CN107043791A - 化学品的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的课题是提供以六碳糖与五碳糖的混合糖为发酵原料的高收率的化学品的制造方法。作为本发明的解决课题的方法是,提供化学品的制造方法,是通过连续发酵来制造化学品的方法,包括:将微生物的培养液用分离膜过滤,将未过滤液保持在或回流至培养液中,在培养液中补加发酵原料,和回收过滤液中的生产物,所述微生物是受到分解代谢物抑制的微生物,所述发酵原料包含六碳糖和五碳糖。
Description
本申请发明是申请号为201380005122.3、发明名称为化学品的制造方法、申请日为2013年1月11日的申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及使用了包含六碳糖和五碳糖的发酵原料的通过连续发酵来制造化学品的方法。
背景技术
以乳酸等生物分解性聚合物原料、乙醇等生物燃料为代表的来源于生物质的化学品作为二氧化碳向大气中的排放问题和/或能源问题的显在化、以及可持续性(sustainability)和生命周期评估(LCA)对应型制品,受到强烈关注。作为这些生物分解性聚合物原料、生物燃料的制造方法,一般使用从玉米等可食性生物质纯化而得的六碳糖葡萄糖作为微生物的发酵原料,作为发酵产物得到,但如果使用可食性生物质,则可能由于与食物竞争而引起价格高涨,不能实现稳定的原料供应。于是,进行了使用来源于稻秸等非可食性生物质的糖作为微生物的发酵原料的尝试(参照专利文献1)。
使用来源于非可食性生物质的糖作为发酵原料时,将非可食生物质所含的纤维素、半纤维素等通过糖化酶分解成糖,但此时不仅得到葡萄糖等六碳糖,还同时得到木糖等五碳糖,在使用来源于非可食性生物质的糖作为微生物的发酵原料的情况下,需要使用六碳糖与五碳糖的混合糖作为发酵原料(参照专利文献1)。
作为以作为六碳糖与五碳糖的混合糖的来源于非可食性生物质的糖为微生物的发酵原料的发酵方法,可采用连续发酵,但实际对于连续发酵时的发酵收率并未确认(参照专利文献1)。另一方面,还已知将六碳糖与五碳糖的混合糖作为发酵原料进行连续发酵时,由于培养基被连续地用于发酵,因而与分批发酵时相比连续地受到分解代谢物抑制,从而与分批发酵相比发酵收率显著降低(参照非专利文献1)。因此,到目前为止的技术常识是认为,如果要通过以六碳糖与五碳糖的混合糖作为微生物的发酵原料的连续发酵来提高发酵收率,则需要使用不受到分解代谢物抑制的微生物。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:WO2010/067785
非专利文献
非专利文献1:Do Yun Kim,Seong Chun Yim,Pyung Cheon Lee,Woo Gi Lee,SangYup Lee,Ho Nam Chang,Batch and continuous fermentation of succinic acid fromwood hydrolysate by Mannheimia succiniciproducens MBEL55E,Enzyme andMicrobial Technology,35,(2004),648-653.
发明内容
发明要解决的课题
作为发酵生产生物分解性聚合物原料和/或生物燃料的微生物,已知大量不受到分解代谢物抑制的微生物。另一方面,如前所述,已知在以六碳糖与五碳糖的混合糖作为微生物的发酵原料进行连续发酵时,由于分解代谢物抑制而发酵收率显著降低。因此,本发明的课题是提高以六碳糖与五碳糖的混合糖作为受到分解代谢物抑制的微生物的发酵原料而进行连续发酵时的发酵收率。
用于解决课题的方法
本发明者对上述课题进行了深入研究,结果发现,在以六碳糖与五碳糖的混合糖作为微生物的发酵原料进行连续发酵的化学品的制造方法中,通过将具有分解代谢物抑制的微生物进行使用分离膜的连续发酵,来解决上述课题,从而完成了本发明。
即,本发明如以下的(1)~(5)。
(1)化学品的制造方法,是通过连续发酵来制造化学品的方法,包括:将微生物的培养液用分离膜过滤,将未过滤液保持在或回流至培养液中,在培养液中补加发酵原料,和回收过滤液中的生产物,
所述微生物是受到分解代谢物抑制的微生物,所述发酵原料包含六碳糖和五碳糖。
(2)根据(1)所述的化学品的制造方法,所述过滤液总量中的五碳糖的浓度为5g/L以下。
(3)根据(1)或(2)所述的化学品的制造方法,所述发酵原料中所含的六碳糖与五碳糖的重量比率为1:9~9:1。
(4)根据(1)或(2)所述的化学品的制造方法,所述发酵原料包含来源于生物质的糖液。
(5)根据(1)~(4)的任一项所述的化学品的制造方法,所述五碳糖是木糖。
发明的效果
根据本发明,即使以六碳糖与五碳糖的混合糖作为受到分解代谢物抑制的微生物的发酵原料,也可以以高收率制造化学品。
具体实施方式
本发明是化学品的制造方法,是在将微生物用发酵原料培养来发酵生产化学品的化学品的制造方法中,将培养液用分离膜过滤,将未过滤液保持在或回流至培养液中,并且在培养液中补加发酵原料,回收过滤液中的生产物的进行连续发酵的化学品的制造方法,其特征在于,使用受到分解代谢物抑制的所述微生物,并且所述发酵原料包含六碳糖和五碳糖。
在本发明的化学品的制造方法中,发酵原料的碳源含有包含五碳糖和六碳糖的混合糖。五碳糖是指构成糖的碳的数为5的糖,也称为戊糖(Pentose)。有1位具有醛基的戊醛糖和2位具有酮基的戊酮糖。作为戊醛糖,可列举木糖、阿拉伯糖、核糖、来苏糖,作为戊酮糖,可列举核酮糖、木酮糖。作为本发明中使用的五碳糖,只要是微生物能够同化的五碳糖则可以是任一种,从自然界的存在比例和/或获得的容易性等观点出发,优选木糖、阿拉伯糖,更优选木糖。
六碳糖是构成糖的碳的数为6的糖,也称为己糖(Hexose)。有1位具有醛基的醛糖和2位具有酮基的酮糖。作为醛糖,可列举葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿洛糖、古洛糖、塔罗糖等,作为酮糖,可列举果糖、阿洛酮糖、山梨糖等。作为本发明中使用的六碳糖,只要是微生物能够同化的六碳糖就可以是任一种,从自然界中的存在比例和/或获得容易性等观点出发,优选葡萄糖、甘露糖、半乳糖,更优选葡萄糖。
关于本发明中使用的混合糖不特别限定,但优选使用已知包含六碳糖与五碳糖两者的来源于含纤维素的生物质的糖液。含纤维素的生物质可列举甘蔗渣、柳枝稷、玉米秸、稻秸、麦秸等草木系生物质、和树木、废建材等木质系生物质等为例。含纤维素的生物质含有作为糖脱水缩合而成的多糖的纤维素或者半纤维素,通过将这样的多糖水解来制造可作为发酵原料利用的糖液。来源于含纤维素的生物质的糖液的制备方法可以是任何方法,作为这样的糖的制造方法,公开了使用浓硫酸将生物质进行酸水解来制造糖液的方法(日本特表平11-506934号公报、日本特开2005-229821号公报),将生物质用稀硫酸进行水解处理后进一步进行纤维素酶等的酶处理从而制造糖液的方法(A.Aden等,“LignocellulosicBiomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover”NREL Technical Report(2002))。另外作为不使用酸的方法,公开了使用250~500℃左右的亚临界水将生物质进行水解来制造糖液的方法(日本特开2003-212888号公报),以及将生物质进行亚临界水处理后进一步进行酶处理从而制造糖液的方法(日本特开2001-95597号公报),将生物质用240~280℃的加压热水进行水解处理后进一步进行酶处理从而制造糖液的方法(日本特许3041380号公报)。如以上那样的处理之后,还可以将所得的糖液进行纯化。其方法在例如WO2010/067785中公开。
对混合糖所含的五碳糖与六碳糖的重量比率不特别限定,如果作为混合糖中的五碳糖与六碳糖的重量比率表示为(五碳糖):(六碳糖),则优选为1:9~9:1。这是假定来源于含纤维素的生物质的糖液为混合糖时的糖比率。
对本发明中使用的发酵原料所含的总糖浓度不特别限定,只要是不抑制微生物的化学品的生产的范围,则优选尽可能高的浓度。具体地,培养基中的碳源的浓度优选为15~500g/L,更优选为20~300g/L。如果总浓度为15g/L以下,则有时来自五碳糖的收率提高的效果降低。另外,如果总糖浓度低,则化学品的生产效率也降低。
本发明中使用的发酵原料所含的六碳糖浓度在上述的总糖浓度、五碳糖与六碳糖的比例的范围内不特别限定,如果使用本发明的化学品的制造方法,则在以浓度5g/L以上包含六碳糖的混合糖液中也可以得到良好的收率。
本发明中使用的发酵原料可以是适宜含有碳源、氮源、无机盐类、和根据需要的氨基酸、和维生素等有机微量营养素的通常的液体培养基。
作为本发明中使用的氮源,可使用氨气、氨水、铵盐类、尿素、硝酸盐类、其他辅助使用的有机氮源例如油粕类、大豆水解液、酪蛋白分解物、其他氨基酸、维生素类、玉米浆、酵母或酵母提取物、肉提取物、胨等肽类、各种发酵菌体及其水解物等。作为无机盐类,可适宜添加使用磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐和锰盐等。
本发明中使用的微生物为了生长繁殖而需要特定的营养素时,可以将其营养物作为标准品或含有该营养物的天然物添加。另外,还可以根据需要使用消泡剂。在本发明中,培养液是指微生物在发酵原料中增殖而得的液体。补加的发酵原料的组成可以由培养开始时的发酵原料组成进一步适宜变更,以使目的化学品的生产性变高。
接下来,对于在本发明中作为分离膜使用的多孔性膜进行说明。
对于本发明中使用的多孔质膜不特别限定,只要具有将在微生物的利用搅拌型培养器或者搅拌型生物反应器的培养中所得的培养液从微生物进行分离过滤的功能即可,可以使用例如多孔质陶瓷膜、多孔质玻璃膜、多孔质有机高分子膜、金属纤维编织体、无纺布等。其中特别是多孔质有机高分子膜或陶瓷膜是合适的。
对于本发明中作为分离膜使用的多孔性膜的构成进行说明。本发明中使用的多孔性膜优选具有适应被处理水的水质和/或用途的分离性能和透水性能。
多孔性膜从阻挡性能和透水性能、分离性能、例如耐污染性的观点出发,优选为包含多孔质树脂层的多孔性膜。
包含多孔质树脂层的多孔性膜优选在多孔质基材的表面具有作为分离功能层发挥作用的多孔质树脂层。多孔质基材支撑多孔质树脂层而赋予分离膜以强度。
本发明中使用的多孔性膜在多孔质基材的表面具有多孔质树脂层时,无论多孔质树脂层渗透到多孔质基材中,还是多孔质树脂层不渗透到多孔质基材中,任一者均可,可根据用途选择。
多孔质基材的平均厚度优选为50μm~3000μm。
多孔质基材的材质包含有机材料和/或无机材料等,期望使用有机纤维。优选的多孔质基材是由纤维素纤维、三乙酸纤维素纤维、聚酯纤维、聚丙烯纤维和聚乙烯纤维等有机纤维制成的纺织布和/或无纺布,更优选使用密度的控制比较容易、制造也容易且廉价的无纺布。
多孔质树脂层可以适合使用有机高分子膜。作为有机高分子膜的材质,可列举例如,聚乙烯系树脂、聚丙烯系树脂、聚氯乙烯系树脂、聚偏-1,1-二氟乙烯系树脂、聚砜系树脂、聚醚砜系树脂、聚丙烯腈系树脂、纤维素系树脂和三乙酸纤维素系树脂等。有机高分子膜也可以是以这些树脂为主成分的树脂的混合物。这里主成分是指其成分含有50重量%以上、优选60重量%以上。有机高分子膜的材质优选使用利用溶液的制膜容易且物理耐久性和/或耐化学性也优异的聚氯乙烯系树脂、聚偏-1,1-二氟乙烯系树脂、聚砜系树脂、聚醚砜系树脂和聚丙烯腈系树脂,最优选使用聚偏-1,1-二氟乙烯系树脂或以其为主成分的树脂。
这里,作为聚偏-1,1-二氟乙烯系树脂,优选使用偏-1,1-二氟乙烯的均聚物。进而,聚偏-1,1-二氟乙烯系树脂还优选使用与可与偏-1,1-二氟乙烯共聚的乙烯基系单体的共聚物。作为可与偏-1,1-二氟乙烯共聚的乙烯基系单体,可例示四氟乙烯、六氟丙烯和三氯氟乙烯等。
对本发明中作为分离膜使用的多孔性膜不特别限定,只要发酵中使用的微生物能够通过即可,但期望不易发生由发酵中使用的微生物的分泌物和/或发酵原料中的微粒造成的堵塞、且过滤性能为长时间稳定地继续的范围。因此,优选多孔性分离膜的平均细孔径为0.01μm以上且小于5μm。另外,进一步优选如果多孔性膜的平均细孔径为0.01μm以上且小于1μm,则可以兼备微生物会不泄漏的高排除率和高透水性,长时间保持透水性可以具有更高的精度和再现性地实施。
如果与微生物的大小接近,则有时这些物质直接塞住孔,所以多孔性膜的平均细孔径优选小于1μm。为了防止微生物的漏出、即排除率降低的不良状况发生,多孔性膜的平均细孔径优选与微生物的大小相比不过大。在使用微生物中细胞较小的细菌等时,作为平均细孔径优选为0.4μm以下,如果小于0.2μm,则可以更适合地实施。
另外,有时微生物生产除了作为所期望的生产物的化学品以外的物质,例如,蛋白质和/或多糖类等易凝集的物质,进而,有时由于发酵培养液中的微生物的一部分死亡而生成细胞的破碎物,为了避免这些物质造成的多孔性膜的堵塞,平均细孔径进一步优选为0.1μm以下。
如果平均细孔径过小,则多孔性膜的透水性能降低,即使膜不污染也不能有效地运转,因而本发明中的多孔性膜的平均细孔径优选为0.01μm以上,更优选为0.02μm以上,进一步优选为0.04μm以上。
这里,平均细孔径可以通过测定在倍率10,000倍的扫描型电子显微镜观察中能够在9.2μm×10.4μm的范围内观察到的全部细孔的直径,并进行平均来求得。平均细孔径或者也可以使用扫描型电子显微镜以倍率10,000倍将膜表面拍摄照片,随机选择10个以上、优选20个以上的细孔测定它们的细孔直径,并进行数平均而求得。在细孔不是圆形时,可以通过用图像处理装置等求出具有与细孔所具有的面积相等的面积的圆(等价圆),以等价圆直径作为细孔的直径的方法来求得。
本发明中使用的多孔性膜的平均细孔径的标准偏差σ优选为0.1μm以下。平均细孔径的标准偏差σ越小越好。平均细孔径的标准偏差σ可以将上述的能够在9.2μm×10.4μm的范围内观察到的细孔数作为N,将测定的各个直径作为Xk,将细孔直径的平均作为X(ave),通过下述(式1)算出。
在本发明中使用的多孔性膜中,发酵培养液的透过性是重要的性能之一。作为多孔性膜的透过性的指标,可以利用使用前的多孔性膜的纯水透过系数。在本发明中,多孔性膜的纯水透过系数,在使用温度为25℃的反渗透膜纯化水,以头高1m测定透水量进行计算时,优选为5.6×10-10m3/m2/s/pa以上,如果纯水透过系数为5.6×10-10m3/m2/s/pa~6×10- 7m3/m2/s/pa,则可以得到实用上充分的透过水量。
在本发明中使用的多孔性膜中,表面粗糙度是与表面垂直方向的高度的平均值。膜表面粗糙度是为了附着于分离膜表面的微生物容易通过因由搅拌和/或循环泵产生的液流带来的膜面清洗效果而剥离的因子之一。对多孔性膜的表面粗糙度不特别限定,只要是附着于膜的微生物、以及其他固形物可被剥离的范围即可,优选为0.1μm以下。如果表面粗糙度为0.1μm以下,附着于膜的微生物、以及其他固形物容易被剥离。
明白了进一步优选通过使用多孔性膜的膜表面粗糙度为0.1μm以下、平均细孔径为0.01μm以上且小于1μm、多孔性膜的纯水透过系数为2×10-9m3/m2/s/pa以上的多孔性膜,不过度需要膜面清洗所需的动力的运转可以更容易。通过使多孔性膜的表面粗糙度为0.1μm以下,可以降低在微生物的过滤中在膜表面发生的剪切力,微生物的破坏被抑制,多孔性膜的堵塞也被抑制,从而长时间稳定的过滤可以更容易。另外,通过使多孔性膜的表面粗糙度为0.1μm以下,可以以更低的膜间压差实施连续发酵,即使在多孔性膜堵塞时,与以高膜间压差运转的情况下相比,清洗恢复性也更良好。通过抑制多孔性膜的堵塞,可以实现稳定的连续发酵,因此多孔性膜的表面粗糙度越小越好。
这里,多孔性膜的膜表面粗糙度使用下述原子力显微镜装置(AFM)在下述条件下测定。
·装置 原子力显微镜装置(Digital Instruments(株)制“Nanoscope IIIa”)
·条件 探针 SiN悬臂(Digital Instruments(株)制)
扫描模式 接触模式(气中测定)
水中敲击模式(水中测定)
扫描范围 10μm、25μm四方(气中测定)
5μm、10μm四方(水中测定)
扫描分辨率 512×512
·样品制备测定时,膜样品在常温下浸渍于乙醇中15分钟后,在RO水中浸渍清洗24小时后,风干使用。RO水是指使用作为过滤膜的一种的反渗透膜(RO膜)进行过滤,排除离子、盐类等杂质后的水。RO膜的孔的大小大概为2nm以下。
膜表面粗糙度drough通过上述原子力显微镜装置(AFM),由各点的Z轴方向的高度,通过下述(式2)算出。
drough:平均表面粗糙度(μm)
Zn:Z轴方向的高度(μm)
:扫描范围的平均高度(μm)
本发明中使用的多孔性膜的形状优选为平膜。多孔性膜的形状为平膜时,其平均厚度可根据用途选择。多孔性膜的形状为平膜时的平均厚度优选为20μm~5000μm,更优选50μm~2000μm。另外,本发明中使用的多孔性膜的形状优选为中空丝膜。多孔性膜为中空丝膜时,中空丝的内径优选为200μm~5000μm,膜厚优选为20μm~2000μm。另外,中空丝的内部还可以含有将有机纤维或无机纤维制成了筒状纺织物和/或编织物。
此外,前述多孔性膜可以通过例如WO2007/097260所记载的制造方法来制造。
另外,作为其他优选方式,本发明中的分离膜可以是至少包含陶瓷的膜。本发明中的陶瓷是指含有金属氧化物、通过高温下的热处理被烧硬而得的物质。作为金属氧化物,可以例示氧化铝、氧化镁、氧化钛、氧化锆等。分离膜可以仅由金属氧化物形成,也可以包含二氧化硅和/或碳化硅、作为二氧化硅与金属氧化物的化合物的莫来石、堇青石等。
对形成分离膜的除陶瓷以外的成分,只要能够形成作为分离膜的多孔质体,就不特别限定。
分离膜包含陶瓷时对其形状也不特别限定,可以使用独块(monolith)膜、平膜、管状膜等任一种。从向容器内的填充效率的观点考虑,优选柱状结构、且较长方向具有贯通孔的结构的分离膜。从填充效率提高的观点考虑,优选独块(monolith)膜。
优选在较长方向具有贯通孔的理由如下。将具有柱状结构的分离膜收纳在组件容器中作为分离膜组件使用时,分离膜可以从外压式和内压式中选择合适的方式进行组件化、过滤。本发明中,此后,将分离膜与发酵培养液相接的侧称为1次侧,将过滤而得到包含化学品的滤液的侧称为2次侧。
如果使用内压式组件,则由于1次侧的流路狭窄,因而可以在进行错流过滤时节约循环泵的输出功率。进而,将堆积在分离膜表面的污浊物排出组件外的作用变强,容易保持分离膜表面清洁,因而优选。但是,为了获得该效果,内压式的分离膜具有发酵培养液的入口和出口是前提。如果此时的入口和出口是配置于一条直线上的贯通孔的状态,则通液阻抗变小,因而优选。进而通过使分离膜为柱状结构、贯通孔在较长方向空出,可以使收纳分离膜的容器变细。如果分离膜组件细,则从制造和/或操作的观点考虑,可以优选使用。
对分离膜的孔隙率不特别限定,如果过低,则过滤效率变差,如果过高,则强度降低。为了兼具过滤效率和分离膜的强度、还具有对反复蒸气灭菌的耐性,优选为20%~60%。
此外孔隙率通过以下式确定。
孔隙率[%]=100×(湿润膜重量[g]-干燥膜重量[g])/水比重[g/cm3]/(膜体积[cm3])。
分离膜的平均孔径优选为0.01μm~1μm,如果是具有该范围的平均孔径的膜,则分离膜不易堵塞、且过滤效率也优异。另外,如果平均孔径为0.02μm~0.2μm的范围,则不易发生以蛋白质、多糖类等为例的由微生物和/或培养细胞产生的发酵副生成物、培养液中的微生物/培养细胞死亡而产生的细胞破碎物这样的容易堵塞分离膜的物质的堵塞,因而特别优选。
具有贯通孔的柱状结构的分离膜以外表面为2次侧,因而为了收集过滤液,优选设置组件容器,作为在组件容器内填充了分离膜的组件使用。填充在1支组件中的分离膜为1支以上。
组件容器优选由能耐受反复的蒸气灭菌处理的原料制成。作为能耐受蒸气灭菌处理的原料,可例示例如不锈钢、平均孔隙率低的陶瓷等。
这样的陶瓷膜组件可以通过例如WO2012/086763所记载的制造方法来制造,但也可以利用市售品。如果作为市售品具体例示,则可列举MEMBRALOX精滤膜(Pall)、陶瓷膜过滤器セフィルトMF膜(日本ガイシ)等。
接下来,对于连续发酵进行说明。
本发明的化学品的制造方法中,对过滤时的膜间压差不特别限定,只要能够过滤发酵培养液即可。但是,为了过滤培养液,如果对于有机高分子膜用高于150kPa的膜间压差进行过滤处理,则有机高分子膜的结构被破坏的可能性变高,有时生产化学品的能力降低。另外,如果是低于0.1kPa的膜间压差,则有时不能充分得到发酵培养液的透过水量,有制造化学品时的生产性降低的倾向。因此,本发明的化学品的制造方法中,对于有机高分子膜通过使作为过滤压力的膜间压差优选为0.1kPa~150kPa的范围,从而发酵培养液的透过水量多,也不会由于膜的结构的破坏而化学品制造能力降低,因而可以维持高的化学品生产能力。膜间压差对于有机高分子膜优选为0.1kPa~50kPa的范围,进一步优选0.1kPa~20kPa的范围。
在使用陶瓷膜时对过滤时的膜间压差也不特别限定,只要能够过滤发酵培养液即可,优选为500kPa以下。如果在500kPa以上运转,则有时发生膜的堵塞,连续发酵运转发生不良。
作为过滤的驱动力,可以通过利用了发酵液与多孔性膜处理水的液位差(水头差)的虹吸管、或错流循环泵而在分离膜产生膜间压差。另外,作为过滤的驱动力,可以在分离膜2次侧设置抽吸泵。另外,使用错流循环泵时可以通过抽吸压力来控制膜间压差。进而,也可以通过导入发酵液侧的压力的气体或液体的压力来控制膜间压差。进行这些压力控制时,以发酵液侧的压力与多孔性膜处理水侧的压力差作为膜间压差,用于膜间压差的控制。
在本发明中,优选将透过了分离膜的过滤液总量中的五碳糖的浓度保持在5g/l以下。如果使用包含六碳糖与五碳糖的混合糖的发酵原料,使用受到分解代谢物抑制的微生物进行连续发酵,则培养基被连续地用于发酵,因而与分批发酵的情况相比连续地受到分解代谢物抑制,其结果是,仅五碳糖在培养液中大量残留,生产收率降低,但在本发明中,通过在连续发酵中使用分离膜,从而即使使用受到分解代谢物抑制的微生物,也可以将过滤液总量的五碳糖浓度保持在5g/l以下,其结果是与不使用分离膜的连续发酵相比,可以提高化学品的生产收率。如果分离膜所得的过滤液总量中五碳糖残留5g/l以上,则有时来自五碳糖的收率提高的效果降低,其结果是有时生产收率也降低。此外,这里所说的生产收率是连续培养中的生产收率,通过以下(式3)计算,以某一定期间内消耗原料碳源而生成的化学品量(g)除以该期间的投入碳源量(g)来求。此时,未被生产物的生产所利用的糖也算入投入碳源量中。
生产收率(g/g)=生产物量(g)÷投入碳源量(g)···(式3)。
过滤液总量中的五碳糖的浓度可以通过培养条件来调节。例如,也可以通过改变发酵原料中所含的糖的浓度、糖的供给速度和/或稀释率,来减少过滤液总量的五碳糖的浓度。或者,还可以通过增加发酵原料中所含的营养源,来提高微生物的糖的消耗,减少过滤液总量的五碳糖的浓度。
在本发明中,微生物的发酵培养中的pH、温度只要是微生物可生长繁殖的范围就不特别限定,优选在pH为4~8、温度为20~75℃的范围进行。培养液的pH通过无机或者有机酸、碱性物质、以及尿素、碳酸钙、氨气等调节到通常的pH4~8范围内的预先设定的值。如果需要提高氧气的供给速度,则可以使用在空气中加入氧气使氧气浓度保持21%以上,或者对培养液加压、提高搅拌速度、提高通气量等方法。
另外,在本发明的化学品的制造方法中,还可以在培养初期进行分批培养或补料分批培养使微生物浓度变高后,开始连续发酵(培养液的过滤)。另外,还可以接种高浓度的菌体,在培养开始的同时进行连续发酵。在本发明的化学品的制造方法中,可以从适当的时期开始进行培养基供给和培养液的过滤。培养基供给和培养液的过滤的开始时间未必相同。另外,培养基供给和培养液的过滤可以是连续的,也可以是间歇的。
只要在原料培养液中添加菌体增殖所需的营养素,使菌体增殖能连续地进行即可。关于培养液中的微生物的浓度,将化学品的生产性维持在高的状态对于获得效率良好的生产性是优选的。培养液中的微生物的浓度,作为一例,通过将干燥重量维持在5g/L以上,可得到良好的生产效率。
在本发明的化学品的制造方法中,还可以通过在连续发酵的中途根据需要从发酵槽内除去包含微生物的培养液的一部分,然后用培养基稀释,来调整培养槽内的微生物浓度。例如,如果发酵槽内的微生物浓度过度变高,则容易发生分离膜的堵塞,因而有时通过除去包含微生物的培养液的一部分,用培养基稀释,可以免于堵塞。另外,有时根据发酵槽内的微生物浓度不同而化学品的生产性能变化,还可以以生产性能作为指标,通过除去包含微生物的培养液的一部分并用培养基稀释,来维持生产性能。
在本发明的化学品的制造方法中,只要是在使菌体增殖的同时生成生产物的连续发酵培养法,则对发酵槽的数不限制。
在本发明中,与现有的分批培养相比,可以得到高的体积生产速度,可以实现效率极好的连续发酵生产。这里,连续发酵培养中的生产速度通过以下式(4)计算。
发酵生产速度(g/L/小时)=滤液中的生产物浓度(g/L)×发酵培养液取出速度(L/小时)÷装置的运转液量(L)···(式4)。
另外,分批培养中的发酵生产速度以将原料碳源全部消耗的时刻的生产物量(g)除以碳源的消耗所需的时间(小时)和该时刻的发酵培养液量(L)来求。
另外,连续培养中的收率通过以下式(5)计算,以某一定期间内消耗原料碳源而生成的化学品量(g),除以该期间的投入碳源量(g)减去微生物未利用的未利用碳源量(g)而得的值,来求。本说明书中所说的收率只要不特别说明,就是指该收率。
收率(g/g)=生产物量(g)÷{投入碳源量(g)-未利用碳源量(g)}····(式5)。
本发明中使用的连续发酵装置只要是将微生物的发酵培养液用分离膜过滤,在从滤液回收生产物的同时将未过滤液保持在或回流至所述发酵培养液中,并且在所述发酵培养液中补加发酵原料,并回收过滤液中的生产物的利用连续发酵来制造化学品的制造装置,就不特别限定,如果列举具体例,则在使用有机高分子膜时,可以使用WO2007/097260所记载的装置。另外,在使用陶瓷膜时,可以使用WO2012/086763所记载的装置。
接下来,对于能够在本发明的化学品的制造方法中使用的微生物进行说明。
本发明中使用的受到分解代谢物抑制的微生物,一般是指将同化五碳糖的微生物进行发酵时,如果使用含有包含六碳糖和五碳糖的混合糖的发酵原料,则五碳糖的消耗被抑制的微生物,但在本发明中,更具体地,对于在使用具有葡萄糖和木糖的同化能的微生物的分批培养中,与在单独木糖的培养基中的木糖的消耗速度相比,在包含葡萄糖和木糖的混合糖的培养基中的木糖的消耗速度慢的微生物,称为“受到分解代谢物抑制的微生物”。
这里,在单独木糖的培养基中的木糖的消耗速度通过下述(式6)算出。
木糖的消耗速度(g/L/小时)=培养开始时的发酵原料所含的总木糖量(g)÷从培养开始到发酵原料所含的木糖完全消耗尽所花费的时间(小时)÷发酵液量(L)···(式6)。
另外,在包含葡萄糖与木糖的混合糖的培养基中的木糖的消耗速度,是在包含葡萄糖和木糖的混合糖的培养基中的葡萄糖存在下的木糖的消耗速度,通过下述(式7)算出。
木糖的消耗速度(g/L/小时)=从培养开始时到时间T所消耗的木糖量(g)÷从培养开始到时间T的时间(小时)÷发酵液量(L)···(式7)。
在(式6)和(式7)中,算出木糖的消耗速度时,混合糖中的葡萄糖与木糖的重量比率以1:1进行。另外,比较木糖的消耗速度时,糖浓度只要是微生物能够无残存糖地完全消耗的浓度就不特别限定。另外,单独木糖的培养基中的木糖的糖浓度、与包含葡萄糖和木糖的混合糖的培养基中的总糖浓度相同。
另外在(式7)中,时间T是葡萄糖被完全消耗的时间。时间T可以将取样的培养液通过HPLC或试剂盒、传感器来测定葡萄糖浓度而求得。但是,在葡萄糖完全被消耗的时间比木糖完全被消耗的时间慢的情况下,时间T为木糖完全被消耗的时间。这种情况下,时间T通过与葡萄糖浓度的测定方法同样地测定木糖浓度来求。另外,在培养中由于中和剂添加和/或取样等而发酵液量变化的情况下,考虑补加到培养液中的液量或减少的液量来进行计算。
受到分解代谢物抑制的微生物可以从发酵工业中常用的面包酵母等酵母、大肠菌、棒状杆菌型细菌等细菌、丝状菌、放线菌等中选择,作为具体例,可以从属于毕赤酵母(Pichia)属、假丝酵母(Candida)属、管囊酵母(Pachysolen)属、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、汉逊酵母属(Hansenula)球拟酵母属(Torulopsis)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)、伊萨酵母属(Issachenkia)、酒香酵母属(Brettanomyces)、リンドネラ属(Lindnera)、威克汉姆酵母属(Wickerhamomyces)等酵母、梭菌(Clostridium)属、肠杆菌(Enterobacter)属、埃希氏菌(Escherichia)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属等肠内细菌类、乳杆菌(Lactobacillus)属、乳球菌(Lactococcus)属等乳酸菌类、以及游动放线菌(Actinoplanes)属、节杆菌(Arthrobacter)属、链霉菌属(Streptomyces)属等放线菌类、芽孢杆菌(Bacillus)属、类芽孢杆菌(Paenibacillus)属、气杆菌(Aerobacter)属、小瓶菌(Ampullariella)属、葡萄球菌(Staphylococcus)属、热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter)属、栖热菌(Thermus)属的微生物中选择。
另外,受到分解代谢物抑制的微生物可以是从自然环境中分离的,也可以从本来不同化五碳糖但通过突变和/或基因重组而变得同化五碳糖的微生物中选择。作为通过基因重组而变得同化五碳糖的微生物的具体例,可列举通过基因重组而导入或者强化了五碳糖的代谢基因的微生物。特别是对于五碳糖中的木糖的代谢基因,可例示木糖异构酶、木糖还原酶、木糖醇脱氢酶、木酮糖激酶等酶,作为通过这样的基因重组方法而被赋予了木糖的同化性的微生物,可例示日本特表2006-525029号公报、日本特开2009-112289号公报、日本特表2010-504756号公报等中记载的微生物。
作为通过本发明所制造的化学品,只要是由上述微生物在发酵培养液中生产的物质就不限制,可列举醇、有机酸、氨基酸、核酸等在发酵工业中大量生产的物质。例如,作为醇,可列举乙醇、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇、2,3-丁二醇、1,4-丁二醇、甘油、丁醇、异丁醇、2-丁醇、异丙醇等,作为有机酸,可列举乙酸、乳酸、己二酸、丙酮酸、琥珀酸、苹果酸、衣康酸、柠檬酸,作为核酸,可列举肌苷、鸟苷等核苷、肌苷酸、鸟苷酸等核苷酸,另外,可列举尸胺等二胺化合物。另外,本发明还可以适用于酶、抗生素、重组蛋白质这样的物质的生产。这些化学品可以通过周知的方法(膜分离、浓缩、蒸馏、晶析、提取等)从过滤液回收。
实施例
以下,列举实施例具体说明本发明。但是,本发明不限于这些实施例。
(参考例1)葡萄糖、木糖、乙醇、2,3-丁二醇的分析方法
发酵液中的葡萄糖、木糖、乙醇和2,3-丁二醇的浓度在下述所示的HPLC条件下通过与标准品的比较来定量。
柱:Shodex SH1011(昭和电工株式会社制)
转移相:5mM硫酸(流速0.6mL/分钟)
反应液:无
检测方法:RI(差示折射率)
温度:65℃。
(参考例2)乳酸的分析方法
发酵液中的乳酸在下述所示的HPLC条件下通过与标准品的比较来定量。
柱:Shim-Pack SPR-H(株式会社岛津制作所制)
转移相:5mM对甲苯磺酸(流速0.8mL/分钟)
反应液:5mM对甲苯磺酸、20mM Bis-Tris、0.1mM EDTA·2Na(流速0.8mL/分钟)
检测方法:电导率
温度:45℃。
(参考例3)凝结芽孢杆菌的木糖消耗速度计算
算出作为乳酸发酵微生物的凝结芽孢杆菌NBRC12714株在乳酸发酵时的木糖消耗速度。作为培养基,使用表1所示的组成的乳酸发酵木糖培养基和表2所示的乳酸发酵混合糖培养基1。适宜进行取样,培养液中的葡萄糖和木糖的浓度通过参考例1的方法测定,作为生产物的乳酸的浓度通过参考例2的方法测定。
表1
表2
将凝结芽孢杆菌NBRC12714株与碳酸钙一起在烧瓶中用50mL的前培养培养基(多胨10g/L、酵母提取物2g/L、硫酸镁7水合物1g/L)振荡培养24小时(前培养)。将前培养液分别接菌于用氮气吹洗后的1L的乳酸发酵木糖培养基、乳酸发酵混合糖培养基1中,在以下的条件下进行分批发酵。
发酵反应槽容量:2(L)
温度调整:50(℃)
反应槽通气量(氮气):100(mL/分钟)
反应槽搅拌速度:200(转/分钟)
pH调整:用5N Ca(OH)2调整为pH7
灭菌:培养槽和使用培养基全部通过121℃、20分钟的高压釜进行高压蒸气灭菌。
乳酸发酵木糖培养基和乳酸发酵混合糖培养基1中的木糖消耗速度按照前述(式6)和(式7)算出,示于表7。由该结果判断,凝结芽孢杆菌NBRC12714株是受到分解代谢物抑制的微生物。
(参考例4)热带假丝酵母的木糖消耗速度计算
算出作为乙醇发酵微生物的热带假丝酵母NBRC0199株在乙醇发酵时的木糖消耗速度。作为培养基,使用表3所示的组成的乙醇发酵木糖培养基和表4所示的乙醇发酵混合糖培养基1。适宜进行取样,培养液中的葡萄糖和木糖的浓度、和作为生产物的乙醇的浓度通过参考例1的方法测定。
表3
表4
将热带假丝酵母NBRC0199株在试管中用2mL的YPD培养基在30℃振荡培养一夜(前前培养)。将所得的培养液接菌于新鲜的YPD培养基50mL中,在500mL容量的带褶皱三角烧瓶中振荡培养一夜(前培养)。将前培养液接菌于2L的乙醇发酵木糖培养基和乙醇发酵混合糖培养基中,在以下的条件下进行分批培养。
发酵反应槽容量:2(L)
温度调整:30(℃)
反应槽通气量:100(mL/分钟)
反应槽搅拌速度:800(转/分钟)
pH调整:无
灭菌:培养槽和使用培养基全部通过121℃、20分钟的高压釜进行高压蒸气灭菌。
乙醇发酵木糖培养基和乙醇发酵混合糖培养基1中的木糖消耗速度按照前述(式6)和(式7)算出,示于表7。由该结果判断,热带假丝酵母NBRC0199株是受到分解代谢物抑制的微生物。
(参考例5)多粘类芽孢杆菌的木糖消耗速度计算
算出作为2,3-丁二醇发酵微生物的多粘类芽孢杆菌ATCC12321株在2,3-丁二醇发酵时的木糖消耗速度。作为培养基使用表5所示的组成的2,3-丁二醇发酵木糖培养基和表6所示的2,3-丁二醇发酵混合糖培养基1。适宜进行取样,培养液中的葡萄糖和木糖的浓度、作为生产物的2,3-丁二醇的浓度通过参考例1的方法测定。
表5
表6
将多粘类芽孢杆菌ATCC12321株在试管中用50mL的前培养培养基(葡萄糖5g/L、胨5g/L、酵母提取物3g/L、麦芽提取物3g/L)振荡培养24小时(前培养)。将前培养液分别接菌于1L的2,3-丁二醇发酵木糖培养基和2,3-丁二醇发酵混合糖培养基,在以下的条件下进行分批培养。
发酵反应槽容量:2(L)
温度调整:30(℃)
反应槽通气量:100(mL/分钟)
反应槽搅拌速度:800(转/分钟)
pH调整:用5N NaOH调整为pH6.5
灭菌:培养槽和使用培养基全部通过121℃、20分钟的高压釜进行高压蒸气灭菌。
2,3-丁二醇发酵木糖培养基和2,3-丁二醇发酵混合糖培养基1中的木糖消耗速度按照前述(式6)和(式7)算出,示于表7。由该结果判断,多粘类芽孢杆菌ATCC12321株是受到分解代谢物抑制的微生物。
表7
(比较例1)以六碳糖(葡萄糖)为发酵原料通过凝结芽孢杆菌的分批培养进行的L-乳酸的制造
作为L-乳酸发酵微生物使用凝结芽孢杆菌NBRC12714株,作为培养基使用表8所示的组成的乳酸发酵培养基。将凝结芽孢杆菌NBRC12714株与碳酸钙一起在烧瓶中用50mL的前培养培养基(多胨10g/L、酵母提取物2g/L、硫酸镁7水合物1g/L)振荡培养24小时(前培养)。将前培养液接菌于用氮气吹洗后的1L的乳酸发酵培养基中,在参考例3的条件下进行96小时的分批培养(表11)。
表8
(比较例2)以混合糖(葡萄糖、木糖)为发酵原料通过凝结芽孢杆菌的分批培养进行的L-乳酸的制造
将凝结芽孢杆菌NBRC12714株使用表2所示的乳酸发酵混合糖培养基在与比较例1同样的条件下进行128小时的分批培养(表11)。
(比较例3)以混合糖(葡萄糖、木糖)为发酵原料通过凝结芽孢杆菌的连续培养进行的L-乳酸的制造
以混合糖(葡萄糖、木糖)为发酵原料,使用表2所示的组成的乳酸发酵混合糖培养基1,进行不利用分离膜的连续培养。将凝结芽孢杆菌NBRC12714株在与上述比较例1的前培养相同的条件进行振荡培养(前前培养)。将前前培养液、将前培养液接菌于用氮气吹洗后的1.5L的乳酸发酵混合糖培养基中,将发酵反应槽用附带的搅拌机以200转/分钟进行搅拌,将发酵反应槽用氮气充满,进行温度调整,进行分批培养直到培养液中的糖被完全消耗(前培养)。前培养结束后立即、前培养结束后,立即运转发酵液取出泵,进一步进行培养基的连续供给,一边进行包含微生物的培养液的取出量的控制使得连续发酵装置的发酵液量为1.5L,一边在以下的条件下进行300小时的连续培养,制造乳酸(表11)。
发酵反应槽容量:2(L)
温度调整:50(℃)
反应槽通气量(氮气):100(mL/分钟)
反应槽搅拌速度:200(转/分钟)
pH调整:用5N Ca(OH)2调整为pH7
发酵液的取出量:3(L/天)
灭菌:培养槽和使用培养基全部通过121℃、20分钟的高压釜进行高压蒸气灭菌。
(实施例1)以混合糖(葡萄糖、木糖)为发酵原料通过凝结芽孢杆菌的利用分离膜的连续培养进行的L-乳酸的制造1
以混合糖(葡萄糖、木糖)为发酵原料,使用表2所示的组成的乳酸发酵混合糖培养基,进行利用了分离膜的连续培养。作为分离膜元件,采用中空丝的方式。将凝结芽孢杆菌NBRC12714株在与上述比较例1的前培养相同的条件下进行振荡培养(前前培养)。将前前培养液、将前培养液接菌于用氮气吹洗后的1.5L的乳酸发酵混合糖培养基中,将发酵反应槽用附带的搅拌机以200转/分钟搅拌,将发酵反应槽用氮气充满,进行温度调整,进行分批培养直到培养液中的糖被完全消耗(前培养)。前培养结束后,立即运转发酵液循环泵,进一步进行培养基的连续供给,一边进行培养液的过滤量的控制使得连续发酵装置的发酵液量为1.5L,一边在以下的条件下进行290小时的连续培养,制造乳酸(表11)。
发酵反应槽容量:2(L)
使用分离膜:聚偏-1,1-二氟乙烯过滤膜
膜分离元件有效过滤面积:473(cm2)
温度调整:50(℃)
发酵反应槽通气量(氮气):100(mL/分钟)
发酵反应槽搅拌速度:200(转/分钟)
发酵液的取出量:3(L/天)
灭菌:包含分离膜元件的培养槽和使用培养基全部通过121℃、20分钟的高压釜进行高压蒸气灭菌。
另外,使用的膜是具有以下性质的膜,过滤时的膜间压差在0.1~20kPa之间变化。
平均细孔径:0.1μm
平均细孔径的标准偏差:0.035μm
膜表面粗糙度:0.06μm
纯水透过系数:50×10-9m3/m2/s/pa。
(实施例2)以混合糖(葡萄糖、木糖)为发酵原料的凝结芽孢杆菌的利用分离膜的连续培养2
使用表9所示的乳酸发酵混合糖培养基2,在与实施例1同样的条件下进行305小时的利用分离膜的连续培养,制造L-乳酸(表11)。
表9
(实施例3)以混合糖(葡萄糖、木糖)为发酵原料的凝结芽孢杆菌的利用分离膜的连续培养3
使用表10所示的乳酸发酵混合糖培养基3,在实施例1同样的条件下进行300小时的利用分离膜的连续培养,制造L-乳酸(表11)。
表10
表11
(比较例4)以六碳糖(葡萄糖)为发酵原料通过热带假丝酵母的分批培养进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物使用热带假丝酵母NBRC0199株,作为培养基使用表12所示的组成的乙醇发酵培养基。将热带假丝酵母NBRC0199株在试管中用2mL的YPD培养基在30℃振荡培养一夜(前前培养)。将所得的培养液接种于新鲜的YPD培养基50mL中,在500mL容量的带褶皱三角烧瓶中振荡培养一夜(前培养)。将前培养液接种于1.5L的乙醇发酵培养基中,在以下的条件下进行16小时的分批培养,制造乙醇(表14)。
发酵反应槽容量:2(L)
温度调整:30(℃)
反应槽通气量:100(mL/分钟)
反应槽搅拌速度:800(转/分钟)
pH调整:无
灭菌:培养槽和使用培养基全部通过121℃、20分钟的高压釜进行高压蒸气灭菌。
表12
(比较例5)以混合糖(葡萄糖、木糖)为发酵原料通过热带假丝酵母的分批培养进行的乙醇的制造
使用表13所示的乙醇发酵混合糖培养基2,在与比较例4同样的条件下进行23小时的分批培养,制造乙醇(表14)。
表13
(比较例6)以混合糖为发酵原料通过热带假丝酵母的连续培养进行的乙醇的制造
作为培养基使用表13所示的乙醇发酵混合糖培养基2,进行不利用分离膜的连续发酵。将热带假丝酵母NBRC0199株在试管中用2mL的YPD培养基在30℃振荡培养一夜(前前前培养)。将所得的培养液接菌于新鲜的YPD培养基50mL中,在500mL容量的带褶皱三角烧瓶中振荡培养一夜(前前培养)。在装入了1.5L的乙醇发酵混合糖培养基2的连续发酵装置中接菌前前培养液,将发酵反应槽用附带的搅拌机以800转/分钟搅拌,并进行发酵反应槽的通气量的调整、温度调整,进行16小时培养(前培养)。前培养结束后,立即运转发酵液取出泵,进一步进行培养基的连续供给,一边进行包含微生物的培养液的取出量的控制使得连续发酵装置的发酵液量为1.5L,一边在以下的条件下进行295小时的连续培养,制造乙醇(表14)。
发酵反应槽容量:2(L)
温度调整:30(℃)
发酵反应槽通气量:100(mL/分钟)
发酵反应槽搅拌速度:800(转/分钟)
pH调整:无
发酵液的取出量:1(L/天)
灭菌:培养槽和使用培养基全部通过121℃、20分钟的高压釜进行高压蒸气灭菌。
(实施例4)以混合糖(葡萄糖、木糖)为发酵原料通过利用了热带假丝酵母的分离膜的连续培养进行的乙醇的制造
作为培养基使用表13所示的组成的乙醇发酵混合糖培养基2,进行利用了分离膜的连续发酵。作为分离膜元件采用平膜的方式。将热带假丝酵母NBRC0199株在试管中用2mL的YPD培养基在30℃振荡培养一夜(前前前培养)。将所得的培养液接种于新鲜的YPD培养基50mL中,在500mL容量的带褶皱三角烧瓶中振荡培养一夜(前前培养)。将前前培养液接种于连续发酵装置的1.5L的乙醇发酵混合糖培养基2中,将发酵反应槽用附带的搅拌机以800转/分钟搅拌,进行发酵反应槽的通气量的调整、温度调整,进行36小时培养(前培养)。前培养结束后,立即运转发酵液循环泵,进一步进行培养基的连续供给,一边进行培养液的过滤量的控制使得连续发酵装置的发酵液量为1.5L,一边在以下的条件下进行300小时的连续培养,制造乙醇(表14)。
发酵反应槽容量:2(L)
使用分离膜:聚偏-1,1-二氟乙烯过滤膜
膜分离元件有效过滤面积:120(cm2)
温度调整:30(℃)
发酵反应槽通气量:100(mL/分钟)
发酵反应槽搅拌速度:800(转/分钟)
pH调整:无
发酵液的取出量:1(L/天)
灭菌:包含分离膜元件的培养槽、和使用培养基全部通过121℃、20分钟的高压釜进行高压蒸气灭菌。
另外,使用的膜使用与实施例1同样性质的膜,过滤时的膜间压差在0.1~19.8kPa之间变化。
表14
(比较例7)以六碳糖(葡萄糖)为发酵原料通过多粘类芽孢杆菌的分批培养进行的2,3-丁二醇的制造
使用作为2,3-丁二醇微生物的多粘类芽孢杆菌ATCC12321株,作为培养基使用表15所示的组成的2,3-丁二醇发酵培养基。
表15
将多粘类芽孢杆菌ATCC12321株在试管中用50mL的前培养培养基(葡萄糖5g/L、胨5g/L、酵母提取物3g/L、麦芽提取物3g/L)振荡培养24小时(前培养)。将前培养液接菌于1L的2,3-丁二醇发酵培养基中,在以下的条件下进行27小时的分批培养,制造2,3-丁二醇(表17)。
发酵反应槽容量:2(L)
温度调整:30(℃)
反应槽通气量:100(mL/分钟)
反应槽搅拌速度:800(转/分钟)
pH调整:用5N NaOH调整为pH6.5
灭菌:培养槽和使用培养基全部通过121℃、20分钟的高压釜进行高压蒸气灭菌。
(比较例8)以混合糖(葡萄糖、木糖)为发酵原料通过多粘类芽孢杆菌的分批培养进行的2,3-丁二醇的制造
使用表16所示的混合糖2,3-丁二醇发酵培养基2,在与比较例7同样的条件下进行50小时的分批培养,制造2,3-丁二醇(表17)。
表16
(比较例9)以混合糖(葡萄糖、木糖)为发酵原料通过多粘类芽孢杆菌的连续培养进行的2,3-丁二醇的制造
以混合糖(葡萄糖、木糖)为发酵原料,进行不利用分离膜的连续培养。将多粘类芽孢杆菌ATCC12321株在与上述比较例7的前培养相同的条件下进行振荡培养(前前培养)。将前前培养液接菌于1.2L的表16所示的混合糖2,3-丁二醇发酵培养基2中,将发酵反应槽用附带的搅拌机以200转/分钟搅拌,进行温度调整,进行分批培养直至培养液中的糖被完全消耗(前培养)。前培养结束后立即、前培养结束后,立即运转发酵液取出泵,进一步进行培养基的连续供给,一边进行包含微生物的培养液的取出量的控制使得连续发酵装置的发酵液量为1.2L,一边在以下的条件下进行280小时的连续培养,制造2,3-丁二醇(表17)。
发酵反应槽容量:2(L)
温度调整:30(℃)
反应槽通气量:100(mL/分钟)
反应槽搅拌速度:800(转/分钟)
pH调整:用5N NaOH调整为pH6.5
发酵液的取出量:0.6(L/天)
灭菌:培养槽和使用培养基全部通过121℃、20分钟的高压釜进行高压蒸气灭菌。
(实施例5)以混合糖(葡萄糖、木糖)为发酵原料通过多粘类芽孢杆菌的利用了分离膜的连续培养进行的2,3-丁二醇的制造
以混合糖(葡萄糖、木糖)为发酵原料,进行利用了分离膜的连续培养。作为分离膜元件采用平膜的方式。将多粘类芽孢杆菌ATCC12321株在与上述比较例7的前培养相同的条件下进行振荡培养(前前培养)。将前前培养液、将前培养液接菌于1.2L的混合糖2,3-丁二醇发酵培养基2中,将发酵反应槽用附带的搅拌机以200转/分钟搅拌,进行温度调整,进行分批培养直至培养液中的糖被完全消耗(前培养)。前培养结束后,立即运转发酵液循环泵,进一步进行培养基的连续供给,一边进行培养液的过滤量的控制使得连续发酵装置的发酵液量为1.2L,一边在以下的条件下进行310小时的连续培养,制造2,3-丁二醇(表17)。
发酵反应槽容量:2(L)
使用分离膜:聚偏-1,1-二氟乙烯过滤膜
膜分离元件有效过滤面积:120(cm2)
温度调整:30(℃)
发酵反应槽通气量:100(mL/分钟)
发酵反应槽搅拌速度:800(转/分钟)
发酵液的取出量:0.6L/天
灭菌:包含分离膜元件的培养槽和使用培养基全部通过121℃、20分钟的高压釜进行高压蒸气灭菌。
另外,使用的膜使用与实施例1同样性质的膜,过滤时的膜间压差在0.1~20kPa之间变化。
表17
(参考例6)树干毕赤酵母的木糖消耗速度计算
在与参考例4同样的条件下进行分批培养,作为培养基使用表3所示的组成的乙醇发酵木糖培养基和表4所示的乙醇发酵混合糖培养基1,算出作为乙醇发酵微生物的树干毕赤酵母NBRC1687株在乙醇发酵时的木糖消耗速度。
乙醇发酵木糖培养基和乙醇发酵混合糖培养基1中的木糖消耗速度按照前述(式6)和(式7)算出,示于表22。由该结果判断,树干毕赤酵母NBRC1687株是受到分解代谢物抑制的微生物。
(参考例7)产朊假丝酵母的木糖消耗速度计算
作为微生物,使用通过WO2010/140602所公开的方法制作的产朊假丝酵母CuLpLDH株。作为培养基,使用表18所示的组成的D-乳酸发酵木糖培养基和表19所示的D-乳酸发酵混合糖培养基1。除了将pH用1N氢氧化钙调整为pH6.0以外,在与比较例1同样的条件下进行40小时分批培养,算出D-乳酸发酵时的木糖消耗速度。
D-乳酸发酵木糖培养基和D-乳酸发酵混合糖培养基1中的木糖消耗速度按照前述(式6)和(式7)算出,示于表22。由该结果判断,产朊假丝酵母CuLpLDH株是受到分解代谢物抑制的微生物。
表18
表19
(参考例8)大肠杆菌KO11株的木糖消耗速度计算
算出作为乙醇发酵微生物的大肠杆菌KO11株在乙醇发酵时的木糖消耗速度。作为培养基使用表20所示的组成的乙醇发酵木糖培养基2和表21所示的乙醇发酵混合糖培养基3。适宜进行取样,培养液中的葡萄糖和木糖的浓度、和作为生产物的乙醇的浓度通过参考例1的方法测定。
表20
表21
将大肠杆菌KO11株在试管中用2mL的前培养培养基(葡萄糖20g/L酵母提取物10g/L、胰蛋白胨5g/L、NaCl 5g/L)在30℃培养一夜(前前培养)。将所得的培养液接菌于加入500mL容量的带褶皱三角烧瓶中的50mL的前培养培养基中,培养一夜(前培养)。将前培养液分别接菌于1.5L的乙醇发酵木糖培养基2和乙醇发酵混合糖培养基3中,一边进行温度调整和pH调整一边在以下所示的运转条件下进行16小时分批发酵。
培养槽容量:2(L)
温度调整:30(℃)
发酵反应槽通气量:100(mL/分钟)
发酵反应槽搅拌速度:800(转/分钟)
pH调整:用5N Ca(OH)2调整至pH6
灭菌:发酵槽和使用培养基全部通过121℃、20分钟的高压釜进行高压蒸气灭菌。
乙醇发酵木糖培养基2和乙醇发酵混合糖培养基3中的木糖消耗速度按照前述(式6)和(式7)算出,示于表22。由该结果判断,大肠杆菌KO11株是受到分解代谢物抑制的微生物。
表22
(比较例10)以六碳糖为发酵原料通过树干毕赤酵母的分批培养进行的乙醇的制造
作为微生物,使用树干毕赤酵母NBRC1687株,在与比较例4同样的条件下进行23小时分批培养,制造乙醇。(表23)
(比较例11)以混合糖为发酵原料通过树干毕赤酵母的分批培养进行的乙醇的制造
作为微生物,使用树干毕赤酵母NBRC1687株,在与比较例5同样的条件下进行40小时分批培养,制造乙醇(表23)。
(比较例12)以混合糖为发酵原料通过树干毕赤酵母的连续发酵进行的乙醇的制造
作为微生物,使用树干毕赤酵母NBRC1687株,用混合糖原料进行不利用分离膜的连续发酵。除了使前培养时间为40小时以外,在与比较例6同样的条件下进行,通过298小时的连续发酵来制造乙醇(表23)。
(实施例6)以混合糖为发酵原料通过树干毕赤酵母的利用了分离膜的连续发酵进行的乙醇的制造1
作为微生物,使用树干毕赤酵母NBRC1687株,进行利用了分离膜的连续发酵。除了使前培养为48小时、膜间压差为0.1~19.8kPa以外,在与实施例4同样的条件下进行,通过305小时的连续发酵来制造乙醇。
表23
(比较例13)以六碳糖为发酵原料通过产朊假丝酵母的分批培养进行的D-乳酸的制造
作为微生物,使用通过WO2010/140602所公开的方法制作的产朊假丝酵母CuLpLDH株。除了将pH用1N氢氧化钙调整为pH6.0,培养基使用表24所示的D-乳酸发酵混合糖培养基2以外,在与比较例4同样的条件下进行23小时分批培养,制造D-乳酸(表25)。
表24
(比较例14)以混合糖为发酵原料通过产朊假丝酵母的分批培养进行的D-乳酸的制造
除了作为微生物使用产朊假丝酵母CuLpLDH株,将pH用1N氢氧化钙调整为pH6.0,培养基使用表24所示的D-乳酸发酵混合糖培养基2以外,在与比较例5同样的条件下进行40小时分批培养,制造D-乳酸(表25)。
(比较例15)以混合糖为发酵原料通过产朊假丝酵母的连续发酵进行的D-乳酸的制造
作为微生物使用产朊假丝酵母CuLpLDH株,进行不利用分离膜的连续发酵。除了使前培养为40小时、将pH用1N氢氧化钙调整为pH6.0、培养基使用表24所示的D-乳酸发酵混合糖培养基2以外,在与比较例6同样的条件下进行,通过290小时的连续发酵来制造D-乳酸(表25)。
(实施例7)以混合糖为发酵原料通过产朊假丝酵母的利用了分离膜的连续发酵进行的D-乳酸的制造1
作为微生物使用产朊假丝酵母CuLpLDH株,进行利用了分离膜的连续发酵。除了使前培养为50小时、将pH用1N氢氧化钙调整为pH6.0、培养基使用表24所示的D-乳酸发酵混合糖培养基2以外,在与实施例4同样的条件下进行,通过310小时的连续发酵来制造D-乳酸。
表25
(比较例16)以六碳糖为发酵原料通过大肠杆菌的分批发酵进行的乙醇的制造
将大肠杆菌KO11株在试管中用2mL的前培养培养基(葡萄糖20g/L酵母提取物10g/L、胰蛋白胨5g/L、NaCl 5g/L)在30℃培养一夜(前前培养)。将所得的培养液接菌于装入500mL容量的带褶皱三角烧瓶中的50mL的前培养培养基中,培养一夜(前培养)。将前培养液接菌于表26所示的组成的1L的乙醇发酵培养基2中,一边进行温度调整和pH调整,一边在以下所示的运转条件下进行16小时分批发酵,制造乙醇(表28)。
培养槽容量:2(L)
温度调整:30(℃)
Kla:30(小时-1)
pH调整:用5N Ca(OH)2调整为pH6
灭菌:发酵槽和使用培养基全部通过121℃、20分钟的高压釜进行高压蒸气灭菌。
表26
(比较例17)以混合糖为发酵原料通过大肠杆菌的分批发酵进行的乙醇的制造
作为发酵培养基使用表27所示的组成的乙醇发酵混合糖培养基4,在与比较例16同样的条件下进行24小时分批发酵,制造乙醇(表28)。
表27
(比较例18)以混合糖为发酵原料通过大肠杆菌的连续发酵进行的乙醇的制造
以混合糖为发酵原料,进行不利用分离膜的连续发酵。将大肠杆菌KO11株在试管中用2mL的前培养培养基(葡萄糖20g/L、酵母提取物10g/L、胰蛋白胨5g/L、NaCl 5g/L)在30℃培养一夜(前前前培养)。将所得的培养液接菌于加入500mL容量的带褶皱三角烧瓶中的50mL的前培养培养基中,培养一夜(前前培养)。将前前培养液接菌于加入了表27所示的组成的乙醇发酵混合糖培养基4的连续培养装置(从WO2007/097260的图2所示的装置中除去了分离膜元件后的装置),一边进行温度调整和pH调整一边在以下所示的运转条件下进行24小时分批发酵(前培养)。前培养结束后,立即开始连续培养,进行乙醇的制造。为了表27所示的组成的乙醇发酵混合糖培养基4的供给以及包含微生物的培养液的取出,使用ペリスタ生物微型泵AC-2120型(ATTO社),在培养槽内直接供给培养基,从培养槽内直接取出包含微生物的培养液。使包含微生物的培养液的取出速度一定,一边控制培养基供给速度使得培养槽内的培养液量为1.5L,一边进行290小时乙醇制造(表28)。
培养槽容量:2(L)
温度调整:30(℃)
Kla:30(小时-1)
pH调整:用5N Ca(OH)2调整为pH6
发酵液的取出速度:2L/天
灭菌:发酵槽和使用培养基全部通过121℃、20分钟的高压釜进行高压蒸气灭菌。
(实施例8)以混合糖为发酵原料通过大肠杆菌的利用分离膜的连续发酵进行的乙醇的制造
以混合糖为发酵原料,进行利用了分离膜的连续发酵。将大肠杆菌KO11株在试管中用2mL的前培养培养基(葡萄糖20g/L、酵母提取物10g/L、胰蛋白胨5g/L、NaCl 5g/L)在30℃培养一夜(前前前培养)。将所得的培养液接菌于加入500mL容量的带褶皱三角烧瓶中的50mL的前培养培养基中,培养一夜(前前培养)。将前前培养液接种于加入了表27所示的组成的乙醇发酵混合糖培养基4的膜一体型的具备以下的条件的连续发酵装置(WO2007/097260的图2所示的装置)中,一边进行温度调整和pH调整,一边在以下所示的运转条件下进行24小时分批发酵(前培养)。前培养结束后,立即开始连续培养,进行乙醇的制造。为了表27所示的组成的乙醇发酵混合糖培养基4的供给和培养液的过滤,使用ペリスタ生物微型泵AC-2120型(ATTO社)。培养基供给直接向培养槽内进行,培养液的过滤通过固定了分离膜的元件进行。使培养液的过滤速度一定,一边控制培养基供给速度使得培养槽内的培养液量为1.5L,一边使过滤时的膜间压差在0.1~19.8kPa的范围变化,从而通过310小时的连续发酵来制造乙醇(表28)。
发酵槽容量:2(L)
使用分离膜:聚偏-1,1-二氟乙烯过滤膜
膜分离元件有效过滤面积:473cm2
分离膜的纯水透过系数:50×10-9m3/m2/s/Pa
分离膜的平均细孔径:0.1μm
平均细孔径的标准偏差:±0.035μm
分离膜的表面粗糙度:0.06μm
温度调整:30(℃)
pH调整:用5N Ca(OH)2调整为pH6
发酵液的取出速度:2L/天
灭菌:包含分离膜元件的发酵槽和使用培养基全部通过121℃、20分钟的高压釜进行高压蒸气灭菌。
表28
(比较例19)以来源于生物质的糖液(葡萄糖、木糖)为发酵原料通过凝结芽孢杆菌的分批培养进行的L-乳酸的制造
作为发酵原料,使用来源于生物质的糖液。乳酸发酵糖液培养基使用通过WO2010/067785的实施例2所记载的利用纳滤膜的制备方法而制备的纤维素糖化液,通过适宜试剂如表29所示地制备。除了使用的培养基、和中和剂为4N KOH以外,在与比较例2同样的条件下进行70小时分批培养,制造L-乳酸(表30)。
表29
(比较例20)以来源于生物质的糖液(葡萄糖、木糖)为发酵原料通过凝结芽孢杆菌的连续培养进行的L-乳酸的制造
作为发酵原料,使用来源于生物质的糖液。乳酸发酵糖液培养基与比较例19同样地使用表29所述的培养基。除了使用的培养基、和中和剂为4N KOH以外,在与比较例3同样的条件下进行250小时的连续培养,制造乳酸(表30)。
(实施例9)以来源于生物质的糖液(葡萄糖、木糖)为发酵原料通过凝结芽孢杆菌的利用分离膜的连续培养进行的L-乳酸的制造
作为发酵原料,使用来源于生物质的糖液。乳酸发酵糖液培养基与比较例19同样地使用表29所述的培养基。除了使用的培养基、和中和剂为4N KOH以外,在与实施例1同样的条件下进行260小时的利用分离膜的连续培养,制造乳酸。
表30
(比较例21)以来源于生物质的糖液(葡萄糖、木糖)为发酵原料通过大肠杆菌的分批培养进行的乙醇的制造
作为发酵原料,使用来源于生物质的糖液。乙醇发酵糖液培养基使用通过WO2010/067785的实施例2所记载的利用纳滤膜的制备方法制备的纤维素糖化液,通过适宜试剂如表31所示地制备。除了使用的培养基以外,在与比较例17同样的条件下进行23小时分批培养,制造乙醇(表32)。
表31
(比较例22)以来源于生物质的糖液(葡萄糖、木糖)为发酵原料通过大肠杆菌的连续培养进行的乙醇的制造
乙醇发酵糖液培养基与比较例21同样地使用表31所记载的培养基,在与比较例18同样的条件下进行285小时的连续培养,制造乙醇(表32)。
(实施例10)以来源于生物质的糖液(葡萄糖、木糖)为发酵原料通过大肠杆菌的利用分离膜的连续培养进行的乙醇的制造
使用表27所示的乙醇发酵糖液培养基,在与实施例8同样的条件下进行295小时的利用分离膜的连续培养,制造乙醇。
表32
(比较例23)以混合糖(葡萄糖、木糖)为发酵原料通过热带假丝酵母的分批培养进行的乙醇的制造2
使用表33所示的乙醇发酵混合糖培养基5,在与比较例4同样的条件下进行45小时的分批培养,制造乙醇(表34)。
表33
(比较例24)以混合糖为发酵原料通过热带假丝酵母的连续培养进行的乙醇的制造
使用表33所示的乙醇发酵混合糖培养基5,在与比较例6同样的条件下进行350小时的连续培养,制造乙醇(表34)。
(实施例11)以混合糖(葡萄糖、木糖)为发酵原料通过热带假丝酵母的利用了分离膜的连续培养进行的乙醇的制造2
使用表33所示的乙醇发酵混合糖培养基5,在与实施例4同样的条件下进行360小时的连续培养,制造乙醇(表34)。
(实施例12)以混合糖为发酵原料通过热带假丝酵母的利用了陶瓷制分离膜的连续发酵进行的乙醇的制造3
使用热带假丝酵母NBRC0199株,进行利用了陶瓷制分离膜的连续发酵。发酵培养基使用表33所示的培养基。将热带假丝酵母NBRC0199株在试管中用2mL的YPD培养基在30℃振荡培养一夜(前前前培养)。将所得的培养液接种于加入了YPD培养基50mL的500mL容量的带褶皱三角烧瓶中,振荡培养一夜(前前培养)。将前前培养液接菌于加入了1.5L的YPDX培养基的膜分离型的连续发酵装置(WO2012/086763的图12所示的装置)中,将培养槽用附带的搅拌机以800转/分钟搅拌,进行培养槽的通气速度的调整、温度调整,进行36小时培养(前培养)。前培养结束后,立即开始连续发酵。一边将过滤时的膜间压差调整为500kPa以下,一边通过400小时的连续发酵来制造乙醇(表34)。
培养槽容量:2L
使用分离膜:Celfit精滤膜独块(monolith)φ4-19(日本ガイシ)
膜分离元件长度:500mm
分离膜的平均细孔径:0.1μm
温度调整:30℃
发酵反应槽通气量:100(mL/分钟)
发酵反应槽搅拌速度:800(转/分钟)
pH调整:无。
表34
(实施例13)以混合糖(葡萄糖、木糖)为发酵原料通过多粘类芽孢杆菌的利用了陶瓷制分离膜的连续培养进行的2,3-丁二醇的制造2
使用多粘类芽孢杆菌ATCC12321株,进行利用了陶瓷制分离膜的连续发酵。将多粘类芽孢杆菌ATCC12321株在试管中用2mL的前培养培养基(葡萄糖5g/L、胨5g/L、酵母提取物3g/L、麦芽提取物3g/L)在30℃培养一夜(前前前培养)。将所得的培养液接菌于加入500mL容量的带褶皱三角烧瓶中的50mL的前培养培养基中,培养一夜(前前培养)。将前前培养液接菌于加入了表16所示的组成的2,3-丁二醇发酵混合糖培养基的连续培养装置(WO2007/097260的图2所示的装置)中,一边进行温度调整和pH调整一边在以下所示的运转条件下进行30小时分批发酵(前培养)。前培养结束后,使用表16所示的组成的2,3-丁二醇发酵混合糖培养基立即开始连续培养,进行2,3-丁二醇的制造。一边将过滤时的膜间压差调整为500kPa以下,一边通过300小时的连续发酵来制造2,3-丁二醇(表35)。
发酵槽容量:2(L)
使用分离膜:Celfit精滤膜独块(monolith)φ4-19(日本ガイシ)
膜分离元件长度:500mm
分离膜的平均细孔径:0.1μm
温度调整:30(℃)
发酵反应槽通气量:100(mL/分钟)
发酵反应槽搅拌速度:800(转/分钟)
pH调整:用5N Ca(OH)2调整为pH6.5
表35
产业可利用性
通过本发明,可以大幅提高使用了包含五碳糖和六碳糖的发酵原料的各种化学品的发酵生产的效率。
Claims (5)
1.化学品的制造方法,是通过连续发酵来制造化学品的方法,包括:将微生物的培养液用分离膜过滤,将未过滤液保持在或回流至培养液中,在培养液中补加发酵原料,和回收过滤液中的生产物,
所述微生物是受到分解代谢物抑制的微生物,所述发酵原料包含六碳糖和五碳糖。
2.根据权利要求1所述的化学品的制造方法,所述过滤液总量中的五碳糖的浓度为5g/L以下。
3.根据权利要求1或2所述的化学品的制造方法,所述发酵原料中所含的六碳糖与五碳糖的重量比率为1:9~9:1。
4.根据权利要求1或2所述的化学品的制造方法,所述发酵原料包含来源于生物质的糖液。
5.根据权利要求1~4的任一项所述的化学品的制造方法,所述五碳糖是木糖。
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