CN106987606A - 化学品的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的课题是提供以六碳糖与五碳糖的混合糖为发酵原料的高收率的化学品的制造方法。作为本发明的解决问题的方法是,提供化学品的制造方法,是通过连续发酵来制造化学品的方法,包括:将微生物的培养液用分离膜过滤,将未过滤液保持在或回流至培养液中,在培养液中补加发酵原料,和回收过滤液中的生产物,所述发酵原料包含五碳糖和六碳糖,所述微生物是具有使用戊糖还原酶和五醇脱氢酶来代谢五碳糖的途径的微生物。
Description
本申请发明是申请号为201380005123.8、发明名称为化学品的制造方法、申请日为2013年1月11日的申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及使用了包含六碳糖和五碳糖的发酵原料的通过连续发酵来制造化学品的方法。
背景技术
以乳酸等生物分解性聚合物原料、乙醇等生物燃料为代表的来源于生物质的化学品作为二氧化碳向大气中的排放问题和/或能源问题的显在化、以及可持续性(sustainability)和生命周期评估(LCA)对应型制品,受到强烈关注。作为这些生物分解性聚合物原料、生物燃料的制造方法,一般使用从玉米等可食性生物质纯化而得的六碳糖葡萄糖作为微生物的发酵原料,作为发酵产物得到,但如果使用可食性生物质,则可能由于与食物竞争而引起价格高涨,不能实现稳定的原料供应。于是,进行了使用来源于稻秸等非可食性生物质的糖作为微生物的发酵原料的尝试(参照专利文献1)。
使用来源于非可食性生物质的糖作为发酵原料时,将非可食生物质所含的纤维素、半纤维素等通过糖化酶分解成糖,但此时不仅得到葡萄糖等六碳糖,还同时得到木糖等五碳糖,在使用来源于非可食性生物质的糖作为微生物的发酵原料的情况下,需要使用六碳糖与五碳糖的混合糖作为发酵原料(参照专利文献1)。在使用六碳糖与五碳糖的混合糖时,需要使用除了六碳糖的代谢途径之外还具有五碳糖的代谢途径的微生物。作为五碳糖的代谢途径,已知通过戊糖还原酶和五醇脱氢酶的代谢途径,已知作为第一阶段,戊糖还原酶与五碳糖作用而生成五醇,作为第二阶段,五醇脱氢酶与五醇作用。然而,实际上第一阶段所生成的五醇不进入第二阶段以后的代谢途径而蓄积在培养液中,因而存在生产收率不提高这样的课题。
作为以作为六碳糖与五碳糖的混合糖的来源于非可食性生物质的糖为微生物的发酵原料的发酵方法,可采用连续发酵,但实际对于连续发酵时的发酵收率并未确认(参照专利文献1)。另一方面,还已知将六碳糖与五碳糖的混合糖作为发酵原料进行连续发酵时,与分批发酵相比发酵收率显著降低(参照非专利文献1)。
因此,想要在以六碳糖与五碳糖的混合糖为发酵原料的具有通过戊糖还原酶和五醇脱氢酶的五碳糖的代谢途径的微生物的发酵中提高发酵收率时,到目前为止的技术常识是认为,需要通过突变导入和/或基因导入来进行木糖代谢途径的改良。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:WO2010/067785
非专利文献
非专利文献1:Susan T.Toon等,Enhanced Cofermentation of Glucose andXylose by Recombinant Saccharomyces Yeast Strains in batch and ContinuousOperating Modes.,Applied Biochemistry and Biotechnology.,(1997),63-65,243-255.
发明内容
发明要解决的课题
本发明的课题是,提高以六碳糖与五碳糖的混合糖作为具有通过戊糖还原酶和五醇脱氢酶的五碳糖代谢途径的微生物的发酵原料进行发酵时的发酵收率。
用于解决课题的方法
本发明者们对上述课题进行了深入研究,结果通过在使用具有戊糖还原酶和戊糖脱氢酶的微生物时,用包含六碳糖和五碳糖的发酵原料进行使用分离膜的连续发酵,从而解决了上述课题,实现了从六碳糖与五碳糖的混合糖中的收率提高,完成了本发明。
即,本发明如以下(1)~(7)。
(1)化学品的制造方法,是通过连续发酵来制造化学品的方法,包括:将微生物的培养液用分离膜过滤,将未过滤液保持在或回流至培养液中,在培养液中补加发酵原料,和回收过滤液中的生产物,
所述发酵原料包含五碳糖和六碳糖,所述微生物是具有使用戊糖还原酶和五醇脱氢酶来代谢五碳糖的途径的微生物。
(2)根据(1)所述的化学品的制造方法,在体积传氧系数即KLa为5~300小时-1的条件下进行连续发酵。
(3)根据(1)或(2)所述的化学品的制造方法,所述发酵原料中所含的五碳糖与六碳糖的比率为1:9~9:1。
(4)根据(1)或(2)所述的化学品的制造方法,所述发酵原料包含来源于生物质的糖液。
(5)根据(1)~(4)的任一项所述的化学品的制造方法,五碳糖是木糖。
(6)根据(1)~(5)的任一项所述的化学品的制造方法,戊糖还原酶是木糖还原酶。
(7)根据(1)~(6)的任一项所述的化学品的制造方法,五醇脱氢酶是木糖醇脱氢酶。
发明的效果
根据本发明,可以大幅提高使用包含五碳糖和六碳糖的发酵原料的具有戊糖还原酶和戊糖脱氢酶的微生物的各种化学品的发酵生产的效率收率。
具体实施方式
本发明的化学品的制造方法的特征在于,是作为发酵原料使用包含五碳糖和六碳糖的混合糖的发酵原料,培养具有戊糖还原酶和戊糖脱氢酶的微生物,将其培养液用分离膜过滤,将未过滤液保持在或回流至培养液中,并且在培养液中补加发酵原料,回收过滤液中的生产物的连续发酵。
五碳糖是指构成糖的碳的数为5的糖,也称为戊糖(Pentose)。有1位具有醛基的戊醛糖和2位具有酮基的戊酮糖。作为戊醛糖,可列举木糖、阿拉伯糖、核糖、来苏糖,作为戊酮糖,可列举核酮糖、木酮糖。作为本发明中使用的五碳糖,只要是微生物能够同化的五碳糖则可以是任一种,从自然界的存在比例和/或获得的容易性等观点出发,优选木糖、阿拉伯糖,更优选木糖。
六碳糖是构成糖的碳的数为6的糖,也称为己糖(Hexose)。有1位具有醛基的醛糖和2位具有酮基的酮糖。作为醛糖,可列举葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿洛糖、古洛糖、塔罗糖等,作为酮糖,可列举果糖、阿洛酮糖、山梨糖等。作为本发明中使用的六碳糖,只要是微生物能够同化的六碳糖就可以是任一种,从自然界中的存在比例和/或获得容易性等观点出发,优选葡萄糖、甘露糖、半乳糖,更优选葡萄糖。
关于本发明中使用的混合糖不特别限定,但由于包含六碳糖与五碳糖两者,因而优选使用来源于含纤维素的生物质的糖液。含纤维素的生物质可列举甘蔗渣、柳枝稷、玉米秸、稻秸、麦秸等草木系生物质、和树木、废建材等木质系生物质等为例。含纤维素的生物质含有作为糖脱水缩合而成的多糖的纤维素或者半纤维素,通过将这样的多糖水解来制造可作为发酵原料利用的糖液。来源于含纤维素的生物质的糖液的制备方法可以是任何方法,作为这样的糖的制造方法,公开了使用浓硫酸将生物质进行酸水解来制造糖液的方法(日本特表平11-506934号公报、日本特开2005-229821号公报),将生物质用稀硫酸进行水解处理后进一步进行纤维素酶等的酶处理从而制造糖液的方法(A.Aden等,“LignocellulosicBiomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover”NREL Technical Report(2002))。另外作为不使用酸的方法,公开了使用250~500℃左右的亚临界水将生物质进行水解来制造糖液的方法(日本特开2003-212888号公报),以及将生物质进行亚临界水处理后进一步进行酶处理从而制造糖液的方法(日本特开2001-95597号公报),将生物质用240~280℃的加压热水进行水解处理后进一步进行酶处理从而制造糖液的方法(日本特许3041380号公报)。如以上那样的处理之后,还可以将所得的糖液进行纯化。其方法在例如WO2010/067785中公开。
作为混合糖所含的五碳糖与六碳糖的重量比率,可以是任何比率,但如果作为混合糖中的五碳糖与六碳糖的重量比率表示为(五碳糖):(六碳糖),则优选为1:9~9:1。这是假定来源于含纤维素的生物质的糖液为混合糖时的糖比率。
作为混合糖的总糖浓度,在微生物不受到底物抑制的程度内优选为高浓度。如果糖浓度过低,则生产效率差,因而优选为20g/L以上。作为优选的总糖浓度的范围,为20~500g/L。鉴于上述,则五碳糖的浓度优选为5g/L以上,六碳糖的浓度优选为5g/L以上。
另外,作为发酵原料所含的氮源可使用氨气、氨水、铵盐类、尿素、硝酸盐类、其他辅助使用的有机氮源例如油粕类、大豆水解液、酪蛋白分解物、其他氨基酸、维生素类、玉米浆、酵母或酵母提取物、肉提取物、胨等肽类、各种发酵菌体及其水解物等。作为无机盐类,可适宜添加使用磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐和锰盐等。
本发明中使用的微生物为了生长繁殖而需要特定的营养素时,可以将其营养物作为标准品或含有该营养物的天然物添加。另外,还可以根据需要使用消泡剂。在本发明中,培养液是指微生物在发酵原料中增殖而得的液体。补加的发酵原料的组成可以由培养开始时的发酵原料组成适宜变更,以使目的化学品的生产性变高。
接下来,对于可以在本发明的化学品的制造方法中使用的微生物进行说明。对于本发明的微生物,只要是具有戊糖还原酶和戊糖脱氢酶的微生物就不特别限定。进而,使用的微生物可以是从自然环境中分离的微生物,也可以是通过突变和/或基因重组而部分性质被改变的微生物。
戊糖还原酶是还原酶的一种,是指以NADH或NADPH为辅酶具有将戊醛糖转换为糖醇的活性的酶。例如,木糖还原酶相当于例如EC1.1.1.307、EC1.1.1.21,是将木糖转换为木糖醇的酶。阿拉伯糖还原酶相当于例如EC1.1.1.21,是将阿拉伯糖转换为阿糖醇的酶。另外,即使不是以上述EC编号分类的酶,只要是具有上述活性的酶,也包含在本发明中的戊糖还原酶中。
五醇脱氢酶是脱氢酶的一种,是以NAD+作为辅酶将五醇转换为戊酮糖的酶。例如,木糖醇脱氢酶相当于例如EC1.1.1.9、EC1.1.1.10,是将木糖醇转换为木酮糖的酶。阿糖醇脱氢酶相当于例如EC1.1.1.11、EC1.1.1.12,是将阿糖醇转换为核糖的酶。即使是分类上与五醇脱氢酶不同的酶,只要是具有上述活性的酶,也包含在本发明中的五醇脱氢酶中。
能代谢戊糖的微生物作为具有戊糖还原酶和戊糖脱氢酶的微生物而已知。例如,毕赤酵母(Pichia)属、假丝酵母(Candida)属、管囊酵母(Pachysolen)属、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、汉逊酵母属(Hansenula)球拟酵母属(Torulopsis)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)、伊萨酵母属(Issachenkia)、酒香酵母属(Brettanomyces)、リンドネラ属(Lindnera)、威克汉姆酵母属(Wickerhamomyces)等。具体可列举树干毕赤酵母(Pichiastipitis)、ピキア·メキシカーナ(Pichia mexcana)、休哈塔假丝酵母(Candidashehatae)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、纤维假丝酵母(Candida tenuis)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、キャンディダ·ソノレンシス(Candida sonorensis)、キャンディダ·ディッデンシ(Candida diddensiae)、中间假丝酵母(Candida intermedia)、近平滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis)、キャンディダ·メタノソルボーサ(Candida methanosorbosa)、キャンディダ·ウィッカーハミイ(Candida wickerhamii)、嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、イッサチェンキア·オリエンタリス(Issachenkia orientalis)、汉逊德巴利氏酵母(Debaryomyceshansenii)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、球拟酵母(Torulopsis bombicola)、纳氏酒香酵母(Brettanomyces naardenensis)、リンドネラ·ロダネンシス(Lindnerarhodanensis)、ウィッカーハモミセス·ラバウレンシス(Wickerhamomyces rabaulensis)等。它们具有戊糖还原酶和戊糖脱氢酶,可以通过利用KEGG(Kyoto Encyclopedia ofGenes and Genomes,京都基因与基因组百科全书)、GenBank等的Web所公开的数据库进行检索而简单地获知。
另外,即使是数据库中无信息的微生物,也可以通过以下[1]、[2]所示的酶活性测定来获知。
[1]戊糖还原酶活性测定
在包含200mM的木糖(或阿拉伯糖等的戊糖)、和100μL的1.5mM的NAD(P)H的50mM的磷酸缓冲液(900μL)中添加培养微生物的菌体提取液,在30℃监测反应所生成的NAD(P)+特异的340nM的吸光度的减少,从而可以测定戊糖还原酶活性。
[2]五醇脱氢酶活性测定
在包含50mM的MgCl2、300mM的木糖醇(或阿拉伯糖等的戊糖)和100μL的10mM的NAD(P)+的50mM的Tris-HCl缓冲液900μL中添加培养微生物的菌体提取液,在35℃监测反应所生成的NAD(P)H特异的340nM的吸光度的增加,从而可以测定五醇脱氢酶活性。
进而,即使是细菌、面包酵母等本来不具有戊糖还原酶和戊糖脱氢酶活性的微生物,只要通过基因重组使其表达该酶,则也包含在本发明中。作为本来不具有戊糖还原酶和戊糖脱氢酶活性的微生物已知的可列举,大肠菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtillis)、スポロラクトバチルス·ラエボラクティカス(Sporolactobacillus laevolacticus)、多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymixa)、运动发酵单孢菌(Zymomonas mobilis)、棕榈发酵单孢菌(Zymobacter palmae)等。作为通过基因重组来制作表达该酶的微生物的方法,在日本特开2009-112289等中公开。
进而,还可以将具有该酶的微生物通过突变导入和/或基因重组而强化发酵能力,和/或导入外来基因而生产本来不产生的物质。具体地,是除了木糖还原酶和木糖醇脱氢酶之外还导入木糖异构酶,使作用于木糖醇的代谢物木酮糖的木酮糖激酶高表达,或对不生产D-乳酸的微生物导入D-乳酸脱氢酶,等等。
接下来,对于在本发明中作为分离膜使用的多孔性膜进行说明。
对于本发明中使用的多孔质膜不特别限定,只要具有将在微生物的利用搅拌型培养器或者搅拌型生物反应器的培养中所得的培养液从微生物进行分离过滤的功能即可,可以使用例如多孔质陶瓷膜、多孔质玻璃膜、多孔质有机高分子膜、金属纤维编织体、无纺布等。其中特别是多孔质有机高分子膜或陶瓷膜是合适的。
对于本发明中作为分离膜使用的多孔性膜的构成进行说明。本发明中使用的多孔性膜优选具有适应被处理水的水质和/或用途的分离性能和透水性能。
多孔性膜从阻挡性能和透水性能、分离性能、例如耐污染性的观点出发,优选为包含多孔质树脂层的多孔性膜。
包含多孔质树脂层的多孔性膜优选在多孔质基材的表面具有作为分离功能层发挥作用的多孔质树脂层。多孔质基材支撑多孔质树脂层而赋予分离膜以强度。
本发明中使用的多孔性膜在多孔质基材的表面具有多孔质树脂层时,无论多孔质树脂层渗透到多孔质基材中,还是多孔质树脂层不渗透到多孔质基材中,任一者均可,可根据用途选择。
多孔质基材的平均厚度优选为50μm~3000μm。
多孔质基材的材质包含有机材料和/或无机材料等,期望使用有机纤维。优选的多孔质基材是由纤维素纤维、三乙酸纤维素纤维、聚酯纤维、聚丙烯纤维和聚乙烯纤维等有机纤维制成的纺织布和/或无纺布,更优选使用密度的控制比较容易、制造也容易且廉价的无纺布。
多孔质树脂层可以适合使用有机高分子膜。作为有机高分子膜的材质,可列举例如,聚乙烯系树脂、聚丙烯系树脂、聚氯乙烯系树脂、聚偏-1,1-二氟乙烯系树脂、聚砜系树脂、聚醚砜系树脂、聚丙烯腈系树脂、纤维素系树脂和三乙酸纤维素系树脂等。有机高分子膜也可以是以这些树脂为主成分的树脂的混合物。这里主成分是指该成分含有50重量%以上、优选60重量%以上。有机高分子膜的材质优选使用利用溶液的制膜容易且物理耐久性和/或耐化学性也优异的聚氯乙烯系树脂、聚偏-1,1-二氟乙烯系树脂、聚砜系树脂、聚醚砜系树脂和聚丙烯腈系树脂,最优选使用聚偏-1,1-二氟乙烯系树脂或以其为主成分的树脂。
这里,作为聚偏-1,1-二氟乙烯系树脂,优选使用偏-1,1-二氟乙烯的均聚物。进而,聚偏-1,1-二氟乙烯系树脂还优选使用与可与偏-1,1-二氟乙烯共聚的乙烯基系单体的共聚物。作为可与偏-1,1-二氟乙烯共聚的乙烯基系单体,可例示四氟乙烯、六氟丙烯和三氯氟乙烯等。
对本发明中作为分离膜使用的多孔性膜不特别限定,只要发酵中使用的微生物能够通过即可,但期望不易发生由发酵中使用的微生物的分泌物和/或发酵原料中的微粒造成的堵塞、且过滤性能为长时间稳定地继续的范围。因此,优选多孔性分离膜的平均细孔径为0.01μm以上且小于5μm。另外,进一步优选如果多孔性膜的平均细孔径为0.01μm以上且小于1μm,则可以兼备微生物会不泄漏的高排除率和高透水性,可以具有更高的精度和再现性地实现长时间保持透水性。
如果与微生物的大小接近,则有时这些物质直接塞住孔,所以多孔性膜的平均细孔径优选小于1μm。为了防止微生物的漏出、即排除率降低的不良状况发生,多孔性膜的平均细孔径优选与微生物的大小相比不过大。在使用微生物中细胞较小的细菌等时,作为平均细孔径优选为0.4μm以下,如果小于0.2μm,则可以更适合地实施。
另外,有时微生物生产除了作为所期望的生产物的化学品以外的物质,例如,蛋白质和/或多糖类等易凝集的物质,进而,有时由于培养液中的微生物的一部分死亡而生成细胞的破碎物,为了避免这些物质造成的多孔性膜的堵塞,平均细孔径更适合为0.1μm以下。
如果平均细孔径过小,则多孔性膜的透水性能降低,即使膜不污染也不能有效地运转,因而本发明中的多孔性膜的平均细孔径优选为0.01μm以上,更优选为0.02μm以上,进一步优选为0.04μm以上。
这里,平均细孔径可以通过测定在倍率10,000倍的扫描型电子显微镜观察中能够在9.2μm×10.4μm的范围内观察到的全部细孔的直径,并进行平均来求得。平均细孔径或者也可以使用扫描型电子显微镜以倍率10,000倍将膜表面拍摄照片,随机选择10个以上、优选20个以上的细孔测定它们的细孔直径,并进行数平均而求得。在细孔不是圆形时,通过用图像处理装置等求出具有与细孔所具有的面积相等的面积的圆(等价圆),以等价圆直径作为细孔的直径的方法来求得。
本发明中使用的多孔性膜的平均细孔径的标准偏差σ优选为0.1μm以下。平均细孔径的标准偏差σ越小越好。平均细孔径的标准偏差σ可以将上述的能够在9.2μm×10.4μm的范围内观察到的细孔数作为N,将测定的各个直径作为Xk,将细孔直径的平均作为X(ave),通过下述式(1)算出。
在本发明中使用的多孔性膜中,发酵培养液的透过性是重要的性能之一。作为多孔性膜的透过性的指标,可以利用使用前的多孔性膜的纯水透过系数。在本发明中,多孔性膜的纯水透过系数,在使用温度为25℃的反渗透膜纯化水,以头高1m测定透水量进行计算时,优选为5.6×10-10m3/m2/s/pa以上,如果纯水透过系数为5.6×10-10m3/m2/s/pa~6×10- 7m3/m2/s/pa,则可以得到实用上充分的透过水量。
在本发明中使用的多孔性膜中,表面粗糙度是与表面垂直方向的高度的平均值。膜表面粗糙度是为了附着于分离膜表面的微生物容易通过因由搅拌和/或循环泵产生的液流带来的膜面清洗效果而剥离的因子之一。对多孔性膜的表面粗糙度不特别限定,只要是附着于膜的微生物、以及其他固形物可被剥离的范围即可,优选为0.1μm以下。如果表面粗糙度为0.1μm以下,附着于膜的微生物、以及其他固形物容易被剥离。
明白了进一步优选通过使用多孔性膜的膜表面粗糙度为0.1μm以下、平均细孔径为0.01μm以上且小于1μm、多孔性膜的纯水透过系数为2×10-9m3/m2/s/pa以上的多孔性膜,不过度需要膜面清洗所需的动力的运转可以更容易。通过使多孔性膜的表面粗糙度为0.1μm以下,可以降低在微生物的过滤中在膜表面发生的剪切力,微生物的破坏被抑制,多孔性膜的堵塞也被抑制,从而长时间稳定的过滤可以更容易。另外,通过使多孔性膜的表面粗糙度为0.1μm以下,可以以更低的膜间压差实施连续发酵,即使在多孔性膜堵塞时,与以高膜间压差运转的情况下相比,清洗恢复性也更良好。通过抑制多孔性膜的堵塞,可以实现稳定的连续发酵,因此多孔性膜的表面粗糙度越小越好。
这里,多孔性膜的膜表面粗糙度使用下述原子力显微镜装置(AFM)在下述条件下测定。
·装置原子力显微镜装置(Digital Instruments(株)制“NanoscopeIIIa”)
·样品制备测定时,膜样品在常温下浸渍于乙醇中15分钟后,在RO水中浸渍清洗24小时后,风干使用。RO水是指使用作为过滤膜的一种的反渗透膜(RO膜)进行过滤,排除离子、盐类等杂质后的水。RO膜的孔的大小大概为2nm以下。
膜表面粗糙度drough通过上述原子力显微镜装置(AFM),由各点的Z轴方向的高度,通过下述式(2)算出。
drough:平均表面粗糙度(μm)
Zn:Z轴方向的高度(μm)
扫描范围的平均高度(μm)
本发明中使用的多孔性膜的形状优选为平膜。多孔性膜的形状为平膜时,其平均厚度可根据用途选择。多孔性膜的形状为平膜时的平均厚度优选为20μm~5000μm,更优选50μm~2000μm。另外,本发明中使用的多孔性膜的形状优选为中空丝膜。多孔性膜为中空丝膜时,中空丝的内径优选为200μm~5000μm,膜厚优选为20μm~2000μm。另外,中空丝的内部还可以含有将有机纤维或无机纤维制成了筒状纺织物和/或编织物。
此外,前述多孔性膜可以通过例如WO2007/097260所记载的制造方法来制造。
另外,作为其他优选方式,本发明中的分离膜可以是至少包含陶瓷的膜。本发明中的陶瓷是指含有金属氧化物、通过高温下的热处理被烧硬而得的物质。作为金属氧化物,可以例示氧化铝、氧化镁、氧化钛、氧化锆等。分离膜可以仅由金属氧化物形成,也可以包含二氧化硅和/或碳化硅、作为二氧化硅与金属氧化物的化合物的莫来石、堇青石等。
对形成分离膜的除陶瓷以外的成分,只要能够形成作为分离膜的多孔质体,就不特别限定。
分离膜包含陶瓷时对其形状也不特别限定,可以使用独块(monolith)膜、平膜、管状膜等任一种。从向容器内的填充效率的观点考虑,优选柱状结构、且较长方向具有贯通孔的结构的分离膜。从填充效率提高的观点考虑,优选独块(monolith)膜。
优选在较长方向具有贯通孔的理由如下。将具有柱状结构的分离膜收纳在组件容器中作为分离膜组件使用时,分离膜可以从外压式和内压式中选择合适的方式进行组件化、过滤。本发明中,此后,将分离膜与发酵培养液相接的侧称为1次侧,将过滤而得到包含化学品的滤液的侧称为2次侧。
如果使用内压式组件,则由于1次侧的流路狭窄,因而可以在进行错流过滤时节约循环泵的输出功率。进而,将堆积在分离膜表面的污浊物排出组件外的作用变强,容易保持分离膜表面清洁,因而优选。但是,为了获得该效果,内压式的分离膜具有发酵培养液的入口和出口是前提。如果此时的入口和出口是配置于一条直线上的贯通孔的状态,则通液阻抗变小,因而优选。进而通过使分离膜为柱状结构、贯通孔在较长方向空出,可以使收纳分离膜的容器变细。如果分离膜组件细,则从制造和/或操作的观点考虑,可以优选使用。
对分离膜的孔隙率不特别限定,如果过低,则过滤效率变差,如果过高,则强度降低。为了兼具过滤效率和分离膜的强度、还具有对反复蒸气灭菌的耐性,优选为20%~60%。
此外孔隙率通过以下式确定。
孔隙率[%]=100×(湿润膜重量[g]-干燥膜重量[g])/水比重[g/cm3]/(膜体积[cm3])。
分离膜的平均孔径优选为0.01μm~1μm,如果是具有该范围的平均孔径的膜,则分离膜不易堵塞、且过滤效率也优异。另外,如果平均孔径为0.02μm~0.2μm的范围,则不易发生以蛋白质、多糖类等为例的由微生物和/或培养细胞产生的发酵副生成物、培养液中的微生物/培养细胞死亡而产生的细胞破碎物这样的容易堵塞分离膜的物质的堵塞,因而特别优选。
具有贯通孔的柱状结构的分离膜以外表面为2次侧,因而为了收集过滤液,优选设置组件容器,作为在组件容器内填充了分离膜的组件使用。填充在1支组件中的分离膜为1支以上。
组件容器优选由能耐受反复的蒸气灭菌处理的原料制成。作为能耐受蒸气灭菌处理的原料,可例示例如不锈钢、平均孔隙率低的陶瓷等。
这样的陶瓷膜组件可以通过例如WO2012/086763所记载的制造方法来制造,但也可以利用市售品。如果作为市售品具体例示,则可列举MEMBRALOX精滤膜(Pall)、陶瓷膜过滤器セフィルトMF膜(日本ガイシ)等。
接下来,对于连续发酵进行说明。
本发明中的连续发酵的特征在于,是将微生物的培养液用分离膜过滤,将未过滤液保持在或回流至培养液中,并且在培养液中补加发酵原料,从过滤液中回收生产物的连续发酵。
微生物的培养设定为适合所使用的微生物的pH和温度即可,只要是微生物能生长繁殖的范围就不特别限定,通常在pH为4~8、温度为20~75℃的范围进行。培养液的pH通过无机或者有机酸、碱性物质、以及尿素、碳酸钙、氨气等调节到通常的pH4~8范围内的预先设定的值。
另外,连续发酵中培养液中的糖浓度从生产性的观点出发,希望保持5g/L以下。可以根据连续发酵的培养基的供给速度、培养液的过滤速度、或者供给培养基中的糖浓度来调节。另外作为其他手段,可列举调节氧供给量。
本发明中使用的具有戊糖还原酶和戊糖脱氢酶的微生物大多氧气浓度越高戊糖的代谢越有利。通常已知利用葡萄糖的乙醇发酵等在不利用氧气的厌氧条件下效率良好地进行。但是,在戊糖的代谢中需氧条件更加有利。认为这是因为,戊糖还原酶大多利用NADH作为辅酶,生成戊糖代谢途径的氧化还原平衡的失调,由于该失调,利用氧气的途径被过度利用。在一部分微生物中,具有能够利用NADH和NADPH两者的作为双酶的戊糖还原酶。这样的酶可以在氧气被限制的状况下防止NAD/NADH氧化还原系统的失调(代謝工学‐原理と方法論‐(代谢工学-原理和方法论-)、グレゴリ·N·ステファノポーラス等、东京电机大学出版、p174(2002))。因此,需要根据所使用的微生物来适宜设定氧气供给量,但即使是如上所的双酶,也有时与NADPH相比,NADH更易被利用,此时在需氧条件下也可以代谢。因此,本发明中的培养的氧条件是,体积传氧系数KLa(小时-1)(以下,仅简称为KLa)为优选5~300小时-1,更优选10~250小时-1,进一步优选20~200小时-1。如果KLa为5小时-1以下,则有时由于糖消耗速度降低而生产效率不提高。另外,如果KLa为300小时-1以上,则有时由于发泡过盛而给连续发酵带来障碍。
KLa是显示在通气搅拌时在单位时间内从气相向液相转移氧而生成溶存氧的能力的物理量,用以下式(3)定义(参照生物工学实验书、日本生物工学会编、培风馆、p.310(1992))。
dC/dt=KLa×(C*-C)···(3)。
这里,C:培养液中的溶存氧浓度DO(ppm)、C*:没有由微生物造成的氧消耗的情况下与气相平衡的溶存氧浓度DO(ppm)、KLa:体积传氧系数(小时-1)。由上述式(3)导出下述式(4),因而通过将C*-C的对数相对于通气的时间作图,可以求出KLa。
In(C*-C)=-KLa×t···(4)。
另外,本发明中的KLa是可通过气体置换法(动力学法)测定的数值。气体置换法(动力学法)是,在插入了溶存氧浓度电极的通气搅拌培养装置中加入水或者所使用的培养基,将这些液体中的氧用氮气置换而降低该液体的氧浓度,接下来将氮气切换为压缩空气,测定规定的通气速度、搅拌速度和温度下的溶存氧的上升过程,从而计算KLa的方法。
KLa可以通过将通气条件与搅拌条件组合进行通气搅拌培养来适宜设定。关于此时的通气,通气的气体也可以根据培养条件而改变。例如,为了将溶存氧浓度保持得较高,可以使用在空气中加入氧气将氧浓度保持在21%以上,或者对培养液加压,提高搅拌速度,提高通气速度等方法。
本发明中的KLa通过上述方法进行直接测定而求得即可,但在KLa较低的范围,因为已知在搅拌速度一定下如以下式(5)所示,KLa与通气速度成比例,所以也可以通过计算来求。具体地,可以在搅拌速度一定下使通气速度适当地变化进行KLa测定,将所得的KLa相对于通气速度作图,代入式(5)求出常数a和b,从而进行设定。
KLa=a×V+b···(5)。
这里,V:通气速度(vvm);a,b:常数。
在KLa变高脱离式(5)的情况下,进行直接测定来求KLa。
本发明的化学品的制造方法中,对过滤时的膜间压差不特别限定,只要能够过滤发酵培养液即可。但是,如果对于有机高分子膜,用高于150kPa的膜间压差进行过滤处理,则有机高分子膜的结构被破坏的可能性变高,有时生产化学品的能力降低。另外,如果是低于0.1kPa的膜间压差,则有时不能充分得到发酵培养液的透过水量,有制造化学品时的生产性降低的倾向。本发明的化学品的制造方法中,对于有机高分子膜通过使作为过滤压力的膜间压差优选为0.1kPa~150kPa的范围,从而发酵培养液的透过水量多,也不会由于膜的结构的破坏而化学品制造能力降低,因而可以维持高的化学品生产能力。膜间压差对于有机高分子膜优选为0.1kPa~50kPa的范围,进一步优选0.1kPa~20kPa的范围。
在使用陶瓷膜时对过滤时的膜间压差也不特别限定,只要能够过滤发酵培养液即可,优选为500kPa以下。如果在500kPa以上运转,则有时发生膜的堵塞,连续发酵运转发生不良。
作为过滤的驱动力,可以通过利用了发酵液与多孔性膜处理水的液位差(水头差)的虹吸管、或错流循环泵而在分离膜产生膜间压差。另外,作为过滤的驱动力,可以在分离膜2次侧设置抽吸泵。另外,使用错流循环泵时可以通过抽吸压力来控制膜间压差。进而,也可以通过导入发酵液侧的压力的气体或液体的压力来控制膜间压差。进行这些压力控制时,以发酵液侧的压力与多孔性膜处理水侧的压力差作为膜间压差,用于膜间压差的控制。
另外,在本发明的化学品的制造方法中,还可以在培养初期进行分批培养或补料分批培养使微生物浓度变高后,开始连续发酵(培养液的过滤)。另外,还可以接种高浓度的菌体,在培养开始的同时进行连续发酵。在本发明的化学品的制造方法中,可以从适当的时期开始进行培养基供给和培养液的过滤。培养基供给和培养液的过滤的开始时间未必相同。另外,培养基供给和培养液的过滤可以是连续的,也可以是间歇的。
只要在原料培养液中添加菌体增殖所需的营养素,使菌体增殖能连续地进行即可。关于培养液中的微生物的浓度,只要是效率良好地生成化学品所优选的浓度即可。培养液中的微生物的浓度,作为一例,通过将干燥重量维持在5g/L以上,可得到良好的生产效率。
在本发明的化学品的制造方法中,还可以通过在连续发酵的中途根据需要从发酵槽内除去包含微生物的培养液的一部分,然后用培养基稀释,来调整培养槽内的微生物浓度。例如,如果发酵槽内的微生物浓度过度变高,则容易发生分离膜的堵塞,因而有时通过除去包含微生物的培养液的一部分,用培养基稀释,可以容易地避免堵塞。另外,有时根据发酵槽内的微生物浓度不同而化学品的生产性能变化,还可以以生产性能作为指标,通过除去包含微生物的培养液的一部分并用培养基稀释,来维持生产性能。
按照本发明的化学品的制造方法进行连续发酵时,与现有的培养相比,可以实现发酵收率极好的连续发酵。这里,连续发酵中的发酵收率通过以下式(6)计算。
收率(g/g)=生成物量(g)÷{投入糖(g)-未利用糖(g)}···(6)。
本发明中使用的连续发酵装置只要是将微生物的发酵培养液用分离膜过滤,在从滤液回收生产物的同时将未过滤液保持在或回流至所述发酵培养液中,并且在所述发酵培养液中补加发酵原料,并回收过滤液中的生产物的利用连续发酵来制造化学品的制造装置,就不特别限定,如果列举具体例,则在使用有机高分子膜时,可以使用WO2007/097260所记载的装置。另外,在使用陶瓷膜时,可以使用WO2012/086763所记载的装置。
作为通过本发明的化学品的制造方法制造的化学品,只要是上述微生物在培养液中生产的物质就不限制。通过本发明的化学品的制造方法制造的化学品可列举醇、有机酸、氨基酸、核酸等在发酵工业中大量生产的物质。例如,作为醇,可列举乙醇、异丁醇、异丙醇、正丁醇、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、2,3-丁二醇、甘油等,作为有机酸,可列举乙酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、苹果酸、衣康酸、柠檬酸、己二酸等,作为核酸可列举肌苷、鸟苷等核苷、肌苷酸、鸟苷酸等核苷酸、以及尸胺、腐胺等二胺化合物。另外,本发明还可以适用于酶、抗生素、重组蛋白质这样的物质的生产。这些化学品可以通过周知的方法(膜分离、浓缩、蒸馏、晶析、提取等)从过滤液回收。
实施例
以下,列举实施例具体说明本发明。但是,本发明不限于这些实施例。
(参考例1)葡萄糖、木糖、乙醇的分析方法
培养液中的葡萄糖、木糖和乙醇的浓度在下述所示的HPLC条件下通过与标准品的比较来定量。
柱:Shodex SH1011(昭和电工株式会社制)
转移相:5mM硫酸(流速0.6mL/分钟)
反应液:无
检测方法:RI(差示折射率)
温度:65℃。
(参考例2)乳酸的分析方法
培养液中的乳酸在下述所示的HPLC条件下通过与标准品的比较来定量。
柱:Shim-Pack SPR-H(株式会社岛津制作所制)
转移相:5mM对甲苯磺酸(流速0.8mL/分钟)
反应液:5mM对甲苯磺酸、20mM Bis-Tris、0.1mM EDTA·2Na(流速0.8mL/分钟)
检测方法:电导率
温度:45℃。
(参考例3)戊糖还原酶活性的测定
将热带假丝酵母NBRC0199株、树干毕赤酵母NBRC1687株、WO2010/140602所记载的产朊假丝酵母CuLpLDH株分别用白金耳接菌于5mL的YPX培养基(酵母提取物1%、细菌蛋白胨2%、木糖2%)中,在30℃振荡培养一夜(前培养)。第二天,在加入了50mL的YPX培养基的500mL的带褶皱三角烧瓶中继续接种前培养液,在30℃振荡培养24小时。将回收的培养液用50mM的磷酸缓冲液清洗2次。用50mM的磷酸缓冲液将菌体再悬浮,用珠式匀浆器(珠φ0.5为0.6g、4000转/分钟、1分钟×5次)破碎后,通过离心分离回收上清,将此作为菌体提取液。在包含200mM的木糖、和100μL的1.5mM的NAD(P)H的50mM的磷酸缓冲液(900μL)中添加菌体提取液,连续地监测在30℃使其反应时的340nM的吸光度。将未添加木糖的样品作为空白,将与空白相比吸光度的减少较大的情况判定为有戊糖还原酶活性,结果可以确认3株均具有戊糖还原酶活性。
(参考例4)五醇脱氢酶活性的测定
将热带假丝酵母NBRC0199株、树干毕赤酵母NBRC1687株、WO2010/140602所述的产朊假丝酵母CuLpLDH株分别用白金耳接菌于5mL的YPX培养基(酵母提取物1%、细菌蛋白胨2%、木糖2%)中,在30℃振荡培养一夜(前培养)。第二天,在加入了50mL的YPX培养基的500mL的带褶皱三角烧瓶中继续接种前培养液,在30℃振荡培养24小时。将回收的培养液用50mM的Tris-HCl缓冲液清洗2次。用50mM的Tris-HCl缓冲液将菌体再悬浮,用珠式匀浆器(珠φ0.5为0.6g、4000转/分钟、1分钟×5次)破碎后,通过离心分离回收上清,将此作为菌体提取液。在包含50mM的MgCl2、300mM的木糖醇和100μL的10mM的NAD(P)+的50mM的Tris-HCl缓冲液900μL中添加菌体提取液,连续地监测在35℃使其反应时的340nM的吸光度。将未添加木糖醇的样品作为空白,将与空白相比吸光度的增加较大的情况判定为有五醇脱氢酶活性,结果可以确认3株均具有五醇脱氢酶活性。
(参考例5)KLa测定
在培养槽中插入溶存氧电极(メトラートレド制)对各通气搅拌条件测定溶存氧浓度,通过使用氮气的动力学法求出KLa。首先,在培养槽加入水1.5L,一边将水温调整为30℃一边以一定的速度搅拌而将氮气充分地吹入水中,在电极值变成最低值的时刻进行溶存氧电极的零校正。然后,测定将通气气体从氮气切换为规定的通气速度的空气后的溶存氧浓度的经时变化,求出KLa。将在搅拌速度800转/分钟、温度30℃通气压缩空气时所得的针对各通气搅拌条件的KLa示于表1。
表1
对于表1的0.01~0.6vvm,将通气速度与KLa的关系作图,算出式(5)的常数(a,b),结果为(284,0.49)。1.5vvM的值超出作图的直线关系,因而在常数的算出中刨除来计算。
(比较例1)以六碳糖为发酵原料通过热带假丝酵母的分批培养进行的乙醇的制造
作为微生物,使用热带假丝酵母NBRC0199株,作为培养基使用YPD培养基(酵母提取物1%、细菌蛋白胨2%、葡萄糖7%)。将热带假丝酵母NBRC0199株在试管中用2mL的YPD培养基在30℃振荡培养一夜(前前培养)。将所得的培养液接菌于加入了50mL的YPD培养基的500mL容量的带褶皱三角烧瓶中,振荡培养一夜(前培养)。将前培养液接菌于1.5L的YPD培养基中,将培养槽用附带的搅拌机以800转/分钟搅拌,进行培养槽的通气速度的调整、温度调整,在以下的条件下进行16小时分批培养,制造乙醇(表3)。
培养槽容积:2L
培养槽有效容积:1.5L
温度调整:30℃
培养槽通气速度:0.1vvm压缩空气
培养槽搅拌速度:800转/分钟
pH调整:无
灭菌:培养槽和使用培养基全部通过121℃、20分钟的高压釜进行高压蒸气灭菌。
(比较例2)以混合糖为发酵原料通过热带假丝酵母的分批培养进行的乙醇的制造
作为培养基使用表2所示的组成的YPDX培养基,在与比较例1同样的条件下进行23小时分批培养,制造乙醇(表3)。
表2
成分 | 含有比例 |
葡萄糖 | 3% |
木糖 | 4% |
细菌蛋白胨 | 2% |
酵母提取物 | 1% |
(比较例3)以混合糖为发酵原料通过热带假丝酵母的连续发酵进行的乙醇的制造
使用表2所示的组成的YPDX培养基作为培养基进行不利用分离膜的连续发酵。将热带假丝酵母NBRC0199株在试管中用2mL的YPD培养基在30℃振荡培养一夜(前前前培养)。将所得的培养液接菌于加入了50mL的YPD培养基的500mL容量的带褶皱三角烧瓶中,振荡培养一夜(前前培养)。在加入了1.5L的YPDX培养基的连续发酵装置(从WO2007/097260的图2所示的装置中除去分离膜元件后的装置)中接菌前前培养液,将培养槽的搅拌速度、通气速度、温度调整为与比较例1相同的条件,进行16小时培养(前培养)。前培养结束后,立即开始连续发酵,通过360小时的连续发酵来制造乙醇。培养基的供给和包含微生物的培养液的取出使用ペリスタ生物微型泵AC-2120型(ATTO社),向培养槽内直接供给培养基,从培养槽内直接取出包含微生物的培养液。将包含微生物的培养液的取出速度设定为0.05L/小时,一边控制培养基供给速度使得培养槽内的培养液量为1.5L,一边进行运转(表3)。
(实施例1)以混合糖为发酵原料通过热带假丝酵母的利用了分离膜的连续发酵进行的乙醇的制造1
使用表2所示的组成的YPDX培养基作为培养基进行利用了分离膜的连续发酵。热带假丝酵母NBRC0199株在试管中用2mL的YPD培养基在30℃振荡培养一夜(前前前培养)。将所得的培养液接菌于加入了YPD培养基50mL的500mL容量的带褶皱三角烧瓶中,振荡培养一夜(前前培养)。将前前培养液接菌于加入了1.5L的YPDX培养基的膜一体型的具备以下的条件的连续发酵装置(WO2007/097260的图2所示的装置)中,将培养槽用附带的搅拌机以800转/分钟搅拌,进行培养槽的通气速度的调整、温度调整,进行36小时培养(前培养)。前培养结束后,立即开始连续发酵,进行乙醇的制造。培养基供给和培养液的过滤使用ペリスタ生物微型泵AC-2120型(ATTO社)。培养基供给向培养槽内直接进行,培养液的过滤作为通过了固定了分离膜的元件的滤液的取出来进行。使培养液过滤速度为一定,一边控制培养基供给速度使得培养槽内的培养液量为1.5L,一边使过滤时的膜间压差在0.1~20.0kPa的范围变化,通过370小时的连续发酵来制造乙醇(表3)。
培养槽容积:2L
培养槽有效容积:1.5L
使用分离膜:聚偏-1,1-二氟乙烯过滤膜
膜分离元件有效过滤面积:120cm2
分离膜的纯水透过系数:50×10-9m3/m2/s/Pa
分离膜的平均细孔径:0.1μm
平均细孔径的标准偏差:0.035μm
分离膜的表面粗糙度:0.06μm
温度调整:30℃
培养槽通气速度:0.01vvm压缩空气
培养槽搅拌速度:800转/分钟
pH调整:无
培养液过滤速度:0.05L/小时
灭菌:包含分离膜元件的培养槽、和使用培养基全部通过121℃、20分钟的高压釜进行高压蒸气灭菌。
(实施例2)以混合糖为发酵原料通过热带假丝酵母的利用了分离膜的连续发酵进行的乙醇的制造2
使用热带假丝酵母NBRC0199株进行利用了分离膜的连续发酵。除了使培养槽通气速度为0.1vvm压缩空气以外,在与实施例1同样的条件下进行,通过369小时的连续发酵来制造乙醇(表3)。
(实施例3)以混合糖为发酵原料通过热带假丝酵母的利用了分离膜的连续发酵进行的乙醇的制造3
使用热带假丝酵母NBRC0199株进行利用了分离膜的连续发酵。除了使培养槽通气速度为1.5vvm压缩空气以外,在与实施例1同样的条件下进行,通过370小时的连续发酵来制造乙醇(表3)。
表3
(比较例4)以六碳糖为发酵原料通过树干毕赤酵母的分批培养进行的乙醇的制造
作为微生物,使用树干毕赤酵母NBRC1687株,在与比较例1同样的条件下进行40小时分批培养,制造乙醇(表4)。
(比较例5)以混合糖为发酵原料通过树干毕赤酵母的分批培养进行的乙醇的制造
作为微生物,使用树干毕赤酵母NBRC1687株,在与比较例2同样的条件下进行40小时分批培养,制造乙醇(表4)。
(比较例6)以混合糖为发酵原料通过树干毕赤酵母的连续发酵进行的乙醇的制造
作为微生物,使用树干毕赤酵母NBRC1687株,用混合糖原料进行不利用分离膜的连续发酵。除了使前培养时间为40小时以外,在与比较例3同样的条件下进行,通过368小时的连续发酵来制造乙醇(表4)。
(实施例4)以混合糖为发酵原料通过树干毕赤酵母的利用了分离膜的连续发酵进行的乙醇的制造1
作为微生物,使用树干毕赤酵母NBRC1687株,进行利用了分离膜的连续发酵。除了使前培养为48小时、膜间压差为0.1~19.8kPa以外,在与实施例1同样的条件下进行,通过370小时的连续发酵来制造乙醇(表4)。
(实施例5)以混合糖为发酵原料通过树干毕赤酵母的利用了分离膜的连续发酵进行的乙醇的制造2
作为微生物,使用树干毕赤酵母NBRC1687株,进行利用了分离膜的连续发酵。除了使前培养为40小时、膜间压差为0.1~19.8kPa以外,在与实施例2同样的条件下进行,通过369小时的连续发酵来制造乙醇(表4)。
(实施例6)以混合糖为发酵原料通过树干毕赤酵母的利用了分离膜的连续发酵进行的乙醇的制造3
作为微生物,使用树干毕赤酵母NBRC1687株,进行利用了分离膜的连续发酵。除了使前培养为36小时、膜间压差为0.1~19.8kPa以外,在与实施例3同样的条件下进行,通过370小时的连续发酵来制造乙醇(表4)。
表4
(比较例7)以六碳糖为发酵原料通过产朊假丝酵母的分批培养进行的D-乳酸的制造
作为微生物,使用通过WO2010/140602所公开的方法制作的产朊假丝酵母CuLpLDH株。除了将pH用1N氢氧化钙调整为pH6.0以外,在与比较例1同样的条件下进行40小时分批培养,制造D-乳酸(表5)。
(比较例8)以混合糖为发酵原料通过产朊假丝酵母的分批培养进行的D-乳酸的制造
作为微生物使用产朊假丝酵母CuLpLDH株,除了将pH用1N氢氧化钙调整为pH6.0以外,在与比较例2同样的条件进行40小时分批培养,制造D-乳酸(表5)。
(比较例9)以混合糖为发酵原料通过产朊假丝酵母的连续发酵进行的D-乳酸的制造
作为微生物使用产朊假丝酵母CuLpLDH株,进行不利用分离膜的连续发酵。除了使前培养为40小时、将pH用1N氢氧化钙调整为pH6.0以外,在与比较例3同样的条件下进行,通过368小时的连续发酵来制造D-乳酸(表5)。
(实施例7)以混合糖为发酵原料通过产朊假丝酵母的利用了分离膜的连续发酵进行的D-乳酸的制造1
作为微生物使用产朊假丝酵母CuLpLDH株,进行利用了分离膜的连续发酵。除了使前培养为50小时、将pH用1N氢氧化钙调整为pH6.0以外,在与实施例1同样的条件下进行,通过370小时的连续发酵来制造D-乳酸(表5)。
(实施例8)以混合糖为发酵原料通过产朊假丝酵母的利用了分离膜的连续发酵进行的D-乳酸的制造2
作为微生物使用产朊假丝酵母CuLpLDH株,进行利用了分离膜的连续发酵。除了使前培养为40小时、将pH用1N氢氧化钙调整为pH6.0以外,在与实施例1同样的条件下进行,通过369小时的连续发酵来制造D-乳酸(表5)。
(实施例9)以混合糖为发酵原料通过产朊假丝酵母的利用了分离膜的连续发酵进行的D-乳酸的制造3
作为微生物使用产朊假丝酵母CuLpLDH株,进行利用了分离膜的连续发酵。除了使前培养为30小时、将pH用1N氢氧化钙调整为pH6.0以外,在与实施例1同样的条件下进行,通过370小时的连续发酵来制造D-乳酸(表5)。
表5
(比较例10)以混合糖为发酵原料通过热带假丝酵母的分批发酵进行的乙醇的制造2
使用热带假丝酵母NBRC0199株,进行分批发酵。发酵培养基使用YPDX培养基,但从表2所示的组成变更糖浓度,以葡萄糖1%、木糖9%制备。其他运转条件等与比较例2同样地进行,通过42小时的分批发酵来制造乙醇(表6)。
(比较例11)以混合糖为发酵原料通过热带假丝酵母的连续发酵进行的乙醇的制造2
使用热带假丝酵母NBRC0199株,进行不利用分离膜的连续发酵。发酵培养基使用YPDX培养基,但从表2所示的组成变更糖浓度,以葡萄糖1%、木糖9%制备。其他运转条件等与比较例3同样地进行,通过400小时的连续发酵来制造乙醇(表6)。
(实施例10)以混合糖为发酵原料通过热带假丝酵母的利用了分离膜的连续发酵进行的乙醇的制造4
使用热带假丝酵母NBRC0199株,进行利用了分离膜的连续发酵。发酵培养基使用YPDX培养基,但从表2所示的组成变更糖浓度,以葡萄糖1%、木糖9%制备。其他运转条件等与实施例1同样地进行,通过420小时的连续发酵来制造乙醇(表6)。
(实施例11)以混合糖为发酵原料通过热带假丝酵母的利用了陶瓷制分离膜的连续发酵进行的乙醇的制造5
使用热带假丝酵母NBRC0199株,进行利用了陶瓷制分离膜的连续发酵。发酵培养基使用YPDX培养基,但从表2所示的组成变更糖浓度,以葡萄糖1%、木糖9%来制备。将热带假丝酵母NBRC0199株在试管中用2mL的YPD培养基在30℃振荡培养一夜(前前前培养)。将所得的培养液接菌于加入了YPD培养基50mL的500mL容量的带褶皱三角烧瓶中,振荡培养一夜(前前培养)。将前前培养液接菌于加入了1.5L的YPDX培养基的膜分离型的连续发酵装置(WO2012/086763的图12所示的装置)中,将培养槽用附带的搅拌机以800转/分钟搅拌,进行培养槽的通气速度的调整、温度调整,进行36小时培养(前培养)。前培养结束后,立即开始连续发酵。一边将过滤时的膜间压差调整为500kPa以下,一边通过400小时的连续发酵来制造乙醇(表6)。
培养槽容积:2L
培养槽有效容积:1.5L
使用分离膜:Celfit精滤膜独块(monolith)φ4-19(日本ガイシ)
膜分离元件长度:500mm
分离膜的平均细孔径:0.1μm
温度调整:30℃
培养槽通气速度:0.01vvm压缩空气
培养槽搅拌速度:800转/分钟
pH调整:无。
表6
(比较例12)以混合糖为发酵原料通过热带假丝酵母的分批培养进行的乙醇的制造3
使用热带假丝酵母NBRC0199株,进行分批发酵。发酵原料利用WO2010/067785的实施例2所公开的利用纳滤膜的制备方法制备的纤维素糖化液,通过适宜试剂将发酵培养基的组成调整成如表7所示那样。其他运转条件等与比较例3同样地进行,通过72小时的分批发酵来制造乙醇(表8)。
表7
成分 | 含有比例 |
葡萄糖 | 6% |
木糖 | 3% |
细菌蛋白胨 | 2% |
酵母提取物 | I% |
(比较例13)以混合糖为发酵原料通过热带假丝酵母的连续发酵进行的乙醇的制造3
使用热带假丝酵母NBRC0199株,进行不利用分离膜的连续发酵。发酵培养基与比较例12同样地使用表7所述的培养基。其他运转条件等与比较例3同样地进行,通过400小时的连续发酵来制造乙醇(表8)。
(实施例12)以混合糖为发酵原料通过热带假丝酵母的利用了分离膜的连续发酵进行的乙醇的制造6
使用热带假丝酵母NBRC0199株,进行利用了分离膜的连续发酵。发酵培养基与比较例12同样地使用表7所述的培养基。其他运转条件等与实施例1同样地进行,通过456小时的连续发酵来制造乙醇(表8)。
表8
由以上的结果,可以从五碳糖与六碳糖的混合糖以高收率制造化学品。
产业可利用性
通过本发明,可以大幅提高使用了包含五碳糖和六碳糖的发酵原料的各种化学品的发酵生产的效率。
Claims (7)
1.化学品的制造方法,是通过连续发酵来制造化学品的方法,包括:将微生物的培养液用分离膜过滤,将未过滤液保持在或回流至培养液中,在培养液中补加发酵原料,和回收过滤液中的生产物,
所述发酵原料包含五碳糖和六碳糖,所述微生物是具有使用戊糖还原酶和五醇脱氢酶来代谢五碳糖的途径的微生物。
2.根据权利要求1所述的化学品的制造方法,在体积传氧系数即KLa为5~300小时-1的条件下进行连续发酵。
3.根据权利要求1或2所述的化学品的制造方法,所述发酵原料中所含的五碳糖与六碳糖的比率为1:9~9:1。
4.根据权利要求1或2所述的化学品的制造方法,所述发酵原料包含来源于生物质的糖液。
5.根据权利要求1~4的任一项所述的化学品的制造方法,五碳糖是木糖。
6.根据权利要求1~5的任一项所述的化学品的制造方法,戊糖还原酶是木糖还原酶。
7.根据权利要求1~6的任一项所述的化学品的制造方法,五醇脱氢酶是木糖醇脱氢酶。
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