CN103834696A

CN103834696A - 一种发酵与膜分离耦合实现连续批次发酵木质纤维素水解液生产乳酸的方法

Info

Publication number: CN103834696A
Application number: CN201310502784.3A
Authority: CN
Inventors: 万印华; 张玉明; 陈向荣; 齐本坤; 沈飞; 苏仪
Original assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Current assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Priority date: 2013-10-23
Filing date: 2013-10-23
Publication date: 2014-06-04
Anticipated expiration: 2033-10-23
Also published as: CN103834696B

Abstract

本发明公开了一种发酵与膜分离耦合，实现连续批次发酵木质纤维素水解液生产乳酸的方法。该方法是以凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）CGMCCC No.7635为发酵菌种，以木质纤维素水解液中混合糖为碳源。本发明针对发酵过程中微生物对己糖和戊糖利用不同步，导致发酵周期延长，产率低等缺点，提出利用膜分离单元与发酵耦合进行细胞回收连续批次发酵，其步骤包括菌种活化，种子培养，发酵培养，超滤膜过滤，细胞回用，批次发酵。采用此方法可以有效缩短发酵周期，提高菌体对己糖和戊糖混合碳源的利用效率。该方法操作条件温和、稳定性好，对微生物利用木质纤维素水解液中混合糖发酵生产生物化工产品具有普遍的指导意义，具有广阔的工业应用前景。

Description

一种发酵与膜分离耦合实现连续批次发酵木质纤维素水解液生产乳酸的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其是涉及一种发酵与膜分离耦合实现连续批次发酵木质纤维素水解液生产乳酸的方法。

背景技术

乳酸是一种重要的有机酸，广泛应用于食品、医药、化工、酿造及纺织等领域，其分子结构中含有一个不对称碳原子，有D和L两种光学异构体。近年来，以乳酸为单体合成的聚乳酸塑料因具有可生物降解特性，被认为是石化塑料的最佳替代品之一。

目前，乳酸主要是由发酵法生产，发酵方式为批次发酵，即每一次发酵都需要培养一级甚至多级种子，种子培养不仅延长了发酵周期，还增加了种子罐等发酵设备的投入。而在大规模发酵过程中，单罐发酵体积越来越大，种子培养体积也相应增大，种子培养过程中的能量消耗不容忽视。为了避免每一批次都要进行的多级种子培养，可将批次发酵得到的菌体细胞作为下一批次发酵的种子，也称之为细胞回收循环发酵。中国专利CN201010148026.2采用离心法进行细胞分离实现细胞回收循环发酵葡萄糖生产乳酸，但是离心法回收细胞存在操作不连续，不能截留发酵液中蛋白质等营养组分等缺点。而膜技术具有高效率、低能耗、过程简单、条件温和、操作方便等特点，并且易于和其他技术集成、便于工业放大，并且能够截留色素、蛋白质，有利于产品的后续分离纯化，与离心等传统分离相比，膜技术应用于细胞循环发酵更具竞争力。中国专利CN200910272524.5报道了一种“间歇式回流细胞高生产率发酵生产有机酸的方法”，但其使用中温菌发酵，整个生产过程需要严格的无菌操作，增加了生产成本，不利于工业放大。

为降低生产成本，利用可再生的木质纤维素资源生产乳酸成为研究热点。木质纤维素的主要成分是纤维素、木质素、半纤维素。木质纤维素中，富含戊糖（木糖、阿拉伯糖为主）的半纤维素组分占到原料干重的20-50%，因此戊糖的利用不同忽视。乳酸杆菌（Lactobacillus）是工业应用的乳酸生产菌，然而，其对戊糖的利用能力十分有限。凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）是一种乳酸发酵新菌种，该菌株不但具备发酵葡萄糖生产乳酸能力，而且戊糖发酵能力也十分突出。凝结芽孢杆菌通过磷酸戊糖（Pentose-Phosphate Pathway,PP）途径代谢木糖，乳酸理论收率为100%。凝结芽孢杆菌具有高温（45～60℃）发酵特性，设备及培养基无需灭菌，生产过程为开放式，极大地降低生产成本。与中温乳酸生产菌种相比，凝结芽孢杆菌更适合于细胞回收循环发酵，因为高温发酵染菌几率低，可保证该工艺长期稳定运行，易于工业放大。然而，凝结芽孢杆菌以己糖戊糖混合液发酵时，存在碳分解代谢物阻遏(carbon catabolite repression,CCR)现象，即先利用葡萄糖，代谢结束后再利用戊糖。因此，菌体不能同步利用木质纤维素水解液中存在的葡萄糖、木糖和阿拉伯糖，导致发酵周期延长，乳酸产率不高。已有报道，使用多级反应器串联发酵，可以提高菌体浓度，能够提高混合糖利用效率。因此，将具有嗜热特性的凝结芽孢杆菌应用于发酵膜分离耦合的细胞回收循环发酵，通过提高生物量的方法提高菌体对混合糖利用效率。同时，高温发酵过程中设备不需灭菌，极大简化了操作工艺，降低了生产成本，这对于细胞循环发酵技术的工业放大具有重大意义。

发明内容

为解决利用木质纤维素水解液中混合糖发酵生产乳酸过程中周期长、产率低等问题，本发明利用发酵与膜分离耦合技术，批次发酵结束后回收细胞循环利用，并补充新鲜培养基，连续批次发酵，达到提高碳源利用速度，提高乳酸产率目的。实现本发明的步骤是：

（1）木质纤维素的糖化：将木质纤维素原料预处理、酶解，并将预处理得到的液体与酶解得到的液体合并，经纳滤技术浓缩，得到木质纤维素水解液；；

（2）以嗜热乳酸生产菌为菌种，以木质纤维素水解液为碳源在一定发酵条件下生产乳酸，培养基无需灭菌，且发酵过程也不需无菌操作；

（3）第一批次发酵结束后，启动与发酵罐耦合的膜分离组件，发酵液经泵输送到超滤膜组件中，得到含有乳酸的透过液，截留的菌体细胞返回发酵罐中，最终将发酵液体积浓缩，其中浓缩液主要为具有发酵能力的菌体细胞；

（4）浓缩液再作为种子培养物接入下一批次发酵培养基中，以与上一批次完全相同的发酵条件继续发酵，然后再对发酵液再次进行超滤操作，获得含有乳酸的透过液及用作下一批次发酵种子培养的浓缩液。如此循环多次，实现木质纤维素水解液的膜耦合连续批次发酵生产乳酸。

本发明所述木质纤维素是玉米秸秆、稻草秸秆、小麦秸秆、甘蔗渣、草类以及阔叶树或针叶树的木屑；木质纤维素预处理方法是稀碱液、稀酸液或者蒸汽爆破方法；纳滤膜组件为卷式、管式或平板式，纳滤膜组件的材料为醋酸纤维素、磺化聚砜、聚酰胺、聚醚砜、磺化聚醚砜、聚哌嗪或聚乙烯醇，纳滤组件的截留分子量为90到400道尔顿之间；最终得到的木质纤维素水解液为己糖（葡萄糖，甘露糖或半乳糖等六碳糖）和戊糖（木糖、阿拉伯糖等五碳糖）的混合物。

本发明使用的嗜热乳酸生产菌为凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）CGMCC No.7635，该菌种于2013年5月23日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，该菌种保藏号为CGMCC No.7635。发酵条件为：温度45～55℃，批次发酵时间20～40h，搅拌转速100～150rpm，使用氢氧化钠、氨水或者碳酸钠控制pH值在6.0～6.5之间。

本发明中超滤膜材料为聚砜、聚砜酰胺、聚酰胺、磺化聚砜、聚丙烯腈、聚氯乙烯、偏聚氯乙烯、聚醚砜或聚醚酮或无机陶瓷膜。膜组件为平板式、管式、卷式或中空纤维式。超滤膜截留分子量在1万到10万道尔顿之间。

本发明发酵及超滤过程为开放式操作，不需无菌操作。每批次发酵结束后，使用超滤膜组件将发酵液浓缩为原始体积的5%～20%，连续发酵批次为5次以上。

本发明具有以下优点：

（1）以木质纤维素为主要原料制备乳酸，显著降低乳酸生产成本，具有广阔的工业应用前景。

（2）采用凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）CGMCC No.7635，一次接种增值，菌体多次重复利用，减少了种子液的制备，同时还实现了菌种驯化效果，使混合糖的利用效率得到显著提高。

（3）菌种经过连续循环批次发酵，得到更多的菌体量，

（4）本发明实现了木质纤维素水解液连续发酵生产乳酸的目的，碳源代谢速度提高，发酵周期明显缩短，乳酸发酵强度显著提高。本过程不需无菌操作，为开放式生产，工艺简单，适合工业放大生产。

附图说明

图1是发酵与膜分离耦合设备示意图。

附图标记

1.碱液罐2.料液罐3.发酵罐4.超滤膜组件5.乳酸粗产品储罐6.进料泵7.阀门

图2是实施例1中开放式细胞循环回收利用小麦秸秆水解液中混合糖发酵生产乳酸的过程图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。本发明所涉及的主题保护范围并非仅限于这些实际例。

实施例1

开放式细胞循环回收利用小麦秸秆水解液中混合糖发酵生产乳酸的方法。

本实施例中所使用的各培养基的组成如下：

MRS培养基（蛋白胨10g/L，牛肉粉10g/L，酵母粉0.5g/L，无水乙酸钠0.5g/L，柠檬酸氢二胺0.2g/L，磷酸氢二钾0.2g/L）。MRS培养基中添加10g/L葡萄糖即为种子培养基。

本实施例具体方法包括以下步骤：

1.小麦秸秆水解液的制备：使用2%（w/v）硫酸121℃处理小麦秸秆粉末90min，固液比1:10，获得的预处理混合物经过滤后得到的液体即为小麦秸秆稀酸水解液。使用纤维素酶酶解稀酸预处理后得到的固体物质（主要组分为纤维素），每克纤维素添加20FPU纤维素酶。酶解条件：50℃、pH5.0、200rpm，酶解时间48h。将小麦秸秆稀酸水解液和酶解液混合，使用截留分子量约为150道尔顿的平板式聚酰胺纳滤膜浓缩，得到含有59.55g/L混合糖（葡萄糖29.72g/L、木糖24.69g/L、阿拉伯糖5.14g/L）的小麦秸秆水解液。

2.种子培养：将凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）CGMCC No.7635接种于种子培养基，摇床振荡培养（100rpm）12小时，培养温度50℃。

3.发酵培养（第1次发酵）：发酵时，向步骤1得到的小麦秸秆水解液中添加20g/L酵母粉得到发酵培养基，发酵培养基不用灭菌。将步骤2得到的种子培养基以5%（v/v）的接种量接种于8L发酵培养基中，发酵罐自动控制发酵条件：52℃，搅拌转速100rpm，培养时间20～40h，结束发酵。培养过程使用40%氢氧化钠自动调节pH值6.0，发酵过程不需要无菌操作。

4.重复批次发酵：第1次发酵结束，启动与发酵罐耦合的膜分离设备，膜组件使用聚丙烯腈（PAN）材料超滤膜，截留分子量为2万道尔顿。待发酵液浓缩至原来体积10%时，即0.8L时超滤操作结束。将超滤浓缩液作为种子培养物，发酵罐中再次加入发酵培养基到8L，继续开始下一批次发酵培养基中，以与第一次发酵完全相同条件进行发酵培养，培养结束后再次启动膜组件，共发酵6批次。

使用高效液相色谱分析发酵液中的糖含量和乳酸产量。分析方法为：使用Bio-rad HPX-87H型色谱柱，柱温50℃，流动相为5mM硫酸，流速0.6mL/min，检测器为岛津RID-10A示差折光检测器检测。

发酵培养基和设备不需要灭菌，操作过程为开放式。发酵过程和结果见图2和表1，由于细胞循环利用，生物量明显提高，葡萄糖代谢速率明显提高，从而也提高了五碳糖利用速率，葡萄糖抑制效应得到缓解。使用膜耦合细胞循环连续批次发酵工艺后，发酵时间由第一批次的50h，缩短为24小时，与第1批次发酵相比，乳酸产率提高了2.14倍。由此可知，发酵与膜分离耦合利用小麦秸秆水解液中混合糖连续批次发酵生产乳酸高效可行，发酵过程稳定，此工艺具有广阔的工业应用前景。

表1膜分离耦合连续批次发酵小麦秸秆水解液

实施例2

开放式细胞循环回收利用甘蔗渣水解液中混合糖发酵生产乳酸的方法。

本实施例中所使用的种子培养基配方与实施例1相同。

本实施例具体方法包括以下步骤：

1.甘蔗渣水解液的制备：甘蔗渣烘干，粉碎成平均大小40目的粉末。甘蔗渣粉末使用氨水蒸汽爆破处理，处理条件为：压力1.5MPa，维持10min，固液比1:6（质量体积比），添加氨水用量为5%。预处理后，固液分离得到预处理液和甘蔗渣固形物（主要组分为纤维素）。使用纤维素酶酶解甘蔗渣固形物，每克纤维素添加20FPU纤维素酶，酶解条件：50℃、pH5.0、200rpm，酶解时间48h。酶解结束后，将预处理液和酶解液合并，使用截留分子量约为100道尔顿的卷式聚酰胺纳滤膜浓缩，得到甘蔗渣水解液，含有56.71g/L混合糖（葡萄糖30.53g/L、木糖17.46g/L、阿拉伯糖8.72g/L）。

2.种子培养：与实施例1相同。

3.发酵培养（第1次发酵）：发酵时，向步骤1得到的甘蔗渣水解液中添加10g/L玉米浆干粉得到发酵培养基，发酵培养基不用灭菌。将步骤2得到的种子培养基以5%（v/v）的接种量接种发酵培养基中进行发酵培养，发酵过程不需要无菌操作，发酵条件同实施例1。培养过程使用氨水自动调节pH值6.5。

4.重复批次发酵：第1次发酵结束，启动与发酵罐耦合的膜分离设备，膜组件使用管式陶瓷超滤膜，截留分子量为10万道尔顿。待发酵液浓缩至原来体积5%时超滤操作结束。将超滤浓缩液作为种子培养物，发酵罐中再次加入发酵培养基到8L，继续开始下一批次发酵培养基中，以与第一次发酵完全相同条件进行发酵培养，培养结束后再次启动膜组件，共发酵8批次。

发酵培养基和设备不需要灭菌，操作过程为开放式。发酵过程间隔时间取样，测定糖、乳酸浓度，方法与实施例1相同。发酵结果表明，经过8个批次连续发酵后乳酸产率提高2.85倍，每一批次乳酸转化率都在0.95g/g以上，说明此工艺稳定高效，具有广阔的工业应用前景。

实施例3

开放式细胞循环回收利用柳枝稷水解液中混合糖发酵生产乳酸的方法。

本实施例中所使用的种子培养基配方与实施例1相同。

1.柳枝稷水解液的制备：柳枝稷烘干，粉碎成平均大小40目的粉末。柳枝稷粉末使用稀酸预处理，条件为：压力135℃，10min，2%（w/v）硫酸，固液比1:8（质量体积比）。预处理后，预处理后，固液分离得到预处理液和柳枝稷固形物（主要组分为纤维素）。使用纤维素酶酶解柳枝稷固形物，每克纤维素添加20FPU纤维素酶，酶解条件：50℃、pH5.0、200rpm，酶解时间48h。酶解结束后，将预处理液和酶解液合并，使用截留分子量约为200道尔顿的卷式聚酰胺纳滤膜浓缩，得到含有66.85g/L混合糖（葡萄糖29.71g/L、木糖30.38g/L、阿拉伯糖6.76g/L）的柳枝稷水解液。

2.种子培养：与实施例1相同。

3.发酵培养（第1次发酵）：发酵时，向步骤1得到的柳枝稷水解液中添加20g/L玉米浆干粉得到发酵培养基，发酵培养基不用灭菌。将步骤2得到的种子培养基以5%（_v/_v）的接种量接种发酵培养基中进行发酵培养，发酵过程不需要无菌操作，发酵条件同实施例1。培养过程使用氨水自动调节pH值6.0。

4.重复批次发酵：第1次发酵结束，启动与发酵罐耦合的膜分离设备，膜组件使用卷式超滤膜，超滤膜材料为聚醚砜，该卷式膜为宽流道设计，截留分子量为2万道尔顿。待发酵液浓缩至原来体积10%时超滤操作结束。将超滤浓缩液作为种子培养物，发酵罐中再次加入发酵培养基到8L，继续开始下一批次发酵培养基中，以与第一次发酵完全相同条件进行发酵培养，培养结束后再次启动膜组件，共发酵8批次。

发酵培养基和设备不需要灭菌，操作过程为开放式。发酵过程间隔时间取样，测定糖、乳酸浓度，方法与实施例1相同。发酵结果表明，经过8个批次连续发酵后乳酸产率提高3.06倍，每一批次乳酸转化率都在0.95g/g以上，说明此工艺稳定高效，具有广阔的工业应用前景。

Claims

1.一种发酵与膜分离耦合实现连续批次发酵木质纤维素水解液生产乳酸的方法，其特征在于，该工艺包括以下步骤：

（1）木质纤维素的糖化：将木质纤维素原料预处理、酶解，并将预处理得到的液体与酶解得到的液体合并，经纳滤技术浓缩，得到木质纤维素水解液；

（2）以嗜热乳酸生产菌为菌种，利用木质纤维素水解液在一定发酵条件下生产乳酸，培养基无需灭菌，且发酵过程也不需无菌操作；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述木质纤维素是玉米秸秆、稻草秸秆、小麦秸秆、甘蔗渣、草类以及阔叶树或针叶树的木屑，木质纤维素预处理方法是稀碱液、稀酸液或者蒸汽爆破方法处理。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的纳滤膜组件为卷式、管式或平板式，纳滤膜组件的材料为醋酸纤维素、磺化聚砜、聚酰胺、聚醚砜、磺化聚醚砜、聚哌嗪或聚乙烯醇，纳滤组件的截留分子量为90到400道尔顿之间。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中使用的嗜热乳酸生产菌为凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）CGMCC No.7635，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中得到的木质纤维素水解液为己糖（葡萄糖，甘露糖或半乳糖等六碳糖）和戊糖（木糖、阿拉伯糖等五碳糖）的混合物。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中的发酵条件为：温度45～55℃，批次发酵时间20～40h，搅拌转速100～150rpm，使用氢氧化钠、氨水或者碳酸钠控制pH值在6.0～6.5之间。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）和（4）中超滤过程为开放式操作，不需无菌操作。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）和（4）中超滤膜材料为聚砜、聚砜酰胺、聚酰胺、磺化聚砜、聚丙烯腈、聚氯乙烯、偏聚氯乙烯、聚醚砜或聚醚酮或无机陶瓷膜；膜组件为平板式、管式、宽流道卷式或外压式中空纤维式；超滤膜截留分子量在1万到10万道尔顿之间。

9.根据权利1要求所示方法，其特征在于，步骤（3）中使用超滤膜组件将发酵液浓缩为原始体积的5%～20%。

10.根据权利1要求所示方法，其特征在于，步骤（4）中连续发酵批次在5次以上。