CN105821100A - 一种连续发酵与分离耦合实现高产多抗菌素的工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种连续发酵与分离耦合实现高产多抗菌素的工艺，将多抗菌素生产菌种子液接入到发酵罐中进行发酵培养；当发酵到对数生长期后期时，启动发酵罐中的膜过滤器，含有多抗菌素的发酵液透过膜过滤器进入到发酵罐外的分离装置，搜集得到发酵液A，菌体细胞被截留在发酵罐内继续发酵；在启动发酵罐中的膜过滤器的同时，向发酵罐中流加氮源培养基，维持发酵罐内稳态的发酵体系，连续发酵至结束，搜集得到发酵液B；将发酵液A和B进入下一步精制、纯化处理得到多抗菌素。本发明不仅解除了发酵过程中产物抑制，降低了发酵液的黏度，而且能够缩短发酵周期，提高产品效价。通过流加装置和分离装置实现连续发酵和分离的耦合，提高设备利用率，降低生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种发酵分离耦合控制的方法，属于生物工程领域，特别涉及一种连续发酵与分离耦合实现高产多抗菌素的工艺。
背景技术
多抗菌素(Polyoxins)又被称为多效霉素、多氧霉素、多抗霉素，是由可可链霉菌阿苏变种、金色产色链霉菌产生的次级代谢产物，是一种肽嘧啶核苷类农用抗生素。研究发现，多抗菌素是由结构相关的14个组分(PolyoxinsA-N)组成。他们没有固定的熔点，在200℃左右逐渐分解，且易溶于水，难溶于丙酮、乙醇和乙醚等有机试剂。在pH2.5-3.0的酸性条件下稳定，在碱性条件下不稳定，对紫外光稳定。
当前，植物病害在全球范围内每年造成高达数千亿美元损失，而其中又以真菌病害最为严重。多抗菌素作为一种广谱性抗生素，具有良好的内吸性及高度的靶标生物选择性，其作用机理是抑制几丁质合成酶的催化作用，导致真菌细胞壁的组成成分几丁质不能合成而起到杀菌作用。由于一般农作物和哺乳动物体内没有几丁质成分，因此多抗菌素对人畜安全，无累积作用，无“三致作用”(致突变、致畸、致癌)。对防治灰霉病、霜霉病、叶霜病、早疫病、枯萎病等多种真菌性病害具有优良的作用，已成为国内外杀菌、除虫的一线药物之一。
目前多抗菌素的生产主要为微生物发酵法，然而在微生物发酵生产过程中，多抗菌素及代谢产物对细胞的生长特别是产物合成具有显著的抑制作用，从而导致发酵效价不高和产物转化率低，限制了其抑菌效果。发酵分离耦合过程是指发酵和分离同时进行的两个过程，广义地也可以理解为将一系列分离器和发酵罐集成于一体的操作。这能接触产物抑制，提高多抗菌素生物效价，提高产物转化率，降低生产成本，缩短发酵周期，降低能耗。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种连续发酵与分离耦合实现高产多抗菌素的工艺，以解决产物抑制导致的多抗菌素发酵效价低，周期长等问题。
为解决上述技术难题，本发明采用的技术方案如下：一种连续发酵与分离耦合实现高产多抗菌素的工艺，其具体步骤如下：
(1)将多抗菌素生产菌种子液接入到装有发酵培养基的发酵罐中，在适宜的发酵条件下进行发酵培养；
(2)当发酵到对数生长期后期时，启动发酵罐中的膜过滤器，含有多抗菌素的发酵液透过膜过滤器进入到发酵罐外的分离装置，搜集得到发酵液A，菌体细胞被截留在发酵罐内继续发酵；
(3)在步骤(2)启动发酵罐中的膜过滤器的同时，向发酵罐中流加氮源培养基，维持发酵罐内稳态的发酵体系(是指发酵过程中培养基的体积保持不变)，连续发酵生产多抗菌素，直至发酵结束，搜集得到发酵液B；
(4)将步骤(2)和步骤(3)搜集得到的发酵液A和B进入下一步精制、纯化处理，最终得到多抗菌素。
优选步骤(1)中的多抗菌素生产菌种子液由以下步骤制得：
A、菌种活化：挑取金色产色链霉菌NJYHYWG66302的单菌落接种于液体种子培养基中，于28-30℃，摇床培养36-48h，得到活化后菌液；
B、种子培养：将活化后的菌液按照2-3％的体积比接入到液体种子培养基中，于28-30℃，摇床培养36-48h，得到种子液。
优选步骤A和B中的液体种子培养基的组分均为：蔗糖12-15g/L，酵母膏8-10g/L，KH2PO40.2-0.4g/L，CaCO30.1-0.2g/L。
优选步骤(1)中多抗菌素产生菌为自主筛选的金色产色链霉菌NJYHYWG66302，保藏日期是2012年2月14日，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.5756。
优选步骤(1)中多抗菌素生产菌种子液接种量与发酵培养基体积比为5-8％。
优选步骤(1)中的发酵培养基组分为：蔗糖17-19g/L，酵母膏18-20g/L，KH2PO40.5-0.7g/L，CaCO30.2-0.3g/L。
优选步骤(1)中的发酵条件为：温度28-30℃，搅拌转速200-250rpm，通气量为2-4vvm。
优选步骤(2)中的多抗菌素发酵生长对数期为24-78h，其后期为发酵70-78h。
优选步骤(2)中的膜过滤器为微滤膜，膜孔径为0.5-1μm，运行压力为0.01-0.02MPa；步骤(2)中的透过膜分离装置的发酵液体积占发酵总体积的50-70％。
优选步骤(3)中的氮源培养基组分为：酵母膏20-25g/L，KH2PO40.2-0.3g/L，CaCO30.1-0.2g/L。
优选步骤(3)中的连续发酵生产多抗菌素结束时间为145-158h。
优选步骤(4)中精制、纯化步骤包括阳离子交换树脂吸附、凝胶树脂除盐和重结晶。
CGMCCNo.5756菌株具有下述性质：
1、形态特征：
菌株在高氏一号培养基上，菌丝生长好。基丝淡茧黄至污黄，直径约0.5-0.6μm，无隔不断裂；气丝深灰色，直径约0.5-0.6μm；孢子丝紧密螺旋形，3-5圈，每圈6-7个孢子，孢子由横隔分裂而来，呈五边形或四边形，大小0.6-0.8μm。不产生水溶性色素。在电子显微镜下，孢子呈椭形。
2、生理生化特性
金色产色链霉菌CGMCCNo.5756菌株的主要生理生化特征见表1：
表1菌株的生理生化特征
注：+++：富集生长；++：适度生长；+：生长；－：不生长
有益效果：
(1)本发明采用发酵分离耦合方法生产多抗菌素，效价高达5500mg/L以上，转化率达98％以上，达到目前发酵法产多抗菌素的最高水平。
(2)本发明采用发酵分离耦合方法生产多抗菌素，周期缩短45％，能耗降低15％，大大提高了生产效率，降低了生产成本。
保藏信息
上述链霉菌其分类命名为金色产色链霉菌(streptomycesaureochromogenes)，参据的微生物(株)为：NJYHYWG66302，该菌株是本课题组自主筛选并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)。其简称为CGMCC，保藏日期是2012年2月14日，登记入册的编号是CGMCCNo.5756。
具体实施方式
以下结合实例来进一步解释本发明，但实施案例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例一
种子培养基：蔗糖12g/L，酵母膏8g/L，KH2PO40.2g/L，CaCO30.1g/L。从平板培养基中挑取金色产色链霉菌NJYHYWG66302的单菌落接种于液体种子培养基中，28℃摇瓶培养36h，再以2％的接种量接入液体种子培养基，28℃摇瓶培养36h，作为下一步发酵培养的种子液。
发酵培养基：蔗糖17g/L，酵母膏18g/L，KH2PO40.5g/L，CaCO30.2g/L，自然pH。将种子液以5％的接种量接种于发酵培养基中，发酵温度为28℃，转速为200rpm，通气量为2vvm。发酵70h启动膜过滤器，膜孔径为0.5μm，运行压力为0.02MPa，含有多抗菌素的发酵液透过膜过滤器进入到发酵罐外的分离装置，搜集发酵液A，同时向发酵罐内流加氮源培养基，保持罐内培养基体积不变，氮源培养基为：酵母膏20g/L，KH2PO40.2g/L，CaCO30.1g/L，流加体积为总体积的50％，发酵145h结束，搜集发酵液B。将发酵液A和B通过阳离子交换树脂吸附、凝胶树脂除盐和重结晶过程，最终得到多抗菌素效价达5525mg/L。
实施例二
种子培养基：蔗糖13g/L，酵母膏9g/L，KH2PO40.3g/L，CaCO30.1g/L。从平板培养基中挑取金色产色链霉菌NJYHYWG66302的单菌落接种于液体种子培养基中，29℃摇瓶培养40h，再以2％的接种量接入液体种子培养基，29℃摇瓶培养40h，作为下一步发酵培养的种子液。
发酵培养基：蔗糖18g/L，酵母膏19g/L，KH2PO40.6g/L，CaCO30.2g/L，自然pH。将种子液以7％的接种量接种于发酵培养基中，发酵温度为29℃，转速为220rpm，通气量为3vvm。发酵75h启动膜过滤器，膜孔径为0.8μm，运行压力为0.01MPa，含有多抗菌素的发酵液透过膜过滤器进入到发酵罐外的分离装置，搜集发酵液A，同时向发酵罐内流加氮源培养基，保持罐内培养基体积不变，氮源培养基为：酵母膏23g/L，KH2PO40.2g/L，CaCO30.2g/L，流加体积为总体积的60％，发酵150h结束，搜集发酵液B。将发酵液A和B通过阳离子交换树脂吸附、凝胶树脂除盐和重结晶过程，最终得到多抗菌素效价达5638mg/L。
实施例三
种子培养基：蔗糖15g/L，酵母膏10g/L，KH2PO40.4g/L，CaCO30.2g/L。从平板培养基中挑取金色产色链霉菌NJYHYWG66302的单菌落接种于液体种子培养基中，30℃摇瓶培养48h，再以2％的接种量接入液体种子培养基，30℃摇瓶培养48h，作为下一步发酵培养的种子液。
发酵培养基：蔗糖19g/L，酵母膏20g/L，KH2PO40.7g/L，CaCO30.3g/L，自然pH。将种子液以8％的接种量接种于发酵培养基中，发酵温度为30℃，转速为250rpm，通气量为4vvm。发酵78h启动膜过滤器，膜孔径为1.0μm，运行压力为0.01MPa，含有多抗菌素的发酵液透过膜过滤器进入到发酵罐外的分离装置，搜集发酵液A，同时向发酵罐内流加氮源培养基，保持罐内培养基体积不变，氮源培养基为：酵母膏25g/L，KH2PO40.3g/L，CaCO30.2g/L，流加体积为总体积的70％，发酵158h结束，搜集发酵液B。将发酵液A和B通过阳离子交换树脂吸附、凝胶树脂除盐和重结晶过程，最终得到多抗菌素效价达5579mg/L。
Claims (10)
1.一种连续发酵与分离耦合实现高产多抗菌素的工艺，其具体步骤如下：
(1)将多抗菌素生产菌种子液接入到装有发酵培养基的发酵罐中，在适宜的发酵条件下进行发酵培养；
(2)当发酵到对数生长期后期时，启动发酵罐中的膜过滤器，含有多抗菌素的发酵液透过膜过滤器进入到发酵罐外的分离装置，搜集得到发酵液A，菌体细胞被截留在发酵罐内继续发酵；
(3)在步骤(2)启动发酵罐中的膜过滤器的同时，向发酵罐中流加氮源培养基，维持发酵罐内稳态的发酵体系，连续发酵生产多抗菌素，直至发酵结束，搜集得到发酵液B；
(4)将步骤(2)和步骤(3)搜集得到的发酵液A和B进入下一步精制、纯化处理，最终得到多抗菌素。
2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于步骤(1)中的多抗菌素生产菌种子液由以下步骤制得：
A、菌种活化：挑取金色产色链霉菌NJYHYWG66302的单菌落接种于液体种子培养基中，于28-30℃，摇床培养36-48h，得到活化后菌液；
B、种子培养：将活化后的菌液按照2-3％的体积比接入到液体种子培养基中，于28-30℃，摇床培养36-48h，得到种子液。
3.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于步骤A和B中的液体种子培养基的组分均为：蔗糖12-15g/L，酵母膏8-10g/L，KH2PO40.2-0.4g/L，CaCO30.1-0.2g/L。
4.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于步骤(1)中多抗菌素生产菌种子液接种量与发酵培养基体积比为5-8％。
5.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于步骤(1)中的发酵培养基组分为：蔗糖17-19g/L，酵母膏18-20g/L，KH2PO40.5-0.7g/L，CaCO30.2-0.3g/L。
6.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于步骤(1)中的发酵条件为：温度28-30℃，搅拌转速200-250rpm，通气量为2-4vvm。
7.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于步骤(2)中的多抗菌素发酵生长期后期为发酵70-78h。
8.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于步骤(2)中的膜过滤器为微滤膜，膜孔径为0.5-1μm，运行压力为0.01-0.02MPa；步骤(2)中的透过膜分离装置的发酵液体积占发酵总体积的50-70％。
9.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于步骤(3)中的氮源培养基组分为：酵母膏20-25g/L，KH2PO40.2-0.3g/L，CaCO30.1-0.2g/L。
10.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于步骤(3)中的连续发酵生产多抗菌素结束时间为145-158h。
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