在1500bp左右有明显条带即视为阳性。进行测序验证，通过Blast后确认是否分离出类似的益生菌C-IFH。
后续发明人从200多人粪便标本中成功分离出38株C-IFH菌株，C-IFH菌在中国人群众的分离成功率约为20％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种人类肠道益生菌的优化分离方法，其特征在于包括以下步骤：步骤一，基础培养基的制备：制备粘蛋白液体培养基和粘蛋白固体培养基；
步骤二：筛选：收集粪便标本并接种于所述粘蛋白液体培养基中厌氧培养得到菌液，取菌液作为模板进行PCR实验，挑选PCR反应阳性管中的菌液接种于粘蛋白固体培养基上厌氧培养出菌落，将粘蛋白固体培养基上的菌落接种于巧克力平板上厌氧培养出菌落，将巧克力平板上的菌落接种于哥伦比亚血平板上进行纯化培养出菌落，取哥伦比亚血平板上的菌落通过16S RNA通用引物进行PCR测序验证，分离出人类肠道益生菌；
所述粘蛋白液体培养基的制备方法如下：
试剂准备：
酸性微量元素：FeCl2·4H2O 1.491g；H3BO4 0.06g；ZnCl2 0.068g；CuCl2·7H2O0.1725g；MnCl2 0.0635g；CoCl2·6H2O 0.0119g；NiCl2·6H2O 0.0235g；HCl 4.18ml，蒸馏水定容到100ml；
碱性微量元素：Na2SeO3 0.01729g；Na2MoO4·2H2O 0.0242g；NaOH 0.4g，蒸馏水定容到100ml；
维生素液：生物素0.02g；Vit B3 0.21g；Vit B6 0.5g；Vit B2 0.1g；Vit B1 0.2g；VitB12 0.25g；泛酸0.1g，蒸馏水定容到100ml；
1液：CaCl2 1.1g；MgCl2 1.0g；酸性微量元素1ml；碱性微量元素1ml，蒸馏水定容到100ml，高压125℃30min，常温密封保存；
2液：Na2HPO4 5.3g；NaCl 3g；KH2PO4 4g，蒸馏水定容到100ml，高压125℃30min，常温密封保存；
3液：NaHCO3 2g；维生素液2ml，定容到100ml，0.22μm滤膜过滤，4℃密封保存；
4液：Na2S 2.5g,蒸馏水定容到100ml，0.22μm滤膜过滤，4℃密封保存；
取200ml无菌蒸馏水盛于高压过的广口瓶中，在超净工作台中加入2ml的1液、2ml的2液、1ml的3液、2ml的4液及纯化后的粘蛋白溶液30-40ml，纯化后的粘蛋白溶液在A230处出现盐峰，吸光度为0.42，每加入一种液体后需摇匀，用电动移液器吸取5ml的液体分装于15ml的离心管中，盖紧管盖，4℃密封保存；
所述粘蛋白固体培养基制备方法如下：
试剂准备：
酸性微量元素：FeCl2·4H2O 1.491g；H3BO4 0.06g；ZnCl2 0.068g；CuCl2·7H2O0.1725g；MnCl2 0.0635g；CoCl2·6H2O 0.0119g；NiCl2·6H2O 0.0235g；HCl 4.18ml,蒸馏水定容到100ml；
碱性微量元素：Na2SeO3 0.01729g；Na2MoO4·2H2O 0.0242g；NaOH 0.4g，蒸馏水定容到100ml；
维生素液：生物素0.02g；Vit B3 0.21g；Vit B6 0.5g；Vit B2 0.1g；Vit B1 0.2g；VitB12 0.25g；泛酸0.1g，蒸馏水定容到100ml；
1液：CaCl2 1.1g；MgCl2 1.0g；酸性微量元素1ml；碱性微量元素1ml，蒸馏水定容到100ml，高压125℃30min，常温密封保存；
2液：Na2HPO4 5.3g；NaCl 3g；KH2PO4 4g，蒸馏水定容到100ml，高压125℃30min，常温密封保存；
3液：NaHCO3 2g；维生素液2ml，定容到100ml，0.22μm滤膜过滤，4℃密封保存；
4液：Na2S 2.5g,蒸馏水定容到100ml，0.22μm滤膜过滤，4℃密封保存；
称取2g琼脂于200ml蒸馏水中，高压125℃30min后，立即在超净工作台中加入2ml的1液、2ml的2液、1ml的3液、2ml的4液及纯化后的粘蛋白溶液30-40ml，纯化后的粘蛋白溶液在A230处出现盐峰，吸光度为0.42，每加入一种液体后需摇匀；倒入无菌平皿中，每个平皿20ml；待冷却凝固后置于无菌塑料袋内，4℃密封保存。
2.如权利要求1所述的人类肠道益生菌的优化分离方法，其特征在于：所述PCR实验所用的PCR反应液包括引物一和引物二；其中，引物一的序列为CAGCACGTGAAGGTGGGGAC，其中，引物二的序列为CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT。
3.如权利要求1所述的人类肠道益生菌的优化分离方法，其特征在于：粪便标本接种于所述粘蛋白液体培养基中厌氧培养的温度为37℃，时间为4天。
4.如权利要求1所述的人类肠道益生菌的优化分离方法，其特征在于：菌液接种于粘蛋白固体培养基上厌氧培养的温度为37℃，时间为3天。
5.如权利要求1所述的人类肠道益生菌的优化分离方法，其特征在于：将粘蛋白固体培养基上的菌落接种于巧克力平板上厌氧培养的温度为37℃，时间为2天。
6.如权利要求1所述的人类肠道益生菌的优化分离方法，其特征在于：将巧克力平板上的菌落接种于哥伦比亚血平板上进行纯化培养的重复次数为3次，每次培养的温度为37℃，时间为5天。
7.如权利要求1所述的人类肠道益生菌的优化分离方法，其特征在于：所述纯化后的粘蛋白是通过以下方法对粘蛋白进行纯化：步骤一，试剂准备：4℃预冷无水乙醇；
A液：无水NaH2PO4 0.2g；Na2HPO4·12H2O 7g；NaCl 6g；调节pH为7.8，定容到1000ml，高压125℃30min，常温保存；
B液：NaCl 5.85g；调节pH为7.0，定容到1000ml，高压125℃30min，常温保存；
步骤二：称取粘蛋白粉末10-15g，加入到500ml A液的烧瓶中，在磁力搅拌器上均匀搅拌2h后，用1M氢氧化钠调整溶液pH为7.2±0.2，滴加500-1000μl甲苯，继续在磁力搅拌器上均匀搅拌18h，3000rpm离心10min，收集上清至另一高压过的烧瓶中，弃去沉淀，向溶液中加入预冷的无水乙醇，使其浓度为60％，4℃冰箱中放置30min，3000rpm离心10min，收集沉淀，弃掉上清，将沉淀溶于200ml B液中，搅拌6h后，3000rpm离心10min，收集上清至另一高压过的烧瓶中，弃去沉淀，向溶液中加入预冷的无水乙醇，使其浓度为60％，4℃冰箱中放置30min，3000rpm离心10min，收集沉淀，弃掉上清，将沉淀溶于100ml蒸馏水中，4℃密封保存。
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