KR20140116844A - 화학품의 제조방법 - Google Patents

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시오미 와타나베
쿄헤이 이소베
켄지 사와이
나경수
신고 히라마츠
카츠시게 야마다
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Abstract

본 발명은 6탄당과 5탄당의 혼합당을 발효 원료로 한 고수율의 화학품의 제조방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
상기 과제를 해결하기 위해서 미생물의 배양액을 분리 막으로 여과하는 것, 미여과액을 배양액에 유지 또는 환류하는 것, 발효 원료를 배양액에 추가하는 것, 및 여과액 중의 생산물을 회수하는 것을 포함하는 연속 발효에 의한 화학품의 제조방법으로서, 상기 미생물은 카타볼라이트 억제를 받는 미생물이고, 상기 발효 원료가 6탄당 및 5탄당을 포함하는 것을 특징으로 하는 화학품의 제조방법을 제공했다.

Description

화학품의 제조방법{METHOD FOR PRODUCING CHEMICAL SUBSTANCE}
본 발명은 6탄당 및 5탄당을 포함하는 발효 원료를 사용한 연속 발효에 의한 화학품의 제조방법에 관한 것이다.
락트산 등의 생분해성 폴리머 원료나 에탄올 등의 바이오 연료로 대표되는 바이오매스 유래의 화학품은 대기 중으로의 이산화탄소의 배출 문제나 에너지 문제의 현재화와 아울러 서스태인어빌리티(지속 가능성) 및 라이프 사이클 어세스먼트(LCA) 대응형 제품으로서 강한 주목을 받고 있다. 이들 생분해성 폴리머 원료나 바이오 연료의 제조방법으로서는 옥수수 등의 가식성 바이오매스로부터 정제한 6탄당인 글루코오스를 미생물의 발효 원료로 사용하고, 발효 산물로서 얻는 것이 일반적이지만, 가식성 바이오매스를 사용하면, 식료와 경합하기 때문에 가격 고등이 야기되어, 안정한 원료의 조달을 할 수 없게 될 우려가 있다. 따라서, 볏짚 등의 비가식성 바이오매스 유래의 당을 미생물의 발효 원료로 사용하는 시도가 행해지고 있다(특허문헌 1 참조).
비가식성 바이오매스 유래의 당을 발효 원료로 사용할 때는 비가식 바이오매스에 포함되는 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 등을 당화 효소에 의해 당으로 분해하지만, 이 때에 글루코오스 등의 6탄당뿐만 아니라, 크실로오스 등의 5탄당도 동시에 얻어져서 비가식성 바이오매스 유래의 당을 미생물의 발효 원료로 사용하는 경우, 6탄당과 5탄당의 혼합당을 발효 원료로서 사용하는 것이 된다(특허문헌 1 참조).
6탄당과 5탄당의 혼합당인 비가식성 바이오매스 유래의 당을 미생물의 발효 원료로 한 발효 방법으로서는 연속 발효가 채용될 수 있지만, 실제로 연속 발효한 경우의 발효 수율에 관해서는 확인되지 않고 있다(특허문헌 1 참조). 한편, 6탄당과 5탄당의 혼합당을 발효 원료로서 연속 발효하는 경우, 배지가 연속적으로 발효에 이용되기 때문에, 배치 발효의 경우보다도 카타볼라이트 억제를 연속적으로 받음으로써 배치 발효보다 발효 수율이 현저하게 저하해버리는 경우도 알려져 있다(비특허문헌 1 참조). 따라서, 6탄당과 5탄당의 혼합당을 미생물의 발효 원료로 한 연속 발효에 의해 발효 수율을 향상시키고자 하는 경우, 카타볼라이트 억제를 받지 않도록 미생물을 사용할 필요가 있다고 생각되는 것이 지금까지의 기술 상식이었다.
WO2010/067785
Do Yun Kim, Seong Chun Yim, Pyung Cheon Lee, Woo Gi Lee, Sang Yup Lee, Ho Nam Chang, Batch and continuous fermentation of succinic acid from wood hydrolysate by Mannheimia succiniciproducens MBEL55E, Enzyme and Microbial Technology, 35, (2004), 648-653.
생분해성 폴리머 원료나 바이오 연료를 발효 생산하는 미생물로서, 카타볼라이트 억제를 받는 것이 다수 알려져 있다. 한편, 상술한 바와 같이, 6탄당과 5탄당의 혼합당을 미생물의 발효 원료로서 연속 발효를 행한 경우에는 카타볼라이트 억제에 의해 발효 수율이 현저하게 저하해버리는 것이 알려져 있다. 그래서, 본 발명은 6탄당과 5탄당의 혼합당을 카타볼라이트 억제를 받는 미생물의 발효 원료로서 연속 발효하는 경우의 발효 수율의 향상을 과제로 하는 것이다.
본 발명자는 상기 과제를 예의 검토한 결과, 6탄당과 5탄당의 혼합당을 미생물의 발효 원료로서 연속 발효하는 화학품의 제조방법에 있어서, 카타볼라이트 억제를 갖는 미생물을, 분리 막을 사용한 연속 발효를 행함으로써 상기 과제를 해결하는 것을 발견하여 본 발명에 이른 것이다.
즉, 본 발명은 이하의 (1)∼(5)와 같다.
(1) 미생물의 배양액을 분리 막으로 여과하는 것, 미여과액을 배양액에 유지 또는 환류하는 것, 발효 원료를 배양액에 추가하는 것, 및 여과액 중의 생산물을 회수하는 것을 포함하는 연속 발효에 의한 화학품의 제조방법으로서, 상기 미생물이 카타볼라이트 억제를 받는 미생물이고, 상기 발효 원료가 6탄당 및 5탄당을 포함한 화학품의 제조방법.
(2) 상기 여과액 총량의 5탄당의 농도가 5g/L 이하인 (1)에 기재된 화학품의 제조방법.
(3) 상기 발효 원료 중에 포함되는 6탄당과 5탄당의 중량 비율이 1:9∼9:1인 (1) 또는 (2)에 기재된 화학품의 제조방법.
(4) 상기 발효 원료가 바이오매스 유래의 당액을 포함하는 (1) 또는 (2)에 기재된 화학품의 제조방법.
(5) 상기 5탄당이 크실로오스인 (1)∼(4) 중 어느 하나에 기재된 화학품의 제조방법.
(발명의 효과)
본 발명에 의하면, 6탄당과 5탄당의 혼합당을 카타볼라이트 억제를 받는 미생물의 발효 원료로 하는데도 불구하고, 화학품을 고수율로 제조할 수 있다.
본 발명은 미생물을 발효 원료로 배양해서 화학품을 발효 생산하는 화학품의 제조방법에 있어서, 배양액을 분리 막으로 여과하여 미여과액을 배양액에 유지 또는 환류하고, 또한 발효 원료를 배양액에 추가해서 여과액 중의 생산물을 회수하는 연속 발효하는 화학품의 제조방법으로서, 카타볼라이트 억제를 받는 상기 미생물을 사용하고, 또한 상기 발효 원료가 6탄당 및 5탄당을 포함하는 것을 특징으로 하는 화학품의 제조방법이다.
본 발명의 화학품의 제조방법에 있어서는 발효 원료의 탄소원에는 5탄당과 6탄당을 포함하는 혼합당이 포함된다. 5탄당이란 당을 구성하는 탄소수가 5개인 것이고, 펜토스(Pentose)라고도 불린다. 1위치에 알데히드기를 갖는 알도펜토스와 2위치에 케톤기를 갖는 케토펜토스가 있다. 알도펜토스로서는 크실로오스, 아라비노스, 리보오스, 릭소스가 열거되고, 케토펜토스로서는 리불로오스, 크실로오스가 열거된다. 본 발명에서 사용하는 5탄당으로서는 미생물이 자화할 수 있는 것이면, 어떠한 것이라도 좋지만 자연계에서의 존재 비율이나 입수 용이성 등의 관점으로부터, 바람직하게는 크실로오스, 아라비노스이고, 보다 바람직하게는 크실로오스이다.
6탄당이란 당을 구성하는 탄소수가 6개인 것이고, 헥소스(Hexose)라고도 불린다. 1위치에 알데히드기를 갖는 알도스와 2위치에 케톤 기를 갖는 케토스가 있다. 알도스로서는 글루코오스, 만노스, 갈락토오스, 알로스, 굴로스, 탈로스 등이 열거되고, 케토스로서는 프룩토스, 프시코스, 소르보스 등이 열거된다. 본 발명에서 사용하는 6탄당으로서는 미생물이 자화할 수 있는 것이면 어떠한 것이라도 좋지만, 자연계에서의 존재 비율이나 입수의 용이성 등의 관점으로부터, 바람직하게는 글루코오스, 만노스, 갈락토오스이고, 보다 바람직하게는 글루코오스이다.
본 발명에서 사용되는 혼합당에 관해서는 특별하게 한정되지 않지만, 6탄당과 5탄당을 모두 포함하는 것이 알려져 있는 셀룰로오스 함유 바이오매스 유래 당액이 바람직하게 사용된다. 셀룰로오스 함유 바이오매스에는 바가스, 스윗치 글라스, 옥수수 대, 볏짚, 밀짚 등 초목계 바이오매스와 수목, 폐건재 등의 목질계 바이오매스 등을 예로서 들 수 있다. 셀룰로오스 함유 바이오매스는 당이 탈수 축합한 다당인 셀룰로오스 또는 헤미셀룰로오스를 함유하고 있고, 이러한 다당을 가수분해함으로써 발효 원료로서 이용 가능한 당액이 제조된다. 셀룰로오스 함유 바이오매스 유래 당액의 조제 방법은 어떤 방법이어도 되고, 이러한 당의 제조 방법으로서는 농황산을 사용해서 바이오매스를 산가수 분해해서 당액을 제조하는 방법(일본국 특허공표 평11-506934호 공보, 일본국 특허공개 2005-229821호 공보), 바이오매스를 희황산으로 가수 분해 처리한 후에 셀룰라아제 등의 효소 처리함으로써 당액을 제조하는 방법이 개시되어 있다(A．Aden 등, "Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co－Current Dilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover" NREL Technical Report(2002)). 또한, 산을 사용하지 않는 방법으로서 250∼500℃ 정도의 아임계수를 사용해서 바이오매스를 가수 분해해서 당액을 제조하는 방법(일본국 특허공개 2003-212888호 공보), 또한 바이오매스를 아임계수 처리한 후에, 또한 효소 처리함으로써 당액을 제조하는 방법(일본국 특허공개 2001-95597호 공보), 바이오매스를 240∼280℃의 가압 열수로 가수 분해 처리한 후에, 또한 효소 처리함으로써 당액을 제조하는 방법(특허 3041380호)이 개시되어 있다. 이상과 같은 처리 후, 얻어진 당액을 정제해도 좋다. 그 방법은 예를 들면, WO2010/067785에 개시되어 있다.
혼합당에 포함되는 5탄당과 6탄당의 중량 비율은 특별히 제한은 없지만, 혼합당 중의 5탄당과 6탄당의 중량 비율로서 (5탄당):(6탄당)으로 나타내면, 1:9∼9:1이 바람직하다. 이것은 혼합당으로서 셀룰로오스 함유 바이오매스 유래 당액을 상정했을 경우의 당비율이다.
본 발명에 사용하는 발효 원료에 포함되는 총당 농도는 특별히 제한되지 않고, 미생물의 화학품의 생산을 저해하지 않는 범위이면 가능한 한 높은 농도인 것이 바람직하다. 구체적으로는 배지 중의 탄소원의 농도는 15∼500g/L가 바람직하고, 20∼300g/L이 보다 바람직하다. 총농도가 15g/L 이하이면 5탄당으로부터의 수율 향상의 효과가 저하해버릴 경우가 있다. 또한, 총당농도가 낮으면 화학품의 생산 효율도 저하해버린다.
본 발명에 사용하는 발효 원료에 포함되는 6탄당 농도는 상기의 총당농도, 5탄당과 6탄당의 비율의 범위에 있어서 특별하게 한정되지 않지만, 본 발명의 화학품의 제조방법을 사용하면, 6탄당을 농도 5g/L이상 포함하는 혼합당액에 있어서도 양호한 수율을 얻을 수 있다.
본 발명에서 사용하는 발효 원료는 탄소원, 질소원, 무기염류, 및 필요에 따라 아미노산 및 비타민 등의 유기 미량 영양소를 적당하게 함유하는 통상의 액체 배지가 좋다.
본 발명에서 사용하는 질소원으로서는 암모니아가스, 암모니아수, 암모늄염류, 요소, 질산염류, 기타 보조적으로 사용되는 유기 질소원, 예를 들면 유박류, 대두 가수분해액, 카제인 분해물, 그 밖의 아미노산, 비타민류, 콘 스팁 리커(corn steep liquor), 효모 또는 효모 엑기스, 육류 엑기스, 펩톤 등의 펩티드류, 각종 발효 균체 및 그 가수 분해물 등이 사용된다. 무기염류로서는 인산염, 마그네슘염, 칼슘염, 철염 및 망간염 등을 적당하게 첨가 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 미생물이 생육을 위해 특정한 영양소를 필요로 하는 경우에는 그 영양물을 표품 또는 그것을 함유하는 천연물로서 첨가한다. 또한, 소포제도 필요에 따라서 사용한다. 본 발명에 있어서, 배양액이란 발효 원료에 미생물이 증식한 결과 얻어지는 액을 말한다. 추가하는 발효 원료의 조성은 목적으로 하는 화학품의 생산성이 높아지도록 배양 개시시의 발효 원료 조성으로부터 적당하게 변경해도 된다.
다음에, 본 발명에 있어서 분리 막으로서 사용되는 다공성 막에 관하여 설명한다.
본 발명에 사용하는 다공질 막에 대해서는 특별히 제한은 없고, 미생물의 교반형 배양기 또는 교반형 바이오리액터에 의한 배양으로 얻어진 배양액을 미생물로부터 분리 여과하는 기능을 갖는 것이면 되고, 예를 들면 다공질 세라믹 막, 다공질 글래스 막, 다공질 유기 고분자 막, 금속 섬유 편직체, 부직포 등을 사용할 수 있다. 이들 중에서 특히, 다공질 유기 고분자 막 또는 세라믹 막이 바람직하다.
본 발명에서 분리 막으로서 사용되는 다공성 막의 구성에 관하여 설명한다. 본 발명에서 사용되는 다공성 막은 바람직하게는, 피처리수의 수질이나 용도에 따른 분리 성능과 투수 성능을 갖는 것이다.
다공성 막은 저지 성능 및 투수 성능이나 분리 성능, 예를 들면 내오염성의 점으로부터, 다공질 수지층을 포함하는 다공성 막인 것이 바람직하다.
다공질 수지층을 포함하는 다공성 막은 바람직하게는 다공질 기재의 표면에, 분리 기능층으로서 작용하는 다공질 수지층을 갖고 있다. 다공질 기재는 다공질 수지층을 지지해서 분리 막에 강도를 부여한다.
본 발명에서 사용되는 다공성 막이 다공질 기재의 표면에 다공질 수지층을 갖고 있을 경우, 다공질 기재에 다공질 수지층이 침투하고 있어도, 다공질 기재에 다공질 수지층이 침투하지 않고 있어도, 어느 쪽이라도 좋고 용도에 따라 선택된다.
다공질 기재의 평균 두께는 바람직하게는 50㎛ 이상 3000㎛ 이하이다.
다공질 기재의 재질은 유기 재료 및/또는 무기 재료 등으로 이루어지고, 유기 섬유가 바람직하게 사용된다. 바람직한 다공질 기재는 셀룰로오스 섬유, 셀룰로오스트리아세테이트 섬유, 폴리에스테르 섬유, 폴리프로필렌 섬유 및 폴리에틸렌 섬유 등의 유기 섬유로 이루어지는 직포나 부직포이고, 보다 바람직하게는 밀도의 제어가 비교적 용이해서 제조도 용이한 저렴한 부직포가 사용된다.
다공질 수지층은 유기 고분자 막을 바람직하게 사용할 수 있다. 유기 고분자 막의 재질로서는 예를 들면, 폴리에틸렌계 수지, 폴리프로필렌계 수지, 폴리염화비닐계 수지, 폴리불화비닐리덴계 수지, 폴리술폰계 수지, 폴리에테르술폰계 수지, 폴리아크릴로니트릴계 수지, 셀룰로오스계 수지 및 셀룰로오스트리아세테이트계 수지 등이 열거된다. 유기 고분자 막은 이들의 수지를 주성분으로 하는 수지의 혼합물이어도 된다. 여기서 주성분이란, 그 성분이 50중량% 이상, 바람직하게는 60중량% 이상 함유하는 것을 말한다. 유기 고분자 막의 재질은 용액에 의한 제막이 용이해서 물리적 내구성이나 내약품성도 뛰어나고 있는 폴리염화비닐계 수지, 폴리불화비닐리덴계 수지, 폴리술폰계 수지, 폴리에테르술폰계 수지 및 폴리아크릴로니트릴계 수지가 바람직하고, 폴리불화비닐리덴계 수지 또는 그것을 주성분으로 하는 수지가 가장 바람직하게 사용된다.
여기서, 폴리불화비닐리덴계 수지로서는 불화비닐리덴의 단독 중합체가 바람직하게 사용된다. 또한, 폴리불화비닐리덴계 수지는 불화비닐리덴과 공중합 가능한 비닐계 단량체와의 공중합체도 바람직하게 사용된다. 불화비닐리덴과 공중합 가능한 비닐계 단량체로서는 테트라플루오로에틸렌, 헥사플루오로프로필렌 및 3염화불화에틸렌 등이 예시된다.
본 발명에서 분리 막으로서 사용되는 다공성 막은 특별히 제한은 없고, 발효에 사용되는 미생물이 통과할 수 없으면 되지만, 발효에 사용되는 미생물의 분비물이나 발효 원료 중의 미립자에 의한 막힘이 일어나기 어렵고, 또한 여과 성능이 장기간 안정하게 계속되는 범위인 것이 바람직하다. 따라서, 다공성 분리 막의 평균 세공 직경은 0. 01㎛ 이상 5㎛ 미만인 것이 바람직하다. 또한, 더욱 바람직하게는 다공성 막의 평균 세공 직경이 0.01㎛ 이상 1㎛ 미만이면, 미생물이 리크하는 경우가 없는 높은 배제율과 높은 투수성을 양립시킬 수 있고, 투수성을 장시간 유지하는 것이 보다 높은 정밀도와 재현성을 가져서 실시할 수 있다.
미생물의 크기에 가깝다면 이들이 직접 구멍을 막아버릴 경우가 있으므로 다공성 막의 평균 세공 직경은 1㎛ 미만인 것이 바람직하다. 다공성 막의 평균 세공 직경은 미생물의 누출, 즉 배제율이 저하하는 바람직하지 않은 경우의 발생을 방지하기 위해서 미생물의 크기와 비교해서 지나치게 크지 않는 것이 바람직하다. 미생물 중, 세포가 작은 세균 등을 사용하는 경우에는 평균 세공 직경으로서 0. 4㎛ 이하가 바람직하고, 0. 2㎛ 미만이면 보다 바람직하게 실시할 수 있다.
또한, 미생물이 소망의 생산물인 화학품 이외의 물질, 예를 들면 단백질이나 다당류 등 응집하기 쉬운 물질을 생산하는 경우가 있고, 또한 발효 배양액 중의 미생물의 일부가 사멸함으로써 세포의 파쇄물이 생성할 경우가 있고, 이들 물질에 의한 다공성 막의 폐쇄를 회피하기 위해서, 평균 세공 직경은 0.1㎛ 이하인 것이 더욱 바람직하다.
평균 세공 직경이 지나치게 작으면 다공성 막의 투수 성능이 저하하고, 막이 오염되지 않아도 효율적인 운전을 할 수 없게 되기 때문에 본 발명에 있어서의 다공성 막의 평균 세공 직경은 바람직하게는 0. 01㎛ 이상이고, 보다 바람직하게는 0.02㎛ 이상이며, 더욱 바람직하게는 0.04㎛ 이상이다.
여기서, 평균 세공 직경은 배율 10,000배의 주사형 전자 현미경 관찰에 있어서의 9.2㎛×10.4㎛의 범위내에서 관찰할 수 있는 세공 모두의 직경을 측정하고, 평균함으로써 구할 수 있다. 평균 세공 직경은 또는 막 표면을 주사형 전자 현미경 을 이용하여 배율 10,000배로 사진 촬영하고, 10개 이상, 바람직하게는 20개 이상의 세공을 무작위로 선택하고, 그들 세공의 직경을 측정하고, 수 평균하여 구할 수도 있다. 세공이 원형상이 아닌 경우, 화상 처리 장치 등에 의해, 세공이 갖는 면적과 동일한 면적을 갖는 원(등가원)을 구하고, 등가원 직경을 세공의 직경으로 하는 방법에 의해 구할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 다공성 막의 평균 세공 직경의 표준 편차(σ)는 0.1㎛ 이하인 것이 바람직하다. 평균 세공 직경의 표준 편차(σ)는 작으면 작을수록 바람직하다. 평균 세공 직경의 표준 편차(σ)는 상술의 9.2㎛×10.4㎛의 범위내에서 관찰할 수 있는 세공수를 N으로 하고, 측정한 각각의 직경을 Xk라고 하고, 세공 직경의 평균을 X(ave)로 한 하기의 (식 1)에 의해 산출된다.
Figure pct00001
본 발명에서 사용되는 다공성 막에 있어서는 발효 배양액의 투과성이 중요한 성능의 하나이다. 다공성 막의 투과성의 지표로서, 사용전의 다공성 막의 순수 투과 계수를 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서, 다공성 막의 순수 투과 계수는 역침투막에 의한 25℃의 온도의 정제수를 사용하고, 헤드 높이 1m로 투수량을 측정하여 산출했을 때, 5.6×10-10m3/m2/s/pa 이상인 것이 바람직하고, 순수 투과 계수가 5.6×10-10m3/m2/s/pa 이상 6×10-7m3/m2/s/pa 이하이면, 실용적으로 충분한 투과 수량이 얻어진다.
본 발명에서 사용되는 다공성 막에 있어서, 표면 조도란 표면에 대하여 수직방향의 높이의 평균값이다. 막 표면 조도는 분리 막 표면에 부착된 미생물이 교반이나 순환 펌프에 의한 액류에 의한 막면 세정 효과에 의해 박리하기 쉽게 하기 위한 인자의 하나이다. 다공성 막의 표면 조도는 특별히 제한은 없고, 막에 부착된 미생물 및 그 밖의 고형물이 박리되는 범위이면 되지만, 0. 1㎛ 이하인 것이 바람직하다. 표면 조도가 0.1㎛ 이하이면 막에 부착된 미생물 및 그 밖의 고형물이 박리되기 쉬워진다.
더욱 바람직하게는 다공성 막의 막 표면 조도가 0. 1㎛ 이하이고, 평균 세공 직경이 0.01㎛ 이상 1㎛ 미만이고, 다공성 막의 순수 투과 계수가 2×10-9m3/m2/s/pa 이상의 다공성 막을 사용함으로써, 막면 세정에 필요한 동력을 과도하게 필요로 하지 않는 운전이 보다 용이하게 가능한 것이 확인되었다. 다공성 막의 표면 조도를 0. 1㎛ 이하로 함으로써, 미생물의 여과에 있어서, 막 표면에서 발생하는 전단력을 저하시킬 수 있고, 미생물의 파괴가 억제되어 다공성 막의 막힘도 억제됨으로써, 장기간 안정한 여과가 보다 용이하게 가능하게 된다. 또한, 다공성 막의 표면 조도를 0. 1㎛ 이하로 함으로써, 보다 낮은 막간 차압으로 연속 발효가 실시 가능하여, 다공성 막이 막혔을 경우라도 높은 막간 차압으로 운전했을 경우에 비하여, 세정 회복성이 양호하다. 다공성 막의 막힘을 억제함으로써, 안정한 연속 발효가 가능하게 되기 때문에, 다공성 막의 표면 조도는 작으면 작을수록 바람직하다.
여기서, 다공성 막의 막 표면 조도는 하기의 원자간력 현미경 장치(AFM)를 사용하고, 하기의 조건으로 측정한 것이다.
·장치 원자간력 현미경 장치(Digital Instruments(주) 제품 "Nanoscope IIIa")
·조건 탐침 SiN 캔틸레버(Digital Instruments(주) 제품)
주사 모드 콘택트 모드(기중 측정)
수중 태핑 모드(수중 측정)
주사 범위 10㎛, 25㎛ 사방(기중 측정)
5㎛, 10㎛ 사방(수중 측정)
주사 해상도 512×512
·시료 조제 측정시에 막 샘플은 상온에서 에탄올에 15분 침지 후, RO 수중에 24시간 침지하여 세정한 후, 풍건하여 사용했다. RO수란 여과 막의 1종인 역침투막(RO막)을 이용하여 여과하고, 이온이나 염류 등의 불순물을 배제한 물을 나타낸다. RO막의 구멍의 크기는 대략 2nm 이하이다.
막 표면 조도(drough)는 상기의 원자간력 현미경 장치(AFM)에 의해 각 포인트의 Z축 방향의 높이로부터, 하기의 (식 2)에 의해 산출된다.
Figure pct00002
본 발명에서 사용되는 다공성 막의 형상은 바람직하게는 평막이다. 다공성 막의 형상이 평막인 경우, 그 평균 두께는 용도에 따라 선택된다. 다공성 막의 형상이 평막인 경우의 평균 두께는 바람직하게는 20㎛ 이상 5000㎛ 이하이고, 보다 바람직하게는 50㎛ 이상 2000㎛ 이하이다. 또한, 본 발명에서 사용되는 다공성 막의 형상은 바람직하게는 중공사 막이다. 다공성 막이 중공사 막인 경우, 중공사의 내경은 바람직하게는 200㎛ 이상 5000㎛ 이하이고, 막두께는 바람직하게는 20㎛ 이상 2000㎛ 이하이다. 또한, 유기 섬유 또는 무기 섬유를 통형상으로 한 직물이나 편물을 중공사의 내부에 포함하고 있어도 된다.
또한, 상술의 다공성 막은 예를 들면, WO2007/097260에 기재되는 제조방법에 의해 제조할 수 있다.
또한, 다른 바람직한 형태로서, 본 발명에 있어서의 분리 막은 적어도 세라믹스를 포함하는 막일 수 있다. 본 발명에 있어서의 세라믹스란 금속 산화물을 함유하고, 고온에서의 열처리에 의해 소성 고화된 것을 나타낸다. 금속 산화물로서는 알루미나, 마그네시아, 티타니아, 지르코니아 등을 예시할 수 있다. 분리 막은 금속 산화물뿐만으로 형성되어도 좋고, 실리카나 탄화규소, 실리카와 금속 산화물의 화합물인 뮬라이트나 코젤라이트 등을 포함해도 좋다.
분리 막을 형성하는 세라믹스 이외의 성분은 분리 막으로서의 다공질체를 이룰 수 있는 것이면 특별하게 한정되지 않는다.
분리 막이 세라믹스를 포함하는 경우도 그 형상에는 특별히 제한은 없고, 모놀리스 막, 평막, 통형상 막 등 어느 것이나 사용할 수 있다. 용기내로의 충전 효율의 관점으로부터 주상 구조이고, 길이 방향에 관통 구멍을 갖는 구조의 것이 바람직하다. 충전 효율을 높이는 점으로부터, 바람직하게는 모놀리스막이다.
길이 방향에 관통 구멍을 갖는 것이 바람직한 이유는 이하와 같다. 주상 구조를 갖는 분리 막을 모듈 용기에 수용해서 분리 막 모듈로서 사용하는 경우에는 분리 막은 외압식 및 내압식 중에서 바람직한 형태를 선택하여 모듈화, 여과하는 것이 가능해진다. 본 발명에 있어서는 이 이후, 분리 막이 발효 배양액과 접하는 측을 1차 측, 여과에 의해 화학품을 포함하는 여액이 얻어지는 측을 2차 측이라 각각 부르는 것으로 한다.
내압식 모듈을 사용하면, 1차측의 유로가 좁기 때문에 크로스 플로우 여과를 행하는 경우에 순환 펌프의 출력을 절약할 수 있다. 또한, 분리 막 표면에 퇴적한 탁질을 모듈 밖으로 배출하는 작용이 강해져, 분리 막 표면이 청정하게 유지되기 쉽기 때문에 바람직하다. 단, 이 효과를 얻기 위해서는 내압식의 분리 막이 발효 배양액의 입구 및 출구를 갖고 있는 것이 전제가 된다. 이 때의 입구 및 출구는 일직선으로 배열된 관통 구멍의 상태이면 통액 저항이 적어지기 때문에 바람직하다. 또한, 분리 막이 주상 구조이고, 관통 구멍이 길이 방향으로 비어 있는 것에 의해, 분리 막을 수용한 용기를 가늘게 하는 것이 가능해진다. 분리 막 모듈이 가늘면, 제조나 취급의 관점으로부터 바람직하게 사용할 수 있다.
분리 막의 기공률은 특별하게 한정되지 않지만, 지나치게 낮으면 여과 효율이 나빠지고, 지나치게 높으면 강도가 저하해버린다. 여과 효율과 분리 막의 강도를 양립시켜, 반복 증기 멸균으로의 내성도 갖게 하기 위해서는 20% 이상 60% 이하인 것이 바람직하다.
또한, 기공률은 이하의 식으로부터 결정된다.
기공률[%] = 100 × (습윤 막 중량[g] - 건조 막 중량[g])/물 비중[g/cm3]/(막 체적[cm3]).
분리 막의 평균 기공 직경은 0.01㎛ 이상 1㎛ 이하이면 바람직하고, 이 범위의 평균 기공 직경을 갖는 막이면 분리 막이 폐쇄되기 어렵고, 또한 여과 효율도 우수하다. 또한, 평균 기공 직경이 0.02㎛ 이상 0.2㎛ 이하의 범위이면, 단백질, 다당류 등으로 예시되는 미생물이나 배양 세포에 의한 발효의 부생성물이나, 배양액 중의 미생물/배양 세포가 사멸해서 생기는 세포 파쇄물이라고 하는 분리 막을 폐쇄시키기 쉬운 물질의 폐쇄가 일어나기 어려워지기 때문에 특히 바람직하다.
관통 구멍을 갖는 주상 구조의 분리 막은 외측 표면이 2차 측이 되기 때문에, 여과액을 수집하기 위해서 모듈 용기를 설치하고, 모듈 용기내로 분리 막을 충전한 모듈로서 사용하는 것이 바람직하다. 1개의 모듈에 충전되는 분리 막은 1개 이상이다.
모듈 용기는 반복의 증기 멸균 처리에 견딜 수 있는 원료로 이루어지는 것이 바람직하다. 증기 멸균 처리에 견딜 수 있는 원료로서는 예를 들면 스테인레스강이나 평균 기공률이 낮은 세라믹스 등이 예시된다.
이러한 세라믹 막 모듈은 예를 들면, WO2012/086763에 기재되는 제조방법에 의해 제조할 수 있지만, 시판하는 것을 이용할 수도 있다. 시판의 것으로서 구체적으로 예시하면, MEMBRALOX 정밀 여과 막(Pall), 세라믹 막 필터 세필트 MF 막(NGK INSULATORS, LTD.) 등이 열거된다.
다음에 연속 발효에 관하여 설명한다.
본 발명의 화학품의 제조방법에 있어서는 여과시의 막간 차압은 특별히 제한되지 않고, 발효 배양액을 여과할 수 있으면 된다. 그러나, 배양액을 여과하기 위해서, 유기 고분자 막에 있어서 150kPa 보다 높은 막간 차압으로 여과 처리하면, 유기 고분자 막의 구조가 파괴될 가능성이 높아지고, 화학품을 생산하는 능력이 저하하는 경우가 있다. 또한, 0.1kPa보다 낮은 막간 차압에서는 발효 배양액의 투과 수량이 충분히 얻어지지 않을 경우가 있고, 화학품을 제조할 때의 생산성이 저하하는 경향이 있다. 따라서, 본 발명의 화학품의 제조방법에서는 유기 고분자 막에 있어서는 여과 압력인 막간 차압을 바람직하게는 0.1kPa∼150kPa의 범위로 함으로써, 발효 배양액의 투과수량이 많고, 막의 구조의 파괴에 의한 화학품 제조 능력의 저하도 없기 때문에, 화학품을 생산하는 능력을 높게 유지하는 것이 가능하다. 막간 차압은 유기 고분자 막에 있어서는 바람직하게는 0. 1kPa 이상 50kPa 이하의 범위이고, 더욱 바람직하게는 0. 1kPa 이상 20kPa 이하의 범위이다.
세라믹 막을 사용하는 경우에 있어서도 여과시의 막간 차압은 특별히 제한되는 경우는 없고, 발효 배양액을 여과할 수 있으면 되지만, 500kPa 이하가 바람직하다. 500kPa 이상으로 운전하면, 막의 막힘이 발생하고, 연속 발효 운전에 바람직하지 않을 경우가 발생하는 일이 있다.
여과의 구동력으로서는 발효액과 다공성 막 처리수의 액위차(수두차)를 이용한 사이펀 또는 크로스 플로우 순환 펌프에 의해 분리 막에 막간 차압을 발생시킬 수 있다. 또한, 여과의 구동력으로서 분리 막 2차 측에 흡인 펌프를 설치해도 된다. 또한, 크로스 플로우 순환 펌프를 사용하는 경우에는 흡인 압력에 의해 막간 차압을 제어할 수 있다. 또한, 발효액측의 압력을 도입하는 기체 또는 액체의 압력에 의해서도 막간 차압을 제어할 수 있다. 이들 압력 제어를 행하는 경우에는 발효액측의 압력과 다공성 막 처리수측의 압력차를 취해서 막간 차압으로 하고, 막간 차압의 제어에 사용할 수 있다.
본 발명에서는 분리 막을 투과한 여과액 총량의 5탄당의 농도가 5g/ℓ이하로 유지되는 것이 바람직하다. 6탄당과 5탄당의 혼합당을 포함하는 발효 원료를 사용하고, 카타볼라이트 억제를 받는 미생물을 이용하여 연속 발효를 행하면, 배지가 연속적으로 발효에 이용되기 때문에 배치 발효의 경우보다 카타볼라이트 억제를 연속적으로 받고, 그 결과, 5탄당만이 배양액 중에 대량으로 남아 생산 수율이 저하해버리지만, 본 발명에서는 연속 발효로 분리 막을 사용함으로써 카타볼라이트 억제를 받는 미생물을 이용하여도 여과액 총량의 5탄당 농도를 5g/ℓ 이하로 유지할 수 있고, 그 결과, 분리 막을 사용하지 않는 연속 발효에 비해서 화학품의 생산 수율을 향상할 수 있다. 분리 막으로 얻어진 여과액 총량에 5탄당이 5g/ℓ 이상 남아버리면, 5탄당으로부터의 수율 향상의 효과가 저하해버리는 경우가 있고, 그 결과, 생산 수율도 저하해버리는 경우가 있다. 또한, 여기서 말하는 생산 수율이란 연속 배양에 있어서의 생산 수율이고, 다음 (식 3)으로 계산되고, 어떤 일정 기간내에서 원료 탄소원을 소비해 생성된 화학품량(g)을 그 기간의 투입 탄소원량(g)으로 나누어서 구한다. 이 때, 생산물을 생산하는데 이용되지 않은 당도 투입 탄소 원량 중에 계산된다.
생산 수율(g/g) = 생산 물량(g) ÷ 투입 탄소 원량 (g) … (식 3)
여과액 총량의 5탄당의 농도는 배양 조건에 의해 조절할 수 있다. 예를 들면, 발효 원료 중에 포함되는 당의 농도, 당의 공급 속도나 희석률을 변화시킴으로써 여과액 총량의 5탄당의 농도를 감소시키는 것도 가능하다. 또한, 발효 원료 중에 포함되는 영양원을 증가시킴으로써 미생물의 당의 소비를 향상시켜, 여과액 총량의 5탄당의 농도를 감소시키는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서, 미생물의 발효 배양에 있어서, pH, 온도는 미생물이 생육하는 범위이면 특별하게 한정되지 않지만, pH가 4∼8이고 온도가 20∼75℃의 범위에서 행해지는 것이 바람직하다. 배양액의 pH는 무기 또는 유기 산, 알칼리성 물질, 또는 요소, 탄산 칼슘, 암모니아 가스 등에 의해, 통상 pH4∼8범위내의 미리 정해진 값으로 조절한다. 산소의 공급 속도를 높일 필요가 있으면, 공기에 산소를 가해서 산소 농도를 21% 이상으로 유지하거나 또는 배양액을 가압하거나 교반 속도를 올리거나 환기량을 올리는 등의 수단을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 화학품의 제조방법에서는 배양 초기에 배치 배양 또는 페드 배치 배양을 행해서 미생물 농도를 높게 한 후에, 연속 발효(배양액의 여과)를 개시해도 좋다. 또한, 고농도의 균체를 시드하고, 배양 개시와 아울러 연속 발효를 행해도 된다. 본 발명의 화학품의 제조방법에서는 적당한 시기부터, 배지 공급 및 배양액의 여과를 행하는 것이 가능하다. 배지 공급과 배양액의 여과의 개시 시기는 반드시 같을 필요는 없다. 또한, 배지 공급과 배양액의 여과는 연속적이어도 되고, 간헐적이어도 된다.
원료 배양액에는 균체 증식에 필요한 영양소를 첨가하고, 균체 증식이 연속적으로 행해지도록 하면 된다. 배양액 중의 미생물의 농도는 화학품의 생산성을 높은 상태로 유지하는 것이 효율적인 생산성을 얻는데 바람직하다. 배양액 중의 미생물의 농도는 일례로서, 건조 중량으로서, 5g/L 이상으로 유지함으로써 양호한 생산 효율이 얻어진다.
본 발명의 화학품의 제조방법에서는 연속 발효 도중에 있어서 필요에 따라서, 발효조내로부터 미생물을 포함한 배양액의 일부를 제거한 상에서, 배지로 희석함으로써, 배양조 내의 미생물 농도를 조정해도 좋다. 예를 들면, 발효조내의 미생물 농도가 지나치게 높게 되면, 분리 막의 폐쇄가 발생하기 쉬워지기 때문에 미생물을 포함한 배양액의 일부를 제거하고, 배지로 희석함으로써 폐쇄로부터 회피할 수 있는 경우가 있다. 또한, 발효조내의 미생물 농도에 의해 화학품의 생산 성능이 변화되는 경우가 있고, 생산 성능을 지표로서, 미생물을 포함한 배양액의 일부를 제거해서 배지로 희석함으로써 생산 성능을 유지시키는 경우도 가능하다.
본 발명의 화학품의 제조방법에서는 균체를 증식하면서 생산물을 생성하는 연속 발효 배양법이면, 발효조의 수는 상관없다.
본 발명에서는 종래의 배치 배양과 비교하여 높은 체적 생산 속도가 얻어져서 매우 효율이 좋은 연속 발효 생산이 가능해진다. 여기서, 연속 발효 배양에 있어서의 생산 속도는, 다음 식(4)으로 계산된다.
발효 생산 속도(g/L/hr) = 여과액 중의 생산물 농도(g/L) × 발효 배양액 추출 속도(L/hr) ÷ 장치의 운전 액량(L) … (식 4)
또한, 배치 배양에서의 발효 생산 속도는 원료 탄소원을 모두 소비한 시점의 생산물량(g)을 탄소원의 소비에 요한 시간(hr)과 그 시점의 발효 배양액량(L)으로 나누어서 구한다.
또한, 연속 배양에 있어서의 수율은 다음 식(5)으로 계산되고, 어떤 일정 기간내에서 원료 탄소원을 소비하여 생성된 화학품량(g)을 그 기간의 투입 탄소원량 (g)으로부터 미생물이 이용할 수 없었던 미이용 탄소원량(g)을 뺀 값으로 나누어서 구한다. 본 명세서에서 말하는 수율이란 특별히 언급하지 않는 한 이것을 나타낸다.
수율(g/g) = 생산물량(g) ÷｛투입 탄소원량(g) - 미이용 탄소원량(g)} … (식 5)
본 발명에서 사용되는 연속 발효 장치는 미생물의 발효 배양액을 분리 막으로 여과하고, 여과액으로부터 생산물을 회수함과 아울러 미여과액을 상기의 발효 배양액에 유지 또는 환류하고, 또한 발효 원료를 상기의 발효 배양액에 추가해서 여과액 중의 생산물을 회수하는 연속 발효에 의한 화학품의 제조 장치이면 특별히 제한은 없지만, 구체예를 들면, 유기 고분자 막을 사용할 때는 WO2007/097260에 기재되는 장치를 사용할 수 있다. 또한 세라믹 막을 사용할 때는 WO2012/086763에 기재되는 장치를 사용할 수 있다.
다음에 본 발명의 화학품의 제조방법에 사용될 수 있는 미생물에 관하여 설명한다.
본 발명에서 사용되는 카타볼라이트 억제를 받는 미생물이란 일반적으로 5탄당을 자화하는 미생물을 발효할 때에, 6탄당과 5탄당을 포함하는 혼합당을 포함하는 발효 원료를 사용하면, 5탄당의 소비가 억제되는 미생물을 말하지만, 본 발명에 있어서는 보다 구체적으로 글루코오스와 크실로오스의 자화능을 갖는 미생물을 사용한 배치 배양에 있어서, 크실로오스 단독의 배지에서의 크실로오스의 소비 속도보다 글루코오스와 크실로오스를 포함하는 혼합당의 배지에서의 크실로오스의 소비 속도가 느린 미생물에 대해서 「카타볼라이트 억제를 받는 미생물이다」라고 한다.
여기서, 크실로오스 단독의 배지에서의 크실로오스의 소비 속도란 하기의 (식 6)에 의해 산출된다.
크실로오스의 소비 속도(g/L/hr) = 배양 개시 시의 발효 원료에 포함되는 총크실로오스량(g) ÷ 배양 개시부터 발효 원료에 포함되는 크실로오스를 완전하게 다 소비할 때까지 소요되는 시간(hr) ÷ 발효액량(L) … (식 6).
또한, 글루코오스와 크실로오스를 포함하는 혼합당의 배지에서의 크실로오스의 소비 속도란 글루코오스와 크실로오스를 포함하는 혼합당의 배지에서의 글루코오스 존재 하에서의 크실로오스의 소비 속도이고, 하기의 (식 7)에 의해 산출된다.
크실로오스의 소비 속도(g/L/hr) = 배양 개시시부터 시간 T까지 소비된 크실로오스량(g) ÷ 배양 개시부터 시간 T까지의 시간(hr) ÷ 발효액량(L) … (식 7).
(식 6) 및 (식 7)에 있어서, 크실로오스의 소비 속도를 산출할 때, 혼합당에서의 글루코오스와 크실로오스의 중량 비율은 1:1로 행한다. 또한, 크실로오스의 소비 속도를 비교할 때, 당농도는 미생물이 잔존 당 없이 완전하게 소비할 수 있는 농도이면 특별하게 한정되지 않는다. 또한, 크실로오스 단독의 배지에서의 크실로오스의 당농도와 글루코오스와 크실로오스를 포함하는 혼합당의 배지에서의 총당농도는 동일하게 한다.
또한, (식 7)에 있어서, 시간 T는 글루코오스가 완전하게 소비된 시간이다. 시간 T는 샘플링한 배양액을 HPLC 또는 키트, 센서에 의해 글루코오스 농도를 측정하여 구할 수 있다. 단, 글루코오스가 완전하게 소비된 시간이 크실로오스가 완전하게 소비된 시간보다 느린 경우는 시간 T는 크실로오스가 완전하게 소비된 시간으로 한다. 이 경우에서 있어서도 시간 T는 글루코오스 농도의 측정 방법과 동일하게, 크실로오스 농도를 측정함으로써 구할 수 있다. 또한, 배양 중에 중화제 첨가나 샘플링 등으로 발효액량이 변화된 경우에는 배양액에 추가한 액량 또는 감한 액량을 고려하여 계산을 행하는 것으로 한다.
카타볼라이트 억제를 받는 미생물은 발효 공업에 있어서 잘 사용되는 빵 효모 등의 효모, 대장균, 코리네형 세균 등의 박테리아, 사상균, 방선균 등으로부터 선택되고, 구체예로서, 피키아(Pichia)속, 칸디다(Candida)속, 파치솔렌(Pachysolen)속, 클루이베르마이세스속(Kluyveromyces), 한세눌라속(Hansenula), 토룰로프시스속(Torulopsis), 데바리오마이세스속(Debaryomyces), 잇사첸키아속(Issachenkia), 브렛타노마이세스속(Brettanomyces), 린드네라속(Lindnera), 윗커하모마이세스속(Wickerhamomyces) 등의 효모, 클로스트리듐(Clostridium)속, 엔테로박터(Enterobacter)속, 에세리키아(Escherichia)속, 클레브시엘라(Klebsiella)속 등의 장내 세균류나 락토바실러스(Lactobacillus)속, 락토코커스(Lactococcus)속 등의 락트산균류, 또한 악티노플라네스(Actinoplanes)속, 아스로박터(Arthrobacter)속, 스트렙토마이세스(Streptomyces)속 등의 방선균류나 바실루스(Bacillus)속, 파에니바실루스(Paenibacillus)속, 아에로박터(Aerobacter)속, 암퓰라리엘라(Ampullariella)속, 스타필로코커스(Staphylococcus)속, 써모아나에로박터(Thermoanaerobacter)속, 써무스(Thermus)속에 속하는 미생물로부터 선택될 수 있다.
또한, 카타볼라이트 억제를 받는 미생물은 자연 환경으로부터 단리된 것이어도, 본래 5탄당을 자화하지 않지만 돌연 변이나 유전자 재조합에 의해 5탄당을 자화하도록 개변된 미생물로부터도 선택될 수 있다. 유전자 재조합에 의해 5탄당을 자화하도록 개변된 미생물의 구체예로서는 유전자 재조합에 의해 5탄당의 대사 유전자를 도입 또는 강화된 미생물이 열거된다. 특히, 5탄당 중에서도 크실로오스의 대사 유전자에 대해서는 크실로오스이소메라제, 크실로오스리덕타제, 크실리톨데히드로게나제, 크실로오스키나제 등의 효소가 예시되고, 이러한 유전자 재조합 방법에 의해 크실로오스의 자화성을 부여한 미생물로서는 일본국 특허공표 2006-525029호 공보, 일본국 특허공개 2009-112289호 공보, 일본국 특허공표 2010-504756호 공보 등에 기재된 미생물을 예시할 수 있다.
본 발명에 의해 제조되는 화학품으로서는 상기 미생물이 발효 배양액 중에 생산하는 물질이면 제한은 없고, 알코올, 유기산, 아미노산, 핵산 등 발효 공업에 있어서 대량 생산되고 있는 물질을 열거할 수 있다. 예를 들면, 알코올로서는 에탄올, 1,3-프로판디올, 1,3-부탄디올, 2,3-부탄디올, 1,4-부탄디올, 글리세롤, 부탄올, 이소부탄올, 2-부탄올, 이소프로판올 등, 유기산으로서는 아세트산, 락트산, 아디프산, 피루브산, 숙신산, 말산, 이타콘산, 시트르산, 핵산이면, 이노신, 구아노신 등의 뉴클레오시드, 이노신산, 구아닐산 등의 뉴클레오티드, 또한 카타베린 등의 디아민 화합물을 들 수 있다. 또한, 본 발명은 효소, 항생 물질, 재조합 단백질과 같은 물질의 생산에 적용하는 것도 가능하다. 이들 화학품은 주지의 방법(막 분리, 농축, 증류, 정석, 추출 등)에 의해 여과액으로부터 회수할 수 있다.
(실시예)
이하, 실시예를 들어서 본 발명을 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.
(참고예 1) 글루코오스, 크실로오스, 에탄올, 2,3-부탄디올의 분석 방법
발효액 중의 글루코오스, 크실로오스, 에탄올 및 2,3-부탄디올의 농도는 하기에 나타내는 HPLC조건으로 표품과의 비교에 의해 정량했다.
컬럼 : Shodex SH1011(Showa Denko K.K. 제품)
이동상 : 5mM 황산(유속 0.6mL/분)
반응액 : 없음
검출 방법 : RI(시차 굴절률)
온도 : 65℃
(참고예 2) 락트산의 분석 방법
발효액 중의 락트산을 하기에 나타내는 HPLC조건으로 표품과의 비교에 의해 정량했다.
칼럼 : Shim-Pack SPR-H(SHIMADZU CORPORATION 제품)
이동상 : 5mM p-톨루엔술폰산(유속 0.8mL/min)
반응액 : 5mM p-톨루엔술폰산, 20mM 비스트리스, 0.1mM EDTA·2Na(유속 0.8mL/min)
검출 방법 : 전기전도도
온도 : 45℃
(참고예 3) 바실루스·코아귤란스에서의 크실로오스 소비 속도 산출
락트산 발효 미생물인 바실루스·코아귤란스 NBRC12714주의 락트산 발효시의 크실로오스 소비 속도를 산출했다. 배지로서 표 1에 나타내는 조성의 락트산 발효 크실로오스 배지와 표 2에 나타내는 락트산 발효 혼합당 배지 1를 사용했다. 적당하게, 샘플링을 행하고, 배양액 중의 글루코오스 및 크실로오스의 농도는 참고예 1의 방법에 의해, 생산물인 락트산의 농도는 참고예 2의 방법에 의해 측정했다.
Figure pct00003
Figure pct00004
바실루스·코아귤란스 NBRC12714주를 탄산칼슘과 함께 플라스크에서 50mL 전배양 배지(폴리펩톤 10g/L, 효모 엑기스 2g/L, 황산 마그네슘 7수화물 1g/L)로 24시간 진동 배양했다(전 배양). 전 배양액을 질소 가스로 퍼지한 1L의 락트산 발효 크실로오스 배지, 락트산 발효 혼합당 배지 1에 각각 식균하고, 이하의 조건으로 배치 발효를 행했다.
발효 반응조 용량 : 2(L)
온도 조정 : 50(℃)
반응조 통기량(질소 가스) : 100(mL/분)
반응조 교반 속도 : 200(rpm)
pH 조정 : 5N Ca(OH)2에 의해 pH7로 조정
멸균 : 배양조 및 사용 배지는 모두 121℃, 20min의 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균
락트산 발효 크실로오스 배지와 락트산 발효 혼합당 배지 1에서의 크실로오스 소비 속도를 상술의 (식 6) 및 (식 7)을 따라 산출하고, 표 7에 나타냈다. 이 결과로부터, 바실루스·코아귤란스 NBRC12714주는 카타볼라이트 억제를 받는 미생물이다라고 판단했다.
(참고예 4) 칸디다·트로피칼리스에서의 크실로오스 소비 속도 산출
에탄올 발효 미생물인 칸디다·트로피칼리스 NBRC0199주의 에탄올 발효시의 크실로오스 소비 속도를 산출했다. 배지로서 표 3에 나타내는 조성의 에탄올 발효 크실로오스 배지와 표 4에 나타내는 에탄올 발효 혼합당 배지 1를 사용했다. 적당하게, 샘플링을 행하고, 배양액 중의 글루코오스 및 크실로오스의 농도와 생산물인 에탄올의 농도는 참고예 1의 방법에 의해 측정했다.
Figure pct00005
Figure pct00006
칸디다·트로피칼리스 NBRC0199주를 시험관에서 2mL의 YPD배지로 30℃에서 하룻밤 진동 배양했다(전전 배양). 얻어진 배양액을 신선한 YPD배지 50mL에 식균하고, 500mL 용량의 주름이 형성된 삼각 플라스크에서 하룻밤 진동 배양했다(전 배양). 전 배양액을 2L의 에탄올 발효 크실로오스 배지 및 에탄올 발효 혼합당 배지에 식균하고, 이하의 조건으로 배치 배양을 행했다.
발효 반응조 용량 : 2(L)
온도 조정 : 30(℃)
반응조 통기량 : 100(mL/분)
반응조 교반 속도 : 800(rpm)
pH조정 : 없음
멸균 : 배양조 및 사용 배지는 모두 121℃, 20min의 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균
에탄올 발효 크실로오스 배지와 에탄올 발효 혼합당 배지 1에서의 크실로오스 소비 속도를 상술의 (식 6) 및 (식 7)을 따라 산출하고, 표 7에 나타냈다. 이 결과, 칸디다·트로피칼리스 NBRC0199주는 카타볼라이트 억제를 받는 미생물이다라고 판단했다.
(참고예 5) 파에니바실러스·폴리믹서에서의 크실로오스 소비 속도 산출
2,3-부탄디올 발효 미생물인 파에니바실러스·폴리믹서 ATCC12321주의 2,3-부탄디올 발효시의 크실로오스 소비 속도를 산출했다. 배지로서 표 5에 나타내는 조성의 2,3-부탄디올 발효 크실로오스 배지와 표 6에 나타내는 2,3-부탄디올 발효 혼합당 배지 1를 사용했다. 적당하게, 샘플링을 행하고, 배양액 중의 글루코오스 및 크실로오스의 농도와 생산물인 2,3-부탄디올의 농도는 참고예 1의 방법에 의해 측정했다.
Figure pct00007
Figure pct00008
파에니바실러스·폴리믹서 ATCC12321주를 시험관에서 50mL 전 배양 배지(글루코오스 5g/L, 펩톤 5g/L, 효모 엑기스 3g/L, 맥아 엑기스 3g/L)로 24시간 진동 배양했다(전 배양). 전 배양액을 1L의 2,3-부탄디올 발효 크실로오스 배지와 2,3-부탄디올 발효 혼합당 배지에 각각 식균하고, 이하의 조건으로 배치 배양을 행했다.
발효 반응조 용량 : 2(L)
온도 조정 : 30(℃)
반응조 통기량 : 100(mL/분)
반응조 교반 속도 : 800(rpm)
pH 조정 : 5N NaOH에 의해 pH 6.5로 조정
멸균: 배양조 및 사용 배지는 모두 121℃, 20min의 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균
2,3-부탄디올 발효 크실로오스 배지와 2,3-부탄디올 발효 혼합당 배지 1에서의 크실로오스 소비 속도를 상술의 (식 6) 및 (식 7)을 따라 산출하고, 표 7에 나타냈다. 이 결과, 파에니바실러스·폴리믹서 ATCC12321주는 카타볼라이트 억제를 받는 미생물이다라고 판단했다.
Figure pct00009
(비교예 1) 6탄당(글루코오스)을 발효 원료로 한 바실루스·코아귤란스의 배치 배양에 의한 L-락트산의 제조
L-락트산 발효 미생물로서 바실루스·코아귤란스 NBRC12714주를 사용하고, 배지로서 표 8에 나타내는 조성의 락트산 발효 배지를 사용했다. 바실루스·코아귤란스 NBRC12714주를 탄산칼슘과 함께 플라스크에서 50mL 전 배양 배지(폴리펩톤 10g/L, 효모 엑기스 2g/L, 황산마그네슘 7수화물 1g/L)로 24시간 진동 배양했다(전 배양). 전 배양액을 질소 가스로 퍼지한 1L의 락트산 발효 배지에 식균하고, 참고예 3의 조건으로 96시간의 배치 배양을 행했다(표 11).
Figure pct00010
(비교예 2)혼합당(글루코오스, 크실로오스)을 발효 원료로 한 바실루스·코아귤란스의 배치 배양에 의한 L-락트산의 제조
바실루스·코아귤란스 NBRC12714주를 표 2에 나타내는 락트산 발효 혼합당 배지를 이용하여 비교예 1과 동일한 조건으로 128시간의 배치 배양을 행했다(표 11).
(비교예 3) 혼합당(글루코오스, 크실로오스)을 발효 원료로 한 바실루스·코아귤란스의 연속 배양에 의한 L-락트산의 제조
혼합당(글루코오스, 크실로오스)을 발효 원료로 한 표 2에 나타내는 조성의 락트산 발효 혼합당 배지 1을 사용한 분리 막을 이용하지 않는 연속 배양을 행했다.바실루스·코아귤란스 NBRC12714주를 상기 비교예 1의 전 배양과 같은 조건으로 진동 배양했다(전전 배양). 전전 배양액을, 전 배양액을 질소 가스로 퍼지한 1. 5L의 락트산 발효 혼합당 배지에 식균하고, 발효 반응조를 부속의 교반기에 의해 200rpm으로 교반하고, 발효 반응조를 질소로 채우고, 온도 조정을 행하여 배양액 중의 당이 완전하게 소비될 때까지 배치 배양을 행했다(전 배양). 전 배양 완료 후 즉시, 전 배양 완료 후, 즉시 발효액 추출 펌프를 가동시키고, 또한 배지의 연속 공급을 행하고, 연속 발효 장치의 발효액량을 1.5L가 되도록 미생물을 포함하는 배양액의 인발량의 제어를 행하면서 이하의 조건으로 300시간의 연속 배양을 행하여 락트산을 제조했다(표 11).
발효 반응조 용량 : 2(L)
온도 조정 : 50(℃)
반응조 통기량(질소 가스) : 100(mL/분)
반응조 교반 속도 : 200(rpm)
pH 조정 : 5N Ca(OH)2에 의해 pH 7로 조정
발효액의 추출량 : 3(L/Day)
멸균: 배양조 및 사용 배지는 모두 121℃, 20min의 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균
(실시예 1) 혼합당(글루코오스, 크실로오스)을 발효 원료로 한 바실루스·코아귤란스의 분리 막 이용 연속 배양에 의한 L-락트산의 제조 1
혼합당(글루코오스, 크실로오스)을 발효 원료로 한 표 2에 나타내는 조성의 락트산 발효 혼합당 배지를 사용한 분리 막을 이용한 연속 배양을 행했다. 분리 막 엘러먼트로서는 중공사의 형태를 채용했다. 바실루스·코아귤란스 NBRC12714주를 상기 비교예 1 전배양과 같은 조건으로 진동 배양했다(전전 배양). 전전 배양액을, 전 배양액을 질소 가스로 퍼지한 1.5L의 락트산 발효 혼합당 배지에 식균하고, 발효 반응조를 부속의 교반기에 의해 200rpm으로 교반하고, 발효 반응조를 질소로 채우고, 온도 조정을 행하고, 배양액 중의 당이 완전하게 소비될 때까지 배치 배양을 행했다(전 배양). 전 배양 완료 후, 즉시 발효액 순환 펌프를 가동시키고, 또한 배지의 연속 공급을 행하고, 연속 발효 장치의 발효액량을 1.5L가 되도록 배양액의 여과량의 제어를 행하면서 이하의 조건으로 290시간의 연속 배양을 행하여 락트산을 제조했다(표 11).
발효 반응조 용량 : 2(L)
사용 분리 막 : 폴리불화비닐리덴 여과 막
막 분리 엘러먼트 유효 여과 면적 : 473(cm2)
온도 조정 : 50(℃)
발효 반응조 통기량(질소 가스) : 100(mL/분)
발효 반응조 교반 속도 : 200(rpm)
발효액의 추출량 : 3(L/Day)
멸균 : 분리 막 엘러먼트를 포함하는 배양조 및 사용 배지는 모두 121℃, 20min의 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균
또한, 사용한 막은 이하의 성질을 가지는 막이고, 여과시의 막간 차압은 0.1∼20kPa의 사이를 추이시켰다.
평균 세공 직경 : 0.1㎛
평균 세공 직경의 표준 편차 : 0.035㎛
막 표면 조도 : 0.06㎛
순수 투과 계수 : 50×10-9m3/m2/s/pa.
(실시예 2) 혼합당(글루코오스, 크실로오스)을 발효 원료로 한 바실루스·코아귤란스의 분리 막 이용 연속 배양 2
표 9에 나타내는 락트산 발효 혼합당 배지 2를 사용하고, 실시예 1과 같은 조건으로 305시간의 분리 막 이용 연속 배양을 행하여 L-락트산을 제조했다(표 11).
Figure pct00011
(실시예 3) 혼합당(글루코오스, 크실로오스)을 발효 원료로 한 바실루스·코아귤란스의 분리 막 이용 연속 배양 3
표 10에 나타내는 락트산 발효 혼합당 배지 3을 사용하고, 실시예 1과 같은 조건으로 300시간의 분리 막 이용 연속 배양을 행하여 L-락트산을 제조했다(표 11).
Figure pct00012
Figure pct00013
(비교예 4) 6탄당(글루코오스)을 발효 원료로 한 칸디다·트로피칼리스의 배치 배양에 의한 에탄올의 제조
에탄올 발효 미생물로서 칸디다·트로피칼리스 NBRC0199주를 사용하고, 배지로서 표 12에 나타내는 조성의 에탄올 발효 배지를 사용했다. 칸디다·트로피칼리스 NBRC0199주를 시험관에서 2mL의 YPD배지로 30℃에서 하룻밤 진동 배양했다(전전 배양). 얻어진 배양액을 신선한 YPD배지 50mL에 식균하고, 500mL 용량의 주름이 형성된 삼각 플라스크에서 하룻밤 진동 배양했다(전 배양). 전 배양액을 1.5L의 에탄올 발효 배지에 식균하고, 이하의 조건으로 16시간의 배치 배양을 행하여 에탄올을 제조했다(표 14).
발효 반응조 용량 : 2(L)
온도 조정 : 30(℃)
반응조 통기량 : 100(mL/분)
반응조 교반 속도 : 800(rpm)
pH 조정 : 없음
멸균 : 배양조 및 사용 배지는 모두 121℃, 20min의 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균
Figure pct00014
(비교예 5) 혼합당(글루코오스, 크실로오스)을 발효 원료로 한 칸디다·트로피칼리스의 배치 배양에 의한 에탄올의 제조
표 13에 나타내는 에탄올 발효 혼합당 배지 2를 사용하고, 비교예 4와 같은 조건으로 23시간의 배치 배양을 행하여 에탄올을 제조했다(표 14).
Figure pct00015
(비교예 6) 혼합당을 발효 원료로 한 칸디다·트로피칼리스의 연속 배양에 의한 에탄올의 제조
배지로서 표 13에 나타내는 에탄올 발효 혼합당 배지 2를 사용한 분리 막을 이용하지 않는 연속 발효를 행했다. 칸디다·트로피칼리스 NBRC0199주를 시험관에서 2mL의 YPD배지로 30℃에서 하룻밤 진동 배양했다(전전전 배양). 얻어진 배양액을 신선한 YPD배지 50mL에 식균하고, 500mL 용량의 주름이 형성된 삼각 플라스크에서 하룻밤 진동 배양했다(전전 배양). 1.5L의 에탄올 발효 혼합당 배지 2가 있는 연속 발효 장치에 전전 배양액을 식균하고, 발효 반응조를 부속의 교반기에 의해 800rpm으로 교반하고, 발효 반응조의 환기량의 조정, 온도 조정을 행하여 16시간 배양을 행했다(전 배양). 전 배양 완료 후, 즉시 발효액 추출 펌프를 가동시키고, 또한 배지의 연속 공급을 행하고, 연속 발효 장치의 발효액량을 1.5L가 되도록 미생물을 포함하는 배양액의 인발량의 제어를 행하면서 이하의 조건으로 295시간의 연속 배양을 행하여 에탄올을 제조했다(표 14).
발효 반응조 용량 : 2(L)
온도 조정 : 30(℃)
발효 반응조 통기량 : 100(mL/분)
발효 반응조 교반 속도 : 800(rpm)
pH 조정 : 없음
발효액의 추출량 : 1(L/Day)
멸균 : 배양조 및 사용 배지는 모두 121℃, 20min의 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균
(실시예 4) 혼합당(글루코오스, 크실로오스)을 발효 원료로 한 칸디다·트로피칼리스의 분리 막을 이용한 연속 배양에 의한 에탄올의 제조
배지로서 표 13에 나타내는 조성의 에탄올 발효 혼합당 배지 2를 사용한 분리 막을 이용한 연속 발효를 행했다. 분리 막 엘러먼트로서는 평막의 형태를 채용했다. 칸디다·트로피칼리스 NBRC0199주를 시험관에서 2mL의 YPD배지로 30℃에서 하룻밤 진동 배양했다(전전전 배양). 얻어진 배양액을 신선한 YPD배지 50mL에 식균하고, 500mL 용량의 주름이 형성된 삼각 플라스크에서 하룻밤 진동 배양했다(전전 배양). 전전 배양액을 연속 발효 장치의 1.5L의 에탄올 발효 혼합당 배지 2에 식균하고, 발효 반응조를 부속의 교반기에 의해 800rpm으로 교반하고, 발효 반응조의 통기량의 조정, 온도 조정을 행하여 36시간 배양을 행했다(전 배양). 전 배양 완료 후, 즉시 발효액 순환 펌프를 가동시키고, 또한 배지의 연속 공급을 행하고, 연속 발효 장치의 발효액량을 1.5L가 되도록 배양액의 여과량의 제어를 행하면서 이하의 조건으로 300시간의 연속 배양을 행하여 에탄올을 제조했다(표 14).
발효 반응조 용량 : 2(L)
사용 분리 막 : 폴리 불화 비닐리덴 여과 막
막 분리 엘러먼트 유효 여과 면적 : 120(cm2)
온도 조정 : 30(℃)
발효 반응조 통기량 : 100(mL/분)
발효 반응조 교반 속도 : 800(rpm)
pH 조정 : 없음
발효액의 추출량 : 1(L/Day)
멸균 : 분리 막 엘러먼트를 포함하는 배양조 및 사용 배지는 모두 121℃, 20min의 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균
또한, 사용한 막은 실시예 1과 같은 성질의 막을 사용하고, 여과시의 막간 차압은 0.1∼19.8kPa의 사이를 추이시켰다.
Figure pct00016
(비교예 7) 6탄당(글루코오스)을 발효 원료로 한 파에니바실러스·폴리믹서의 배치 배양에 의한 2,3-부탄디올의 제조
2,3-부탄디올 미생물인 파에니바실러스·폴리믹서 ATCC12321주를 사용하고, 배지로서 표 15에 나타내는 조성의 2,3-부탄디올 발효 배지를 사용했다.
Figure pct00017
파에니바실러스·폴리믹서 ATCC12321주를 시험관에서 50mL 전 배양 배지(글루코오스 5g/L, 펩톤 5g/L, 효모 엑기스 3g/L, 맥아 엑기스 3g/L)로 24시간 진동 배양했다(전 배양). 전 배양액을 1L의 2,3-부탄디올 발효 배지에 식균하고, 이하의 조건으로 27시간의 배치 배양을 행하여 2,3-부탄디올을 제조했다(표 17).
발효 반응조 용량 : 2(L)
온도 조정 : 30(℃)
반응조 통기량 : 100(mL/분)
반응조 교반 속도 : 800(rpm)
pH 조정 : 5N NaOH에 의해 pH 6.5로 조정
멸균 : 배양조 및 사용 배지는 모두 121℃, 20min의 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균
(비교예 8) 혼합당(글루코오스, 크실로오스)을 발효 원료로 한 파에니바실러스·폴리믹서의 배치 배양에 의한 2,3-부탄디올의 제조
표 16에 나타내는 혼합당 2,3-부탄디올 발효 배지 2를 사용하고, 비교예 7과 같은 조건으로 50시간의 배치 배양을 행하여 2,3-부탄디올을 제조했다(표 17).
Figure pct00018
(비교예 9) 혼합당(글루코오스, 크실로오스)을 발효 원료로 한 파에니바실러스·폴리믹서의 연속 배양에 의한 2,3-부탄디올의 제조
혼합당(글루코오스, 크실로오스)을 발효 원료로 한 분리 막을 이용하지 않는 연속 배양을 행했다. 파에니바실러스·폴리믹서 ATCC12321주를 상기 비교예 7의 전 배양과 동일한 조건으로 진동 배양했다(전전 배양). 전전 배양액을 1.2L의 표 17에 나타내는 혼합당 2,3-부탄디올 발효 배지 2에 식균하고, 발효 반응조를 부속의 교반기에 의해 200rpm으로 교반하고, 온도 조정을 행하여 배양액 중의 당이 완전하게 소비될 때까지 배치 배양을 행했다(전 배양). 전 배양 완료 후 즉시, 전 배양 완료후, 즉시 발효액 추출 펌프를 가동시키고, 또한 배지의 연속 공급을 행하고 연속 발효 장치의 발효액량을 1.2L가 되도록 미생물을 포함하는 배양액의 인발량의 제어를 행하면서 이하의 조건으로 280시간의 연속 배양을 행하여 2,3-부탄디올을 제조했다(표 17).
발효 반응조 용량 : 2(L)
온도 조정 : 30(℃)
반응조 통기량 : 100(mL/분)
반응조 교반 속도 : 800(rpm)
pH 조정 : 5N NaOH에 의해 pH 6.5로 조정
발효액의 추출량 : 0.6(L/Day)
멸균 : 배양조 및 사용 배지는 모두 121℃, 20min의 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균
(실시예 5) 혼합당(글루코오스, 크실로오스)을 발효 원료로 한 파에니바실러스·폴리믹서의 분리 막을 이용한 연속 배양에 의한 2,3-부탄디올의 제조
혼합당(글루코오스, 크실로오스)을 발효 원료로 한 분리 막을 이용한 연속 배양을 행했다. 분리 막 엘러먼트로서는 평막의 형태를 채용했다. 파에니바실러스·폴리믹서 ATCC12321주를 상기 비교예 7의 전 배양과 동일한 조건으로 진동 배양했다(전전 배양). 전전 배양액을, 전 배양액을 1.2L의 혼합당 2,3-부탄디올 발효 배지 2에 식균하고, 발효 반응조를 부속의 교반기에 의해 200rpm으로 교반하고, 온도 조정을 행하여 배양액 중의 당이 완전하게 소비될 때까지 배치 배양을 행했다(전 배양). 전 배양 완료 후, 즉시 발효액 순환 펌프를 가동시키고, 또한 배지의 연속 공급을 행하고, 연속 발효 장치의 발효액량을 1.2L가 되도록 배양액의 여과량의 제어를 행하면서 이하의 조건으로 310시간의 연속 배양을 행하여 2,3-부탄디올을 제조했다(표 17).
발효 반응조 용량 : 2(L)
사용 분리 막 : 폴리불화비닐리덴 여과 막
막 분리 엘러먼트 유효 여과 면적 : 120(cm2)
온도 조정 : 30(℃)
발효 반응조 통기량 : 100(mL/분)
발효 반응조 교반 속도 : 800(rpm)
발효액의 추출량 : 0.6L/Day
멸균 : 분리 막 엘러먼트를 포함하는 배양조 및 사용 배지는 모두 121℃, 20min의 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균
또한, 사용한 막은 실시예 1과 같은 성질의 막을 사용하고, 여과시의 막간 차압은 0.1∼20kPa의 사이를 추이시켰다.
Figure pct00019
(참고예 6) 피키아·스티피티스에서의 크실로오스 소비 속도 산출
참고예 4와 같은 조건으로 배치 배양을 행하고, 배지로서 표 3에 나타내는 조성의 에탄올 발효 크실로오스 배지와 표 4에 나타내는 에탄올 발효 혼합당 배지 1를 사용하고, 에탄올 발효 미생물인 피키아·스티피티스 NBRC1687주의 에탄올 발효시의 크실로오스 소비 속도를 산출했다.
에탄올 발효 크실로오스 배지와 에탄올 발효 혼합당 배지 1에서의 크실로오스 소비 속도를 상술의 (식 6) 및 (식 7)을 따라 산출하고, 표 22에 나타냈다. 이 결과, 피키아·스티피티스 NBRC1687주는 카타볼라이트 억제를 받는 미생물이다라고 판단했다.
(참고예 7) 칸디다·유틸리스에서의 크실로오스 소비 속도 산출
미생물로서, WO2010/140602에 개시된 방법에 의해 제작한 칸디다·유틸리스 CuLpLDH주를 사용했다. 배지로서 표 18에 나타내는 조성의 D-락트산 발효 크실로오스 배지와 표 19에 나타내는 D-락트산 발효 혼합당 배지 1을 사용했다. pH를 1N 수산화칼슘으로 pH 6.0으로 조정하는 것 이외는, 비교예 1과 동일한 조건으로 40시간 배치 배양을 행하여 D-락트산 발효시의 크실로오스 소비 속도를 산출했다.
D-락트산 발효 크실로오스 배지와 D-락트산 발효 혼합당 배지 1에서의 크실로오스 소비 속도를 상술의 (식 6) 및 (식 7)을 따라 산출하고, 표 22에 나타냈다. 이 결과, 칸디다·유틸리스 CuLpLDH주는 카타볼라이트 억제를 받는 미생물이다라고 판단했다.
Figure pct00020
Figure pct00021
(참고예 8) 에셔리키어·콜라이 KO11주에서의 크실로오스 소비 속도 산출
에탄올 발효 미생물인 에셔리키어·콜라이 KO11주의 에탄올 발효시의 크실로오스 소비 속도를 산출했다. 배지로서 표 20에 나타내는 조성의 에탄올 발효 크실로오스 배지 2와 표 21에 나타내는 에탄올 발효 혼합당 배지 3을 사용했다. 적당하게, 샘플링을 행하여 배양액 중의 글루코오스 및 크실로오스의 농도와 생산물인 에탄올의 농도는 참고예 1의 방법에 의해 측정했다.
Figure pct00022
Figure pct00023
에셔리키어·콜라이 KO11주를 시험관에서 2mL 전 배양 배지(글루코오스 20g/L 효모 엑기스 10g/L, 트립톤 5g/L, NaCl 5g/L)로 30℃에서 하룻밤 배양했다(전전 배양). 얻어진 배양액을 500mL 용량의 주름이 형성된 삼각 플라스크에 넣은 50mL의 전 배양 배지에 식균하고, 하룻밤 배양했다(전 배양). 전 배양액을 1.5L의 에탄올 발효 크실로오스 배지 2와 에탄올 발효 혼합당 배지 3에 각각 식균하고, 온도 조정 및 pH 조정을 행하면서 이하에 나타내는 운전 조건으로 16시간 배치 발효를 행했다.
배양조 용량 : 2(L)
온도 조정 : 30(℃)
발효 반응조 통기량 : 100(mL/분)
발효 반응조 교반 속도 : 800(rpm)
pH 조정 : 5N Ca(OH)2에 의해 pH6으로 조정
멸균 : 발효조 및 사용 배지는 모두 121℃, 20min의 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균
에탄올 발효 크실로오스 배지 2와 에탄올 발효 혼합당 배지 3에서의 크실로오스 소비 속도를 상술의 (식 6) 및 (식 7)을 따라 산출하고, 표 22에 나타냈다. 이 결과, 에셔리키어·콜라이 KO11주는 카타볼라이트 억제를 받는 미생물이다라고 판단했다.
Figure pct00024
(비교예 10) 6탄당을 발효 원료로 한 피키아·스티피티스의 배치 배양에 의한 에탄올의 제조
미생물로서, 피키아·스티피티스 NBRC1687주를 사용하고, 비교예 4와 같은 조건으로 23시간 배치 배양을 행하여 에탄올을 제조했다.(표 23)
(비교예 11) 혼합당을 발효 원료로 한 피키아·스티피티스의 배치 배양에 의한 에탄올의 제조
미생물로서, 피키아·스티피티스 NBRC1687주를 사용하고, 비교예 5와 같은 조건으로 40시간 배치 배양을 행하여 에탄올을 제조했다(표 23).
(비교예 12) 혼합당을 발효 원료로 한 피키아·스티피티스의 연속 발효에 의한 에탄올의 제조
미생물로서, 피키아·스티피티스 NBRC1687주를 사용하고, 혼합당 원료로 분리 막을 이용하지 않는 연속 발효를 행했다. 전 배양 시간을 40시간으로 하는 것 이외는 비교예 6과 같은 조건으로 행하여 298시간의 연속 발효에 의해 에탄올을 제조했다(표 23).
(실시예 6) 혼합당을 발효 원료로 한 피키아·스티피티스의 분리 막을 이용한 연속 발효에 의한 에탄올의 제조 1
미생물로서, 피키아·스티피티스 NBRC1687주를 사용하고, 분리 막을 이용한 연속 발효를 행했다. 전 배양을 48시간으로 하고 막간 차압을 0.1∼19.8kPa로 한 것 이외는 실시예 4와 동일한 조건으로 행하여 305시간의 연속 발효에 의해 에탄올을 제조했다.
Figure pct00025
(비교예 13) 6탄당을 발효 원료로 한 칸디다·유틸리스의 배치 배양에 의한 D-락트산의 제조
미생물로서, WO2010/140602에 개시된 방법에 의해 제작한 칸디다·유틸리스 CuLpLDH주를 사용했다. pH를 1N 수산화칼슘으로 pH 6.0으로 조정하고, 배지는 표 24에 나타내는 D-락트산 발효 혼합당 배지 2를 사용하는 것 이외는, 비교예 4와 같은 조건으로 23시간 배치 배양을 행하여 D-락트산을 제조했다(표 25).
Figure pct00026
(비교예 14) 혼합당을 발효 원료로 한 칸디다·유틸리스의 배치 배양에 의한 D-락트산의 제조
미생물로서 칸디다·유틸리스 CuLpLDH주를 사용하고, pH를 1N 수산화칼슘으로 pH 6.0으로 조정하고, 배지는 표 24에 나타내는 D-락트산 발효 혼합당 배지 2를 사용하는 것 이외는, 비교예 5와 같은 조건으로 40시간 배치 배양을 행하여 D-락트산을 제조했다(표 25).
(비교예 15) 혼합당을 발효 원료로 한 칸디다·유틸리스의 연속 발효에 의한 D-락트산의 제조
미생물로서 칸디다·유틸리스 CuLpLDH주를 사용하고, 분리 막을 이용하지 않는 연속 발효를 행했다. 전 배양을 40시간으로 하고, pH를 1N 수산화칼슘으로 pH 6.0으로 조정하고, 배지는 표 24에 나타내는 D-락트산 발효 혼합당 배지 2를 사용하는 것 이외는 비교예 6과 같은 조건으로 행하여 290시간의 연속 발효에 의해 D- 락트산을 제조했다(표 25).
(실시예 7) 혼합당을 발효 원료로 한 칸디다·유틸리스의 분리 막을 이용한 연속 발효에 의한 D-락트산의 제조 1
미생물로서 칸디다·유틸리스 CuLpLDH주를 사용하고, 분리 막을 이용한 연속 발효를 행했다. 전 배양을 50시간으로 하고 pH를 1N 수산화칼슘으로 pH 6.0으로 조정하고, 배지는 표 24에 나타내는 D-락트산 발효 혼합당 배지 2를 사용하는 것 이외는 실시예 4와 동일한 조건으로 행하여 310시간의 연속 발효에 의해 D-락트산을 제조했다.
Figure pct00027
(비교예 16) 6탄당을 발효 원료로 한 에셔리키어·콜라이의 배치 발효에 의한 에탄올의 제조
에셔리키어·콜라이 KO11주를 시험관에서 2mL 전배양 배지(글루코오스 20g/L효모 엑기스 10g/L, 트립톤 5g/L, NaCl 5g/L)로 30℃에서 하룻밤 배양했다(전전 배양). 얻어진 배양액을 500mL 용량의 주름이 형성된 삼각 플라스크에 있는 50mL 전 배양 배지에 식균하고, 하룻밤 배양했다(전 배양). 전 배양액을 표 26에 나타내는 조성의 1L의 에탄올 발효 배지 2에 식균하고, 온도 조정 및 pH 조정을 행하면서 이하에 나타내는 운전 조건으로 16시간 배치 발효를 행하여 에탄올을 제조했다(표 28).
배양조 용량 : 2(L)
온도 조정 : 30(℃)
Kla : 30(h-1)
pH 조정 : 5N Ca(OH)2에 의해 pH6으로 조정
멸균 : 발효조 및 사용 배지는 모두 121℃, 20min의 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균
Figure pct00028
(비교예 17) 혼합당을 발효 원료로 한 에셔리키어·콜라이의 배치 발효에 의한 에탄올의 제조
발효 배지로서 표 27에 나타내는 조성의 에탄올 발효 혼합당 배지 4를 사용하고, 비교예 16과 같은 조건으로 24시간 배치 발효를 행하여 에탄올을 제조했다(표 28).
Figure pct00029
(비교예 3) 혼합당을 발효 원료로 한 에셔리키어·콜라이의 연속 발효에 의한 에탄올의 제조
혼합당을 발효 원료로 한 분리 막을 이용하지 않는 연속 발효를 행했다. 에셔리키어·콜라이 KO11주를 시험관에서 2mL 전 배양 배지(글루코오스 20g/L, 효모 엑기스 10g/L, 트립톤 5g/L, NaCl 5g/L)로 30℃에서 하룻밤 배양했다(전전전 배양). 얻어진 배양액을 500mL 용량의 주름이 형성된 삼각 플라스크에 있는 50mL 전 배양 배지에 식균하고, 하룻밤 배양했다 (전전 배양). 전전 배양액을 표 27에 나타내는 조성의 에탄올 발효 혼합당 배지 4가 있는 연속 배양 장치(WO2007/097260의 도 2에 나타내는 장치에서 분리 막 엘러먼트를 제외한 것)에 식균하고, 온도 조정 및 pH 조정을 행하면서 이하에 나타내는 운전 조건으로 24시간 배치 발효를 행했다(전 배양). 전 배양 완료 후, 즉시 연속 배양을 개시하여 에탄올의 제조를 행했다. 표 27에 나타내는 조성의 에탄올 발효 혼합당 배지 3의 공급과 미생물을 포함하는 배양액의 인발에는 페리스타·바이오 미니 펌프 AC-2120형(ATTO사 제품)을 이용하여 배양조내에 직접 배지 공급을 행하고, 배양조내에서 직접 미생물을 포함하는 배양액의 인발을 행했다. 미생물을 포함하는 배양액의 인발 속도를 일정하게 하고, 배양조내의 배양액량을 1.5L가 되도록 배지 공급 속도를 제어하면서 290시간 에탄올 제조를 행했다(표 28).
배양조 용량 : 2(L)
온도 조정 : 30(℃)
Kla : 30(h-1)
pH 조정 : 5N Ca(OH)2에 의해 pH 6으로 조정
발효액의 추출 속도 : 2L/day
멸균 : 발효조 및 사용 배지는 모두 121℃, 20min의 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균
(실시예 8) 혼합당을 발효 원료로 한 에셔리키어·콜라이의 분리 막 이용 연속 발효에 의한 에탄올의 제조
혼합당을 발효 원료로 한 분리 막을 이용한 연속 발효를 행했다. 에셔리키어·콜라이 KO11주를 시험관에서 2mL 전배양 배지(글루코오스 20g/L, 효모 엑기스 10g/L, 트립톤 5g/L, NaCl 5g/L)로 30℃에서 하룻밤 배양했다(전전전 배양). 얻어진 배양액을 500mL 용량의 주름이 형성된 삼각 플라스크에 있는 50mL 전 배양 배지에 식균하고, 하룻밤 배양했다(전전 배양). 전전 배양액을 표 27에 나타내는 조성의 에탄올 발효 혼합당 배지 4가 있는 막일체형의 이하의 조건을 구비한 연속 발효 장치(WO2007/097260의 도 2에 나타내는 장치)에 식균하고, 온도 조정 및 pH 조정을 행하면서 이하에 나타내는 운전 조건으로 24시간 배치 발효를 행했다(전 배양). 전 배양 완료 후, 즉시 연속 배양을 개시하여 에탄올의 제조를 행했다. 표 27에 나타내는 조성의 에탄올 발효 혼합당 배지 3의 공급과 배양액의 여과에는 페리스타·바이오 미니 펌프 AC-2120형(ATTO사 제품)을 사용했다. 배지 공급은 배양조내에 직접 행하고 배양액의 여과는 분리 막을 고정한 엘러먼트를 통하여 행했다. 배양액의 여과 속도를 일정하게 하고, 배양조내의 배양액량을 1.5L가 되도록 배지 공급 속도를 제어하면서, 여과시의 막간 차압은 0.1∼19.8kPa의 범위를 추이시킴으로써 310시간의 연속 발효에 의해 에탄올을 제조했다(표 28).
발효조 용량 : 2(L)
사용 분리 막: 폴리불화비닐리덴 여과 막
막 분리 엘러먼트 유효 여과 면적 : 473cm2
분리 막의 순수 투과 계수 : 50×10-9m3/m2/s/Pa
분리 막의 평균 세공 직경 : 0.1㎛
평균 세공 직경의 표준 편차 : ±0.035㎛
분리 막의 표면 조도 : 0.06㎛
온도 조정 : 30(℃)
pH 조정 : 5N Ca(OH)2에 의해 pH 6으로 조정
발효액의 추출 속도 : 2L/day
멸균 : 분리 막 엘러먼트를 포함하는 발효조 및 사용 배지는 모두 121℃, 20min의 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균
Figure pct00030
(비교예 19) 바이오매스 유래의 당액(글루코오스, 크실로오스)을 발효 원료로 한 바실루스·코아귤란스의 배치 배양에 의한 L-락트산의 제조
발효 원료로서, 바이오매스 유래의 당액을 사용했다. 락트산 발효 당액 배지는 WO2010/067785의 실시예 2에 기재된 나노 여과 막에 의한 조제 방법으로 조제한 셀룰로오스 당화액을 사용하고, 적당하게 시약에 의해 표 29에 나타내는 바와 같이 조제했다. 사용한 배지와 중화제를 4N KOH로 하는 것 이외는, 비교예 2와 같은 조건으로 70시간 배치 배양을 행하여 L-락트산을 제조했다(표 30).
Figure pct00031
(비교예 20) 바이오매스 유래의 당액(글루코오스, 크실로오스)을 발효 원료로 한 바실루스·코아귤란스의 연속 배양에 의한 L-락트산의 제조
발효 원료로서, 바이오매스 유래의 당액을 사용했다. 락트산 발효 당액 배지는 비교예 19와 동일하게 표 29 기재의 배지를 사용했다. 사용한 배지와 중화제를 4N KOH로 하는 것 이외는, 비교예 3과 같은 조건으로 250시간의 연속 배양을 행하여 락트산을 제조했다(표 30).
(실시예 9) 바이오매스 유래의 당액(글루코오스, 크실로오스)을 발효 원료로 한 바실루스·코아귤란스의 분리 막 이용 연속 배양에 의한 L-락트산의 제조
발효 원료로서, 바이오매스 유래의 당액을 사용했다. 락트산 발효 당액 배지는 비교예 19와 마찬가지로 표 29 기재의 배지를 사용했다. 사용한 배지와 중화제를 4N KOH로 하는 것 이외는, 실시예 1와 동일한 조건으로 260시간의 분리 막 이용 연속 배양을 행하여 락트산을 제조했다.
Figure pct00032
(비교예 21) 바이오매스 유래의 당액(글루코오스, 크실로오스)을 발효 원료로 한 에셔리키어·콜라이의 배치 배양에 의한 에탄올의 제조
발효 원료로서, 바이오매스 유래의 당액을 사용했다. 에탄올 발효 당액 배지는 WO2010/067785의 실시예 2에 기재된 나노 여과 막에 의한 조제 방법으로 조제한 셀룰로오스 당화액을 사용하고, 적당하게 시약에 의해 표 31에 나타내는 바와 같이 조제했다. 사용한 배지 이외는, 비교예 17과 동일한 조건으로 23시간 배치 배양을 행하여 에탄올을 제조했다(표 32).
Figure pct00033
(비교예 22) 바이오매스 유래의 당액(글루코오스, 크실로오스)을 발효 원료로 한 에셔리키어·콜라이의 연속 배양에 의한 에탄올의 제조
에탄올 발효 당액 배지는 비교예 21과 마찬가지로 표 31 기재의 배지를 사용하고, 비교예 18과 같은 조건으로 285시간의 연속 배양을 행하여 에탄올을 제조했다(표 32).
(실시예 10) 바이오매스 유래의 당액(글루코오스, 크실로오스)을 발효 원료로 한 에셔리키어·콜라이의 분리 막 이용 연속 배양에 의한 에탄올의 제조
표 27에 나타내는 에탄올 발효 당액 배지를 사용하고, 실시예 8과 같은 조건으로 295시간의 분리 막 이용 연속 배양을 행하여 에탄올을 제조했다.
Figure pct00034
(비교예 23) 혼합당(글루코오스, 크실로오스)을 발효 원료로 한 칸디다·트로피칼리스의 배치 배양에 의한 에탄올의 제조 2
표 33에 나타내는 에탄올 발효 혼합당 배지 5를 사용하고, 비교예 4와 같은 조건으로 45시간의 배치 배양을 행하여 에탄올을 제조했다(표 34).
Figure pct00035
(비교예 24) 혼합당을 발효 원료로 한 칸디다·트로피칼리스의 연속 배양에 의한 에탄올의 제조
표 33에 나타내는 에탄올 발효 혼합당 배지 5를 사용하고, 비교예 6과 같은 조건으로 350시간의 연속 배양을 행하여 에탄올을 제조했다(표 34).
(실시예 11) 혼합당(글루코오스, 크실로오스)을 발효 원료로 한 칸디다·트로피칼리스의 분리 막을 이용한 연속 배양에 의한 에탄올의 제조 2
표 33에 나타내는 에탄올 발효 혼합당 배지 5를 사용하고, 실시예 4와 같은 조건으로 360시간의 연속 배양을 행하여 에탄올을 제조했다(표 34).
(실시예 12) 혼합당을 발효 원료로 한 칸디다·트로피칼리스의 세라믹제 분리 막을 이용한 연속 발효에 의한 에탄올의 제조 3
칸디다·트로피칼리스 NBRC0199주를 사용하고, 세라믹제 분리 막을 이용한 연속 발효를 행했다. 발효 배지는 표 33에 나타내는 배지를 사용했다. 칸디다·트로피칼리스 NBRC0199주를 시험관에서 2mL의 YPD배지로 30℃에서 하룻밤 진동 배양했다(전전전 배양). 얻어진 배양액을 YPD배지 50mL가 있는 500mL 용량의 주름이 형성된 삼각 플라스크에 식균하고, 하룻밤 진동 배양했다(전전 배양). 전전 배양액을 1.5L의 YPDX 배지가 있는 막 분리형의 연속 발효 장치(WO2012/086763의 도 12에 나타내는 장치)에 식균하고, 배양조를 부속의 교반기에 의해 800rpm으로 교반하고, 배양조의 통기 속도의 조정, 온도 조정을 행하여 36시간 배양을 행했다(전 배양). 전 배양 완료 후, 즉시 연속 발효를 개시했다. 여과시의 막간 차압은 500kPa 이하가 되도록 조정하면서, 400시간의 연속 발효에 의해 에탄올을 제조했다(표 34).
배양조 용량 : 2L
사용 분리 막: Celfit 정밀 여과 막 모놀리스 φ4-19(NGK INSULATORS, LTD. 제품)
막 분리 엘러먼트 길이 : 500mm
분리 막의 평균 세공 직경 : 0.1㎛
온도 조정 : 30℃
발효 반응조 통기량 : 100(mL/분)
발효 반응조 교반 속도 : 800(rpm)
pH 조정 : 없음
Figure pct00036
(실시예 13) 혼합당(글루코오스, 크실로오스)을 발효 원료로 한 파에니바실러스·폴리믹서 세라믹제 분리 막을 이용한 연속 배양에 의한 2,3-부탄디올의 제조 2
파에니바실러스·폴리믹서 ATCC12321주를 사용하고, 세라믹제 분리 막을 이용한 연속 발효를 행했다. 파에니바실러스·폴리믹서 ATCC12321주를 시험관에서 2mL 전 배양 배지(글루코오스 5g/L, 펩톤 5g/L, 효모 엑기스 3g/L, 맥아 엑기스 3g/L)로 30℃에서 하룻밤 배양했다(전전전 배양). 얻어진 배양액을 500mL 용량의 주름이 형성된 삼각 플라스크에 있는 50mL 전 배양 배지에 식균하고, 하룻밤 배양했다(전전 배양). 전전 배양액을 표 16에 나타내는 조성의 2,3-부탄디올 발효 혼합당 배지가 있는 연속 배양 장치(WO2007/097260의 도 2에 나타내는 장치)에 식균하고, 온도 조정 및 pH 조정을 행하면서 이하에 나타내는 운전 조건으로 30시간 배치 발효를 행했다(전 배양). 전 배양 완료 후, 표 16에 나타내는 조성의 2,3-부탄디올 발효 혼합당 배지를 이용하여 즉시 연속 배양을 개시하여 2,3-부탄디올의 제조를 행했다. 여과시의 막간 차압은 500kPa 이하가 되도록 조정하면서, 300시간의 연속 발효에 의해 2,3-부탄디올을 제조했다(표 35).
발효조 용량 : 2(L)
사용 분리 막 : Celfit 정밀 여과 막 모놀리스 φ4-19(NGK INSULATORS, LTD. 제품)
막 분리 엘러먼트 길이 : 500mm
분리 막의 평균 세공 직경 : 0.1㎛
온도 조정 : 30(℃)
발효 반응조 통기량 : 100(mL/분)
발효 반응조 교반 속도 : 800(rpm)
pH 조정 : 5N Ca(OH)2에 의해 pH 6.5로 조정
Figure pct00037
(산업상의 이용 가능성)
본 발명에 의해, 5탄당 및 6탄당을 포함하는 발효 원료를 사용한 여러가지의 화학품의 발효 생산의 효율을 대폭 향상시킬 수 있다.

Claims (5)

  1. 미생물의 배양액을 분리 막으로 여과하는 것, 미여과액을 배양액에 유지 또는 환류하는 것, 발효 원료를 배양액에 추가하는 것, 및 여과액 중의 생산물을 회수하는 것을 포함하는 연속 발효에 의한 화학품의 제조방법으로서,
    상기 미생물은 카타볼라이트 억제를 받는 미생물이고, 상기 발효 원료가 6탄당 및 5탄당을 포함하는 것을 특징으로 하는 화학품의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 여과액 총량 중 5탄당의 농도는 5g/L 이하인 것을 특징으로 하는 화학품의 제조방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 발효 원료 중에 포함되는 6탄당과 5탄당의 중량 비율은 1:9∼9:1인 것을 특징으로 하는 화학품의 제조방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 발효 원료는 바이오매스 유래의 당액을 포함하는 것을 특징으로 하는 화학품의 제조방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 5탄당은 크실로오스인 것을 특징으로 하는 화학품의 제조방법.
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