CN101939439A

CN101939439A - 通过连续发酵实施的乳酸的制造方法

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Publication number: CN101939439A
Application number: CN200980104086XA
Authority: CN
Inventors: 佐佐木七生; 守田健; 耳塚孝; 泽井秀树; 山田胜成
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2008-02-04
Filing date: 2009-02-03
Publication date: 2011-01-05
Anticipated expiration: 2029-02-03
Also published as: AU2009211772A1; KR101483470B1; US20110053231A1; ES2407639T3; CN101939439B; EP2311969A4; JP5992135B2; KR20100110345A; JPWO2009099044A1; EP2311969A1; CA2713564A1; US8551745B2; US20140017746A1; WO2009099044A1; EP2311969B1; BRPI0905928A2

Abstract

通过采用连续发酵实施的乳酸的制造方法，能够由长时间稳定且低成本地发酵而显着提高乳酸的生产效率，所述方法的特征在于，用平均细孔径为0.01μm以上至不到1μm的多孔性膜过滤处理具有生产乳酸能力的高倍体酵母的培养液，从滤液中回收生产物，同时使未滤过液保持在或返流到该培养液中，并且在所述培养液中追加发酵原料。

Description

通过连续发酵实施的乳酸的制造方法

技术领域

本发明涉及以具有乳酸生产能力的酵母作为高倍体，使酵母的培养和发酵稳定化，使得能够进行长时间有效的乳酸生产，通过连续发酵实施的乳酸的制造方法。

背景技术

发酵法大多可被分类为分批发酵法(Batch发酵法)和补料分批发酵法(Fed-Batch发酵法)、以及连续发酵法。分批发酵法和补料分批发酵法的设备简单、培养在短时间内结束，因此具有杂菌污染导致的损害少的优点。但是，其存在着，随时间经过，培养液中的生产物浓度变高，由于渗透压或生产物阻碍等影响而导致生产性和收率降低的问题。因此，难以长时间稳定地维持高收率和高生产性。连续发酵法由于避免了发酵槽内目的物质高浓度蓄积，因此存在能够长时间维持高收率和高生产性的优点，但是要使通过连续发酵法进行的培养长时间稳定地继续非常困难，人们反复进行了研究。

在连续发酵法的提案中，有以下方法，所述方法为用分离膜过滤微生物或培养细胞，从滤液回收生产物，同时使经过滤的微生物或培养细胞保持在或返流到培养液中，将培养液中的微生物或细胞维持在高浓度。

例如，公开了在使用陶瓷膜的连续发酵装置中进行连续发酵的技术(专利文献1～3)。但是，所公开的技术存在着由于陶瓷膜堵塞导致的过滤流量和过滤效率降低上的问题，为了防止堵塞，进行了逆清洗等。

此外，还公开了通过琥珀酸的连续发酵进行的制造方法(专利文献5)。该技术中，在膜分离中采用了高过滤压(约200kPa)。高过滤压不仅在成本上不利，而且过滤处理中微生物或细胞由于压力而受到物理损伤，因此在将微生物或细胞连续地返回到培养液中的连续发酵法中是不合适的。此外，专利文献5中还公开了分离膜和过滤压等技术作为用于使连续发酵长时间继续的提案，然而还希望连续发酵时间在300小时左右，使更长时间连续培养继续的方法。

另一方面，在有机酸制造中使用的微生物的研究中，人们积极地进行了利用对酸耐性强的酵母的研究(非专利文献1和2)。酵母中除了只存在1组染色体的单倍体酵母之外，还存在具有多组染色体的高倍体。高倍体酵母主要作为面包酵母和酿造用酵母使用(专利文献6～8)。它们被用于食料和饮料的生产，也用于提高风味和改良制造过程，但并没有在连续培养中利用的描述。

此外，还公开了使用高倍体的乳酸制造方法(专利文献9～12)。这些都是为了增加乳酸合成基因的数量而利用高倍体，全部都是用补料分批发酵法进行的培养，而且培养时间也是在100小时以内这样的短时间，并没有关于利用膜进行连续发酵的记载。

此外，还报道了采用没有营养需求性的营养非缺陷型酵母的乳酸生产(专利文献13)，但其培养时间也不到100小时，发酵法也只公开了补料分批发酵法。

这样一来，对提高生产性的连续发酵法以及发酵中利用的微生物都分别进行了研究。在用有利的连续发酵法作为发酵法培养微生物时，由于过滤压随着培养的进行而增高，不可能实现长时间继续，或者乳酸随着培养的长期化而生产性降低等，难以使这两者的优点充分发挥。因此，希望开发出解决这些问题，可以长时间稳定地生产乳酸的连续发酵技术。

专利文献1：特开平5-95778号公报

专利文献2：特开昭62-138184号公报

专利文献3：特开平10-174594号公报

专利文献4：特开2005-333886号公报

专利文献5：特开2007-252367号公报

专利文献6：特开2000-139326号公报

专利文献7：特开2002-027974号公报

专利文献8：特开2002-253212号公报

专利文献9：特开2006-006271号公报

专利文献10：特开2006-020602号公报

专利文献11：特开2007-089466号公报

专利文献12：特开2001-204464号公报

专利文献13：US20050112737

非专利文献1：Biotechnology rogress，11，294-298(1995)

非专利文献2：Journal of fermentation and bioengineering，86，284-289(1988)

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的在于提供通过能够长时间稳定地维持乳酸高生产性的连续发酵法制造乳酸的方法。

用于解决问题的手段

本发明人进行了积极的研究，其结果发现，由于在连续发酵中乳酸生产酵母反复进行长时间稳定的增殖的同时维持乳酸的高生产性，将具有乳酸生产能力的酵母采用高倍体，能够长时间维持乳酸的高生产性，从而完成了本发明。也就是说，本发明具有以下构成。

(1)通过连续发酵实施的乳酸的制造方法，其特征在于，用平均细孔径为0.01μm以上至不到1μm的多孔性膜过滤处理具有生产乳酸能力的高倍体酵母的培养液，从滤液中回收生产物，同时使未滤过液保持在或返流到该培养液中，并在该培养液中追加发酵原料。

(2)(1)所述的乳酸的制造方法，其特征在于，在多孔性膜的膜间差压为0.1kPa以上至不到20kPa的范围内进行过滤处理。

(3)(1)或(2)所述的乳酸的制造方法，其特征在于，高倍体酵母为2倍体。

(4)(1)～(3)任一项所述的乳酸的制造方法，其特征在于，高倍体酵母为营养非缺陷型。

(5)(1)～(4)任一项所述的乳酸的制造方法，其特征在于，连续发酵的乳酸对糖收率在70％以上。

(6)(1)～(5)任一项所述的乳酸的制造方法，其特征在于，连续发酵的培养液中的乳酸蓄积浓度为40g/L以上。

(7)(1)～(6)任一项所述的乳酸的制造方法，其特征在于，连续发酵的乳酸生产速度在7.5g/L以上。

(8)(5)～(7)任一项所述的乳酸的制造方法，其特征在于，使连续发酵继续400小时以上。

(9)(1)～(8)任一项所述的乳酸的制造方法，其特征在于，高倍体酵母属于酵母属(Saccharomyces)。

(10)(1)～(9)任一项所述的乳酸的制造方法，高倍体酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

发明效果

如果根据本发明，通过使用高倍体酵母，可以进行长时间稳定地维持所希望的发酵生产物乳酸的高生产性的连续发酵，还能以低成本稳定地生产乳酸。

附图的简要说明

[图1]是用于说明本发明中使用的膜分离型的连续发酵装置的一个实施方式的概要侧面图。

[图2]是用于说明能够在本发明中使用的其它膜分离型连续发酵装置的一个实施方式的概要侧面图。

[图3]图3是用于说明本发明中使用的分离膜组件的一个实施方式的概要斜视图。

[图4]图4是用于说明本发明中使用的其它分离膜组件的例子的概要斜视图。

[图5]图5是乳酸脱氢酶基因表达用载体。

[图6]图6是实施例13和实施例14以及比较例16和比较例17的乳酸蓄积浓度的变化。

[图7]图7是实施例13和实施例14以及比较例16和比较例17的乳酸对糖收率的变化。

[图8]图8是实施例13和实施例14以及比较例16和比较例17的乳酸生产速度的变化。

[图9]图9是实施例15和实施例16以及比较例18和比较例19的乳酸蓄积浓度的变化。

[图10]图10是实施例15和实施例16以及比较例18和比较例19的乳酸对糖收率的变化。

[图11]图11是实施例15和实施例16以及比较例18和比较例19的乳酸生产速度的变化。

符号说明

1 发酵反应槽

2 分离膜组件

3 水位差控制装置

4 气体供给装置

5 搅拌机

6 液位传感器

7 培养基供给泵

8 pH调节液供给泵

9 pH传感器·控制装置

10 温度调节器

11 发酵液循环泵

12 膜分离槽

13 支持板

14 流路材料

15 分离膜

16 凹部

17 集水管

18 分离膜束

19 上部树脂密封层

20 下部树脂密封层

21 支持框

22 集水管

用于实施发明的最佳方式

本发明是在培养具有生产乳酸能力的酵母的发酵中，通过使用高倍体酵母，一边长时间维持乳酸的高生产性，一边通过连续发酵法制造乳酸的方法，该方法是用分离膜过滤具有生产乳酸能力的高倍体酵母的培养液，从滤液中回收生产物，再使未滤过液保持在或返流到培养液中，并在培养液中追加发酵原料的连续发酵中，使用平均细孔径为0.01μm以上至不到1μm的多孔性膜作为分离膜，进行过滤处理的乳酸的制造方法。

首先，就本发明中作为分离膜使用的多孔性膜进行说明。本发明中的多孔性膜，优选具有适应被处理水的水质和用途的分离性能和透水性能。多孔性膜从阻止性能和透水性能和分离性能，例如耐污性角度来看，优选含有多孔质树脂层的多孔性膜。

含有多孔质树脂层的多孔性膜优选在多孔质基材的表面上具有起分离功能层作用的多孔质树脂层。这里，多孔质基材的材质由有机材料和/或无机材料等构成，优选使用有机材料，更优选使用有机纤维。其中优选的多孔质基材是使用纤维素纤维、三乙酸纤维素纤维、聚酯纤维、聚丙烯纤维和聚乙烯纤维等有机纤维构成的织布或无纺布，更优选使用密度控制比较容易、制造也容易的便宜的无纺布。前述多孔质基材的厚度在50μm以上3000μm以下，优选该范围是因为能够支持多孔质树脂层，给予分离膜强度。此外，多孔质树脂层可以浸透在多孔质基材中，多孔质树脂层也可以不浸透在多孔质基材中，这根据用途进行选择。

多孔质树脂层可优选使用有机高分子膜。作为有机高分子膜的材质，可以列举例如，聚乙烯类树脂、聚丙烯类树脂、聚氯乙烯类树脂、聚偏氟乙烯类树脂、聚砜类树脂、聚醚砜类树脂、聚丙烯腈类树脂、聚烯烃类树脂、纤维素类树脂、三乙酸纤维素类树脂等，可以是以这些树脂作为主要成分的树脂混合物。这其中，作为主要成分，是指含有50重量％以上、优选60重量％以上的该成分。尤其是，作为有机高分子膜的材质，优选通过溶液进行的制膜容易、且物理的耐久性和耐药性优异的聚氯乙烯类树脂、聚偏氟乙烯类树脂、聚砜类树脂、聚醚砜类树脂、聚丙烯腈类树脂、聚烯烃类树脂或以这些树脂作为主要成分的树脂混合物，更优选聚偏氟乙烯类树脂或以其作为主要成分的树脂混合物。

这里，作为聚偏氟乙烯类树脂，优选使用偏氟乙烯的均聚物或与可以与偏氟乙烯共聚的乙烯类单体的共聚体。作为可以与偏氟乙烯共聚的乙烯类单体，可以列举四氟乙烯、六氟丙烯和三氯一氟乙烯等。

此外，作为聚烯烃类树脂，可以列举聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯或聚氯丙烯，但优选聚氯乙烯。

本发明中使用的多孔性膜的表面平均细孔径在0.01μm以上是重要的。多孔性膜的表面平均细孔径如果在0.01μm以上，则此膜具有不容易发生由发酵时使用的菌体导致的堵塞，且长时间稳定地维持过滤性能的性能。而且，如果多孔性膜的平均细孔径在0.01μm以上，则可使不漏出高倍体酵母的高排除率和高透水性同时实现，能够长时间保持透水性，以更高精度和再现性来实施。此外，在本发明的多孔性膜的表面平均细孔径不到0.01μm时，存在多孔性膜的透水性能降低，膜即使不被污染，也无法有效运转的情况，多孔性膜的平均细孔径在0.01μm以上、优选0.02μm以上，更优选在0.04μm以上时，可以有效运转。

为了防止高倍体酵母的漏出，即排除率降低的麻烦的发生，以及为了防止高倍体酵母直接堵塞孔，本发明中多孔性膜的平均细孔径不到1μm十分重要，优选在0.4μm以下，如果在0.2μm以下，则可以更好的实施。此外，高倍体酵母有时是生产作为目的的乳酸以外的物质例如蛋白质、多糖类等容易凝集的物质的情形，另外，存在由于培养液中的高倍体酵母的一部分死亡而生成细胞破碎物的情形，为了避免这些物质导致的多孔性膜的堵塞，更优选平均细孔径在0.1μm以下。因此，本发明中使用的多孔性膜的表面平均细孔径，多孔性膜的平均细孔径优选在0.4μm以下，更优选在0.2μm以下，特别优选在0.1μm以下。

这里，本发明中表面的平均细孔径可以通过测定在倍率10,000倍的扫描型电子显微镜观察多孔质膜表面时，在9.2μm×10.4μm的范围内可以观察到的所有细孔的直径，进行平均后求得。平均细孔径也可以用扫描型电子显微镜，以10,000倍的倍率，拍摄膜表面，随机选择10个以上、优选20个以上的细孔，测定这些细孔的直径，求出平均数。细孔不成圆状时，通过以下方法求出，即用图像处理装置等，求出与细孔的面积相同面积的圆(等价圆)，以等价圆直径作为细孔的直径。

本发明中使用的多孔性膜的表面的平均细孔径，细孔径的标准偏差小，即细孔径的大小是一致的，能够获得均匀的滤液，标准偏差σ优选在0.1μm以下。而且，为了使发酵运转管理变得容易，平均细孔径的标准偏差越小越好。平均细孔径的标准偏差σ可以通过下述(式1)计算得出，该式中以在上述10,000倍的倍率的扫描型电子显微镜多孔膜表面的观察下，在9.2μm×10.4μm范围内能够观察到的细孔数作为N，以测定的各个直径作为X_k，以细孔直径的平均值作为X(ave)。

σ = \sqrt{\frac{Σ_{k = 1}^{N} {(X_{k} - X (ave))}^{2}}{N}}

....(式1)

在本发明使用的分离膜中，培养液的透过性是重要的性能之一。作为多孔性膜的透过性的指标，可以采用使用前的多孔性膜的纯水透过系数。本发明中，多孔性膜的纯水透过系数，在以用透析膜(东丽(株)制フイルトライザ一B2-1.5H)过滤饮用水之后的水作为原水，25℃、以落差高度1m测定透水量计算时，优选为2×10^-9m³/m²/s/pa以上，纯水透过系数如果为2×10^-9m³/m²/s/pa以上6×10^-7m³/m²/s/pa以下，则可以获得实用上足够的透过水量。更优选为2×10^-9m³/m²/s/pa以上1×10^-7m³/m²/s/pa以下。

本发明中使用的多孔性膜的膜表面的粗糙度是与表面垂直方向的高度的平均值。膜表面粗糙度是为了使附着于分离膜表面的高倍体酵母容易被搅拌或通过循环泵产生的液流形成的膜面清洗效果而容易剥离的因子之一。多孔性膜的表面粗糙度优选在0.1μm以下。膜表面粗糙度如果在0.1μm以下，附着于膜上的高倍体酵母容易剥离，在高倍体酵母的过滤中，能够使膜表面上发生的剪切力降低，抑制酵母的破坏，抑制多孔性膜的堵塞，因而可以长时间稳定的过滤，而且能够以较低的膜间差压实施连续发酵，因此即使膜堵塞时，清洗恢复性也比在高膜间差压下运作的情况要好。而且，由于通过抑制堵塞，可以进行稳定的连续发酵，因此优选多孔性膜的表面粗糙度越小越好。

这里，膜表面粗糙度可以使用下述的原子力显微镜装置(AFM)，在下述条件下测定。

装置：原子力显微镜装置(Digital Instruments(株)制Nanoscope IIIa)

条件

探针： SiN悬臂(Digital Instruments(株)制)

扫描模式接触模式(气中测定)

水中轻敲(水中测定)

扫描范围 10μm、25μm 四方(气中测定)

5μm、10μm 四方(水中测定)

扫描分辨率 512×512

样品制备：测定时的膜样品，常温下浸渍在乙醇中15分钟后，浸渍于RO水中24小时并洗净后，风干再用。

根据上述的原子力显微镜装置(AFM)获得的各点的Z轴方向的高度，用下述的(式2)计算膜表面粗糙度(d_rough)。

d_{rough} = Σ_{n = 1}^{N} \frac{| Z_{n} - \overset{&OverBar;}{Z} |}{N}

....(式2)

d_rough：表面粗糙度(μm)

Z_n：Z轴方向的高度(μm)

扫描范围的平均高度(μm)

N：测定样品数

本发明中使用的多孔性膜的形状可以是平膜，也可以是中空纤维膜。多孔性膜的形状为平膜时，其平均厚度根据其用途来选择，但优选在20μm以上5000μm以下，更优选在50μm以上2000μm以下。多孔性膜为中空纤维膜时，中空纤维的内径优选在200μm以上5000μm以下，膜厚优选在20μm以上2000μm以下。此外，在中空纤维的内部还可以含有由有机纤维或无机纤维制成筒状的织物或编物。

就本发明中使用的多孔性膜的制造方法进行例示性说明。

首先，就作为多孔性膜的一个优选方式的平膜的制造方法进行说明。在多孔质基材的表面上形成含有树脂和溶剂的原液的被膜，同时使该原液浸渍于多孔质基材中。然后，只使具有被膜的多孔质基材的被膜侧表面与含有非溶剂的凝固浴接触，使树脂凝固，同时在多孔质基材的表面上形成多孔质树脂层。

原液通过使树脂溶解于溶剂中来调整。原液温度，从制膜性的角度考虑，通常优选在5～120℃的范围内选择。溶剂为溶解树脂的、作用于树脂并促进它们形成多孔质树脂层的溶剂。作为溶剂，可以使用N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N，N-二甲基乙酰胺(DMAc)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、N-甲基-2-吡咯烷酮、甲基乙基酮、四氢呋喃、四甲基脲、磷酸三甲酯、环己酮、异佛尔酮、γ-丁内酯、甲基异戊基酮、邻苯二甲酸二甲酯、丙二醇甲基醚、碳酸异丙烯酯、双丙酮醇、甘油三乙酸酯、丙酮和甲基乙基酮等。这其中，优选使用树脂溶解性高的N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N，N-二甲基乙酰胺(DMAc)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)。这些溶剂可以单独使用，也可以两种以上混合使用。

此外，还可以在溶剂中添加聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和甘油等溶剂以外的成分。还可以在溶剂中添加非溶剂。非溶剂为不溶解树脂的液体。非溶剂起到控制树脂凝固的速度，控制细孔大小的作用。作为非溶剂，可以使用水、甲醇和乙醇等醇类。其中，作为非溶剂，从价格方面考虑，优选水和甲醇。溶剂以外的成分和非溶剂也可以是混合物。

还可以在原液中添加开孔剂。开孔剂具有在浸渍于凝固浴时被抽出，使树脂层成为多孔质的作用。通过添加开孔剂，可以控制平均细孔径的大小。开孔剂优选在凝固浴的溶解性高。作为开孔剂，可以使用例如氯化钙或碳酸钙等无机盐。此外，作为开孔剂，可以使用聚乙二醇和聚丙二醇等聚氧化烯类，聚乙烯醇、聚乙烯醇缩丁醛和聚丙烯酸等水溶性高分子化合物和甘油。

下面，就作为多孔性膜的一个优选方式的中空纤维膜的制造方法进行说明。中空纤维膜可以通过从二重管式金属口外侧的管吐出包含树脂和溶剂的原液，并从二重管式金属口内侧的管吐出中空部形成用流体，然后在冷却浴中冷却固化的方式制作。

原液可以通过使上述平膜的制造方法中所述的树脂以20重量％以上60重量％以下的浓度溶解于上述平膜的制造方法中所述的溶剂中来调整。此外，通常可以使用气体或液体作为中空部形成用流体。此外，在获得的中空纤维膜的外表面上还可以涂覆(层叠)新的多孔性树脂层。层叠可以是为了使中空纤维膜的性质例如亲水性或疏水性、细孔径等变化成所希望的性质而进行的。层叠的新的多孔性树脂层可以通过以下方式制造，即通过使树脂溶解于溶剂的原液与含有非溶剂的凝固浴接触，使树脂凝固。该树脂的材质优选是例如与上述有机高分子膜的材质同样的材质。此外，层叠方法没有特别限定，可以将中空纤维膜浸渍于原液中，也可以在中空纤维膜的表面上涂布原液，层叠后，通过挤出付着的原液的一部分，用气刀吹跑，来调整层叠量。

本发明中使用的多孔性膜用树脂等部材来粘着、封闭中空纤维膜的中空部，通过设置在支持体而形成分离膜组件。

本发明中使用的多孔性膜还可以通过与支持体组合，形成分离膜组件。使用支持板作为支持体，该支持板的至少一面上配备本发明中使用的多孔性膜的分离膜组件是本发明使用的具有多孔性膜的分离膜组件的一个优选的实施方式。为了扩大透水量，优选在支持板的两面配置分离膜，这是多孔性膜组件的优选方式。

本发明的乳酸的制造方法中，优选在多孔性膜的膜间差压为0.1kPa以上至不到20kPa的范围内进行过滤处理。为了过滤发酵培养液，如果在20kPa以上的膜间差压下进行过滤处理，则需要用于施加压力的动力，制造乳酸时的经济效果降低。此外，通过施加20kPa以上的较高膜间差压，存在破碎连续发酵培养中使用的高倍体酵母的情形，导致生产乳酸的能力下降。在不到0.1kPa的膜间差压下，过滤费时，生产速度降低。作为过滤压力的膜间差压如果在0.1以上至不到20kPa的范围内，由于通过水位差能获得膜间差压，不需要特别地保持发酵槽内在加压状态，因此生产乳酸的能力不会降低。而且，还可列举以下优点，所述优点是不需要特别地保持发酵槽内在加压状态，因此在发酵槽内部设置多孔性膜的方式也可以，可以使发酵装置紧凑简洁。

这里所谓的膜间差压，表示多孔性膜中被处理水侧与透过水侧的压力差。使多孔质膜的每单位面积的处理流量维持在一定量运转时，如果用多孔性膜对被处理水进行长时间连续的膜过滤，由于存在于被处理水的污浊物质吸附在多孔性膜的细孔以及堆积在表面导致膜被污染。那么，发生膜堵塞，膜间差压提高，处理流量显着降低，稳定运转难以继续，因此优选一边测定膜间差压一边进行过滤。膜间差压的测定方法，可以通过在多孔性膜中被处理水侧和透过水侧设置压力计，测定压力，求出该压力差来测定。

下面，对本发明中使用的具有生产乳酸能力的高倍体酵母进行说明。本发明的乳酸的制造方法中，通过使用具有生产乳酸能力的高倍体酵母，在简便的操作条件下，就可以进行长时间稳定维持所希望的发酵生产物乳酸的高生产性的连续发酵，能以低成本稳定地生产乳酸。

所谓高倍体酵母，是指细胞内具有2组以上的染色体的酵母。高倍体酵母一般比遗传学分析中使用的单倍体酵母大，与其相比，较难发生多孔质膜的堵塞，适于长时间培养。可以列举以下优点：通过使用高倍体酵母，可以使膜表面上发生的剪切力降低，酵母的破坏受到抑制，多孔性膜的堵塞也受到抑制，可以在实现长时间稳定地过滤的同时实现膜的再利用，能够实现低成本化。此外，在膜堵塞时，与单倍体酵母相比，清洗恢复性良好。高倍体酵母的染色体组数没有特别限定，优选为具有2组染色体的2倍体酵母。

高倍体酵母可以列举例如发酵工业中经常使用的面包酵母、清酒酵母、葡萄酒酵母和啤酒酵母等酵母等。使用的高次倍数对酵母可以是从自然环境中分离的，也可以是通过突变或基因重组改变了部分性质的酵母。

具有生产乳酸能力的高倍体酵母是指导入了乳酸脱氢酶基因(以下有时称为LDH)的高倍体酵母。对导入了乳酸脱氢酶的高倍体酵母的制造方法没有特别限定，但通过使染色体上导入了乳酸脱氢酶基因的单倍体酵母进行高倍体化，则可以不使每个染色体的基因型发生变化，就简单的使乳酸脱氢酶基因的拷贝数增加，进而可使乳酸生产能力增强。

而且，本发明中，具有生产乳酸能力的高倍体酵母如果是营养非缺陷型，可以使用比以往的营养素少的培养基、即低成本的培养基，并且在简单的操作条件下，可以进行长时间稳定地维持乳酸的高生产性的连续发酵，能够以低成本稳定地生产乳酸，因此在本发明中优选使用。

所谓酵母具有的营养需求性，是指野生型酵母具有的营养合成基因中由于某种原因发生变异，导致该营养的合成能力受损。另外，所谓营养需求性的恢复是指该营养需求性的变异再恢复到野生型或与其非常接近的状态。营养需求性主要作为基因操作等时的标记使用，因此营养缺陷型酵母优选在基因操作时使用。

酵母具有营养需求性时，作为所必需营养素的具体例子，已知有蛋氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、丝氨酸、精氨酸、尿嘧啶、腺嘌呤、赖氨酸、色氨酸、亮氨酸、组氨酸等。作为显示出营养缺陷型的酵母所具有的基因型，可以列举以下例子。

·蛋氨酸需求性：met1、met2、met3、met4、met5、met6、met7、met8、met10、met13、met14、met20

·酪氨酸需求性：tyr1

·异亮氨酸、缬氨酸需求性：ilv1、ilv2、ilv3、ilv5

·苯丙氨酸需求性：pha2

·谷氨酸需求性：GLU3

·苏氨酸需求性：thr1、thr4

·天冬氨酸需求性：asp1、asp5

·丝氨酸需求性：ser1、ser2

·精氨酸需求性：arg1、arg3、arg4、arg5、arg8、arg9、arg80、arg81、arg82、arg84

·尿嘧啶需求性：ura1、ura2、ura3、ura4、ura6

·腺嘌呤需求性：ade1、ade2、ade3、ade4、ade5、ade6、ade8、ade9、ade12、ADE15

·赖氨酸需求性：lys1、lys2、lys4、lys5、lys7、lys9、lys11、lys13、lys14

·色氨酸需求性：trp1、trp2、trp3、trp4、trp5

·亮氨酸需求性：leu1、leu2、leu3、leu4、leu5

·组氨酸需求性：his1、his2、his3、his4、his5、his6、his7、his8。

本发明中优选使用的营养非缺陷型酵母为不具有显示上述营养需求性的基因型或为互补的酵母。而且，作为判断是否为营养非缺陷型酵母的方法，可以以在酵母的最小培养基SD培养基(表1)中是否可以生长作为判断标准。

[表1]

无氨基酸的酵母氮源(Difco公司制) 1.7g

葡萄糖 30g

琼脂 20g

到1L

作为通过使营养缺陷型酵母的营养需求性恢复，制作营养非缺陷型酵母的方法，可以列举通过基因重组法导入营养合成基因，使营养需求性恢复的方法、以及重复具有不同营养需求性的酵母之间接合，使子囊形成，使目的营养需求性恢复的过程，最终使营养需求性全部恢复，制成营养非缺陷型酵母的方法等。

作为导入于具有生产乳酸能力的高倍体酵母中的LDH，只要是编码具有将还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和丙酮酸转换成氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)和乳酸的活性的蛋白质，就没有限定，例如，可以使用乳酸的对糖收率高的乳酸菌来源的LDH、哺乳类来源的LDH或两栖类来源的LDH。这其中可优选使用人(Homo sapiens)来源和蛙类来源的LDH。而且，蛙类中优选使用属于负子蟾科(Pipidae)的蛙类来源的LDH，属于负子蟾科的蛙类中，优选使用非洲爪蟾(Xenopus laevis)来源的LDH。

前述LDH还包含由于遗传多态性和诱变等产生的变异型基因。这里所谓的遗传多态性，是由于基因上的自然突变导致基因的碱基序列的一部分发生变化，所谓诱变，是指通过人工在基因中导入变异。诱变有例如，使用定点诱变导入用试剂盒(Mutan-K(TakaraBio公司制))的方法、使用随机诱变导入用试剂盒(BD Diversify PCR Random Mutagenesis(CLONTECH公司制))的方法等。此外，本发明中使用的LDH如果编码具有将NADH和丙酮酸转化为NAD+和乳酸的活性的蛋白质，碱基序列的一部分中存在缺失或插入也可以。

对于具有生产乳酸能力的高倍体酵母，前述LDH可以保持在维持于酵母染色体外的质粒或YAC等中，但如上所述，优选整合在酵母染色体中保持。作为在酵母染色体中导入LDH的方法，没有特别限制，可以通过例如特开2008-29329号公报中公开的方法导入。此外，在具有生产乳酸能力的高倍体酵母中，至少保持1个LDH，优选2个以上，更优选3个以上，更优选4个以上。

本发明中使用的发酵原料可以是促进培养的酵母的生长，能够使作为目的发酵生产物的乳酸良好生产的原料，可以优选使用例如适当含有碳源、氮源、无机盐类、和根据需要添加的氨基酸和维生素等有机微量营养素的液体培养基。作为上述碳源，可优选使用例如葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、乳糖和麦芽糖等糖类、含有这些糖类的淀粉糖化液、甘薯糖蜜、甜菜糖蜜、高级糖蜜(High Test Molasses)、蔗汁、蔗汁提取物或浓缩液、从蔗汁中纯化或结晶化的原料糖、从蔗汁中纯化或结晶化的纯化糖、以及醋酸、延胡索酸等有机酸、乙醇等醇类和甘油等。这里所谓糖类是指多元醇的最初氧化生成物，具有一个醛基或酮基，且具有醛基的糖被分类为醛糖、具有酮基的糖被分类为酮糖的碳水化合物，优选为葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、乳糖或麦芽糖。上述碳源，可以在培养开始时一起添加，还可以在培养中分批或连续地添加。

此外，作为上述氮源，可以使用例如氨气、氨水、铵盐类、尿素、硝酸盐类、其它辅助使用的有机氮源例如油粕类、大豆加水分解液、酪蛋白分解物、其它氨基酸、维生素类、玉米浆、酵母或酵母提取物、肉膏、蛋白胨等肽类、各种发酵菌体及其加水分解物等。

此外，作为上述无机盐类，可以适当添加例如磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、和锰盐等。

此外，在具有生产乳酸能力的高倍体酵母为营养缺陷型的情形时，可以添加作为制品的营养物，或者含有该营养物的天然物。而且，根据需要还可以添加使用消泡剂。

具有生产乳酸能力的高倍体酵母的发酵培养条件，只要能够进行培养，就没有特别限制，但优选在pH为4～8，温度在20～40℃的范围内进行。发酵培养液的pH用无机酸或有机酸、碱性物质、以及尿素、碳酸钙和氨气等，调整到上述范围内的预先确定的值。

具有生产乳酸能力的高倍体酵母的发酵培养中，如果需要提高氧的供给速度，可以采用在空气中添加氧，将氧浓度保持在21％以上，加压培养液，提高搅拌速度或者提高通气量等手段。相反，在需要降低氧的供给速度时，也可以在空气中混合二氧化碳气体、氮和氩等不含氧的气体再进行供给。

本发明中，可以在培养初期进行分批培养或补料分批培养，在菌体浓度提高后开始连续培养(抽取)，也可以接种高浓度的菌体，在培养开始的同时进行连续培养。从适当时期开始，可以进行发酵原料液的供给和培养物的抽取。发酵原料液供给和培养物的抽取开始时间不一定需要相同。此外，发酵原料液的供给和培养物的抽取可以是连续的，也可以是间歇的。可以在发酵原料液中添加如上所示的菌体增殖所必需的营养素，使得菌体增殖得以连续进行。

为了获得有效的生产性，发酵培养液中菌体的浓度优选在发酵培养液的环境不适于酵母增殖且死亡率不升高的范围下，以高浓度状态维持，作为其中一例，通过将菌体浓度作为干燥重量维持在5g/L以上，可以获得良好的生产效率。此外，只要不导致连续发酵装置运作上的不方便或生产效率降低，菌体浓度的上限值就没有特别限定。

使具有发酵生产能力的新鲜菌体增殖的同时进行的连续培养操作，在培养管理上，通常优选在单一的发酵反应槽中进行。然而，如果是菌体增殖的同时生成生产物的连续培养法，则发酵反应槽的数目是任意的。由于发酵反应槽的容量小等原因，也可以使用多个发酵反应槽。这种情况下，即使用配管并列或串联地连接多个发酵反应槽进行连续培养，也可以获得发酵生产物的高生产性。

本发明中，所谓连续发酵继续，表示连续地或者间歇地进行发酵原料液供给和培养物的抽提的状态。本发明中，连续发酵继续期间优选有效生产乳酸。乳酸有效生产是指通过乳酸蓄积浓度、乳酸生产速度、乳酸对糖收率进行评价，它们中的任一个，优选2个，更优选全部都在高状态。

所谓乳酸蓄积浓度是指培养液中所含乳酸的浓度，所谓乳酸蓄积浓度高的状态是指乳酸蓄积浓度在40g/L以上、优选42g/L、更优选44g/L。

乳酸生产速度是指每单位时间生产的乳酸量，乳酸生产速度高的状态是指，数式3表示的乳酸生产速度在7.5g/L/小时以上、优选在8g/L/小时以上、更优选在9g/L/小时以上。

P_B：乳酸生产速度(g/l/h)

P_{B} = V \frac{dP}{dt} = \frac{P (F_{M} + F_{N})}{V}

....(式3)

F_M：培养基供给速度(l/h)

F_N：中和剂供给速度(l/h)

P：生产物浓度(g/l)

P_B：生产速度(g/l/h)

S：底物浓度(g/l)

S_R：供给培养基中的底物浓度(g/l)

t：时间(h)

V：培养液量(l)

Y_P/S：生产物收率(g/g)

乳酸对糖收率是指每单位时间消耗的碳源所产生的乳酸量的比例，乳酸对糖收率高的状态是指，数式4表示的乳酸对糖收率为70％以上、优选为75％以上、更优选为80％以上。

Y_P/S：生产物收率(g/g)

Y_{p / S} = V \frac{P}{S_{R} - S} = \frac{P (F_{M} + F_{N})}{F \times S_{R} - S (F_{M} + F_{N})}

....(式4)

培养基中糖的重量均换算为葡萄糖的质量。

例如，1mol的蔗糖换算为2mol的葡萄糖。

本发明制造的过滤和分离发酵液中所含的乳酸的分离和纯化可以通过组合以往已知的浓缩、蒸馏和晶析等方法进行，可以列举，例如通过使过滤和分离发酵液的pH达到1以下，然后用二乙醚或乙酸乙酯等提取的方法，吸附在离子交换树脂、清洗后洗脱的方法，酸催化剂的存在下、使之与醇反应形成酯、进行蒸馏的方法，和晶析成钙盐或锂盐的方法，WO2009/004922中公开的组合纳米过滤膜和蒸馏的分离和纯化方法等。

下面，就本发明的乳酸的制造方法中使用的连续发酵装置的优选方式，用图进行说明。

图1是用于说明本发明的通过连续发酵实施的乳酸的制造方法中使用的膜分离型连续发酵装置的优选例子的概要侧面图。图1是分离膜组件设置在发酵反应槽的外部的代表例。

图1中，膜分离型连续发酵装置基本由发酵反应槽1和膜分离层12和差压控制装置3构成。这里，分离膜组件2中整合至多孔性分离膜。作为该多孔性分离膜，合适的是使用例如国际公开第2002/064240号小册子中公开的分离膜和分离膜组件。此外，膜分离槽12通过发酵培养液循环泵11与发酵反应槽1连接。

图1中，通过培养基供给泵7，向发酵反应槽1中投入培养基，根据需要，用搅拌机5搅拌发酵反应槽1内的发酵培养液，而且根据需要还可以用气体供给装置4供给必要的气体。此时，可以回收供给的气体，再循环，通过气体供给装置4再供给。此外，根据需要，可以通过pH传感器·控制装置9和pH调节液供给泵8来调整发酵液的pH，此外，根据需要，可以通过用温度调节器10调节发酵培养液的温度，进行生产性高的发酵生产。而且，装置内的发酵液通过发酵液循环泵11，在发酵反应槽1与膜分离槽12之间循环。含有发酵生产物的发酵培养液被分离膜组件2过滤并分离成微生物和发酵生产物，可以从装置系统中取出。

此外，由于被过滤和分离的微生物停留于装置系统内，因此装置系统内的微生物可以维持高浓度，因而可以进行高生产性的发酵生产。这里，通过分离膜组件2进行的过滤和分离通过与膜分离槽12的水面的水位差压进行，不需要特别的动力就可实施，根据需要，通过液位传感器6和差压控制装置3，可以适当调节分离膜组件2的过滤和分离速度以及装置系统内的发酵培养液量。根据需要，还可以通过气体供给装置4向膜分离槽12内供给必要的气体。此时，可以回收供给的气体，再循环，通过气体供给装置4再供给。通过分离膜组件2进行的过滤和分离根据需要还可以通过泵等吸引滤过或通过加压装置系统内部，进行过滤和分离。此外，可以在培养槽内连续发酵地培养高倍体酵母，根据需要，向发酵槽内供给。通过在培养槽内培养高倍体酵母，根据需要，向发酵槽内供给，可以总是通过新鲜的乳酸生产能力高的高倍体酵母进行连续发酵，可以进行长时间维持高生产性能的连续发酵。

接下来，图2是用于说明本发明中使用的其它膜分离型连续发酵装置的例子的概要侧面图。本发明的乳酸制造方法中使用的连续发酵装置中，分离膜组件设置在发酵反应槽内部的一个代表性例子示于图2的概要图。

图2中，膜分离型连续发酵装置基本由发酵反应槽1和差压控制装置3构成。发酵反应槽1内的分离膜组件2中整合了多孔性膜。作为该多孔性分离膜，可以使用例如国际公开第2002/064240号小册子中公开的分离膜和分离膜组件。分离膜组件随后详述。

下面，就通过图2的膜分离型连续发酵装置进行的连续发酵的方式进行说明。用培养基供给泵7，向发酵反应槽1中连续地或间歇地投入培养基。培养基在投入前可以根据需要进行加热杀菌、加热灭菌或采用过滤器的灭菌处理。发酵生产时，根据需要，可以用发酵反应槽1内的搅拌机5搅拌发酵反应槽1内的发酵培养液。发酵生产时，根据需要，可以通过气体供给装置4给发酵反应槽1内供给必要的气体。发酵生产时，根据需要，可以通过pH传感器·控制装置9和pH调节液供给泵8来调整发酵反应槽1内的发酵培养液的pH，根据需要，可以通过用温度调节器10调节发酵反应槽1内的发酵培养液的温度进行生产性高的发酵生产。这里，尽管例示了在通过仪器检测和控制装置进行的发酵培养液的物理化学条件的调节中pH和温度的调节，但根据需要，可以进行溶解氧和ORP的控制，而且还可以通过在线化学传感器等分析装置测定发酵培养液中的乳酸的浓度，控制以发酵培养液中的乳酸的浓度作为指标的物理化学的条件。此外，培养基的连续或间歇投入优选以通过上述检测装置进行的发酵液的物理化学环境的测定值作为指标，适当调节培养基投入量和速度。

图2中，用设置于发酵反应槽1内的分离膜组件2，将发酵培养液过滤和分离成菌体和发酵生产物，再从装置系统中取出发酵生产物。此外，通过将被过滤和分离的菌体留在装置系统内，装置系统内的菌体浓度可以维持高浓度，因而可以进行高生产性的发酵生产。这里，由分离膜组件2进行的过滤和分离通过与发酵反应槽1水面的水位差压进行，不需要使用特别的动力就可以实施，根据需要，通过液位传感器6和差压控制装置3，可以适当调节分离膜组件2的过滤和分离速度以及发酵反应槽1内的发酵培养液量。通过上述分离膜组件进行的过滤和分离根据需要，还可以通过泵等进行的吸引过滤或通过加压装置系统内部，进行过滤和分离。而且，还可以在另外准备的培养槽中培养菌体，根据需要供给到发酵槽内。在培养槽中培养菌体，根据需要向发酵槽内供给，可以总是用新鲜的菌体进行连续发酵，可以进行长时间维持高乳酸生产性能的连续发酵。

本发明的乳酸的制造方法中使用的连续发酵装置中优选使用的分离膜组件基于附图进行说明。本发明的乳酸的制造方法中使用的连续发酵装置中优选可以使用国际公开第2002/064240号小册子中公开的分离膜和分离膜组件。

以下用附图简要说明作为本发明中使用的分离膜组件的形态的合适例子的国际公开第2002/064240号小册子中公开的分离膜和分离膜组件。图3是用于说明本发明中使用的分离膜组件的一个实施方式的概要斜视图。

分离膜组件，如图3所示，由在具有刚性的支持板13的两面依次配置流路材料14和前述分离膜15而构成。支持板13在其两面具有凹部16。分离膜15过滤发酵培养液。流路材料14是使经分离膜15过滤的滤液有效流到支持板13的材料。流到支持板13的滤液通过支持板13的凹部16，经排出手段的集水管17，被取出到连续发酵装置外部。

下面，对图4所示的其它方式的分离膜组件进行说明。图4是用于说明本发明中使用的其它分离膜组件的例子的截面说明图。

分离膜组件如图4所示，由中空纤维膜构成的分离膜束18被部树脂密封层19和下部树脂密封层20以束状被粘着和固定。由下部树脂密封层20进行的粘着和固定化形成了密封中空纤维膜的中空部，防止发酵培养液漏出的结构。另一方面，形成了上部树脂密封层19不密封中空纤维膜的内孔，滤液流到集水管22的结构。该分离膜组件可以通过支持框21设置在连续发酵装置内。由分离膜束18过滤的滤液通过中空纤维膜的中空部，经集水管22，被取出到发酵培养槽的外部。作为用于取出滤液的动力，可以使用水位差压、泵、通过液体或气体等进行的吸引过滤、或对装置系统内加压等方法。

通过本发明的连续发酵进行的乳酸制造方法中使用的连续发酵装置的分离膜组件的构成部件，优选是耐高压蒸汽灭菌操作的部件。发酵装置内如果可以灭菌，就可以避免在连续发酵时被不优选的菌体污染的危险，可以实现更稳定的连续发酵。构成分离膜组件的部件，优选在高压蒸汽灭菌操作的条件即121℃ 15分钟下有耐性。分离膜组件部件可优选选择例如不锈钢或铝等金属、聚酰胺类树脂、氟类树脂、聚碳酸酯类树脂、聚缩醛类树脂、聚对苯二甲酸丁二醇酯类树脂、PVDF、改性聚苯醚类树脂和聚砜类树脂等树脂。

通过本发明的连续发酵进行的乳酸的制造方法中使用的连续发酵装置中，分离膜组件可以设置在发酵槽外，也可以设置在发酵反应槽内。分离膜组件设置在发酵反应槽外时，可以另外设置膜分离槽，在其内部设置分离膜组件，可以一边使发酵培养液在发酵反应槽和膜分离槽之间循环，一边通过分离膜组件连续过滤发酵培养液。

通过本发明的连续发酵进行的乳酸的制造方法中使用的连续发酵装置中，理想的是，膜分离槽可以进行高压蒸汽灭菌。如果膜分离槽可以进行高压蒸汽灭菌，则容易避免杂菌导致的污染。

实施例

以下，用实施例说明本发明。

(参考例1)具有生产乳酸能力的高倍体酵母的制作

通过对在酿酒酵母NBRC10505株中导入非洲爪蟾来源的L-乳酸脱氢酶基因(以下也称为XLDH)获得的具有生产乳酸能力的酵母进行高倍体化，制成具有生产乳酸能力的高倍体酵母。并且，如以下详细说明的那样，给予营养需求性的恢复和温度感受性变异的性质。用于制作高倍体酵母的酵母和用以下说明的方法制成的酵母示于表2。以下，对LDH的插入、温度感受性突变的赋予、营养需求性的恢复方法，说明详细的程序。

(其1)非洲爪蟾来源的L-LDH(XLDH)表达载体的构建

XLDH(序列号1)的克隆通过PCR法进行。PCR中，以从非洲爪蟾肾脏来源的cDNA文库(STRATAGENE公司制)，按照附带的操作规程制备的噬菌粒DNA作为模板。

PCR扩增反应中使用KOD-Plus聚合酶(东洋纺公司制)，反应缓冲液、dNTPmix等采用试剂盒附带的产品。制备50μl的反应体系，其中如上所述按照附带的操作规程调整的噬菌粒DNA为50ng/样品、引物为50pmol/样品，和KOD-Plus聚合酶为1单位/样品。用PCR扩增装置iCycler(BIO-RAD公司制)，使反应溶液在94℃温度热变性5分钟后，以94℃(热变性)30秒、55℃(引物的退火)30秒、68℃(互补链延伸)1分钟为一个循环，进行30个循环，然后冷却到4℃。并且，基因扩增用引物(序列号2，3)在5末端侧添加SalI识别序列、3末端侧添加NotI识别序列而制备。

纯化PCR扩增片段，用T4多核苷酸激酶(TakaraBio公司制)对末端磷酸化后，连接到pUC118载体(用限制性酶HincII切断，对切断面进行脱磷酸化处理)中。用DNA连接试剂盒Ver.2(TakaraBio公司制)进行连接。用连接溶液转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞(TakaraBio公司制)，接种到含50μg/mL抗生素氨苄青霉素的LB板上，培养一晚。生长的菌落，用小型制备法回收质粒DNA，用限制性酶SalI和NotI切断，选择出导入了非洲爪蟾来源的LDH基因的质粒。这一系列操作都按照附带的操作规程进行。

用限制性酶SalI和NotI切断插入了XLDH的pUC118载体，通过1％琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，按照常规方法纯化含有XLDH的片段。获得的片段连接到图5所示的表达载体pTRS11的XhoI/NotI切断部位，用与上述相同方法回收质粒DNA，通过用限制性酶XhoI和NotI切断，选择出插入了XLDH的表达载体pTRS102。

以如上所述获得的pTRS102作为XLDH的模板，在PDC1·SED1·TDH3基因座中插入LDH的方法说明如下。

(其2)向酵母染色体PDC1基因座插入LDH

以pTRS102作为扩增模板，通过以寡核苷酸(序列号4，5)作为引物对的PCR，扩增出含有XLDH和TDH3终止子序列的1.3kb的PCR片段。这里，序列号4被设计成添加了对应于PDC1基因的起始密码子上游60bp的序列。

然后，以质粒pTRS424作为扩增模板，通过以寡核苷酸(序列号6，7)作为引物对的PCR，扩增出含有作为酵母选择标记的TRP1基因的1.2kb的PCR片段。这里，序列号7被设计成添加了对应于PDC1基因终止密码子下游60bp的序列。

用1％琼脂糖凝胶电泳分离各个DNA片段，按常规方法纯化。以混合了此处获得的各1.3kb片段、1.2kb片段的混合物作为扩增模板，通过以寡核苷酸(序列号4，7)作为引物对的PCR法，扩增出了在5末端和3末端分别添加了对应于PDC1基因的上游和下游60bp的序列的连接了XLDH、TDH3终止子和TRP1基因的约2.5kb的PCR片段。

用1％琼脂糖凝胶电泳分离上述PCR片段，按常规方法纯化后，进行转化操作，用色氨酸非添加培养基进行培养，选择出XLDH导入在染色体上的PDC1基因启动子下游的转化株。

按下述方式对用上述方式获得的转化株为非洲爪蟾来源的L-LDH导入在染色体上PDC1基因启动子下游的酵母进行确认。首先，用基因组DNA提取试剂盒Genとるくん(TakaraBio公司制)制备转化株的基因组DNA，以其作为扩增模板，通过以寡核苷酸(序列号7，8)作为引物对的PCR，确认获得了约2.8kb的扩增DNA片段。而且，非转化株中，通过上述PCR获得了约2.1kb的扩增DNA片段。

(其3)向酵母染色体SED1基因座插入LDH

向SED1基因座的导入，以参考例1中制备的pTRS102作为扩增模板，通过以寡核苷酸(序列号5，9)作为引物对的PCR，扩增出含有非洲爪蟾来源的LDH基因和TDH3终止子序列的1.3kb的PCR片段。这里，序列号9被设计成添加了对应于SED1基因的起始密码子上游60bp的序列。

然后，通过以质粒pRS423作为扩增模板，以寡核苷酸(序列号6，10)作为引物对的PCR，扩增出含有作为酵母选择标记的HIS3基因的约1.3kb的PCR片段。这里，序列号10被设计成添加了对应于SED1基因终止密码子下游60bp的序列。

用1％琼脂糖凝胶电泳分离各个DNA片段，按常规方法纯化。通过以混合了此处获得的两种约1.3kb片段的混合物作为扩增模板，以寡核苷酸(序列号9，10)作为引物对的PCR法，扩增出了在5末端·3末端分别添加了对应于SED1基因的上游·下游60bp序列的连接了非洲爪蟾来源的LDH基因、TDH3终止子和HIS3基因的约2.6kb的PCR片段。

用1％琼脂糖凝胶电泳分离上述PCR片段，按常规方法纯化后，进行转化操作，用组氨酸非添加培养基进行培养，选择出XLDH导入在染色体上的SED1基因启动子的下游的转化株。

按下述方式对用上述方式获得的转化株为XLDH导入在染色体上的SED1基因启动子下游的酵母进行确认。首先，用基因组DNA提取试剂盒Genとるくん(TakaraBio公司制)制备转化株的基因组DNA，通过以其作为扩增模板，以寡核苷酸(序列号11，12)作为引物对的PCR，确认获得了约2.9kb的扩增DNA片段。而且，非转化株中，通过上述PCR获得了约1.4kb的扩增DNA片段。

(其4)向酵母染色体TDH3基因座导入LDH

对向TDH3基因座的导入，制作了将pTRS102的TDH3终止子变成ADH1终止子的质粒。

首先，用基因组DNA提取试剂盒Genとるくん(TakaraBio公司制)从NBRC10505株中提取基因组DNA，通过以提取的基因组DNA作为模板，以寡核苷酸(序列号13，14)作为引物对的PCR，扩增出含有ADH1启动子的PCR片段。这里，序列号13被制作成在5末端侧添加NotI识别序列，序列号14被制作成在3末端侧添加HindIII识别序列。

纯化PCR扩增片段，用T4多核苷酸激酶(TakaraBio公司制)对末端磷酸化后，连接到pUC118载体(用限制性酶HincII切断，对切断面进行脱磷酸化处理)中。用连接溶液转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞(TakaraBio公司制)，接种到含50μg/mL抗生素氨苄青霉素的LB板上，培养一晚。生长的菌落，用小型制备法回收质粒DNA，用限制性酶NotI和HindIII切断，选择出插入了ADH1终止子的质粒。制作的质粒称为pUC118-ADH1t。

然后，用限制性酶NotI和HindIII切断pUC118-ADH1t，通过1％琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，按照常规方法纯化含有ADH1终止子的片段。获得的含有ADH1终止子的片段连接到pTRS102的NotI/HindIII切断部位，用与上述相同方法回收质粒DNA，通过用限制性酶NotI和HindIII切断，选择出TDH3终止子变化为ADH1终止子的质粒。以后将这样制备的质粒称为pTRS150。

以该pTRS150作为模板，通过以寡核苷酸(序列号15，16)作为引物对的PCR，扩增出含有蛙类来源的L-LDH基因和ADH1终止子序列的1.3kb的PCR片段。这里，序列号16的引物被设计成添加了对应于TDH3基因的起始密码子上游60bp的序列。

然后，以质粒pRS426作为扩增模板，通过以寡核苷酸(序列号17，18)作为引物对的PCR，扩增出含有作为酵母选择标记的URA3基因的1.2kb的PCR片段。这里，序列号18的引物被设计成添加了对应于TDH3基因的终止密码子下游60bp的序列。

用1％琼脂糖凝胶电泳分离各个DNA片段，按常规方法纯化。以混合了此处获得的各1.3kb片段、1.2kb片段的混合物作为扩增模板，通过以寡核苷酸(序列号16，18)作为引物对的PCR法，扩增出了连接有XLDH、ADH1终止子和URA3基因的约2.5kb的PCR片段。

用1％琼脂糖凝胶电泳分离上述PCR片段，按常规方法纯化后，进行转化操作，用尿嘧啶非添加培养基进行培养，选择出XLDH导入在染色体上的TDH3基因启动子的下游的转化株。

按下述方式对用上述方式获得的转化株为XLDH导入在染色体上TDH3基因启动子下游的酵母进行确认。首先，用基因组DNA提取试剂盒Genとるくん(TakaraBio公司制)制备转化株的基因组DNA，通过以其作为扩增模板，以寡核苷酸(序列号19，20)作为引物对的PCR，确认获得了约2.8kb的扩增DNA片段。而且，非转化株中，通过上述PCR获得了约2.1kb的扩增DNA片段。

(其5)PDC5基因具有温度感受性变异的酵母的获得

温度感受性变异的给予，通过特开2008-048726号公报中记载的使pdc5基因中具有温度感受性变异的酵母SW015株与想给予温度感受性变异的酵母接合获得。使该2倍体酵母在子囊形成培养基中形成子囊，用显微操作器解剖子囊，获得各个单倍体细胞，研究各个单倍体细胞的营养需求性，从获得的单倍体细胞中，选择出在PDC1基因、SED1基因、TDH1基因座任意一个中插入了XLDH，且PDC5基因中具有温度感受性变异的(34℃不能生长)株。

接着，说明营养需求性的恢复方法。

(其6)赖氨酸营养需求性恢复株的制作

在使赖氨酸需求性恢复的情形使用以下方法。以Funakoshi公司制的BY4741的基因组DNA作为模板，通过以寡核苷酸(序列号21，22)作为引物对的PCR，扩增出LYS2基因的前半约2kb的PCR片段。用1％琼脂糖凝胶电泳分离上述PCR片段，按常规方法纯化后，进行转化操作，解除LYS2基因的琥珀突变。用赖氨酸非添加培养基培养，选择出赖氨酸合成能力恢复的转化株。

按下述方式对用上述方式获得的转化株为解除了LYS2基因的琥珀突变的酵母进行确认。首先，使获得的转化体与具有野生型的LYS2基因的20GY77株接合，获得2倍体细胞。使该2倍体细胞在子囊形成培养基上形成子囊。用显微操作器解剖子囊，获得各个单倍体细胞，研究各个单倍体细胞的营养需求性。确认了获得的所有单倍体细胞都具有赖氨酸合成能力。而且，在不解除LYS2基因的变异而恢复赖氨酸合成能力的情形时，上述获得的单倍体细胞中，获得了不具有赖氨酸合成能力的细胞。

(其7)亮氨酸营养需求性恢复株的获得

在使亮氨酸需求性恢复的情形，使用以下方法。以质粒PRS425作为模板，通过以寡核苷酸(序列号23，24)作为引物对的PCR，扩增出LEU2基因的约2kb的PCR片段。用1％琼脂糖凝胶电泳分离上述PCR片段，按常规方法纯化后，进行转化操作，解除LEU2基因的变异。用亮氨酸非添加培养基培养，选择出亮氨酸合成能力恢复的转化株。

按下述方式对用上述方式获得的转化株为解除了LEU2基因变异的酵母进行确认。首先，使获得的转化体与具有野生型的LEU2基因的酿酒酵母20GY7株接合，获得2倍体细胞。使该2倍体细胞在子囊形成培养基上形成子囊。用显微操作器解剖子囊，获得各个单倍体细胞，研究各个单倍体细胞的营养需求性。确认了获得的所有单倍体细胞都具有亮氨酸合成能力。而且，在不解除LEU2基因的变异而恢复亮氨酸合成能力的情形时，上述获得的单倍体细胞中，获得了不具有亮氨酸合成能力的细胞。

(其8)腺嘌呤营养需求性恢复株的获得

在使腺嘌呤需求性恢复的情形，使用以下方法。以质粒PRS422作为模板，通过以寡核苷酸(序列号25，26)作为引物对的PCR，扩增出ADE2基因的约2kbPCR片段。用1％琼脂糖凝胶电泳分离上述PCR片段，按常规方法纯化后，进行转化操作，解除LEU2基因的变异。用腺嘌呤非添加培养基培养，选择出腺嘌呤亮氨酸合成能力恢复的转化株。

按下述方式对用上述方式获得的转化株为解除了AED2基因变异的酵母进行确认。首先，使获得的转化体与具有野生型的ADE2基因的酿酒酵母20GY7株接合，获得2倍体细胞。使该2倍体细胞在子囊形成培养基上形成子囊。用显微操作器解剖子囊，获得各个单倍体细胞，研究各个单倍体细胞的营养需求性。确认了获得的所有单倍体细胞都具有腺嘌呤合成能力。而且，在不解除ADE2基因的变异而恢复腺嘌呤合成能力的情形时，上述获得的单倍体细胞中，获得了不具有腺嘌呤合成能力的细胞。

(其9)尿嘧啶营养需求性恢复株的获得

在使尿嘧啶需求性恢复的情形时，使用以下方法。以质粒pRS426作为模板，通过以寡核苷酸(序列号27，28)作为引物对的PCR，扩增出URA3基因的约2kb的PCR片段。用1％琼脂糖凝胶电泳分离上述PCR片段，按常规方法纯化后，进行转化操作，解除URA3基因变异。用尿嘧啶非添加培养基培养，选择出尿嘧啶合成能力恢复的转化株。

按下述方式对用上述方式获得的转化株为解除了URA3基因变异的酵母进行确认。首先，使获得的转化体与具有野生型的URA3基因的酿酒酵母20GY7株接合，获得2倍体细胞。使该2倍体细胞在子囊形成培养基上形成子囊。用显微操作器解剖子囊，获得各个单倍体细胞，研究各个单倍体细胞的营养需求性。确认了获得的所有单倍体细胞都具有尿嘧啶合成能力。而且，在不解除URA3基因的变异而恢复尿嘧啶合成能力的情形时，上述获得的单倍体细胞中，获得了不具有尿嘧啶合成能力的细胞。

(其10)具有生产乳酸能力的高倍体株的获得

使通过组合其1～9的方法获得的转化体接合，获得了没有营养需求性的2倍体原营养株。进而使2倍体原营养株在子囊形成培养基上形成子囊，用显微操作器解剖子囊，获得各个单倍体细胞。研究取得的各个单倍体细胞的营养需求性，对在SD培养基(表1)上生长的株，判断为营养需求性已恢复，作为单倍体原营养株。

[表2]

pdc5^ts-9：温度感受性变异

(参考例2)乳酸的定量方法

对于培养液的离心上清，通过在下述所示条件下用HPLC法测定乳酸量来确认乳酸。

柱：Shim-Pack SPR-H(株式会社岛津制作所制)

移动相：5mM对甲苯磺酸(流速0.8mL/分钟)

反应液：5mM对甲苯磺酸、20mM Bis-Tris、0.1mM EDTA·2Na(流速0.8mL/分钟)

检测方法：导电性

温度：45℃

此外，L-乳酸的光学纯度测定在以下条件下通过HPLC法测定。

柱：TSK-gel Enantio L1(注册商标：东曹株式会社制)

移动相：1mM硫酸铜水溶液

流速：1.0ml/分钟

检测方法：UV254nm

温度：30℃。

另外，L-乳酸的光学纯度用下式计算。

光学纯度(％)＝100×(L-D)/(L+D)

其中，L表示L-乳酸的浓度，D表示D-乳酸的浓度。

(参考例3)多孔性膜的制作(其1)

分别使用聚偏氟乙烯(PVDF)树脂作为树脂，并且N，N-二甲基乙酰胺(DMAc)作为溶剂，在90℃的温度下将它们充分搅拌，获得了具有以下组成的原液。

[原液]

·PVDF：13.0重量％

·DMAc：87.0重量％。

接着，上述原液在冷却到25℃的温度后，涂布在预先贴附在玻璃板上的密度为0.48g/cm³、厚度为220μm的聚酯纤维制无纺布(多孔质基材)上，立即浸渍于25℃温度的具有下述组成的凝固浴中5分钟，获得了在多孔质基材上形成了多孔质树脂层的平膜。

[凝固浴]

·水：30.0重量％

·DMAc：70.0重量％。

将该多孔性膜从玻璃板上剥离后，浸渍于80℃温度的热水中3次，洗出DMAc，获得了分离膜。用扫描型电子显微镜以10,000倍的倍率观察多孔质树脂层表面9.2μm×10.4μm的范围，能够观察到的所有细孔的直径平均值为0.1μm。然后，对该分离膜的纯水透过系数进行评价，结果是50×10^-9m³/m²/s/Pa。另外，平均细孔径的标准偏差为0.035μm，膜表面粗糙度为0.06μm。

(参考例4)多孔性膜的制作(其2)

重量平均分子量41.7万的偏氟乙烯均聚物和γ-丁内酯分别以38重量％和62重量％的比例于170℃的温度溶解，制作原液。该原液在以γ-丁内酯作为中空部形成液体进行伴随搅拌的同时，从金属口吐出，在温度20℃的γ-丁内酯80重量％水溶液构成的冷却浴中固化，制成中空纤维膜。

然后，按14重量％的重量平均分子量28.4万的偏氟乙烯均聚物，1重量％的乙酸丙酸纤维素(Eastman Chemical公司，CAP482-0.5)，77重量％的N-甲基-2-吡咯烷酮，5重量％的聚氧乙烯椰油脂肪酸失水山梨醇(三洋化成株式会社制，商品名“イオネツトT-20C”(注册商标))，和3重量％的水的比例，在95℃的温度混合溶解，调整原液。将该原液均匀涂布于上述获得的中空纤维膜的表面，立即在水浴中凝固，制成本发明中使用的中空纤维膜(多孔性膜)。获得的中空纤维膜(分离膜)的被处理水侧表面的平均细孔径为0.05μm。接着，对上述分离膜中空纤维膜的纯水透过系数进行评价，结果是5.5×10^-9m³/m²·s·Pa。而且，平均细孔径的标准偏差为0.006μm。

(实施例1)使用具有生产乳酸能力的高倍体(营养非缺陷型)酵母，通过连续发酵进行的乳酸的制造(其1)

使用参考例1中制备的酵母HI003株，用图1的连续发酵装置和表3所示组成的SC4培养基进行乳酸的制造。培养基在121℃温度高压蒸汽灭菌15分钟后再使用。分离膜组件部材采用不锈钢和聚砜树脂的成型品。分离膜使用上述参考例3中制备的多孔性膜。

表3

实施例1中的运行条件为如下条件。

·发酵反应槽容量：2(L)

·膜分离槽容量：0.5(L)

·使用分离膜：聚偏氟乙烯过滤膜(参考例3)

·膜分离元件有效过滤面积：60cm²

·温度调整：32(℃)

·发酵反应槽通气量：0.05(L/分钟)

·膜分离槽通气量：0.3(L/分钟)

·发酵反应槽搅拌速度：100(转/分钟)

·pH调整：用8N Ca(OH)₂调整到pH5

·乳酸发酵培养基供给速度：在50～300ml/小时的范围内可变控制

·通过发酵液循环装置进行的循环液量：0.1(L/分钟)

·膜透过水量控制：通过膜间差压进行的流量控制

(膜间差压：控制在0.1kPa～不到20kPa)

·含有分离膜元件的培养层用121℃、20分钟的高压灭菌器进行高压蒸汽灭菌。

生产物乳酸的浓度的评价中采用上述参考例2所示的HPLC，葡萄糖浓度的测定中采用“葡萄糖Test Wako C”(注册商标)(和光纯药公司制)。

首先，在试管中用5ml的SC4培养基振荡培养HI003株过夜，获得了培养液(前前前培养)。在新鲜的100ml SC4培养基中接种获得的培养液，用500ml容坂口烧瓶，30℃的温度振荡培养24小时(前前培养)。将前前培养液接种于图1所示的连续发酵装置的1.5L的SC4培养基中，用附带的搅拌机5搅拌发酵反应槽1，进行发酵反应槽1的通气量的调整、温度调整、pH调整，不使发酵培养液循环泵11运作，进行24小时培养(前培养)。前培养结束后，立即使发酵培养液循环泵11运作，除了前培养时的运行条件之外，还通气膜分离槽12，进行SC4培养基的连续供给，进行膜透过水量的控制使得膜分离型的连续发酵装置的发酵培养液量到达2L，并同时进行连续培养，通过连续发酵进行乳酸的制造。进行连续发酵试验时的膜透过水量的控制通过差压控制装置3进行，使得膜间差压适当变化以便达到0.1kPa以上至不到20kPa。适当地，测定膜透过发酵培养液中生产的乳酸浓度和残存的葡萄糖浓度。

进行800小时的连续发酵试验的结果是，如表6所示，可以通过稳定的乳酸的连续发酵进行制造。

(实施例2)通过使用具有生产乳酸能力的高倍体(营养非缺陷型)酵母的连续发酵进行乳酸的制造(其2)

使用参考例1制作的酵母HI003株，使用图2所示的连续发酵装置和表3所示组成的SC4培养基，进行乳酸的制造。该培养基在121℃的温度高压蒸气灭菌处理15分钟。作为分离膜组件部件，使用不锈钢和聚砜树脂的成型品。使用上述参考例3制作的多孔性分离膜作为分离膜。

实施例2中的运行条件如下。

·发酵反应槽容量：2(L)

·使用分离膜：聚偏氟乙烯过滤膜(参考例3)

·膜分离元件有效过滤面积：120cm²

·温度调整：32(℃)

·发酵反应槽通气量：0.05(L/分钟)

·乳酸发酵培养基供给速度：在50～300ml/小时的范围可变控制

·发酵反应槽搅拌速度：800(转/分钟)

·pH调整：用8N Ca(OH)₂调整到pH5

·膜透过水量控制：通过膜间差压进行流量控制

(膜间差压：控制在0.1kPa～不到20kPa)

·含有分离膜元件的培养槽通过121℃、20分钟的高压灭菌器进行高压蒸汽灭菌。

首先，在试管中用5ml的SC4培养基振荡培养HI003株过夜，获得了培养液(前前前培养)。在新鲜的100ml SC4培养基中接种获得的培养液，用500ml容坂口烧瓶，30℃的温度振荡培养24小时(前前培养)。将前前培养液接种于图2所示的膜分离型的连续发酵装置的1.5L的SC4培养基中，用附带的搅拌机5搅拌发酵反应槽1，以400转/分钟搅拌，进行发酵反应槽1的通气量的调整、温度调整、pH调整，进行24小时培养(前培养)。前培养结束后，立即进行SC4培养基的连续供给，进行膜透过水量的控制使得膜分离型的连续发酵装置的发酵液量到达1.5L，并同时进行连续培养，通过连续发酵进行乳酸的制造。进行连续发酵试验时的膜透过水量的控制通过差压控制装置3进行，使得膜间差压适当变化以便达到0.1kPa以上至不到20kPa。适当地，测定膜透过发酵培养液中生产的乳酸浓度和残存的葡萄糖浓度。并且，测定由乳酸和自葡萄糖浓度计算出的投入葡萄糖而求出的乳酸对糖收率、乳酸生产速度。

进行800小时的发酵试验的结果示于表6。通过使用图2所示的连续发酵装置的本发明的乳酸的制造方法，可以通过稳定的乳酸的连续发酵进行制造。

(实施例3)通过使用具有生产乳酸能力的高倍体(营养非缺陷型)的酵母的连续发酵进行乳酸的制造(其3)

除了使用上述参考例4中制成的多孔性膜作为分离膜以外，其余在与实施例1相同条件下实施，评价。进行750小时的连续发酵试验的结果示于表6。通过本发明的乳酸的制造方法，可以通过稳定的乳酸的连续发酵进行制造。

(实施例4)通过使用具有生产乳酸能力的高倍体(营养非缺陷型)的酵母的连续发酵进行乳酸的制造(其4)

除了使用上述参考例4中制成的多孔性分离膜作为分离膜以外，其余在与实施例2相同条件下实施，评价。进行770小时的发酵试验的结果示于表6。通过本发明的乳酸的制造方法，可以通过稳定的乳酸的连续发酵进行制造。

(比较例1)使用具有生产乳酸能力的高倍体(营养非缺陷型)酵母通过分批发酵进行乳酸的制造

进行作为采用菌体的发酵方式的最典型的分批发酵，评价该L-乳酸生产性。使用表3所示的SC4培养基，只使用图1的膜分离型的连续发酵装置的发酵反应槽1，进行分批发酵试验。培养基在121℃温度高压蒸汽灭菌15分钟后再使用。在该比较例1中，使用上述的参考例1中制备的酵母HI003株作为菌体，生产物乳酸的浓度和培养液中糖类的定量，采用上述参考例2中所示的HPLC。

比较例1的运行条件如下。

·发酵反应槽容量：2(L)

·温度调整：30(℃)

·发酵反应槽通气量：0.05(L/分钟)

·发酵反应槽搅拌速度：100(转/分钟)

·pH调整：用8N Ca(OH)₂调整到pH5

·培养槽用121℃、20分钟的高压灭菌器进行高压蒸汽灭菌。

首先，在试管中用5ml的乳酸发酵培养基振荡培养HI003株一晚(前前培养)。在新鲜的100ml乳酸发酵培养基中接种前前培养液，用500ml容坂口烧瓶，振荡培养24小时(前培养)。将前培养液接种于膜分离型的连续发酵装置的1L乳酸发酵培养基中，用附带的搅拌机5以100转/分钟搅拌发酵反应槽1，通气发酵反应槽1。进行温度的调整和pH的调整，不使发酵培养液循环泵11运作，进行分批发酵培养。此时的菌体增殖量在600nm处的吸光度为14。分批发酵的结果示于表6。发酵时间短，乳酸对糖收率、乳酸生产速度比本发明的实施例差。

(比较例2)使用单倍体酵母(营养非缺陷型)，通过连续发酵进行的乳酸的制造(其1)

除了使用参考例1制备的酵母HI003-1B株以外，其余用与实施例1相同条件进行评价。其结果是，在600小时，膜间差压达到20kPa以上的培养结束。该连续发酵试验结果示于表6。其结果表明使用高倍体酵母能够长时间稳定地制造乳酸。

(比较例3)使用单倍体酵母(营养非缺陷型)，通过连续发酵进行乳酸的制造(其2)

除了使用参考例1制备的酵母HI003-1B株以外，其余在与实施例2相同条件下实施评价。其结果是，在600小时，膜间差压达到20kPa以上的培养结束。该连续发酵试验结果示于表6。其结果表明使用高倍体酵母能够长时间稳定地制造乳酸。

(比较例4)使用单倍体酵母(营养非缺陷型)，通过连续发酵进行乳酸的制造(其3)

除了使用参考例1制备的酵母HI003-1B株以外，其余在与实施例3相同条件下实施评价。其结果是，在500小时，膜间差压达到20kPa以上的培养结束。该连续发酵试验结果示于表6。其结果表明使用高倍体酵母能够长时间稳定地制造乳酸。

(比较例5)使用单倍体酵母(营养非缺陷型)，通过连续发酵进行乳酸的制造(其4)

除了使用参考例1制备的酵母HI003-1B株以外，其余在与实施例4相同条件下实施评价。其结果是，在500小时，膜间差压达到20kPa以上的培养结束。该连续发酵试验结果示于表6。其结果表明使用高倍体酵母能够长时间稳定地制造乳酸。

(比较例6)使用单倍体酵母(营养非缺陷型)，通过连续发酵进行乳酸的制造(其1)

除了使用参考例1中制备的酵母SU014-3B株以外，其余在与实施例1相同条件下实施评价。其结果是，在300小时，膜间差压达到20kPa以上的培养结束。该连续发酵试验结果示于表6。其结果表明使用营养非缺陷型酵母或高倍体酵母能够长时间稳定地制造乳酸。

(比较例7)使用单倍体酵母(营养缺陷型)，通过连续发酵进行乳酸的制造(其2)

除了使用参考例1中制备的酵母SU014-3B株以外，其余在与实施例2相同条件下实施评价。其结果是，在280小时，膜间差压达到20kPa以上的培养结束。该连续发酵试验结果示于表6。其结果表明使用营养非缺陷型酵母或高倍体酵母能够长时间稳定地制造乳酸。

(比较例8)使用单倍体酵母(营养缺陷型)，通过连续发酵进行乳酸的制造(其3)

除了使用参考例1中制备的酵母SU014-3B株以外，其余在与实施例3相同条件下实施评价。其结果是，在350小时，膜间差压达到20kPa以上的培养结束。该连续发酵试验结果示于表6。其结果表明使用营养非缺陷型酵母或高倍体酵母能够长时间稳定地制造乳酸。

(比较例9)使用单倍体酵母(营养缺陷型)，通过连续发酵进行乳酸的制造(其4)

除了使用参考例1中制备的酵母SU014-3B株以外，其余在与实施例4相同条件下实施评价。其结果是，在270小时，膜间差压达到20kPa以上的培养结束。该连续发酵试验结果示于表6。其结果表明使用营养非缺陷型酵母或性高倍体酵母能够长时间稳定地制造乳酸。

(实施例5)使用具有生产乳酸能力的高倍体(营养非缺陷型)酵母，通过连续发酵进行乳酸的制造(其5)

除了使用表4记载的乳酸发酵培养基之外，其余在与实施例1相同条件下实施评价。进行800小时的发酵试验的结果示于表7。比SC4培养基营养源少的乳酸发酵培养基也可以通过本发明的乳酸的制造方法，通过稳定的乳酸的连续发酵进行制造。

[表4]

粗糖(Muso株式会社制) 50g

硫酸铵 1.5g

至1L

(实施例6)使用具有生产乳酸能力的高倍体(营养非缺陷型)酵母，通过连续发酵进行的乳酸的制造(其6)

除了使用表4记载的乳酸发酵培养基之外，其余在与实施例2相同条件下实施评价。进行800小时的发酵试验的结果示于表7。比SC4培养基营养源少的乳酸发酵培养基也可以通过本发明的乳酸的制造方法，通过稳定的乳酸的连续发酵进行制造。

(实施例7)使用具有生产乳酸能力的高倍体(营养非缺陷型)酵母，通过连续发酵进行乳酸的制造(其7)

除了使用表4记载的乳酸发酵培养基之外，其余在与实施例3相同条件下实施评价。进行800小时的发酵试验的结果示于表7。比SC4培养基营养源少的乳酸发酵培养基也可以通过本发明的乳酸的制造方法，通过稳定的乳酸的连续发酵进行制造。

(实施例8)使用具有生产乳酸能力的高倍体(营养非缺陷型)酵母，通过连续发酵进行乳酸的制造(其8)

除了使用表4记载的乳酸发酵培养基之外，其余在与实施例4相同条件下实施评价。进行800小时的发酵试验的结果示于表7。比SC4培养基营养源少的乳酸发酵培养基也可以通过本发明的乳酸的制造方法，通过稳定的乳酸的连续发酵进行制造。

(实施例9)使用具有生产乳酸能力的高倍体酵母(营养缺陷型)，通过连续发酵进行乳酸的制造(其1)

除了使用参考例1中制备的酵母SU014株以外，其余在与实施例5相同条件下实施评价。进行700小时的连续发酵试验的结果示于表7。与营养非缺陷型的高倍体酵母相比，乳酸对糖收率和乳酸生产速度上尽管稍差，但可以通过长时间稳定的乳酸的连续发酵进行制造。

(实施例10)使用具有生产乳酸能力的高倍体酵母(营养缺陷型)，通过连续发酵进行乳酸的制造(其2)

除了使用参考例1中制备的酵母SU014株以外，其余在与实施例6相同条件下实施评价。进行700小时的发酵试验的结果示于表7。与营养非缺陷型的高倍体酵母相比，乳酸对糖收率和乳酸生产速度上尽管稍差，但可以通过长时间稳定的乳酸的连续发酵进行制造。

(实施例11)使用具有生产乳酸能力的高倍体酵母(营养缺陷型)，通过连续发酵进行L-乳酸的制造(其3)

除了使用参考例1中制备的酵母SU014株以外，其余在与实施例7相同条件下实施评价。进行650小时的连续发酵试验的结果示于表7。与营养非缺陷型的高倍体酵母相比，乳酸对糖收率和乳酸生产速度上尽管稍差，但可以通过长时间稳定的乳酸的连续发酵进行制造。

(实施例12)使用具有生产乳酸能力的高倍体酵母(营养缺陷型)，通过连续发酵进行的乳酸的制造(其4)

除了使用参考例1中制备的酵母SU014株以外，其余在与实施例8相同条件下实施评价。进行670小时的发酵试验的结果示于表7。与营养非缺陷型的高倍体酵母相比，乳酸对糖收率和乳酸生产速度上尽管稍差，但可以通过长时间稳定的乳酸的连续发酵进行制造。

(比较例10)使用具有生产乳酸能力的高倍体(营养非缺陷型)酵母，通过分批发酵进行乳酸的制造

除了使用表4记载的乳酸发酵培养基之外，其余在与比较例1相同条件下实施评价。分批发酵的结果示于表7。发酵时间短，乳酸对糖收率、乳酸生产速度都比本发明实施例差。

(比较例11)使用具有生产乳酸能力的高倍体酵母(营养缺陷型)，通过分批发酵进行乳酸的制造

除了使用参考例1中制备的酵母SU014株以外，其余在与比较例2相同条件下实施评价。分批发酵的结果示于表7。发酵时间短，乳酸对糖收率、乳酸生产速度都比本发明实施例差。

(比较例12)使用具有生产乳酸能力的单倍体酵母(营养缺陷型)，通过连续发酵进行乳酸的制造(其1)

除了使用参考例1中制备的酵母SU014-3B株以外，其余在与实施例5相同条件下实施评价。其结果是，在300小时，膜间差压达到20kPa以上的培养结束。该连续发酵试验结果示于表7。其结果表明采用高倍体酵母能够长时间稳定地制造乳酸。

(比较例13)使用具有生产乳酸能力的单倍体酵母(营养缺陷型)，通过连续发酵进行乳酸的制造(其2)

除了使用参考例1中制备的酵母SU014-3B株以外，其余在与实施例6相同条件下实施评价。其结果是，在280小时，膜间差压达到20kPa以上的培养结束。该连续发酵试验结果示于表7。其结果表明使用高倍体酵母能够长时间稳定地制造乳酸。

(比较例14)使用具有生产乳酸能力的单倍体酵母(营养缺陷型)，通过连续发酵进行乳酸的制造(其3)

除了使用参考例1中制备的酵母SU014-3B株以外，其余在与实施例7相同条件下实施评价。其结果是，在单倍体酵母的情形，在350小时，膜间差压达到20kPa以上的培养结束。该连续发酵试验结果示于表7。其结果表明使用高倍体酵母能够长时间稳定地制造乳酸。

(比较例15)使用具有生产乳酸能力的单倍体酵母(营养缺陷型)，通过连续发酵进行乳酸的制造(其4)

除了使用参考例1中制备的酵母SU014-3B株以外，其余在与实施例8相同条件下实施评价。其结果是，在270小时，膜间差压达到20kPa以上的培养结束。该连续发酵试验结果示于表7。其结果表明使用高倍体酵母能够长时间稳定地制造乳酸。

(实施例13)使用具有生产乳酸能力的高倍体(营养非缺陷型)酵母，通过连续发酵进行乳酸的制造(其9)

除了膜分离组件有效过滤面积扩大到240cm²，使用表5记载的乳酸发酵培养基2之外，其余在与实施例1相同条件下实施评价。进行1400小时的发酵试验的结果示于图6～8。通过本发明的乳酸的制造方法，可以通过长时间稳定的乳酸的连续发酵进行制造。

[表5]

粗糖(Muso株式会社制) 100g

硫酸铵 1.5g

至1L

(实施例14)使用具有生产乳酸能力的高倍体(营养非缺陷型)酵母，通过连续发酵进行乳酸的制造(其10)

除了膜分离组件有效过滤面积扩大到240cm²、使用表5记载的乳酸发酵培养基2之外，其余在与实施例3相同条件下实施评价。进行1350小时的发酵试验的结果示于图6～8。通过本发明的乳酸的制造方法，可以通过长时间稳定的乳酸的连续发酵进行制造。

(实施例15)使用具有生产乳酸能力的高倍体(营养非缺陷型)酵母，通过连续发酵进行乳酸的制造(其11)

除了使用参考例1中制备的酵母SE001株以外，其余在与实施例13相同条件下实施评价。进行1350小时的发酵试验的结果示于图9～11。通过本发明的乳酸的制造方法，可以通过长时间稳定的乳酸的连续发酵进行制造。

(实施例16)使用具有生产乳酸能力的高倍体(营养非缺陷型)酵母，通过连续发酵进行乳酸的制造(其12)

除了使用参考例1中制备的酵母SE001株以外，其余在与实施例14相同条件下实施评价。进行1350小时的发酵试验的结果示于图9-11。通过本发明的乳酸的制造方法，可以通过长时间稳定的乳酸的连续发酵进行制造。

(比较例16)使用具有生产乳酸能力的单倍体酵母(营养缺陷型)，通过连续发酵进行乳酸的制造(其5)

除了使用参考例1中制备的酵母SU014-3B株以外，其余在与实施例13相同条件下实施评价。其结果是，在300小时，膜间差压达到20kPa以上的培养结束。该连续发酵试验结果示于图9～11。其结果表明使用高倍体酵母能够长时间稳定地制造乳酸。

(比较例17)使用具有生产乳酸能力的单倍体酵母(营养缺陷型)，通过连续发酵进行乳酸的制造(其6)

除了使用参考例1中制备的酵母SU014-3B株以外，其余在与实施例14相同条件下实施评价。其结果是，在280小时，膜间差压达到20kPa以上的培养结束。该连续发酵试验结果示于图9～11。其结果表明使用高倍体酵母能够长时间稳定地制造乳酸。

(比较例18)使用具有生产乳酸能力的单倍体酵母(营养缺陷型)，通过连续发酵进行乳酸的制造(其7)

除了使用参考例1中制备的酵母SE001-1A株以外，其余在与实施例15相同条件下实施评价。其结果是，在300小时，膜间差压达到20kPa以上的培养结束。该连续发酵试验结果示于图9～11。其结果表明使用高倍体酵母能够长时间稳定地制造乳酸。

(比较例19)使用具有生产乳酸能力的单倍体酵母(营养缺陷型)，通过连续发酵进行乳酸的制造(其8)

除了使用参考例1中制备的酵母SE001-1A株以外，其余在与实施例16相同条件下实施评价。其结果是，在270小时，膜间差压达到20kPa以上的培养结束。该连续发酵试验结果示于图9～11。其结果表明使用高倍体酵母能够长时间稳定地制造乳酸。

另外，实施例1～16和比较例1～19的培养条件示于表8。

[表6]

[表7]

[表8]

供试菌

培养装置

分离膜

培养基

结果

分离膜面积

实施例1

HI003

图1

参考例3

表3

表6

60cm²

实施例2

HI003

图2

参考例3

表3

表6

120cm²

实施例3

HI003

图1

参考例4

表3

表6

60cm²

实施例4

HI003

图2

参考例4

表3

表6

120cm²

实施例5

HI003

图1

参考例3

表4

表7

60cm²

实施例6

HI003

图2

参考例3

表4

表7

120cm²

实施例7

HI003

图1

参考例4

表4

表7

60cm²

实施例8

HI003

图2

参考例4

表4

表7

120cm²

实施例9

SU014

图1

参考例3

表4

表7

60cm²

实施例10

SU014

图2

参考例3

表4

表7

120cm²

实施例11

SU014

图1

参考例4

表4

表7

60cm²

实施例12

SU014

图2

参考例4

表4

表7

120cm²

实施例13

HI003

图1

参考例3

表5

图6图7图8

240cm²

实施例14

HI003

图1

参考例4

表5

图6图7图8

240cm²

实施例15

SE001

图1

参考例5

表5

图9图10图11

240cm²

实施例16

SE001

图1

参考例6

表5

图9图10图11

240cm²

比较例1

HI003

图1(分批培养)

表3

表6

比较例2

HI003-1B

图1

参考例3

表3

表6

60cm²

比较例3

HI003-1B

图2

参考例3

表3

表6

120cm²

比较例4

HI003-1B

图1

参考例4

表3

表6

60cm²

比较例5

HI003-1B

图2

参考例4

表3

表6

120cm²

比较例6

SU014-3B

图1

参考例3

表3

表6

60cm²

比较例7

SU014-3B

图2

参考例3

表3

表6

120cm²

比较例8

SU014-3B

图1

参考例4

表3

表6

60cm²

比较例9

SU014-3B

图2

参考例4

表3

表6

120cm²

比较例10

HI003

图1(分批培养)

表4

表7

比较例11

SU014

图1(分批培养)

表4

表7

比较例12

SU014-3B

图1

参考例3

表4

表7

60cm²

比较例13

SU014-3B

图2

参考例3

表4

表7

120cm²

比较例14

SU014-3B

图1

参考例4

表4

表7

60cm²

比较例15

SU014-3B

图2

参考例4

表4

表7

120cm²

比较例16

SU014-3B

图1

参考例3

表5

图6图7图8

240cm²

比较例17

SU014-3B

图1

参考例4

表5

图6图7图8

240cm²

比较例18

SE001-1A

图1

参考例5

表5

图9图10图11

240cm²

比较例19

SE001-1A

图1

参考例6

表5

图9图10图11

240cm²

工业实用性

根据本发明的以高倍体酵母作为供试菌、通过连续发酵法实施的乳酸的制造方法，可以在简便的操作条件下进行长时间稳定地维持所希望的发酵生产物乳酸的高生产性的连续发酵，在广泛的发酵工业中，能够以低成本稳定地生产发酵生产物乳酸。

Claims

1.通过连续发酵的乳酸的制造方法，其特征在于，用平均细孔径为0.01μm以上至不到1μm的多孔性膜过滤处理具有生产乳酸能力的高倍体酵母的培养液，从滤液中回收生产物，同时使未滤过液保持在或返流到该培养液中，并在该培养液中追加发酵原料。

2.权利要求1所述的乳酸的制造方法，其特征在于，在多孔性膜的膜间差压为0.1kPa以上至不到20kPa的范围内进行过滤处理。

3.权利要求1或2所述的乳酸的制造方法，其特征在于，高倍体酵母是2倍体。

4.权利要求1～3任一项所述的乳酸的制造方法，其特征在于，高倍体酵母是营养非缺陷型。

5.权利要求1～4任一项所述的乳酸的制造方法，其特征在于，连续发酵的乳酸对糖收率是70％以上。

6.权利要求1～5任一项所述的乳酸的制造方法，其特征在于，连续发酵的培养液中的乳酸蓄积浓度是40g/L以上。

7.权利要求1～6任一项所述的乳酸的制造方法，其特征在于，连续发酵的乳酸生产速度是7.5g/L以上。

8.权利要求5～7任一项所述的乳酸的制造方法，其特征在于，使连续发酵继续400小时以上。

9.权利要求1～8任一项所述的乳酸的制造方法，其特征在于，高倍体酵母属于酵母属(Saccharomyces)。

10.权利要求1～9任一项所述的乳酸的制造方法，其特征在于，高倍体酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。