KR20140116845A

KR20140116845A - 화학품의 제조방법

Info

Publication number: KR20140116845A
Application number: KR20147014778A
Authority: KR
Inventors: 시오미 와타나베; 코지 코바야시; 쿄헤이 이소베; 켄지 사와이; 경수 나; 신고 히라마츠; 카츠시게 야마다
Original assignee: 도레이 카부시키가이샤
Priority date: 2012-01-13
Filing date: 2013-01-11
Publication date: 2014-10-06
Also published as: WO2013105652A1; CN104039969A; EP2803730A4; AU2013208440B2; BR112014017005A8; CA2860759A1; AU2013208440A1; JPWO2013105652A1; BR112014017005A2; PH12014501608A1; RU2014133170A; CN106987606A; US20150024445A1; EP2803730A1; RU2595388C2

Abstract

[과제] 6탄당과 5탄당의 혼합당을 발효 원료로 한 고수율의 화학품의 제조방법을 제공하는 것.
[해결수단] 미생물의 배양액을 분리막에 의해 여과하는 것, 미여과액을 배양액에 유지 또는 환류하는 것, 발효 원료를 배양액에 추가하는 것, 및 여과액 중의 생산물을 회수하는 것을 포함하는 연속 발효에 의한 화학품의 제조방법으로서, 상기 발효 원료는 5탄당 및 6탄당을 포함하고, 상기 미생물은 펜토오스 리덕타아제 및 펜톨 디히드로게나아제를 이용하여 5탄당을 대사하는 경로를 갖는 미생물인 화학품의 제조방법을 제공했다.

Description

화학품의 제조방법{METHOD FOR PRODUCING CHEMICAL SUBSTANCE}

본 발명은 6탄당 및 5탄당을 포함하는 발효 원료를 사용한 연속 발효에 의한 화학품의 제조방법에 관한 것이다.

락트산 등의 생분해성 폴리머 원료나 에탄올 등의 바이오 연료로 대표되는 바이오매스 유래의 화학품은 대기 중으로의 이산화탄소의 배출 문제나 에너지 문제의 표면화와 함께 서스테이너빌리티(지속 가능성) 및 라이프사이클 어세스먼트(LCA) 대응형 제품으로서 강한 주목을 받고 있다. 이들 생분해성 폴리머 원료나 바이오 연료의 제조방법으로서는 옥수수 등의 가식성 바이오매스로부터 정제된 6탄당인 글루코오스를 미생물의 발효 원료로 사용하여 발효 산물로서 얻는 것이 일반적이지만, 가식성 바이오매스를 사용하면 식료와 경합되기 때문에 가격 고등이 일어나게 되어 안정된 원료의 조달을 할 수 없게 될 우려가 있다. 그래서, 볏짚 등의 비가식성 바이오매스 유래의 당을 미생물의 발효 원료로 사용하는 시도가 행해지고 있다(특허문헌 1 참조).

비가식성 바이오매스 유래의 당을 발효 원료로 사용하는 경우에는 비가식 바이오매스에 포함되는 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 등을 당화 효소에 의해서 당으로 분해되지만, 이 때에 글루코오스 등의 6탄당뿐만 아니라 크실로오스 등의 5탄당도 동시에 얻어져 비가식성 바이오매스 유래의 당을 미생물의 발효 원료로 사용하는 경우, 6탄당과 5탄당의 혼합당을 발효 원료로서 사용하게 된다(특허문헌 1 참조). 6탄당과 5탄당의 혼합당을 사용하는 경우에는 6탄당의 대사 경로에 추가하여 5탄당의 대사 경로를 갖는 미생물을 사용할 필요가 있다. 5탄당의 대사 경로로서 펜토오스 리덕타아제와 펜톨 디히드로게나아제에 의한 대사 경로가 알려져 있고, 제 1 단계로서 5탄당에 펜토오스 리덕타아제가 작용하여 펜톨을 생성하고, 제 2 단계로서 펜톨에 펜톨 디히드로게나아제가 작용하는 것이 알려져 있다. 그러나, 실제로는 제 1 단계에서 생성되는 펜톨이 제 2 단계 이후의 대사 경로로 나아가지 않고 배양액 중에 축적되어 버리기 때문에 생산 수율이 높아지지 않는다고 하는 문제가 있다.

6탄당과 5탄당의 혼합당인 비가식성 바이오매스 유래의 당을 미생물의 발효 원료로 한 발효 방법으로서는 연속 발효가 채용될 수 있지만, 실제로 연속 발효된 경우의 발효 수율에 대해서는 확인되어 있지 않다(특허문헌 1 참조). 한편, 6탄당과 5탄당의 혼합당을 발효 원료로서 연속 발효하는 경우, 배치 발효보다 발효 수율이 현저하게 저하되어 버리는 경우도 알려져 있다(비특허문헌 1 참조).

따라서, 6탄당과 5탄당의 혼합당을 발효 원료로 한 펜토오스 리덕타아제와 펜톨 디히드로게나아제에 의한 5탄당의 대사 경로를 갖는 미생물의 발효에 있어서 발효 수율을 향상시키고자 하는 경우, 변이 도입이나 유전자 도입에 의한 크실로오스 대사 경로의 개량을 행할 필요가 있다고 생각되는 것이 지금까지의 기술 상식이었다.

WO2010/067785

Susan T. Toon 등, Enhanced Cofermentation of Glucose and Xylose by Recombinant Saccharomyces Yeast Strains in batch and Continuous Operating Modes., Applied Biochemistry and Biotechnology., (1997), 63-65, 243-255.

본 발명은 6탄당과 5탄당의 혼합당을 펜토오스 리덕타아제 및 펜톨 디히드로게나아제에 의한 5탄당 대사 경로를 갖는 미생물의 발효 원료로서 발효시키는 경우의 발효 수율의 향상을 과제로 하는 것이다.

본 발명자들은 상기 과제를 예의 검토한 결과, 펜토오스 리덕타아제와 펜토오스 디히드로게나아제를 갖는 미생물을 사용하는 경우에 6탄당 및 5탄당을 포함하는 발효 원료에 의해 분리막을 이용한 연속 발효를 행함으로써 상기 과제를 해결하고, 6탄당과 5탄당의 혼합당으로부터의 수율 향상을 실현하여 본 발명에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하 (1)~(7)과 같다.

(1) 미생물의 배양액을 분리막에 의해 여과하는 것, 미여과액을 배양액에 유지 또는 환류하는 것, 발효 원료를 배양액에 추가하는 것, 및 여과액 중의 생산물을 회수하는 것을 포함하는 연속 발효에 의한 화학품의 제조방법으로서, 상기 발효 원료는 5탄당 및 6탄당을 포함하고, 상기 미생물은 펜토오스 리덕타아제 및 펜톨 디히드로게나아제를 이용하여 5탄당을 대사하는 경로를 갖는 미생물인 것을 특징으로 하는 화학품의 제조방법.

(2) (1)에 있어서, 산소 이동 용량 계수(KLa)는 5~300h^-1의 조건에서 연속 발효를 행하는 것을 특징으로 하는 화학품의 제조방법.

(3) (1) 또는 (2)에 있어서, 상기 발효 원료 중에 포함되는 5탄당과 6탄당의 비율은 1:9~9:1인 것을 특징으로 하는 화학품의 제조방법.

(4) (1) 또는 (2)에 있어서, 상기 발효 원료는 바이오매스 유래의 당액을 포함하는 것을 특징으로 하는 화학품의 제조방법.

(5) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 5탄당은 크실로오스인 것을 특징으로 하는 화학품의 제조방법.

(6) (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 있어서, 펜토오스 리덕타아제는 크실로오스 리덕타아제인 것을 특징으로 하는 화학품의 제조방법.

(7) (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 있어서, 펜톨 디히드로게나아제는 크실리톨 디히드로게나아제인 것을 특징으로 하는 화학품의 제조방법.

(발명의 효과)

본 발명에 의해서, 5탄당 및 6탄당을 포함하는 발효 원료를 이용한 펜토오스 리덕타아제와 펜토오스 디히드로게나아제를 갖는 미생물의 각종 화학품의 발효 생산의 효율 수율을 대폭 향상시킬 수 있다.

본 발명의 화학품의 제조방법은 발효 원료에 5탄당 및 6탄당의 혼합당을 포함하는 것을 사용하여 펜토오스 리덕타아제와 펜토오스 디히드로게나아제를 갖는 미생물을 배양하고, 그 배양액을 분리막에 의해 여과하여 미여과액을 배양액에 유지 또는 환류하고, 또한 발효 원료를 배양액에 추가하여 여과액 중의 생산물을 회수하는 연속 발효인 것을 특징으로 한다.

5탄당이란 당을 구성하는 탄소수가 5개인 것이며, 펜토오스(Pentose)라고도 불린다. 1위치에 알데히드기를 갖는 알도펜토오스와 2위치에 케톤기를 갖는 케토펜토오스가 있다. 알도펜토오스로서는 크실로오스, 아라비노오스, 리보오스, 릭소오스가 예시되고, 케토펜토오스로서는 리불로오스, 크실룰로오스가 예시된다. 본 발명에서 이용되는 5탄당으로서는 미생물이 자화(資化)할 수 있는 것이라면 어느 것이어도 좋지만, 자연계에서의 존재 비율이나 입수의 용이함 등의 관점에서 바람직하게는 크실로오스, 아라비노오스이며, 보다 바람직하게는 크실로오스이다.

6탄당이란 당을 구성하는 탄소수가 6개이며, 헥소오스(Hexose)라고도 불린다. 1위치에 알데히드기를 갖는 알도오스와 2위치에 케톤기를 갖는 케토오스가 있다. 알도오스로서는 글루코오스, 만노오스, 갈락토오스, 알로오스, 굴로오스, 탈로오스 등이 예시되고, 케토오스로서는 프룩토오스, 피시코오스, 소르보오스 등이 예시된다. 본 발명에서 이용되는 6탄당으로서는 미생물이 자화할 수 있는 것이라면 어느 것이어도 좋지만, 자연계에서의 존재 비율이나 입수의 용이성 등의 관점에서 바람직하게는 글루코오스, 만노오스, 갈락토오스이며, 보다 바람직하게는 글루코오스이다.

본 발명에서 사용되는 혼합당에 관해서는 특별히 한정되지 않지만, 6탄당과 5탄당을 양쪽 포함하는 점에서 셀룰로오스 함유 바이오매스 유래 당액이 바람직하게 사용된다. 셀룰로오스 함유 바이오매스에는 버개스, 지팽이풀(swichgrass), 콘 스토버, 볏짚, 밀짚 등 초목계 바이오매스와, 수목, 폐자재 등의 목질계 바이오매스 등을 예로서 예시할 수 있다. 셀룰로오스 함유 바이오매스는 당이 탈수 축합된 다당인 셀룰로오스 또는 헤미셀룰로오스를 함유하고 있고, 이러한 다당을 가수분해함으로써 발효 원료로서 이용 가능한 당액이 제조된다. 셀룰로오스 함유 바이오매스 유래 당액의 조제 방법은 어떠한 방법이어도 좋고, 이러한 당의 제조방법으로서는 농황산을 사용하여 바이오매스를 산 가수분해하여 당액을 제조하는 방법(일본 특허 공표 평11-506934호 공보, 일본 특허 공개 2005-229821호 공보), 바이오매스를 희황산에 의해 가수분해 처리한 후에, 또한 셀룰라아제 등의 효소 처리함으로써 당액을 제조하는 방법이 개시되어 있다[A. Aden 등, " LignocellulosicBiomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover" NREL Technical Report(2002)]. 또한, 산을 사용하지 않는 방법으로서 250~500℃ 정도의 아임계수를 사용하여 바이오매스를 가수분해하여 당액을 제조하는 방법(일본 특허 공개 2003-212888호 공보), 또한 바이오매스를 아임계수 처리한 후에 더 효소 처리함으로써 당액을 제조하는 방법(일본 특허 공개 2001-95597호 공보), 바이오매스를 240~280℃의 가압 열수에 의해 가수분해 처리한 후에 더 효소 처리함으로써 당액을 제조하는 방법(일본 특허 3041380호 공보)이 개시되어 있다. 이상과 같은 처리 후, 얻어진 당액을 정제하여도 좋다. 그 방법은, 예를 들면 WO2010/067785에 개시되어 있다.

혼합당에 포함되는 5탄당과 6탄당의 중량 비율로서는 어떠한 비율이어도 상관없지만, 혼합당 중의 5탄당과 6탄당의 중량 비율로서 (5탄당):(6탄당)으로 나타내면, 1:9~9:1이 바람직하다. 이것은 혼합당으로서 셀룰로오스 함유 바이오매스 유래 당액을 가정한 경우의 당비율이다.

혼합당의 총 당 농도로서는 미생물이 기질 저해를 받지 않는 정도로 고농도인 것이 바람직하다. 당 농도가 너무 낮으면 생산 효율이 나쁘기 때문에 20g/ℓ 이상이 바람직하다. 바람직한 총 당 농도의 범위로서는 20~500g/ℓ이다. 상기를 감안하면, 5탄당의 농도는 5g/ℓ 이상, 6탄당의 농도는 5g/ℓ 이상이 바람직하다.

또한, 발효 원료에 포함되는 질소원으로서는 암모니아 가스, 암모니아수, 암모늄염류, 요소, 질산염류, 기타 보조적으로 사용되는 유기 질소원, 예를 들면 유박류, 대두 가수분해액, 카제인 분해물, 기타 아미노산, 비타민류, 옥수수 침지액, 효모 또는 효모 추출액, 고기 추출액, 펩톤 등의 펩티드류, 각종 발효 균체 및 그 가수분해물 등이 사용된다. 무기 염류로서는 인산염, 마그네슘염, 칼슘염, 철염 및 망간염 등을 적절히 첨가하여 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 미생물이 생육을 위해 특정의 영양소를 필요로 하는 경우에는, 그 영양물을 표품 또는 그것을 함유하는 천연물로서 첨가한다. 또한, 소포제도 필요에 따라서 사용된다. 본 발명에 있어서, 배양액이란 발효 원료에 미생물이 증식한 결과 얻어지는 액을 말한다. 추가되는 발효 원료의 조성은 목적으로 하는 화학품의 생산성이 높아지도록 배양 개시시의 발효 원료 조성으로부터 적절히 변경하여도 좋다.

이어서, 본 발명의 화학품의 제조방법에 이용될 수 있는 미생물에 대해서 설명한다. 본 발명의 미생물에 대해서는 펜토오스 리덕타아제와 펜토오스 디히드로게나아제를 갖는 미생물이라면 특별히 제한은 없다. 또한, 사용되는 미생물은 자연 환경으로부터 단리된 것이어도 좋고, 돌연변이나 유전자 재조합에 의해서 일부 성질이 개변된 것이어도 좋다.

펜토오스 리덕타아제란 환원 효소 중 하나이며, NADH 또는 NADPH를 보효소로 해서 알도펜토오스를 당 알코올로 변환하는 활성을 갖는 효소를 의미한다. 예를 들면, 크실로오스 리덕타아제는, 예를 들면 EC1.1.1.307이나 EC1.1.1.21이 해당되고, 크실로오스를 크실리톨로 변환하는 효소이다. 아라비노오스 리덕타아제는, 예를 들면 EC1.1.1.21이 해당되고, 아라비노오스를 아라비톨로 변환하는 효소이다. 또한, 상기 EC번호에 의해 분류되는 효소가 아니어도 상기 활성을 갖는 효소이라면, 본 발명 중에 있어서의 펜토오스 리덕타아제에 포함된다.

펜톨 디히드로게나아제란 탈수소 효소 중 하나이며, NAD+를 보효소로 해서 펜톨을 케토펜토오스로 변환하는 효소이다. 예를 들면, 크실리톨 디히드로게나아제는, 예를 들면 EC1.1.1.9나 EC1.1.1.10이 해당되고, 크실리톨을 크실룰로오스로 변환하는 효소이다. 아라비톨 디히드로게나아제는, 예를 들면 EC1.1.1.11이나 EC1.1.1.12가 해당되고, 아라비톨을 리보오스로 변환하는 효소이다. 분류상 펜톨 디히드로게나아제와 다른 효소이어도 상기 활성을 갖는 효소이라면, 본 발명 중에 있어서의 펜톨 디히드로게나아제에 포함된다고 한다.

펜토오스를 대사할 수 있는 미생물은 펜토오스 리덕타아제와 펜토오스 디히드로게나아제를 갖는 미생물로서 알려져 있다. 예를 들면, 피치아(Pichia)속, 칸디다(Candida)속, 파치솔렌(Pachysolen)속, 클루이베로마이세스속(Kluyveromyces), 한세눌라속(Hansenula), 토룰롭시스속(Torulopsis), 데바리오마이세스속(Debaryomyces), 이사첸키아속(Issachenkia), 브레타노마이세스 속(Brettanomyces), 린드네라속(Lindnera), 위커하모마이세스속(Wickerhamomyces) 등이다. 구체적으로는 피치아 스티피티스(Pichia stipitis), 피치아 멕시카나(Pichia mexcana), 칸디다 시하타에(Candida shehatae), 칸디다 유틸리스(Candida utilis), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 칸디다 테누이 스(Candida tenuis), 칸디다 보이디니(Candida boidinii), 칸디다 소노렌시스(Candida sonorensis), 칸디다 디드덴시에(Candida diddensiae), 칸디다 인터 미디아(Candida intermedia), 칸디다 파라프실로시스(Candida parapsilosis), 칸디다 메타노소르보사(Candida methanosorbosa), 칸디다 위커하미(Candida wickerhamii), 파치솔렌 탄노필루스(Pachysolen tannophilus), 클루이베로마이세스 마르키아누스(Kluyveromyces marxianus), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 이사첸키아 오리엔탈리스(Issachenkia orientalis), 데바리오마이세스 한세니(Debaryomyces hansenii), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 토룰롭시스 봄비콜라(Torulopsis bombicola), 브레타노마이세스 나르데넨시스(Brettanomyces naardenensis), 린드네라 로다넨시스(Lindnera rhodanensis), 위커하모마이세스 라바울렌시스(Wickerhamomyces rabaulensis) 등이 예시된다. 이것들이 펜토오스 리덕타아제 및 펜토오스 디히드로게나아제를 갖는 것은 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)나 GenBank 등의 웹에서 공개되어 있는 데이터베이스에서 검색을 행함으로써 간단하게 알 수 있다.

또한, 데이터베이스에 정보가 없는 미생물이어도 이하의 [1], [2]에 나타내는 효소 활성 측정에 의해서 알 수 있다.

[1] 펜토오스 리덕타아제 활성 측정

20mM 크실로오스(또는 아라비노오스 등의 펜토오스) 및 100㎕의 1.5mM의 NAD(P)H를 포함하는 50mM의 인산 버퍼(900㎕)에 배양 미생물의 균체 추출액을 첨가하고, 반응에 의해서 생성되는 NAD(P)+의 특이적인 340㎚의 흡광도의 감소를 30℃에서 모니터링함으로써 펜토오스 리덕타아제 활성을 측정할 수 있다.

[2] 펜톨 디히드로게나아제 활성 측정

50mM의 MgCl₂, 300mM의 크실리톨(또는 아라비노오스 등의 펜토오스) 및 100㎕의 10mM의 NAD(P)+를 포함하는 50mM의 Tris-HCl 버퍼 900㎕에 배양 미생물의 균체 추출액을 첨가하고, 반응에 의해서 생성되는 NAD(P)H의 특이적인 340㎚의 흡광도의 증가를 35℃에서 모니터링함으로써 펜톨 디히드로게나아제 활성을 측정할 수 있다.

또한, 박테리아나 빵효모 등 원래 펜토오스 리덕타아제와 펜토오스 디히드로게나아제 활성을 갖지 않는 미생물이어도 유전자 재조합에 의해서 그 효소를 발현시키고 있으면, 본 발명에 포함된다. 원래 펜토오스 리덕타아제와 펜토오스 디히드로게나아제 활성을 갖지 않는 미생물로서 알려져 있는 것은 대장균(Escherichia coli), 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 바실루스 코아규란스(Bacillus coagulans), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtillis), 스포로락토바실루스 레보락티쿠스(Sporolactobacillus laevolacticus), 패니바실루스 폴리믹사(Paenibacillus polymixa), 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis), 자이모박터 팔메(Zymobacter palmae) 등이 예시된다. 유전자 재조합에 의해서 그 효소를 발현시킨 미생물을 작출(作出)하는 방법으로서는 일본 특허 공개 2009-112289 등에 개시되어 있다.

또한, 그 효소를 갖는 미생물을 변이 도입이나 유전자 재조합에 의해서 발효능을 강화하거나, 외래 유전자를 도입하여 원래 만들지 않는 물질을 생산시키거나 하여도 좋다. 구체적으로는 크실로오스 리덕타아제와 크실리톨 디히드로게나아제에 추가하여 크실로오스 이소메라아제를 도입하는, 크실리톨의 대사물인 크실룰로오스에 작용하는 크실룰로오스 키나아제를 고발현시키고, 또한 D-락트산을 생산하지 않는 미생물에 D-락트산 탈수소 효소를 도입하는 등이다.

이어서, 본 발명에 있어서 분리막으로서 이용되는 다공성 막에 대해서 설명한다.

본 발명에 이용되는 다공질 막에 대해서는 특별히 제한은 없고, 미생물의 교반형 배양기 또는 교반형 바이오 리액터에 의한 배양으로 얻어진 배양액을 미생물로부터 분리 여과하는 기능을 갖는 것이라면 좋고, 예를 들면 다공질 세라믹막, 다공질 유리막, 다공질 유기 고분자막, 금속 섬유 편직체, 부직포 등을 이용할 수 있다. 이들 중에서, 특히 다공질 유기 고분자막 또는 세라믹막이 적합하다.

본 발명에서 분리막으로서 이용되는 다공성 막의 구성에 대해서 설명한다. 본 발명에서 이용되는 다공성 막은 바람직하게는 피처리수의 수질이나 용도에 따른 분리 성능과 투수 성능을 갖는 것이다.

다공성 막은 저지 성능 및 투수 성능이나 분리 성능, 예를 들면 내오염성의 점에서 다공질 수지층을 포함하는 다공성 막인 것이 바람직하다.

다공질 수지층을 포함하는 다공성 막은 바람직하게는 다공질 기재의 표면에 분리 기능층으로서 작용하는 다공질 수지층을 갖고 있다. 다공질 기재는 다공질 수지층을 지지하여 분리막에 강도를 부여한다.

본 발명에서 이용되는 다공성 막이 다공질 기재의 표면에 다공질 수지층을 갖고 있는 경우, 다공질 기재에 다공질 수지층이 침투되어 있어도, 다공질 기재에 다공질 수지층이 침투되어 있지 않아도 어느 것이라도 좋고, 용도에 따라서 선택된다.

다공질 기재의 평균 두께는 바람직하게는 50㎛ 이상 3000㎛ 이하이다.

다공질 기재의 재질은 유기재료 및/또는 무기재료 등으로 이루어지고, 유기섬유가 바람직하게 이용된다. 바람직한 다공질 기재는 셀룰로오스 섬유, 셀룰로오스트리아세테이트 섬유, 폴리에스테르 섬유, 폴리프로필렌 섬유 및 폴리에틸렌 섬유 등의 유기섬유인 직포나 부직포이며, 보다 바람직하게는 밀도의 제어가 비교적 용이하고, 제조도 용이하며 저렴한 부직포가 사용된다.

다공질 수지층은 유기 고분자막을 적합하게 사용할 수 있다. 유기 고분자막의 재질로서는, 예를 들면 폴리에틸렌계 수지, 폴리프로필렌계 수지, 폴리염화비닐계 수지, 폴리불화비닐리덴계 수지, 폴리술폰계 수지, 폴리에테르술폰계 수지, 폴리아크릴로니트릴계 수지, 셀룰로오스계 수지 및 셀룰로오스트리아세테이트계 수지 등이 예시된다. 유기 고분자막은 이들 수지를 주성분으로 하는 수지의 혼합물이어도 좋다. 여기서, 주성분이란 그 성분이 50중량% 이상, 바람직하게는 60중량% 이상 함유되는 것을 말한다. 유기 고분자막의 재질은 용해에 의한 제막이 용이하고, 물리적 내구성이나 내약품성도 우수한 폴리염화비닐계 수지, 폴리불화비닐리덴계 수지, 폴리술폰계 수지, 폴리에테르술폰계 수지 및 폴리아크릴로니트릴계 수지가 바람직하고, 폴리불화비닐리덴계 수지 또는 그것을 주성분으로 하는 수지가 가장 바람직하게 이용된다.

여기서, 폴리불화비닐리덴계 수지로서는 불화비닐리덴의 단독 중합체가 바람직하게 이용된다. 또한, 폴리불화비닐리덴계 수지는 불화비닐리덴과 공중합 가능한 비닐계 단량체와의 공중합체도 바람직하게 이용된다. 불화비닐리덴과 공중합 가능한 비닐계 단량체로서는 테트라플루오로에틸렌, 헥사플루오로프로필렌 및 삼염화플루오르화에틸렌 등이 예시된다.

본 발명에서 분리막으로서 사용되는 다공성 막은 특별히 제한은 없고, 발효에 사용되는 미생물이 통과할 수 없으면 좋지만, 발효에 사용되는 미생물의 분비물이나 발효 원료 중의 미립자에 의한 막힘을 일으키기 어렵고, 또한 여과 성능이 장기간 안정되게 계속되는 범위인 것이 바람직하다. 따라서, 다공성 분리막의 평균 세공 지름이 0.01㎛ 이상 5㎛ 미만 것이 바람직하다. 또한, 더욱 바람직하게는 다공성 막의 평균 세공 지름이 0.01㎛ 이상 1㎛ 미만이면, 미생물이 누출되는 일이 없는 높은 배제율과 높은 투수성을 양립시킬 수 있고, 투수성을 장시간 유지하는 것이 보다 높은 정밀도와 재현성을 가지고 실시될 수 있다.

미생물의 크기에 가까우면, 이것들이 직접 구멍을 막아버리는 경우가 있으므로 다공성 막의 평균 세공 지름은 1㎛ 미만인 것이 바람직하다. 다공성 막의 평균 세공 지름은 미생물의 누출, 즉 배제율이 저하되는 문제의 발생을 방지하기 위해서 미생물의 크기와 비교하여 너무 크지 않는 것이 바람직하다. 미생물 중 세포가 작은 세균 등을 이용하는 경우에는 평균 세공 지름으로서 0.4㎛ 이하가 바람직하고, 0.2㎛ 미만이라면 보다 적합하게 실시될 수 있다.

또한, 미생물이 소망의 생산물인 화학품 이외의 물질, 예를 들면 단백질이나 다당류 등 응집하기 쉬운 물질을 생산하는 경우가 있고, 또한 배양액 중의 미생물의 일부가 사멸됨으로써 세포의 파쇄물이 생성되는 경우가 있어, 이들 물질에 의한 다공성 막의 폐색을 회피하기 위해서 평균 세공 지름은 0.1㎛ 이하인 것이 더욱 적합하다.

평균 세공 지름이 너무 작으면 다공성 막의 투수 성능이 저하되고, 막이 오염되지 않아도 효율적인 운전을 할 수 없게 되기 때문에, 본 발명에 있어서의 다공성 막의 평균 세공 지름은 바람직하게는 0.01㎛ 이상이고, 보다 바람직하게는 0.02㎛ 이상이며, 더욱 바람직하게는 0.04㎛ 이상이다.

여기서, 평균 세공 지름은 배율 10,000배의 주사형 전자 현미경 관찰 에 있어서의 9.2㎛×10.4㎛의 범위 내에서 관찰될 수 있는 세공 모두의 직경을 측정하고, 평균함으로써 구할 수 있다. 평균 세공 지름은, 또는 막 표면을 주사형 전자 현미경을 이용하여 배율 10,000배에서 사진 촬영하고, 10개 이상, 바람직하게는 20개 이상의 세공을 무작위로 선택하고, 그들 세공의 직경을 측정하고, 수평균하여 구할 수도 있다. 세공이 원 형상이 아닌 경우, 화상 처리 장치 등에 의해서 세공이 갖는 면적과 동등한 면적을 갖는 원(등가원)을 구하고, 등가원 직경을 세공의 직경으로 하는 방법에 의해 구해진다.

본 발명에서 이용되는 다공성 막의 평균 세공 지름의 표준 편차 σ는 0.1㎛ 이하인 것이 바람직하다. 평균 세공 지름의 표준 편차 σ는 작으면 작을수록 바람직하다. 평균 세공 지름의 표준 편차 σ는 상술의 9.2㎛×10.4㎛의 범위 내에서 관찰될 수 있는 세공수를 N으로 하고, 측정된 각각의 직경을 X_k로 하고, 세공 직경의 평균을 X(ave)로 한 하기 식(1)에 의해 산출된다.

본 발명에서 이용되는 다공성 막에 있어서는 발효 배양액의 투과성이 중요한 성능 중 하나이다. 다공성 막의 투과성의 지표로서 사용 전의 다공성 막의 순수 투과계수를 이용할 수 있다. 본 발명에 있어서, 다공성 막의 순수 투과계수는 역침투막에 의한 25℃의 온도의 정제수를 이용하여 헤드 높이 1m에서 투수량을 측정하여 산출했을 때, 5.6×10^-10㎥/㎡/s/pa 이상인 것이 바람직하고, 순수 투과계수가 5.6×10^-10㎥/㎡/s/pa 이상 6×10^-7㎥/㎡/s/pa 이하이라면, 실용적으로 충분한 투과수량이 얻어진다.

본 발명에서 이용되는 다공성 막에 있어서, 표면 조도란 표면에 대하여 수직 방향의 높이의 평균값이다. 막 표면 조도는 분리막 표면에 부착된 미생물이 교반이나 순환 펌프에 의한 액 흐름에 의한 막면 세정 효과에 의해 박리되기 쉽게 하기 위한 인자 중 하나이다. 다공성 막의 표면 조도는 특별히 제한은 없고, 막에 부착된 미생물, 및 기타 고형물이 박리되는 범위이라면 좋지만, 0.1㎛ 이하인 것이 바람직하다. 표면 조도가 0.1㎛ 이하이면, 막에 부착된 미생물, 및 기타 고형물이 박리되기 쉬워진다.

더욱 바람직하게는, 다공성 막의 막 표면 조도가 0.1㎛ 이하이며, 평균 세공 지름이 0.01㎛ 이상 1㎛ 미만이며, 다공성 막 순수 투과계수가 2×10^-9㎥/㎡/s/pa 이상인 다공성 막을 사용함으로써 막면 세정에 필요한 동력을 과도하게 필요로 하지 않는 운전이 보다 용이하게 가능하다는 것을 알 수 있었다. 다공성 막의 표면 조도를 0.1㎛ 이하로함으로써 미생물의 여과에 있어서 막 표면에서 발생하는 전단력을 저하시킬 수 있고, 미생물의 파괴가 억제되어 다공성 막의 막힘도 억제됨으로써 장기간 안정된 여과가 보다 용이하게 가능하게 된다. 또한, 다공성 막의 표면 조도를 0.1㎛ 이하로 함으로써 보다 낮은 막간차압으로 연속 발효가 실시 가능하며, 다공성 막이 막힌 경우라도 높은 막간차압으로 운전한 경우에 비해서 세정 회복성이 양호하다. 다공성 막의 막힘을 억제함으로써 안정된 연속 발효가 가능하게 되기 때문에 다공성 막의 표면 조도는 작으면 작을수록 바람직하다.

여기서, 다공성 막의 막 표면 조도는 하기 원자간력 현미경 장치(AFM)를 사용하여 하기 조건에서 측정된 것이다.

· 장치 원자간력 현미경 장치(Digital Instruments(주)제 "Nanoscope IIIa")

· 조건 탐침 SiN 칸틸레버(Digital Instruments(주) 제)

주사 모드 컨택트 모드(기중 측정)

수중 태핑 모드(수중 측정)

주사 범위 10㎛×25㎛(기중 측정)

5㎛×10㎛(수중 측정)

주사 해상도 512×512

· 시료 조제 측정에 즈음해서 막 샘플은 상온에서 에탄올에 15분 침지 후, RO수 중에 24시간 침지하고, 세정한 후 풍건하여 사용하였다. RO수란 여과막의 일종인 역침투막(RO막)을 이용하여 여과하여 이온이나 염류 등의 불순물을 제거한 물을 가리킨다. RO막의 구멍의 크기는 대체로 2㎚ 이하이다.

막 표면 조도 d_rough는 상기 원자간력 현미경 장치(AFM)에 의해 각 포인트의 Z축 방향의 높이로부터 하기 식(2)에 의해 산출했다.

본 발명에서 이용되는 다공성 막의 형상은 바람직하게는 평막이다. 다공성 막의 형상이 평막인 경우, 그 평균 두께는 용도에 따라서 선택된다. 다공성 막의 형상이 평막인 경우의 평균 두께는 바람직하게는 20㎛ 이상 5,000㎛ 이하이며, 보다 바람직하게는 50㎛ 이상 2,000㎛ 이하이다. 또한, 본 발명에서 이용되는 다공성 막의 형상은 바람직하게는 중공사막이다. 다공성 막이 중공사막인 경우, 중공사의 내경은 바람직하게는 200㎛ 이상 5,000㎛ 이하이고, 막 두께는 바람직하게는 20㎛ 이상 2,000㎛ 이하이다. 또한, 유기섬유 또는 무기섬유를 통 형상으로 된 직물이나 편물을 중공사의 내부에 포함하고 있어도 좋다.

또한, 상술의 다공성 막은, 예를 들면 WO2007/097260에 기재되는 제조방법에 의해 제조할 수 있다.

또한, 다른 바람직한 형태로서, 본 발명에 있어서의 분리막은 적어도 세라믹스를 포함하는 막일 수 있다. 본 발명에 있어서의 세라믹스란 금속 산화물을 함유하고, 고온에서의 열처리에 의해 소결된 것을 가리킨다. 금속 산화물로서는 알루미나, 마그네시아, 티아니아, 지르코니아 등이 예시될 수 있다. 분리막은 금속 산화물만으로 형성되어도 좋고, 실리카나 탄화규소, 실리카와 금속 산화물의 화합물인 뮬라이트나 코디어라이트 등을 포함하여도 좋다.

분리막을 형성하는 세라믹스 이외의 성분은 분리막으로서의 다공질체를 이룰 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않는다.

분리막이 세라믹스를 포함하는 경우에도 그 형상에는 특별히 제한은 없고, 모노리스막, 평막, 관 형상 막 등 모두 이용할 수 있다. 용기 내로의 충전 효율의 관점에서 기둥 형상 구조이며, 길이 방향으로 관통 구멍을 갖는 구조인 것이 바람직하다. 충전 효율이 높아지는 점에서, 바람직하게는 모노리스막이다.

길이 방향으로 관통 구멍을 갖는 것이 바람직한 이유는 이하와 같다. 기둥 형상 구조를 갖는 분리막을 모듈 용기에 넣어서 분리막 모듈로서 이용하는 경우에는 분리막은 외압식 및 내압식 중에서 적합한 실시형태를 선택하여 모듈화, 여과하는 것이 가능해진다. 본 발명에 있어서는, 이 이후 분리막이 발효 배양액과 접하는 측을 1차측, 여과에 의해 화학품을 포함하는 여과액이 얻어지는 측을 2차측으로 각각 칭하기로 한다.

내압식 모듈을 이용하면, 1차측의 유로가 좁기 때문에 크로스플로우 여과를 행할 경우에 순환 펌프의 출력이 절약될 수 있다. 또한, 분리막 표면에 퇴적된 탁질을 모듈 밖으로 배출하는 작용이 강해져 분리막 표면이 청정하게 유지되기 쉽기 때문에 바람직하다. 단, 이 효과를 얻기 위해서는 내압식의 분리막이 발효 배양액의 입구 및 출구를 갖고 있는 것이 전제가 된다. 이 때의 입구 및 출구는 일직선으로 배치된 관통 구멍의 상태이면 통액저항이 작아지기 때문에 바람직하다. 또한, 분리막이 기둥 형상 구조이고, 관통 구멍이 길이 방향으로 형성되어 있음으로써 분리막을 수용하는 용기를 가늘게 하는 것이 가능해진다. 분리막 모듈이 가늘면, 제조나 취급의 관점에서 바람직하게 사용할 수 있다.

분리막의 기공률은 특별히 한정되지 않지만, 너무 낮으면 여과 효율이 나빠지고, 너무 높으면 강도가 저하되어 버린다. 여과 효율과 분리막의 강도를 양립시켜 반복 증기 멸균으로의 내성도 갖게 하기 위해서는 20% 이상 60% 이하인 것이 바람직하다.

또한, 기공률은 이하의 식으로부터 결정된다.

기공률[%]=100×(습윤막 중량[g]-건조막 중량[g])/물 비중[g/㎤]/(막 체적[㎤]).

분리막의 평균 기공 지름은 0.01㎛ 이상 1㎛ 이하이라면 바람직하고, 이 범위의 평균 기공 지름을 갖는 막이라면 분리막이 폐색되기 어렵고, 또한 여과 효율도 우수하다. 또한, 평균 기공 지름이 0.02㎛ 이상 0.2㎛ 이하의 범위이라면, 단백질, 다당류 등으로 예시되는 미생물이나 배양 세포에 의한 발효의 부생성물이나, 배양액 중의 미생물/배양 세포가 사멸하여 생기는 세포 파쇄물이라고 한 분리막을 폐색시키기 쉬운 물질의 폐색이 일어나기 어렵게 되기 때문에 특히 바람직하다.

관통 구멍을 갖는 기둥 형상 구조의 분리막은 외표면이 2차측으로 되기 때문에, 여과액을 모으기 위해서 모듈 용기를 설치하여 모듈 용기 내에 분리막을 충전시킨 모듈로서 이용하는 것이 바람직하다. 1개의 모듈에 충전되는 분리막은 1개 이상이다.

모듈 용기는 반복의 증기 멸균 처리에 견딜 수 있는 원료로 이루어지는 것이 바람직하다. 증기 멸균 처리에 견딜 수 있는 원료로서는, 예를 들면 스테인리스강이나 평균 기공률이 낮은 세라믹스 등이 예시된다.

이러한 세라믹막 모듈은, 예를 들면 WO2012/086763에 기재되는 제조방법에 의해 제조될 수 있지만, 시판의 것을 이용할 수도 있다. 시판의 것으로서 구체적으로 예시하면, MEMBRALOX 정밀 여과막(Pall), 세라믹막 필터 세필트 MF막(니폰가이시) 등이 예시된다.

이어서, 연속 발효에 대해서 설명한다.

본 발명에서의 연속 발효는 미생물의 배양액을 분리막에 의해 여과하여 미여과액을 배양액에 유지 또는 환류하고, 또한 발효 원료를 배양액에 추가하여 여과액 중에서 생산물을 회수하는 연속 발효인 것을 특징으로 한다.

미생물의 배양은 이용되는 미생물에 적합한 pH 및 온도를 설정하면 좋고, 미생물이 생육하는 범위이라면 특별히 한정되지 않지만, 통상 pH가 4~8이고, 온도가 20~75℃인 범위에서 행해진다. 배양액의 pH는 무기 또는 유기의 산, 알칼리성 물질, 또한 요소, 탄산칼슘, 암모니아 가스 등에 의해서 통상 pH4~8 범위 내의 미리 정해진 값으로 조절된다.

또한, 연속 발효에 있어서의 배양액 중의 당 농도는 생산성의 관점에서 5g/ℓ 이하를 유지하는 것이 바람직하다. 연속 발효의 배지의 공급 속도나 배양액의 여과 속도, 또는 공급 배지 중의 당 농도에 의해서 조절될 수 있다. 또한, 다른 방법으로서는 산소 공급량을 조절하는 것이 예시된다.

본 발명에서 이용되는 펜토오스 리덕타아제와 펜토오스 디히드로게나아제를 갖는 미생물은 산소 농도가 높을수록 펜토오스의 대사가 유리한 경우가 많다. 통상, 글루코오스를 이용한 에탄올 발효 등은 산소를 이용하지 않는 혐기적 조건 하에서 효율적으로 행해지는 것이 알려져 있다. 그러나, 펜토오스의 대사에 있어서는 호기적 조건인 쪽이 유리하다. 이러한 것은, 펜토오스 리덕타아제는 보효소로서 대부분이 NADH를 이용하지만, 펜토오스 대사 경로의 산화 환원 밸런스의 언밸런스가 발생하여 있고, 이 언밸런스때문에 산소를 이용하는 경로를 과도하게 이용하고 있는 것으로 생각된다. 일부 미생물에서는 NADH와 NADPH 양쪽을 이용할 수 있는 듀얼 효소의 펜토오스 리덕타아제를 갖는다. 이러한 효소는 산소가 제한된 상황 하에서 NAD/NADH 산화 환원 시스템의 언밸런스를 방지할 수 있다(대사공학-원리와 방법론-, 그레고리 N 스테파노프러스 등, 도쿄덴키다이가쿠슈판, p174(2002)). 그 때문에, 이용되는 미생물에 의해서 적절히 산소 공급량을 설정하는 것이 필요하지만, 상기와 같은 듀얼 효소여도 NADPH보다 NADH의 쪽이 이용되기 쉬운 경우가 있고, 그 경우에는 호기적 조건에 있어서도 대사가 가능하다. 따라서, 본 발명에 있어서의 배양의 산소 조건은 산소 이동 용량 계수 KLa(hr^-1)(이하, 단지 KLa로 약칭함)가 바람직하게는 5~300hr^-1, 보다 바람직하게는 10~250hr^-1, 더욱 바람직하게는 20~200hr^-1이다. KLa가 5hr^-1 이하이면, 당 소비 속도가 저하되기 때문에 생산 효율이 높아지지 않을 수 있다. 또한, KLa가 300hr^-1 이상이면, 발포가 활발하게 되기 때문에 연속 발효에 지장을 초래하는 경우가 있다.

KLa란 통기 교반시에 있어서 단위 시간에 기상으로부터 액상으로 산소를 이동시켜 용존 산소를 생성시키는 능력을 나타내는 것이며, 이하의 식(3)으로 정의된다(생물공학실험서, 일본생물공학협회편, 바이후칸, p.310(1992) 참조).

dC/dt=KLa×(C^*-C)···(3).

여기서, C: 배양액 중의 용존 산소 농도 DO(ppm), C^*: 미생물에 의한 산소의 소비가 없는 경우의 기상과 평형의 용존 산소 농도 DO(ppm), KLa: 산소 이동 용량 계수(hr^-1)이다. 상기 식(3)으로부터, 하기 식(4)이 도출되기 때문에 통기한 시간에 대하여 C^*-C의 대수를 플롯함으로써 KLa를 구할 수 있다.

In(C^*-C)=-KLa×t···(4).

또한, 본 발명에 있어서의 KLa는 기체 치환법(다이나믹법)에 의해 측정되는 수치이다. 기체 치환법(다이나믹법)이란 용존 산소 농도 전극을 삽입한 통기 교반 배양 장치에 물 또는 사용되는 배지를 넣고, 이들 액체 중의 산소를 질소 가스에 의해 치환하여 그 액체의 산소 농도를 저하시키고, 이어서 질소 가스를 압축 공기로 교체하여 소정의 통기 속도, 교반 속도 및 온도 하에서의 용존 산소의 상승 과정을 측정함으로써 KLa를 계산하는 방법이다.

KLa는 통기 조건과 교반 조건을 조합하여 통기 교반 배양함으로써 적절하게 설정할 수 있다. 그 경우 통기는, 통기하는 기체도 배양 조건에 따라서 변경하는 것이 가능하다. 예를 들면, 용존 산소 농도를 높게 유지하기 위해서는 공기에 산소를 첨가하여 산소 농도를 21% 이상으로 유지하고, 또는 배양액을 가압하고, 교반 속도를 높이고, 통기 속도를 높이는 등의 방법을 이용할 수 있다.

본 발명에 있어서의 KLa는 상기 방법에 의해서 직접 측정하여 구하면 좋지만, KLa가 낮은 범위에 있어서는 교반 속도 일정 하에서는 이하의 식(5)에 나타내는 바와 같이 KLa가 통기 속도에 비례하는 것이 알려져 있기 때문에, 계산에 의해서 구해도 좋다. 구체적으로는 교반 속도 일정 하에서 통기 속도를 적당히 변화시켜서 KLa 측정을 행하고, 얻어진 KLa를 통기 속도에 대하여 플롯하여 식(5)에 해당하는 정수 a 및 b를 구함으로써 설정할 수 있다.

KLa=a×V+b···(5).

여기서, V: 통기 속도(vvm), a, b: 정수이다.

KLa가 높아져 식(5)으로부터 벗어나는 경우에는 직접 측정을 행해서 KLa를 구한다.

본 발명의 화학품의 제조방법에 있어서는 여과시 막간차압은 특별히 제한되는 것은 아니고, 발효 배양액을 여과할 수 있다면 좋다. 그러나, 유기 고분자막에 있어서는 150kPa보다 높은 막간차압에서 여과 처리하면, 유기 고분자막의 구조가 파괴될 가능성이 높아지고, 화학품을 생산하는 능력이 저하되는 경우가 있다. 또한, 0.1kPa보다 낮은 막간차압에서는 발효 배양액의 투과수량이 충분히 얻어지지 않는 경우가 있어 화학품을 제조할 때의 생산성이 저하되는 경향이 있다. 본 발명의 화학품의 제조방법에서는 유기 고분자막에 있어서는 여과 압력인 막간차압을 바람직하게는 0.1kPa~150kPa의 범위로 함으로써 발효 배양액의 투과수량이 많고, 막 구조의 파괴에 의한 화학품 제조 능력의 저하도 없기 때문에 화학품을 생산하는 능력을 높게 유지하는 것이 가능하다. 막간차압은 유기 고분자막에 있어서는 바람직하게는 0.1kPa 이상 50kPa 이하의 범위이며, 더욱 바람직하게는 0.1kPa 이상 20kPa 이하의 범위이다.

세라믹막을 이용하는 경우에 있어서도 여과시의 막간차압은 특별히 제한되는 것은 아니고, 발효 배양액을 여과할 수 있다면 좋지만, 500kPa 이하가 바람직하다. 500kPa 이상으로 운전하면, 막의 막힘이 발생하여 연속 발효 운전에 문제를 발생시킬 수 있다.

여과의 원동력으로서는 발효액과 다공성 막 처리수의 액위차(수두차)를 이용한 사이펀 또는 크로스플로우 순환 펌프에 의해 분리막에 막간차압을 발생시킬 수 있다. 또한, 여과의 구동력으로서 분리막 2차측에 흡인 펌프를 설치해도 좋다. 또한, 크로스플로우 순환 펌프를 사용하는 경우에는 흡인 압력에 의해 막간차압을 제어할 수 있다. 또한, 발효액측의 압력을 도입하는 기체 또는 액체의 압력에 의해서도 막간차압을 제어할 수 있다. 이들 압력 제어를 행하는 경우에는 발효액 측의 압력과 다공성 막 처리수 측의 압력차를 가지고 막간차압으로 하여 막간차압의 제어에 이용할 수 있다.

또한, 본 발명의 화학품의 제조방법에서는 배양 초기에 배치 배양 또는 페드 배치(fed-batch) 배양을 행하여 미생물 농도를 높게 한 후, 연속 발효(배양액의 여과)를 개시하여도 좋다. 또한, 고농도의 균체를 시딩하고, 배양 개시와 함께 연속 발효를 행해도 좋다. 본 발명의 화학품의 제조방법에서는 적당한 시기에서 배지 공급 및 배양액의 여과를 행하는 것이 가능하다. 배지 공급과 배양액의 여과의 개시 시기는 반드시 같을 필요는 없다. 또한, 배지 공급과 배양액의 여과는 연속적이어도 좋고, 간헐적이어도 좋다.

배지에는 균체 증식에 필요한 영양소를 첨가하고, 균체 증식이 연속적으로 행해지도록 하면 된다. 배양액 중의 미생물의 농도는 화학품을 효율적으로 생산하는데 바람직한 농도이면 좋다. 배양액 중의 미생물의 농도는, 일예로서 건조 중량으로서 5g/ℓ 이상으로 유지함으로써 양호한 생산 효율이 얻어진다.

본 발명의 화학품의 제조방법에서는 연속 발효의 도중에 있어서 필요에 따라서 발효조 내에서 미생물을 포함한 배양액의 일부를 제거한 후, 배지로 희석함으로써 배양조 내의 미생물 농도를 조정해도 좋다. 예를 들면, 발효조 내의 미생물 농도가 너무 높아지면, 분리막의 폐색이 발생하기 쉬워지기 때문에 미생물을 포함한 배양액의 일부를 제거하고, 배지로 희석함으로써 분리막의 폐색을 용이하게 회피할 수 있다. 또한, 발효조 내의 미생물 농도에 의해서 화학품의 생산 성능이 변화되는 경우가 있고, 생산 성능을 지표로 해서 미생물을 포함한 배양액의 일부를 제거하고, 배지로 희석함으로써 생산 성능을 유지시키는 것도 가능하다.

본 발명의 화학품의 제조방법에 따라서 연속 발효를 행한 경우, 종래의 배양과 비교하여 매우 발효 수율이 좋은 연속 발효가 가능해진다. 여기서, 연속 발효에 있어서의 발효 수율은 다음의 식(6)으로 계산된다.

수율(g/g)=생성물량(g)÷{투입당(g)-미이용 당(g)}···(6).

본 발명에서 이용되는 연속 발효 장치는 미생물의 발효 배양액을 분리막에 의해 여과하고, 여과액으로부터 생산물을 회수함과 아울러 미여과액을 상기 발효 배양액에 유지 또는 환류하고, 또한 발효 원료를 상기 발효 배양액에 추가하여 여과액 중의 생산물을 회수하는 연속 발효에 의한 화학품의 제조 장치이라면 특별히 제한은 없지만, 구체예를 들면 유기 고분자막을 사용하는 경우에는 WO2007/097260에 기재되는 장치가 사용될 수 있다. 또한, 세라믹막을 사용할 때에는 WO2012/086763에 기재되는 장치를 사용할 수 있다.

본 발명의 화학품의 제조방법에 의해 제조되는 화학품으로서는 상기 미생물이 배양액 중에 생산하는 물질이라면 제한은 없다. 본 발명의 화학품의 제조방법에 의해 제조되는 화학품은 알코올, 유기산, 아미노산, 핵산 등 발효 공업에 있어서 대량 생산되고 있는 물질을 예시할 수 있다. 예를 들면, 알코올로서는 에탄올, 이소부탄올, 이소프로판올, n-부탄올, 1,3-프로판디올, 1,4-부탄디올, 2,3-부탄디올, 글리세롤 등, 유기산으로서는 아세트산, 락트산, 피루브산, 숙신산, 말산, 이타콘산, 구연산, 아디프산 등, 핵산으로서는 이노신, 구아노신 등의 뉴클레오시드, 이노신산, 구아닐산 등의 뉴클레오티드, 또한 카다베린, 푸트레신 등의 디아민 화합물을 예시할 수 있다. 또한, 본 발명은 효소, 항생물질, 재조합 단백질과 같은 물질의 생산에 적용하는 것도 가능하다. 이들 화학품은 공지의 방법(막 분리, 농축, 증류, 정석, 추출 등)에 의해 여과액으로부터 회수할 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 예시하여 본 발명을 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이것들에 한정되는 것은 아니다.

(참고예 1) 글루코오스, 크실로오스, 에탄올의 분석 방법

배양액 중의 글루코오스, 크실로오스 및 에탄올의 농도는 하기에 나타내는 HPLC 조건에서 표품과의 비교에 의해 정량했다.

컬럼: Shodex SH1011(쇼와덴코가부시키가이샤제)

이동상: 5mM 황산(유속 0.6㎖/min)

반응액: 없음

검출 방법: RI(시차 굴절률)

온도: 65℃.

(참고예 2) 락트산의 분석 방법

배양액 중의 락트산을 하기에 나타내는 HPLC 조건에서 표품과의 비교에 의해 정량했다.

컬럼: Shim-Pack SPR-H(가부시키가이샤 시마즈세이사쿠쇼제)

이동상: 5mM p-톨루엔술폰산(유속 0.8㎖/min)

반응액: 5mM p-톨루엔술폰산, 20mM 비스토리스, 0.1mM EDTA·2Na(유속 0.8㎖/min)

검출 방법: 전기 전도도

온도: 45℃.

(참고예 3) 펜토오스 리덕타아제 활성의 측정

칸디다 트로피칼리스 NBRC0199주, 피치아 스티피티스 NBRC1687주, WO2010/140602에 기재된 칸디다 유틸리스 CuLpLDH주를 각각 5㎖의 YPX 배지(효모 추출액 1%, 박토펩톤 2%, 크실로오스 2%)에 백금이(platinum loop)로 식균하고, 30℃에서 하룻밤 진탕 배양을 행했다(전 배양). 다음날 50㎖의 YPX 배지가 들어간 500㎖의 주름이 있는 삼각 플라스크에 전 배양액을 계대배양하고, 30℃에서 24시간 진탕 배양을 행했다. 회수한 배양액을 50mM의 인산 버퍼로 2회 세정했다. 50mM의 인산 버퍼로 균체를 재현탁시키고, 비즈식 호모게나이저(비즈 φ0.5를 0.6g, 4000rpm, 1분간×5회)로 파쇄한 후, 원심 분리에 의해서 상청을 회수하고, 이것을 균체 추출액으로 했다. 200mM의 크실로오스 및 100㎕의 1.5mM의 NAD(P)H를 포함하는 50mM의 인산 버퍼(900㎕)에 균체 추출액을 첨가하여 30℃에서 반응시켰을 때의 340㎚의 흡광도를 연속적으로 모니터링했다. 크실로오스를 첨가하지 않은 것을 블랭크로 하고, 블랭크와 비교하여 흡광도의 감소가 큰 경우를 펜토오스 리덕타아제 활성이 있는 것으로 판단한 결과, 3주 모두 펜토오스 리덕타아제 활성을 갖는 것을 확인할 수 있었다.

(참고예 4) 펜톨 디히드로게나아제 활성의 측정

칸디다 트로피칼리스 NBRC0199주, 피치아 스티피티스 NBRC1687주, WO2010/140602에 기재된 칸디다 유틸리스 CuLpLDH주를 각각 5㎖의 YPX 배지(효모 추출액 1%, 박토펩톤 2%, 크실로오스 2%)에 백금이로 식균하고, 30℃에서 하룻밤 진탕 배양을 행했다(전 배양). 다음날 50㎖의 YPX 배지가 들어간 500㎖의 주름이 있는 삼각 플라스크에 전 배양액을 계대배양하고, 30℃에서 24시간 진탕 배양을 행했다. 회수한 배양액을 50mM의 Tris-HCl 버퍼로 2회 세정했다. 50mM의 Tris-HCl 버퍼로 균체를 재현탁시키고, 비즈식 호모게나이저(비즈 φ0.5를 0.6g, 4000rpm, 1분간×5회)로 파쇄한 후, 원심 분리에 의해서 상청을 회수하고, 이것을 균체 추출액으로 했다. 50mM의 MgCl₂, 300mM의 크실리톨 및 100㎕의 10mM의 NAD(P)+를 포함하는 50mM의 Tris-HCl 버퍼 900㎕에 균체 추출액을 첨가하여 35℃에서 반응시켰을 때의 340㎚의 흡광도를 연속적으로 모니터링했다. 크실리톨을 첨가하지 않은 것을 블랭크로 하고, 블랭크와 비교하여 흡광도의 증가가 큰 경우를 펜톨 디히드로게나아제 활성이 있는 것으로 판단한 결과, 3주 모두 펜톨 디히드로게나아제 활성을 갖는 것을 확인할 수 있었다.

(참고예 5) KLa 측정

배양조에 용존 산소 전극(메틀러톨레도제)을 삽입하여 각 통기 교반 조건에 대한 용존 산소 농도를 측정하고, 질소 가스를 이용하는 다이나믹법에 의해 KLa를 구했다. 우선, 배양조에 물 1.5ℓ를 채우고, 수온을 30℃로 조정하면서 일정한 속도로 교반하여 질소 가스를 충분히 수중에 불어넣고, 전극값이 최저값으로 된 시점에서 용존 산소 전극의 제로 교정을 행했다. 그 후, 통기 가스를 질소 가스로부터 소정의 통기 속도의 공기로 교체하고나서의 용존 산소 농도의 경시 변화를 측정하여 KLa를 구했다. 교반 속도 800rpm, 온도 30℃에서 압축 공기를 통기했을 때에 얻어진 각 통기 교반 조건에 대한 KLa를 표 1에 나타낸다.

표 1의 0.01~0.6vvm에 있어서, 통기 속도와 KLa의 관계를 플롯하여 식(5)의 정수(a, b)를 산출한 결과 (284, 0.49)였다. 1.5vvm의 값은 플롯의 직선 관계에서 벗어나기 때문에 정수의 계산에 있어서는 제외하고 계산했다.

(비교예 1) 6탄당을 발효 원료로 한 칸디다 트로피칼리스의 배치 배양에 의한 에탄올의 제조

미생물로서, 칸디다 트로피칼리스 NBRC0199주를 이용하고, 배지로서는 YPD 배지(효모 추출액 1%, 박토펩톤 2%, 글루코오스 7%)를 사용했다. 칸디다 트로피칼리스 NBRC0199주를 시험관에서 2㎖의 YPD 배지에서 30℃로 하룻밤 진탕 배양했다(전전 배양). 얻어진 배양액을 50㎖의 YPD 배지가 들어간 500㎖ 용량의 주름이 있는 삼각 플라스크에 식균하고, 하룻밤 진탕 배양했다(전 배양). 전 배양액을 1.5ℓ의 YPD 배지에 식균하여 배양조를 부속의 교반기에 의해서 800rpm으로 교반하여 배양조의 통기 속도의 조정, 온도 조정을 행하고, 이하의 조건에서 16시간 배치 배양을 행하여 에탄올을 제조했다(표 3).

배양조 용적: 2ℓ

배양조 유효 용적: 1.5ℓ

온도 조정: 30℃

배양조 통기 속도: 0.1vvm 압축 공기

배양조 교반 속도: 800rpm

pH 조정: 없음

멸균: 배양조 및 사용 배지는 모두 121℃, 20min의 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균.

(비교예 2) 혼합당을 발효 원료로 한 칸디다 트로피칼리스의 배치 배양에 의한 에탄올의 제조

배지로서 표 2에 나타내는 조성의 YPDX 배지를 사용하여 비교예 1과 동일한 조건에서 23시간 배치 배양을 행하여 에탄올을 제조했다(표 3).

(비교예 3) 혼합당을 발효 원료로 한 칸디다 트로피칼리스의 연속 발효에 의한 에탄올의 제조

배지로서 표 2에 나타내는 조성의 YPDX 배지를 이용한 분리막을 이용하지 않는 연속 발효를 행했다. 칸디다 트로피칼리스 NBRC0199주를 시험관에서 2㎖의 YPD 배지에서 30℃로 하룻밤 진탕 배양했다(전전전 배양). 얻어진 배양액을 50㎖의 YPD 배지가 들어간 500㎖ 용량의 주름이 있는 삼각 플라스크에 식균하고, 하룻밤 진탕 배양했다(전전 배양). 1.5ℓ의 YPDX 배지가 들어간 연속 발효 장치(WO2007/097260의 도 2에 나타내는 장치로부터 분리막 엘리먼트를 제거한 것)에 전전 배양액을 식균하고, 배양조의 교반 속도, 통기 속도, 온도를 비교예 1과 같은 조건으로 조정하여 16시간 배양을 행했다(전 배양). 전 배양 완료 후, 즉시 연속 발효를 개시하고, 360시간의 연속 발효에 의해 에탄올을 제조했다. 배지의 공급과 미생물을 포함하는 배양액의 인발에는 페리스타 바이오미니 펌프 AC-2120형(ATTO사)를 이용하여 배양조 내에 직접 배지 공급을 행하고, 배양조 내에서 직접 미생물을 포함하는 배양액의 인발을 행했다. 미생물을 포함하는 배양액의 인발 속도를 0.05ℓ/hr로 설정하고, 배양조 내의 배양액량을 1.5ℓ가 되도록 배지 공급 속도를 제어하면서 운전했다(표 3).

(실시예 1) 혼합당을 발효 원료로 한 칸디다 트로피칼리스의 분리막을 이용한 연속 발효에 의한 에탄올의 제조 1

배지로서 표 2에 나타내는 조성의 YPDX 배지를 이용한 분리막을 이용한 연속 발효를 행했다. 칸디다 트로피칼리스 NBRC0199주를 시험관에서 2㎖의 YPD 배지에서 30℃로 하룻밤 진탕 배양했다(전전전 배양). 얻어진 배양액을 YPD 배지 50㎖가 들어간 500㎖ 용량의 주름이 있는 삼각 플라스크에 식균하고, 하룻밤 진탕 배양했다(전전 배양). 전전 배양액을 1.5ℓ의 YPDX 배지가 들어간 막 일체형의 이하의 조건을 구비한 연속 발효 장치(WO2007/097260의 도 2에 나타내는 장치)에 식균하고, 배양조를 부속의 교반기에 의해서 800rpm으로 교반하여 배양조의 통기 속도의 조정, 온도 조정을 행하고, 36시간 배양을 행했다(전 배양). 전 배양 완료 후, 즉시 연속 발효를 개시하여 에탄올의 제조를 행했다. 배지 공급과 배양액의 여과에는 페리스타 바이오 미니 펌프 AC-2120형(ATTO사)을 사용했다. 배지 공급은 배양조 내에 직접 행하고, 배양액의 여과는 분리막을 고정한 엘리먼트를 통한 여과액의 인발로서 행했다. 배양액 여과 속도를 일정하게 하여 배양조 내의 배양액량을 1.5ℓ로 되도록 배지 공급 속도를 제어하면서, 여과시의 막간차압은 0.1~20.0kPa의 범위를 추이시킴으로써 370시간의 연속 발효에 의해 에탄올을 제조했다(표 3).

배양조 용적: 2ℓ

배양조 유효 용적: 1.5ℓ

사용 분리막: 폴리불화비닐리덴 여과막

막 분리 엘리먼트 유효 여과 면적: 120㎠

분리막의 순수 투과계수: 50×10^-9㎥/㎡/s/Pa

분리막의 평균 세공 지름: 0.1㎛

평균 세공 지름의 표준 편차: 0.035㎛

분리막의 표면 조도: 0.06㎛

온도 조정: 30℃

배양조 통기 속도: 0.01vvm 압축 공기

배양조 교반 속도: 800rpm

pH 조정: 없음

배양액 여과 속도: 0.05ℓ/hr

멸균: 분리막 엘리먼트를 포함하는 배양조 및 사용 배지는 모두 121℃, 20min의 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균.

(실시예 2) 혼합당을 발효 원료로 한 칸디다 트로피칼리스의 분리막을 이용한 연속 발효에 의한 에탄올의 제조 2

칸디다 트로피칼리스 NBRC0199주를 이용한 분리막을 이용한 연속 발효를 행했다. 배양조 통기 속도를 0.1vvm 압축 공기로 하는 것 이외에는 실시예 1과 마찬가지의 조건에서 행하고, 369시간의 연속 발효에 의해 에탄올을 제조했다(표 3).

(실시예 3) 혼합당을 발효 원료로 한 칸디다 트로피칼리스의 분리막을 이용한 연속 발효에 의한 에탄올의 제조 3

칸디다 트로피칼리스 NBRC0199주를 이용한 분리막을 이용한 연속 발효를 행했다. 배양조 통기 속도를 1.5vvm 압축 공기로 하는 것 이외에는 실시예 1과 마찬가지의 조건으로 행하고, 370시간의 연속 발효에 의해 에탄올을 제조했다(표 3).

(비교예 4) 6탄당을 발효 원료로 한 피치아 스티피티스의 배치 배양에 의한 에탄올의 제조

미생물로서, 피치아 스티피티스 NBRC1687주를 사용하여 비교예 1과 동일한 조건에서 40시간 배치 배양하여 에탄올을 제조했다(표 4).

(비교예 5) 혼합당을 발효 원료로 한 피치아 스티피티스의 배치 배양에 의한 에탄올의 제조

미생물로서, 피치아 스티피티스 NBRC1687주를 사용하여 비교예 2와 마찬가지의 조건에서 40시간 배치 배양하여 에탄올을 제조했다(표 4).

(비교예 6) 혼합당을 발효 원료로 한 피치아 스티피티스의 연속 발효에 의한 에탄올의 제조

미생물로서, 피치아 스티피티스 NBRC1687주를 사용하여 혼합당 원료에서 분리막을 이용하지 않는 연속 발효를 행했다. 전 배양 시간을 40시간으로 한 것 이외에는 비교예 3과 마찬가지의 조건에서 행하고, 368시간의 연속 발효에 의해 에탄올을 제조했다(표 4).

(실시예 4) 혼합당을 발효 원료로 한 피치아 스티피티스의 분리막을 이용한 연속 발효에 의한 에탄올의 제조 1

미생물로서, 피치아 스티피티스 NBRC1687주를 사용하여 분리막을 이용한 연속 발효를 행했다. 전 배양을 48시간으로 하고, 막간차압을 0.1~19.8kPa로 한 것 이외에는 실시예 1과 마찬가지의 조건에서 행하고, 370시간의 연속 발효에 의해 에탄올을 제조했다(표 4).

(실시예 5) 혼합당을 발효 원료로 한 피치아 스티피티스의 분리막을 이용한 연속 발효에 의한 에탄올의 제조 2

미생물로서, 피치아 스티피티스 NBRC1687주를 사용하여 분리막을 이용한 연속 발효를 행했다. 전 배양을 40시간으로 하고, 막간차압을 0.1~19.8kPa로 한 것 이외에는 실시예 2와 마찬가지의 조건에서 행하고, 369시간의 연속 발효에 의해 에탄올을 제조했다(표 4).

(실시예 6) 혼합당을 발효 원료로 한 피치아 스티피티스의 분리막을 이용한 연속 발효에 의한 에탄올의 제조 3

미생물로서, 피치아 스티피티스 NBRC1687주를 사용하여 분리막을 이용한 연속 발효를 행했다. 전 배양을 36시간으로 하고, 막간차압을 0.1~19.8kPa로 한 것 이외에는 실시예 3과 마찬가지의 조건에서 행하고, 370시간의 연속 발효에 의해 에탄올을 제조했다(표 4).

(비교예 7) 6탄당을 발효 원료로 한 칸디다 유틸리스의 배치 배양에 의한 D-락트산의 제조

미생물로서, WO2010/140602에 개시된 방법에 의해서 제작된 칸디다 유틸리스 CuLpLDH주를 사용하였다. pH를 1N 수산화칼슘에 의해 pH6.0으로 조정한 것 이외에는 비교예 1과 마찬가지의 조건에서 40시간 배치 배양을 행하여 D-락트산을 제조했다(표 5).

(비교예 8) 혼합당을 발효 원료로 한 칸디다 유틸리스의 배치 배양에 의한 D-락트산의 제조

미생물로서, 칸디다 유틸리스 CuLpLDH주를 사용하여 pH를 1N 수산화칼슘에 의해 pH6.0으로 조정한 것 이외에는 비교예 2와 마찬가지의 조건에서 40시간 배치 배양을 행하여 D-락트산을 제조했다(표 5).

(비교예 9) 혼합당을 발효 원료로 한 칸디다 유틸리스의 연속 발효에 의한 D-락트산의 제조

미생물로서, 칸디다 유틸리스 CuLpLDH주를 사용하여 분리막을 이용하지 않는 연속 발효를 행했다. 전 배양을 40시간으로 하고, pH를 1N 수산화칼슘에 의해 pH6.0으로 조정한 것 이외에는 비교예 3과 마찬가지의 조건에서 행하고, 368시간의 연속 발효에 의해 D-락트산을 제조했다(표 5).

(실시예 7) 혼합당을 발효 원료로 한 칸디다 유틸리스의 분리막을 이용한 연속 발효에 의한 D-락트산의 제조 1

미생물로서 칸디다 유틸리스 CuLpLDH주를 사용하여 분리막을 이용한 연속 발효를 행했다. 전 배양을 50시간으로 하고, pH를 1N 수산화칼슘에 의해 pH6.0으로 조정한 것 이외에는 실시예 1과 마찬가지의 조건에서 행하고, 370시간의 연속 발효에 의해 D-락트산을 제조했다(표 5).

(실시예 8) 혼합당을 발효 원료로 한 칸디다 유틸리스의 분리막을 이용한 연속 발효에 의한 D-락트산의 제조 2

미생물로서 칸디다 유틸리스 CuLpLDH주를 사용하여 분리막을 이용한 연속 발효를 행했다. 전 배양을 40시간으로 하고, pH를 1N 수산화칼슘에 의해 pH6.0 으로 조정한 것 이외에는 실시예 1과 마찬가지의 조건에서 행하고, 369시간의 연속 발효에 의해 D-락트산을 제조했다(표 5).

(실시예 9) 혼합당을 발효 원료로 한 칸디다 유틸리스의 분리막을 이용한 연속 발효에 의한 D-락트산의 제조 3

미생물로서 칸디다 유틸리스 CuLpLDH주를 사용하여 분리막을 이용한 연속 발효를 행했다. 전 배양을 30시간으로 하고, pH를 1N 수산화칼슘에 의해 pH6.0 으로 조정한 것 이외에는 실시예 1과 마찬가지의 조건에서 행하고, 370시간의 연속 발효에 의해 D-락트산을 제조했다(표 5).

(비교예 10) 혼합당을 발효 원료로 한 칸디다 트로피칼리스의 배치 발효에 의한 에탄올의 제조 2

칸디다 트로피칼리스 NBRC0199주를 사용하여 배치 발효를 행했다. 발효 배지는 YPDX 배지를 이용했지만, 표 2에 나타내는 조성으로부터 당 농도를 변경하여 글루코오스 1%, 크실로오스 9%로 조제했다. 다른 운전 조건 등은 비교예 2와 마찬가지로 행하여 42시간의 배치 발효에 의해 에탄올을 제조했다(표 6).

(비교예 11) 혼합당을 발효 원료로 한 칸디다 트로피칼리스의 연속 발효에 의한 에탄올의 제조 2

칸디다 트로피칼리스 NBRC0199주를 사용하여 분리막을 이용하지 않는 연속 발효를 행했다. 발효 배지는 YPDX 배지를 이용했지만, 표 2에 나타내는 조성으로부터 당 농도를 변경하여 글루코오스 1%, 크실로오스 9%로 조제했다. 다른 운전 조건 등은 비교예 3과 마찬가지로 행하여 400시간의 연속 발효에 의해 에탄올을 제조했다(표 6).

(실시예 10) 혼합당을 발효 원료로 한 칸디다 트로피칼리스의 분리막을 이용한 연속 발효에 의한 에탄올의 제조 4

칸디다 트로피칼리스 NBRC0199주를 사용하여 분리막을 이용한 연속 발효를 행했다. 발효 배지는 YPDX 배지를 이용했지만, 표 2에 나타내는 조성으로부터 당 농도를 변경하여 글루코오스 1%, 크실로오스 9%로 조제했다. 다른 운전 조건 등은 실시예 1과 마찬가지로 행하여 420시간의 연속 발효에 의해 에탄올을 제조했다(표 6).

(실시예 11) 혼합당을 발효 원료로 한 칸디다 트로피칼리스의 세라믹제 분리막을 이용한 연속 발효에 의한 에탄올의 제조 5

칸디다 트로피칼리스 NBRC0199주를 사용하여 세라믹제 분리막을 이용한 연속 발효를 행했다. 발효 배지는 YPDX 배지를 이용했지만, 표 2에 나타내는 조성으로부터 당 농도를 변경하여 글루코오스 1%, 크실로오스 9%로 조제했다. 칸디다 트로피칼리스 NBRC0199주를 시험관에서 2㎖의 YPD 배지에서 30℃로 하룻밤 진탕 배양했다(전전전 배양). 얻어진 배양액을 YPD 배지 50㎖가 들어간 500㎖ 용량의 주름이 있는 삼각 플라스크에 식균하고, 하룻밤 진탕 배양했다(전전 배양). 전전 배양액을 1.5ℓ의 YPDX 배지가 들어간 막분리형의 연속 발효 장치(WO2012/086763의 도 12에 나타내는 장치)에 식균하고, 배양조를 부속의 교반기에 의해서 800rpm으로 교반하여 배양조의 통기 속도의 조정, 온도 조정을 행하고, 36시간 배양을 행했다(전 배양). 전 배양 완료 후, 즉시 연속 발효를 개시했다. 여과시의 막간차압은 500kPa 이하로 되도록 조정하면서 400시간의 연속 발효에 의해 에탄올을 제조했다(표 6).

배양조 용적: 2ℓ

배양조 유효 용적: 1.5ℓ

사용 분리막: Celfit 정밀 여과막 모노리스 φ4-19(니폰가이시)

막분리 엘리먼트 길이: 500㎜

분리막의 평균 세공 지름: 0.1㎛

온도 조정: 30℃

배양조 통기 속도: 0.01vvm 압축 공기

배양조 교반 속도: 800rpm

pH 조정: 없음.

(비교예 12) 혼합당을 발효 원료로 한 칸디다 트로피칼리스의 배치 배양에 의한 에탄올의 제조 3

칸디다 트로피칼리스 NBRC0199주를 사용하여 배치 발효를 행했다. 발효 원료는 WO2010/067785의 실시예 2에 개시된 나노여과막에 의한 조제방법에 의해 조제된 셀룰로오스 당화액을 이용하고, 적절한 시약에 의해 발효 배지의 조성을 표 7에 나타내는 바와 같이 조제했다. 다른 운전 조건 등은 비교예 3과 마찬가지로 행하여 72시간의 배치 발효에 의해 에탄올을 제조했다(표 8).

(비교예 13) 혼합당을 발효 원료로 한 칸디다 트로피칼리스의 연속 발효에 의한 에탄올의 제조 3

칸디다 트로피칼리스 NBRC0199주를 사용하여 분리막을 이용하지 않는 연속 발효를 행했다. 발효 배지는 비교예 12와 마찬가지로 표 7 기재의 배지를 이용했다. 다른 운전 조건 등은 비교예 3과 마찬가지로 행하여 400시간의 연속 발효에 의해 에탄올을 제조했다(표 8).

(실시예 12) 혼합당을 발효 원료로 한 칸디다 트로피칼리스의 분리막을 이용한 연속 발효에 의한 에탄올의 제조 6

칸디다 트로피칼리스 NBRC0199주를 사용하여 분리막을 이용한 연속 발효를 행했다. 발효 배지는 비교예 12와 마찬가지로 표 7 기재의 배지를 이용했다. 다른 운전 조건 등은 실시예 1과 마찬가지로 행하여 456시간의 연속 발효에 의해 에탄올을 제조했다(표 8).

이상의 결과로부터, 5탄당과 6탄당의 혼합당으로부터 화학품을 고수율로 제조할 수 있었다.

(산업상 이용가능성)

본 발명에 의해서, 5탄당 및 6탄당을 포함하는 발효 원료를 이용한 각종 화학품의 발효 생산 효율을 대폭 향상시킬 수 있다.

Claims

미생물의 배양액을 분리막에 의해 여과하는 것, 미여과액을 배양액에 유지 또는 환류하는 것, 발효 원료를 배양액에 추가하는 것, 및 여과액 중의 생산물을 회수하는 것을 포함하는 연속 발효에 의한 화학품의 제조방법으로서, 상기 발효 원료는 5탄당 및 6탄당을 포함하고, 상기 미생물은 펜토오스 리덕타아제 및 펜톨 디히드로게나아제를 이용하여 5탄당을 대사하는 경로를 갖는 미생물인 것을 특징으로 하는 화학품의 제조방법.
제 1 항에 있어서,
산소 이동 용량 계수(KLa)는 5~300h^-1의 조건에서 연속 발효를 행하는 것을 특징으로 하는 화학품의 제조방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 발효 원료 중에 포함되는 5탄당과 6탄당의 비율은 1:9~9:1인 것을 특징으로 하는 화학품의 제조방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 발효 원료는 바이오매스 유래의 당액을 포함하는 것을 특징으로 하는 화학품의 제조방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
5탄당은 크실로오스인 것을 특징으로 하는 화학품의 제조방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
펜토오스 리덕타아제는 크실로오스 리덕타아제인 것을 특징으로 하는 화학품의 제조방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
펜톨 디히드로게나아제는 크실리톨 디히드로게나아제인 것을 특징으로 하는 화학품의 제조방법.