WO2013105651A1 - 化学品の製造方法 - Google Patents

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小林　宏治
志緒美 渡邊
匡平 磯部
健司 澤井
景洙 羅
紳吾 平松
山田　勝成
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東レ株式会社
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    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a chemical product by continuous fermentation using a fermentation raw material containing hexose and pentose.
  • Biomass-derived chemicals such as biodegradable polymer raw materials such as lactic acid and biofuels such as ethanol have become sustainable (sustainable) as well as carbon dioxide emissions into the atmosphere and the emergence of energy problems. It is attracting a great deal of attention as a life cycle assessment (LCA) compatible product.
  • LCA life cycle assessment
  • As a method for producing these biodegradable polymer materials and biofuels glucose, which is a hexose refined from edible biomass such as corn, is generally used as a fermentation material for microorganisms, and is obtained as a fermentation product. If edible biomass is used, competition with food causes price increases, which may prevent stable procurement of raw materials. Therefore, attempts have been made to use sugar derived from non-edible biomass such as rice straw as a fermentation raw material for microorganisms (see Patent Document 1).
  • sugars derived from non-edible biomass are used as fermentation raw materials
  • cellulose, hemicellulose, etc. contained in non-edible biomass are decomposed into sugars by saccharifying enzymes.
  • saccharifying enzymes not only hexose sugars such as glucose are decomposed.
  • Pentoses such as xylose can be obtained at the same time.
  • sugars derived from non-edible biomass are used as fermentation raw materials for microorganisms, mixed sugars of hexose and pentose sugars are used as fermentation raw materials (patents) Reference 1).
  • Continuous fermentation can be adopted as a fermentation method using sugar derived from non-edible biomass, which is a mixed sugar of hexose sugar and pentose sugar, as a fermentation raw material for microorganisms. It has not been confirmed (see Patent Document 1).
  • sugar derived from non-edible biomass which is a mixed sugar of hexose sugar and pentose sugar
  • the batch is obtained by continuously receiving catabolite suppression compared to batch fermentation. It is also known that the fermentation yield is significantly lower than that of fermentation (see Non-Patent Document 1).
  • microorganisms that undergo catabolite suppression are known as microorganisms that fermentatively produce biodegradable polymer raw materials and biofuels.
  • microorganisms that fermentatively produce biodegradable polymer raw materials and biofuels.
  • this invention makes it a subject to improve the fermentation yield in the case of continuously fermenting a mixed sugar of hexose and pentose as a fermentation raw material for microorganisms subject to catabolite suppression.
  • the present inventor used a separation membrane for microorganisms having catabolite suppression in a method for producing a chemical that continuously fermented a mixed sugar of hexose and pentose as a fermentation raw material for microorganisms.
  • the present inventors have found that the above-mentioned problems can be solved by performing continuous fermentation, which has led to the present invention.
  • the present invention is as follows (1) to (5).
  • a method for producing a chemical product by continuous fermentation wherein the microorganism is a microorganism that is subject to catabolite suppression, and the fermentation material contains hexose and pentose.
  • a chemical product can be produced in a high yield despite the fact that a mixed sugar of hexose and pentose is used as a fermentation raw material for microorganisms that are subject to catabolite suppression.
  • the present invention relates to a method for producing a chemical product in which a microorganism is cultured with a fermentation raw material to produce a chemical product by fermentation.
  • the culture solution is filtered through a separation membrane, and the unfiltered solution is retained or refluxed in the culture solution.
  • a method for producing a continuously fermented chemical that recovers a product in a filtrate in addition to a culture solution, wherein the microorganism that is subject to catabolite suppression is used, and the fermentation raw material is hexose and pentose. It is the manufacturing method of the chemical characterized by including.
  • the carbon source of the fermentation raw material includes a mixed sugar containing pentose and hexose.
  • the pentose sugar has five carbons constituting the sugar, and is also called pentose.
  • the pentose used in the present invention may be any pentose as long as it can assimilate microorganisms, but is preferably xylose or arabinose, more preferably from the viewpoint of the natural ratio or availability. Is xylose.
  • the hexose has 6 carbons constituting the sugar, and is also called hexose.
  • aldose include glucose, mannose, galactose, allose, growth, and talose.
  • ketose include fructose, psicose, and sorbose.
  • the hexose used in the present invention may be any as long as it can assimilate microorganisms, but from the viewpoint of the natural ratio, availability, etc., preferably glucose, mannose, galactose, More preferred is glucose.
  • the mixed sugar used in the present invention is not particularly limited, but a cellulose-containing biomass-derived sugar solution known to contain both hexose and pentose is preferably used.
  • the cellulose-containing biomass include plant biomass such as bagasse, switchgrass, corn stover, rice straw, and straw, and woody biomass such as trees and waste building materials.
  • Cellulose-containing biomass contains cellulose or hemicellulose, which is a polysaccharide obtained by dehydrating and condensing sugar, and a sugar solution that can be used as a fermentation raw material is produced by hydrolyzing such a polysaccharide. Any method may be used for preparing the cellulose-containing biomass-derived sugar solution.
  • a method for producing a sugar solution by acid hydrolysis of biomass using concentrated sulfuric acid discloses a method for producing a sugar solution by hydrolyzing biomass with dilute sulfuric acid and further treating with an enzyme such as cellulase (A).
  • Aden et al. “Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Optimized Co-Current Dirty Acid Prehydrology and Enzymatic Physiology Hydrology. ver "NREL Technical Report (2002)).
  • a method not using an acid a method of hydrolyzing biomass using subcritical water at about 250 to 500 ° C.
  • the weight ratio of the pentose and hexose contained in the mixed sugar is not particularly limited, but the weight ratio of the pentose and hexose in the mixed sugar is expressed as (pentose): (hexose). And 1: 9 to 9: 1 are preferred. This is a sugar ratio when a cellulose-containing biomass-derived sugar solution is assumed as a mixed sugar.
  • the total sugar concentration contained in the fermentation raw material used in the present invention is not particularly limited and is preferably as high as possible as long as it does not inhibit the production of microbial chemicals.
  • the concentration of the carbon source in the medium is preferably 15 to 500 g / L, more preferably 20 to 300 g / L. If the total concentration is 15 g / L or less, the effect of improving the yield from pentose may be reduced. In addition, when the total sugar concentration is low, the production efficiency of chemicals also decreases.
  • the concentration of hexose contained in the fermentation raw material used in the present invention is not particularly limited in the range of the total sugar concentration and the ratio of pentose and hexose, but if the method for producing a chemical product of the present invention is used. A good yield can be obtained even in a mixed sugar solution containing hexose at a concentration of 5 g / L or more.
  • the fermentation raw material used in the present invention is preferably a normal liquid medium appropriately containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and if necessary, organic micronutrients such as amino acids and vitamins.
  • nitrogen source used in the present invention examples include ammonia gas, aqueous ammonia, ammonium salts, urea, nitrates, and other auxiliary organic nitrogen sources such as oil cakes, soybean hydrolysate, casein decomposition products, and others.
  • inorganic salts phosphates, magnesium salts, calcium salts, iron salts, manganese salts, and the like can be appropriately added and used.
  • the nutrient is added as a preparation or a natural product containing it.
  • An antifoaming agent is also used as necessary.
  • the culture solution refers to a solution obtained as a result of the growth of microorganisms on the fermentation raw material. You may change suitably the composition of the fermentation raw material to add from the fermentation raw material composition at the time of a culture
  • the porous membrane used in the present invention is not particularly limited as long as it has a function of separating and filtering a culture solution obtained by culturing using a microbial stirring type incubator or a stirring type bioreactor from microorganisms.
  • Ceramic ceramic membranes, porous glass membranes, porous organic polymer membranes, metal fiber woven fabrics, nonwoven fabrics, and the like can be used. Among these, a porous organic polymer film or a ceramic film is particularly preferable.
  • the configuration of a porous membrane used as a separation membrane in the present invention will be described.
  • the porous membrane used in the present invention preferably has separation performance and water permeability according to the quality of water to be treated and the application.
  • the porous membrane is preferably a porous membrane including a porous resin layer from the viewpoint of blocking performance, water permeability performance and separation performance, for example, stain resistance.
  • the porous membrane including the porous resin layer preferably has a porous resin layer that acts as a separation functional layer on the surface of the porous substrate.
  • the porous substrate supports the porous resin layer and gives strength to the separation membrane.
  • the porous substrate used in the present invention has a porous resin layer on the surface of the porous substrate, the porous substrate is porous even if the porous resin layer penetrates the porous substrate. It does not matter if the porous resin layer does not penetrate, and it is selected according to the application.
  • the average thickness of the porous substrate is preferably 50 ⁇ m or more and 3000 ⁇ m or less.
  • the material of the porous substrate is made of an organic material and / or an inorganic material, and an organic fiber is preferably used.
  • the preferred porous substrate is a woven or non-woven fabric made of organic fibers such as cellulose fiber, cellulose triacetate fiber, polyester fiber, polypropylene fiber and polyethylene fiber. More preferably, the density control is relatively easy and the production is easy. Inexpensive nonwoven fabric is used.
  • An organic polymer film can be suitably used for the porous resin layer.
  • the material of the organic polymer film include polyethylene resin, polypropylene resin, polyvinyl chloride resin, polyvinylidene fluoride resin, polysulfone resin, polyethersulfone resin, polyacrylonitrile resin, cellulose resin, and the like. Examples thereof include cellulose triacetate resins.
  • the organic polymer film may be a mixture of resins mainly composed of these resins.
  • the main component means that the component is contained in an amount of 50% by weight or more, preferably 60% by weight or more.
  • the organic polymer film is made of a polyvinyl chloride resin, a polyvinylidene fluoride resin, a polysulfone resin, a polyethersulfone resin, which is easy to form a film with a solution and has excellent physical durability and chemical resistance.
  • Polyacrylonitrile-based resins are preferable, and polyvinylidene fluoride-based resins or resins containing them as the main components are most preferably used.
  • polyvinylidene fluoride-based resin a homopolymer of vinylidene fluoride is preferably used.
  • polyvinylidene fluoride resin a copolymer of a vinyl monomer copolymerizable with vinylidene fluoride is also preferably used.
  • vinyl monomers copolymerizable with vinylidene fluoride include tetrafluoroethylene, hexafluoropropylene, and ethylene trichloride fluoride.
  • the porous membrane used as a separation membrane in the present invention is not particularly limited, and may be any microorganism as long as it does not pass through microorganisms used for fermentation. It is desirable that the clogging is less likely to occur and the filtration performance is within a range that continues stably for a long period of time. Therefore, the average pore diameter of the porous separation membrane is preferably 0.01 ⁇ m or more and less than 5 ⁇ m. More preferably, when the average pore diameter of the porous membrane is 0.01 ⁇ m or more and less than 1 ⁇ m, it is possible to achieve both a high exclusion rate at which microorganisms do not leak and a high water permeability. Holding for a long time can be carried out with higher accuracy and reproducibility.
  • the average pore diameter of the porous membrane is preferably less than 1 ⁇ m.
  • the average pore diameter of the porous membrane is preferably not too large compared to the size of the microorganism in order to prevent the occurrence of a problem that the microorganism leaks out, that is, the rejection rate decreases.
  • the average pore diameter is preferably 0.4 ⁇ m or less, and more preferably less than 0.2 ⁇ m.
  • the average pore size of the porous membrane in the present invention is preferably 0.01 ⁇ m. It is above, More preferably, it is 0.02 micrometer or more, More preferably, it is 0.04 micrometer or more.
  • the average pore diameter can be obtained by measuring and averaging the diameters of all pores that can be observed within a range of 9.2 ⁇ m ⁇ 10.4 ⁇ m in a scanning electron microscope observation at a magnification of 10,000 times. it can.
  • the average pore diameter can be obtained by taking a photograph of the surface of the membrane at a magnification of 10,000 using a scanning electron microscope and randomly selecting 10 or more, preferably 20 or more pores. It can also be obtained by measuring and number average.
  • a circle having an area equal to the area of the pores (equivalent circle) can be obtained by an image processing apparatus or the like, and the equivalent circle diameter can be obtained by the method of setting the diameter of the pores.
  • the standard deviation ⁇ of the average pore diameter of the porous membrane used in the present invention is preferably 0.1 ⁇ m or less.
  • the standard deviation ⁇ of the average pore diameter is N as the number of pores that can be observed within the above-mentioned range of 9.2 ⁇ m ⁇ 10.4 ⁇ m, the measured diameter is X k, and the average pore diameter is X (ave ) And the following (Equation 1).
  • the permeability of the fermentation broth is one of the important performances.
  • the pure water permeability coefficient of the porous membrane before use can be used as an index of the permeability of the porous membrane.
  • the pure water permeability coefficient of the porous membrane is 5.6 ⁇ 10 ⁇ 10 m when calculated by measuring the water permeability at a head height of 1 m using purified water at a temperature of 25 ° C. by a reverse osmosis membrane.
  • a pure water permeability coefficient is 5.6 ⁇ 10 ⁇ 10 m 3 / m 2 / s / pa or more 6 ⁇ 10 ⁇ 7 m 3 / m 2 / s. If it is / pa or less, a practically sufficient amount of permeated water can be obtained.
  • the surface roughness is the average value of the height in the direction perpendicular to the surface.
  • the membrane surface roughness is one of the factors for facilitating separation of microorganisms adhering to the separation membrane surface by the membrane surface cleaning effect by the liquid flow by stirring or a circulation pump.
  • the surface roughness of the porous membrane is not particularly limited as long as it is within a range in which microorganisms attached to the membrane and other solid substances are peeled off, but is preferably 0.1 ⁇ m or less. When the surface roughness is 0.1 ⁇ m or less, microorganisms adhering to the film and other solid substances are easily peeled off.
  • the membrane surface roughness of the porous membrane is 0.1 ⁇ m or less, the average pore diameter is 0.01 ⁇ m or more and less than 1 ⁇ m, and the pure water permeability coefficient of the porous membrane is 2 ⁇ 10 ⁇ 9 m 3 / It has been found that by using a porous membrane of m 2 / s / pa or more, an operation that does not require excessive power required for membrane surface cleaning can be performed more easily.
  • the surface roughness of the porous membrane to 0.1 ⁇ m or less, in the filtration of microorganisms, the shearing force generated on the membrane surface can be reduced, the destruction of microorganisms is suppressed, and the porous membrane is clogged.
  • the surface roughness of the porous membrane is preferably as small as possible.
  • the film surface roughness of the porous film is measured under the following conditions using the following atomic force microscope (AFM).
  • FAM atomic force microscope
  • Device Atomic force microscope device (“Nanoscope IIIa” manufactured by Digital Instruments)
  • Condition probe SiN cantilever manufactured by Digital Instruments
  • Scan mode Contact mode in-air measurement
  • Underwater tapping mode underwater measurement
  • Scanning range 10 ⁇ m, 25 ⁇ m square (measurement in air) 5 ⁇ m
  • 10 ⁇ m square underwater measurement
  • Scanning resolution 512 ⁇ 512 -Sample preparation The membrane sample was immersed in ethanol at room temperature for 15 minutes, then immersed in RO water for 24 hours, washed, and then air-dried.
  • the RO water refers to water that has been filtered using a reverse osmosis membrane (RO membrane), which is a type of filtration membrane, to exclude impurities such as ions and salts.
  • RO membrane reverse osmosis membrane
  • the pore size of the RO membrane is approximately 2 nm or less.
  • the film surface roughness d rough is calculated by the following (Equation 2) from the height of each point in the Z-axis direction by the above-described atomic force microscope (AFM).
  • the shape of the porous membrane used in the present invention is preferably a flat membrane.
  • the average thickness is selected according to the application.
  • the average thickness when the shape of the porous membrane is a flat membrane is preferably 20 ⁇ m or more and 5000 ⁇ m or less, and more preferably 50 ⁇ m or more and 2000 ⁇ m or less.
  • the shape of the porous membrane used in the present invention is preferably a hollow fiber membrane.
  • the inner diameter of the hollow fiber is preferably 200 ⁇ m or more and 5000 ⁇ m or less
  • the film thickness is preferably 20 ⁇ m or more and 2000 ⁇ m or less.
  • a woven fabric or a knitted fabric in which organic fibers or inorganic fibers are formed in a cylindrical shape may be included in the hollow fiber.
  • the above-mentioned porous membrane can be manufactured by the manufacturing method described in WO2007 / 097260, for example.
  • the separation membrane in the present invention can be a membrane containing at least ceramics.
  • the ceramics in the present invention refers to those containing a metal oxide and baked and hardened by heat treatment at a high temperature.
  • the metal oxide include alumina, magnesia, titania, zirconia and the like.
  • the separation membrane may be formed of only a metal oxide, and may include silica, silicon carbide, mullite, cordierite, or the like, which is a compound of silica and a metal oxide.
  • Components other than the ceramics forming the separation membrane are not particularly limited as long as they can form a porous body as a separation membrane.
  • the shape is not particularly limited, and any of monolithic membrane, flat membrane, tubular membrane and the like can be used. From the viewpoint of filling efficiency into the container, a columnar structure and a structure having a through hole in the longitudinal direction is preferable. A monolith film is preferred from the viewpoint of increasing the filling efficiency.
  • the separation membrane When a separation membrane having a columnar structure is housed in a module container and used as a separation membrane module, the separation membrane can be modularized and filtered by selecting a suitable mode from an external pressure type and an internal pressure type.
  • the side where the separation membrane is in contact with the fermentation broth is referred to as the primary side
  • the side where the filtrate containing the chemical product is obtained by filtration is referred to as the secondary side.
  • the output of the circulation pump can be saved when cross-flow filtration is performed because the flow path on the primary side is narrow. Furthermore, the action of discharging turbidity deposited on the surface of the separation membrane to the outside of the module becomes stronger, which is preferable because the surface of the separation membrane is easily kept clean.
  • the internal pressure type separation membrane has an inlet and an outlet for the fermentation broth. In this case, it is preferable that the inlet and the outlet are in a state of through holes arranged in a straight line, since the liquid flow resistance becomes small. Further, since the separation membrane has a columnar structure and the through-holes are vacant in the longitudinal direction, the container for accommodating the separation membrane can be made thinner. When the separation membrane module is thin, it can be preferably used from the viewpoint of production and handling.
  • the porosity of the separation membrane is not particularly limited, but if it is too low, the filtration efficiency will deteriorate, and if it is too high, the strength will decrease. In order to achieve both the filtration efficiency and the strength of the separation membrane and to have resistance to repeated steam sterilization, it is preferably 20% or more and 60% or less.
  • the average pore diameter of the separation membrane is preferably 0.01 ⁇ m or more and 1 ⁇ m or less. If the membrane has an average pore diameter in this range, the separation membrane is less likely to block and the filtration efficiency is excellent. In addition, if the average pore size is in the range of 0.02 ⁇ m or more and 0.2 ⁇ m or less, fermentation by-products by microorganisms and cultured cells exemplified by proteins and polysaccharides, and microorganisms / cultured cells in the culture solution This is particularly preferable because clogging of a substance that easily clogs the separation membrane, such as a crushed cell produced by death, is less likely to occur.
  • the separation membrane having a columnar structure having a through hole has a secondary surface on the secondary side, it is preferable to provide a module container for collecting filtrate and use the module as a module in which the separation container is filled.
  • One or more separation membranes are filled in one module.
  • the module container is preferably made of a material that can withstand repeated steam sterilization.
  • raw materials that can withstand steam sterilization include stainless steel and ceramics having a low average porosity.
  • Such a ceramic membrane module can be manufactured by, for example, a manufacturing method described in WO2012 / 086763, but a commercially available one can also be used. Specific examples of commercially available products include MEMBLAROX microfiltration membranes (Pall), ceramic membrane filter cefilt MF membranes (NGK), and the like.
  • the transmembrane pressure difference during filtration is not particularly limited as long as the fermentation broth can be filtered.
  • the organic polymer membrane is filtered at a transmembrane differential pressure higher than 150 kPa to filter the culture solution, the structure of the organic polymer membrane is likely to be destroyed, and the ability to produce chemicals is increased. May decrease.
  • the transmembrane pressure is lower than 0.1 kPa, the permeated water amount of the fermentation broth may not be obtained sufficiently, and the productivity when producing a chemical product tends to decrease.
  • the permeated water amount of the fermentation broth is increased by setting the transmembrane differential pressure, which is the filtration pressure, preferably in the range of 0.1 kPa to 150 kPa. Further, since there is no decrease in chemical production capacity due to destruction of the film structure, it is possible to maintain a high ability to produce chemical products.
  • the transmembrane pressure difference is preferably in the range of 0.1 kPa to 50 kPa, and more preferably in the range of 0.1 kPa to 20 kPa.
  • the transmembrane pressure difference during filtration is not particularly limited as long as the fermentation broth can be filtered, but is preferably 500 kPa or less.
  • the operation is performed at 500 kPa or more, clogging of the membrane occurs, which may cause a problem in the continuous fermentation operation.
  • a transmembrane differential pressure can be generated in the separation membrane by a siphon using a liquid level difference (water head difference) of the fermented liquid and the porous membrane treated water or a cross flow circulation pump.
  • a suction pump may be installed on the secondary side of the separation membrane as a driving force for filtration.
  • the transmembrane pressure difference can be controlled by the suction pressure.
  • the transmembrane pressure difference can be controlled also by the pressure of the gas or liquid that introduces the pressure on the fermentation broth side.
  • the concentration of the pentose in the total amount of filtrate that has passed through the separation membrane is maintained at 5 g / l or less.
  • the medium is continuously used for fermentation.
  • pentose remains in a large amount in the culture medium, resulting in a decrease in the production yield.
  • the use of a separation membrane for continuous fermentation allows for catabolite.
  • the pentose concentration in the total amount of filtrate can be maintained at 5 g / l or less, and as a result, the production yield of chemicals is improved compared to continuous fermentation without using a separation membrane. be able to. If 5 g / l or more of pentose remains in the total amount of filtrate obtained from the separation membrane, the yield improvement effect from pentose may be reduced, resulting in a decrease in production yield. May end up.
  • the concentration of pentose in the total amount of filtrate can be adjusted according to the culture conditions. For example, it is possible to reduce the concentration of pentose in the total amount of filtrate by changing the concentration of sugar contained in the fermentation raw material, the supply rate of sugar, and the dilution rate. Alternatively, by increasing the nutrient sources contained in the fermentation raw material, it is possible to improve the consumption of microbial sugars and reduce the concentration of pentose in the total amount of filtrate.
  • the pH and temperature are not particularly limited as long as the microorganisms grow, but the pH is preferably 4 to 8 and the temperature is preferably 20 to 75 ° C.
  • the pH of the culture solution is usually adjusted to a predetermined value within a pH range of 4 to 8 with an inorganic or organic acid, an alkaline substance, urea, calcium carbonate, ammonia gas, or the like. If it is necessary to increase the oxygen supply rate, means such as adding oxygen to the air to maintain the oxygen concentration at 21% or higher, pressurizing the culture solution, increasing the agitation rate, or increasing the aeration rate can be used. .
  • continuous fermentation filtration of the culture solution
  • continuous fermentation may be started after batch culture or fed-batch culture is performed at the initial stage of culture to increase the microorganism concentration.
  • the start timing of the medium supply and the filtration of the culture solution is not necessarily the same. Further, the medium supply and the filtration of the culture solution may be continuous or intermittent.
  • a nutrient necessary for cell growth may be added to the raw material culture solution so that the cell growth can be continuously performed.
  • the concentration of microorganisms in the culture solution is preferably maintained in a state where the productivity of chemicals is high in order to obtain efficient productivity. For example, good production efficiency can be obtained by maintaining the concentration of microorganisms in the culture solution as a dry weight of 5 g / L or more.
  • microorganisms in the culture tank are obtained by removing a part of the culture solution containing the microorganisms from the fermenter and diluting with a medium as necessary during the continuous fermentation.
  • the density may be adjusted. For example, if the concentration of microorganisms in the fermenter becomes too high, clogging of the separation membrane is likely to occur, so avoiding clogging by removing a part of the culture solution containing microorganisms and diluting with a medium. There are things you can do.
  • the production performance of chemicals may change depending on the concentration of microorganisms in the fermenter. Using the production performance as an indicator, remove a part of the culture solution containing microorganisms and dilute it in the medium to maintain the production performance. It is also possible.
  • the number of fermenters is not limited as long as it is a continuous fermentation culture method for producing a product while growing cells.
  • the production rate in continuous fermentation culture is calculated by the following equation (4).
  • Fermentation production rate (g / L / hr) product concentration in the filtrate (g / L) ⁇ fermentation culture liquid withdrawal rate (L / hr) ⁇ operating fluid amount (L) of the apparatus (Formula 4).
  • the fermentation production rate in batch culture is determined by the amount of product (g) at the time when all of the raw carbon source is consumed by the time (hr) required for consumption of the carbon source and the amount of fermentation broth (L) at that time. It is obtained by dividing.
  • the yield in continuous culture is calculated by the following equation (5), and the amount of chemical product (g) produced by consuming the raw material carbon source within a certain period is calculated as the amount of input carbon source (g ) Divided by the value obtained by subtracting the amount of unused carbon source (g) from which microorganisms could not be used.
  • the yield mentioned in the present specification refers to this unless otherwise specified.
  • Yield (g / g) product amount (g) ⁇ ⁇ input carbon source amount (g) ⁇ unused carbon source amount (g) ⁇ (Formula 5).
  • the continuous fermentation apparatus used in the present invention filters the fermentation broth of microorganisms through a separation membrane, collects the product from the filtrate, holds or refluxs the unfiltrated liquid in the fermentation broth, and supplies the fermentation raw material.
  • a separation membrane collects the product from the filtrate in addition to the fermentation broth, but when using an organic polymer membrane, a specific example is given.
  • the apparatus described in WO2007 / 097260 can be used.
  • the apparatus described in WO2012 / 086763 can be used.
  • the microorganism subjected to catabolite suppression used in the present invention generally means that when fermenting a microorganism that assimilate pentose, and using a fermentation raw material containing a mixed sugar containing hexose and pentose, pentose
  • the consumption rate of xylose in a medium containing xylose alone in batch culture using a microorganism capable of assimilating glucose and xylose More than that, a microorganism with a slow consumption rate of xylose in a mixed sugar medium containing glucose and xylose is said to be “a microorganism subject to catabolite suppression”.
  • the consumption rate of xylose in a medium containing xylose alone is calculated by the following (formula 6).
  • Xylose consumption rate (g / L / hr) total amount of xylose contained in the fermentation raw material at the start of cultivation (g) ⁇ time spent until the xylose contained in the fermentation raw material is completely consumed (hr) ) / Fermentation liquid amount (L) (Formula 6).
  • the consumption rate of xylose in a mixed sugar medium containing glucose and xylose is the consumption rate of xylose in the presence of glucose in the mixed sugar medium containing glucose and xylose. ).
  • Xylose consumption rate (g / L / hr) xylose amount consumed from the start of culture to time T (g) ⁇ time from start of culture to time T (hr) ⁇ fermented liquid amount (L) (Formula 7).
  • the weight ratio of glucose and xylose in the mixed sugar is 1: 1.
  • the sugar concentration is not particularly limited as long as the microorganism can be completely consumed without residual sugar.
  • the sugar concentration of xylose in a medium containing xylose is the same as the total sugar concentration in a mixed sugar medium containing glucose and xylose.
  • time T is the time when glucose is completely consumed.
  • the time T can be obtained by measuring the glucose concentration of the sampled culture solution using HPLC, a kit, or a sensor.
  • the time T is the time when xylose is completely consumed.
  • the time T can be obtained by measuring the xylose concentration in the same manner as the glucose concentration measuring method.
  • the calculation is performed in consideration of the amount of liquid added to the culture liquid or the amount of liquid reduced.
  • microorganisms that are subject to catabolite suppression are selected from yeasts such as baker's yeast often used in the fermentation industry, bacteria such as Escherichia coli and coryneform bacteria, filamentous fungi, actinomycetes, and the like.
  • Pichia genus candy The genus Candida, the genus Pachisolen, the genus Kluyveromyces, the genus Hansenula, the genus Torulopsis, the genus Debaryomyes, the genus Isachenkia, the Isachenchia genus Yeasts such as the genus (Lindnera) and Wickerhamomyces (Clostridial) um), Enterobacter genus, Escherichia genus, Klebsiella genus bacteria, Lactobacillus genus, Lactococcus genus Lactococcus Actinoplanes, Arthrobacter, Streptomyces, and other actinomycetes, Bacillus, Paenibacillus, Aerobacter, Aerobacter, Aerobacter , Staphylococcus genus, Thermoanae Citrobacter (Thermoanaerobacter) genus, may be selected from Thermoan
  • microorganisms that are catabolite-suppressed are isolated from the natural environment, they were originally not assimilated pentose, but were modified to assimilate pentose by mutation or genetic recombination It can also be selected from microorganisms.
  • microorganisms modified so as to assimilate pentose by gene recombination include microorganisms in which a pentose metabolic gene is introduced or enhanced by gene recombination.
  • xylose metabolic genes include enzymes such as xylose isomerase, xylose reductase, xylitol dehydrogenase, xylulose kinase, and microorganisms to which xylose is assimilated by such genetic recombination techniques. Examples thereof include microorganisms described in JP-T-2006-525029, JP-A-2009-112289, JP-T 2010-504756, and the like.
  • the chemical product produced by the present invention is not limited as long as it is a substance produced by the microorganism in the fermentation broth, and includes substances that are mass-produced in the fermentation industry, such as alcohols, organic acids, amino acids, and nucleic acids. Can do. For example, as alcohol, ethanol, 1,3-propanediol, 1,3-butanediol, 2,3-butanediol, 1,4-butanediol, glycerol, butanol, isobutanol, 2-butanol, isopropanol, etc.
  • organic acids include acetic acid, lactic acid, adipic acid, pyruvic acid, succinic acid, malic acid, itaconic acid, citric acid, and nucleic acids, nucleosides such as inosine and guanosine, nucleotides such as inosinic acid and guanylic acid, Examples thereof include diamine compounds such as cataverine.
  • the present invention can also be applied to the production of substances such as enzymes, antibiotics, and recombinant proteins. These chemicals can be recovered from the filtrate by known methods (membrane separation, concentration, distillation, crystallization, extraction, etc.).
  • Reference Example 3 Calculation of Xylose Consumption Rate in Bacillus coagulans
  • As the medium a lactic acid fermentation xylose medium having the composition shown in Table 1 and a lactic acid fermentation mixed sugar medium 1 shown in Table 2 were used. Sampling was performed as appropriate, and the concentrations of glucose and xylose in the culture solution were measured by the method of Reference Example 1, and the concentration of lactic acid as a product was measured by the method of Reference Example 2.
  • Bacillus coagulans NBRC12714 strain was cultured with calcium carbonate in a flask in 50 mL of a preculture medium (polypeptone 10 g / L, yeast extract 2 g / L, magnesium sulfate heptahydrate 1 g / L) for 24 hours (preculture).
  • the preculture was inoculated into 1 L of lactic acid fermentation xylose medium and lactic acid fermentation mixed sugar medium 1 purged with nitrogen gas, and batch fermentation was performed under the following conditions.
  • Fermentation reactor capacity 2 (L) Temperature adjustment: 50 (°C) Reaction tank ventilation rate (nitrogen gas): 100 (mL / min) Reaction tank stirring speed: 200 (rpm) pH adjustment: adjusted to pH 7 with 5N Ca (OH) 2 Sterilization: All culture tanks and culture media are autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes and autoclaved for 20 minutes.
  • the xylose consumption rates in the lactic acid fermentation xylose medium and the lactic acid fermentation mixed sugar medium 1 were calculated according to the above-mentioned (formula 6) and (formula 7), and are shown in Table 7. From this result, it was determined that the Bacillus coagulans NBRC12714 strain was a microorganism subject to catabolite suppression.
  • Reference Example 4 Calculation of Xylose Consumption Rate in Candida tropicalis
  • As the medium an ethanol fermentation xylose medium having the composition shown in Table 3 and an ethanol fermentation mixed sugar medium 1 shown in Table 4 were used. Sampling was performed as appropriate, and the concentrations of glucose and xylose in the culture solution and the concentration of ethanol as a product were measured by the method of Reference Example 1.
  • Candida tropicalis NBRC0199 strain was cultured with shaking in 2 mL of YPD medium in a test tube at 30 ° C. overnight (pre-culture).
  • the obtained culture solution was inoculated into 50 mL of a fresh YPD medium, and cultured with shaking overnight in a 500 mL pleated Erlenmeyer flask (preculture).
  • the preculture liquid was inoculated into 2 L of ethanol fermentation xylose medium and ethanol fermentation mixed sugar medium, and batch culture was performed under the following conditions.
  • Fermentation reactor capacity 2 (L) Temperature adjustment: 30 (° C) Aeration rate of reaction tank: 100 (mL / min) Reaction tank stirring speed: 800 (rpm) pH adjustment: None Sterilization: All culture tanks and culture media are autoclaved at 121 ° C for 20 min and autoclaved.
  • the xylose consumption rates in the ethanol-fermented xylose medium and ethanol-fermented mixed sugar medium 1 were calculated according to the above-described (formula 6) and (formula 7), and are shown in Table 7.
  • Candida tropicalis NBRC0199 strain was determined to be a microorganism that is subject to catabolite suppression.
  • Reference Example 5 Calculation of Xylose Consumption Rate in Paenibacillus polymixer
  • As the medium 2,3-butanediol-fermented xylose medium having the composition shown in Table 5 and 2,3-butanediol-fermented mixed sugar medium 1 shown in Table 6 were used. Sampling was performed as appropriate, and the concentrations of glucose and xylose in the culture solution and the concentration of 2,3-butanediol as a product were measured by the method of Reference Example 1.
  • Paenibacillus polymixer ATCC12321 strain was cultured in a test tube with shaking in a 50 mL preculture medium (glucose 5 g / L, peptone 5 g / L, yeast extract 3 g / L, malt extract 3 g / L) for 24 hours (preculture).
  • the preculture was inoculated into 1 L of 2,3-butanediol-fermented xylose medium and 2,3-butanediol-fermented mixed sugar medium, respectively, and batch culture was performed under the following conditions.
  • Fermentation reactor capacity 2 (L) Temperature adjustment: 30 (° C) Aeration rate of reaction tank: 100 (mL / min) Reaction tank stirring speed: 800 (rpm) pH adjustment: pH 6.5 adjusted with 5N NaOH Sterilization: All culture tanks and culture media are autoclaved at 121 ° C for 20 minutes and autoclaved for 20 minutes.
  • the xylose consumption rates in the 2,3-butanediol-fermented xylose medium and the 2,3-butanediol-fermented mixed sugar medium 1 were calculated according to the above (formula 6) and (formula 7), and are shown in Table 7. As a result, it was determined that Paenibacillus polymixer ATCC 12321 strain is a microorganism that is subject to catabolite suppression.
  • Comparative Example 2 Production of L-lactic acid by batch culture of Bacillus coagulans using mixed sugar (glucose, xylose) as a fermentation raw material Comparative Example 1 using Bacillus coagulans NBRC12714 strain with lactic acid fermentation mixed sugar medium shown in Table 2 Batch culture was performed for 128 hours under the same conditions as in Table 11 (Table 11).
  • Fermentation reactor capacity 2 (L) Temperature adjustment: 50 (°C) Reaction tank ventilation rate (nitrogen gas): 100 (mL / min) Reaction tank stirring speed: 200 (rpm) pH adjustment: adjusted to pH 7 with 5N Ca (OH) 2 Extracted amount of fermentation broth: 3 (L / Day) Sterilization: All culture tanks and culture media are autoclaved at 121 ° C for 20 min and autoclaved.
  • Example 1 Production of L-lactic acid by continuous culture using a separation membrane of Bacillus coagulans using a mixed sugar (glucose, xylose) as a fermentation raw material 1
  • Continuous culture was performed using a separation membrane using a lactic acid fermentation mixed sugar medium having the composition shown in Table 2 using mixed sugar (glucose, xylose) as a fermentation raw material.
  • a hollow fiber form was adopted as the separation membrane element.
  • the Bacillus coagulans NBRC12714 strain was cultured with shaking under the same conditions as the preculture in Comparative Example 1 (pre-culture).
  • Pre-culture medium was inoculated into 1.5 L lactic acid fermentation mixed sugar medium purged with nitrogen gas, and the fermentation reaction tank was stirred at 200 rpm with the attached stirrer to fill the fermentation reaction tank with nitrogen. The temperature was adjusted, and batch culture was performed until the sugar in the culture solution was completely consumed (preculture). Immediately after completion of the pre-culture, the fermenter circulation pump is operated, the medium is continuously supplied, and the filtration amount of the culture solution is controlled so that the amount of the fermentation solution in the continuous fermentation apparatus is 1.5 L under the following conditions. Lactic acid was produced by continuous culture for 290 hours (Table 11).
  • Fermentation reactor capacity 2 (L) Separation membrane used: Polyvinylidene fluoride filtration membrane membrane separation element Effective filtration area: 473 (cm 2 ) Temperature adjustment: 50 (°C) Fermentation reactor aeration volume (nitrogen gas): 100 (mL / min) Fermentation reactor stirring speed: 200 (rpm) Extracted amount of fermentation broth: 3 (L / Day) Sterilization: All the culture tank and separation medium containing the separation membrane element are autoclaved at 121 ° C for 20 min.
  • the membrane used was a membrane having the following properties, and the transmembrane pressure difference during filtration was changed between 0.1 and 20 kPa.
  • Average pore diameter 0.1 ⁇ m Standard deviation of average pore diameter: 0.035 ⁇ m
  • Film surface roughness 0.06 ⁇ m
  • Pure water permeability coefficient 50 ⁇ 10 ⁇ 9 m 3 / m 2 / s / pa.
  • Example 2 Continuous culture 2 using a separation membrane of Bacillus coagulans using a mixed sugar (glucose, xylose) as a fermentation raw material 2 L-lactic acid was produced by using the lactic acid fermentation mixed sugar medium 2 shown in Table 9 for 305 hours using the separation membrane under the same conditions as in Example 1 (Table 11).
  • Example 3 Continuous culture 3 using Bacillus coagulans using a mixed sugar (glucose, xylose) as a fermentation raw material Using the lactic acid fermentation mixed sugar medium 3 shown in Table 10, continuous culture using a separation membrane for 300 hours was performed under the same conditions as in Example 1 to produce L-lactic acid (Table 11).
  • Candida tropicalis NBRC0199 strain was used as the ethanol fermentation microorganism, and the composition shown in Table 12 was used as the medium. An ethanol fermentation medium was used.
  • Candida tropicalis NBRC0199 strain was cultured with shaking in 2 mL of YPD medium in a test tube at 30 ° C. overnight (pre-culture). The obtained culture solution was inoculated into 50 mL of a fresh YPD medium, and cultured with shaking overnight in a 500 mL pleated Erlenmeyer flask (preculture).
  • the preculture was inoculated into 1.5 L of ethanol fermentation medium, and batch culture was performed for 16 hours under the following conditions to produce ethanol (Table 14).
  • Fermentation reactor capacity 2 (L) Temperature adjustment: 30 (° C) Aeration rate of reaction tank: 100 (mL / min) Reaction tank stirring speed: 800 (rpm) pH adjustment: None Sterilization: All culture tanks and culture media are autoclaved at 121 ° C for 20 min and autoclaved.
  • Fermentation reactor capacity 2 (L) Temperature adjustment: 30 (° C) Aeration volume of fermentation reaction tank: 100 (mL / min) Fermentation reactor stirring speed: 800 (rpm) pH adjustment: None Fermentation liquid withdrawal: 1 (L / Day) Sterilization: All culture tanks and culture media are autoclaved at 121 ° C for 20 min and autoclaved.
  • Example 4 Production of ethanol by continuous culture using a separation membrane of Candida tropicalis using mixed sugar (glucose, xylose) as a fermentation raw material
  • ethanol-fermented mixed sugar medium 2 having the composition shown in Table 13 is used.
  • the continuous fermentation using the separated membrane was performed.
  • a flat membrane was adopted as the separation membrane element.
  • Candida tropicalis NBRC0199 strain was cultured in a test tube with shaking in 2 mL of YPD medium at 30 ° C. overnight (pre-culture).
  • the obtained culture broth was inoculated into 50 mL of fresh YPD medium, and cultured overnight in a 500 mL capacity fluted Erlenmeyer flask (pre-culture).
  • Pre-culture medium is inoculated into 1.5L ethanol fermentation mixed sugar medium 2 of continuous fermentation apparatus, the fermentation reaction tank is stirred at 800 rpm with the attached stirrer, adjustment of aeration volume of fermentation reaction tank, temperature adjustment And cultured for 36 hours (pre-culture).
  • the fermenter circulation pump is operated, the medium is continuously supplied, and the filtration amount of the culture solution is controlled so that the amount of the fermentation solution in the continuous fermentation apparatus is 1.5 L under the following conditions. Ethanol was produced by continuous culture for 300 hours (Table 14).
  • Fermentation reactor capacity 2 (L) Separation membrane used: Polyvinylidene fluoride filtration membrane membrane separation element Effective filtration area: 120 (cm 2 ) Temperature adjustment: 30 (° C) Aeration volume of fermentation reaction tank: 100 (mL / min) Fermentation reactor stirring speed: 800 (rpm) pH adjustment: None Fermentation liquid withdrawal: 1 (L / Day) Sterilization: The culture tank containing the separation membrane element and the medium used are all autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes and autoclaved.
  • the membrane used was a membrane having the same properties as in Example 1, and the transmembrane pressure difference during filtration was changed between 0.1 and 19.8 kPa.
  • Paenibacillus polymixer ATCC12321 strain was cultured in a test tube with shaking in 50 mL of a preculture medium (glucose 5 g / L, peptone 5 g / L, yeast extract 3 g / L, malt extract 3 g / L) for 24 hours (preculture).
  • the preculture was inoculated into 1 L of 2,3-butanediol fermentation medium, and batch culture was performed for 27 hours under the following conditions to produce 2,3-butanediol (Table 17).
  • Fermentation reactor capacity 2 (L) Temperature adjustment: 30 (° C) Aeration rate of reaction tank: 100 (mL / min) Reaction tank stirring speed: 800 (rpm) pH adjustment: pH 6.5 adjusted with 5N NaOH Sterilization: All culture tanks and culture media are autoclaved at 121 ° C for 20 minutes and autoclaved for 20 minutes.
  • Fermentation reactor capacity 2 (L) Temperature adjustment: 30 (° C) Aeration rate of reaction tank: 100 (mL / min) Reaction tank stirring speed: 800 (rpm) pH adjustment: adjusted to pH 6.5 with 5N NaOH Extraction amount of fermentation broth: 0.6 (L / Day) Sterilization: All culture tanks and culture media are autoclaved at 121 ° C for 20 min and autoclaved.
  • Example 5 Production of 2,3-butanediol by continuous culture using a separation membrane of Paenibacillus polymixer using mixed sugar (glucose, xylose) as fermentation raw material Separation using mixed sugar (glucose, xylose) as fermentation raw material Continuous culture using a membrane was performed. A flat membrane was adopted as the separation membrane element.
  • Paenibacillus polymixer ATCC12321 strain was cultured with shaking under the same conditions as the preculture of Comparative Example 7 (pre-culture). Pre-culture solution is inoculated into 1.2 L of mixed sugar 2,3-butanediol fermentation medium 2 and pre-culture solution is stirred at 200 rpm with the attached stirrer to adjust the temperature and culture.
  • Batch culture was performed until the sugar in the liquid was completely consumed (pre-culture). Immediately after completion of the pre-culture, the fermenter circulation pump is operated, the medium is continuously supplied, and the filtration amount of the culture solution is controlled so that the amount of the fermentation solution in the continuous fermentation apparatus is 1.2 L under the following conditions. Continuous culture for 310 hours was performed to produce 2,3-butanediol (Table 17).
  • Fermentation reactor capacity 2 (L) Separation membrane used: Polyvinylidene fluoride filtration membrane membrane separation element Effective filtration area: 120 (cm 2 ) Temperature adjustment: 30 (° C) Aeration volume of fermentation reaction tank: 100 (mL / min) Fermentation reactor stirring speed: 800 (rpm) Extracted amount of fermentation broth: 0.6 L / Day Sterilization: All the culture tank and separation medium containing the separation membrane element are autoclaved at 121 ° C for 20 min.
  • the membrane used was a membrane having the same properties as in Example 1, and the transmembrane pressure difference during filtration was changed between 0.1 and 20 kPa.
  • Reference Example 7 Calculation of Xylose Consumption Rate in Candida utilis Candida utilis CuLpLDH strain prepared by the method disclosed in WO2010 / 140602 was used as a microorganism.
  • a D-lactic acid fermentation xylose medium having the composition shown in Table 18 and a D-lactic acid fermentation mixed sugar medium 1 shown in Table 19 were used as the medium.
  • Batch culture was performed for 40 hours under the same conditions as in Comparative Example 1 except that the pH was adjusted to pH 6.0 with 1N calcium hydroxide, and the xylose consumption rate during D-lactic acid fermentation was calculated.
  • the xylose consumption rates in the D-lactic acid fermented xylose medium and the D-lactic acid fermented mixed sugar medium 1 were calculated according to the above (formula 6) and (formula 7), and are shown in Table 22.
  • the Candida utilis CuLpLDH strain was determined to be a microorganism that is subject to catabolite suppression.
  • Reference Example 8 Calculation of Xylose Consumption Rate in Escherichia coli KO11 Strain
  • the xylose consumption rate during ethanol fermentation of Escherichia coli KO11 strain which is an ethanol fermentation microorganism, was calculated.
  • As the medium ethanol fermentation xylose medium 2 having the composition shown in Table 20 and ethanol fermentation mixed sugar medium 3 shown in Table 21 were used. Sampling was performed as appropriate, and the concentrations of glucose and xylose in the culture solution and the concentration of ethanol as a product were measured by the method of Reference Example 1.
  • Escherichia coli KO11 strain was cultured overnight in a test tube at 30 ° C. in a 2 mL preculture medium (glucose 20 g / L yeast extract 10 g / L, tryptone 5 g / L, NaCl 5 g / L).
  • the obtained culture solution was inoculated into a 50 mL preculture medium in a 500 mL pleated Erlenmeyer flask and cultured overnight (preculture).
  • the preculture was inoculated into 1.5 L of ethanol-fermented xylose medium 2 and ethanol-fermented mixed sugar medium 3, and batch fermentation was performed for 16 hours under the following operating conditions while adjusting the temperature and pH.
  • Culture tank capacity 2 (L) Temperature adjustment: 30 (° C) Aeration volume of fermentation reaction tank: 100 (mL / min) Fermentation reactor stirring speed: 800 (rpm) pH adjustment: adjusted to pH 6 with 5N Ca (OH) 2 Sterilization: All fermenters and culture media are autoclaved at 121 ° C. for 20 min under high pressure steam sterilization.
  • the xylose consumption rates in the ethanol-fermented xylose medium 2 and the ethanol-fermented mixed sugar medium 3 were calculated according to the above (formula 6) and (formula 7), and are shown in Table 22. As a result, it was determined that Escherichia coli KO11 strain is a microorganism that is subject to catabolite suppression.
  • Example 6 Production of Ethanol by Continuous Fermentation Using Pichia Stippitis Separation Membrane Using Mixed Sugar as Fermentation Raw Material 1 As a microorganism, Pichia stipitis NBRC1687 strain was used, and continuous fermentation using a separation membrane was performed. Ethanol was produced by continuous fermentation for 305 hours under the same conditions as in Example 4 except that the preculture was performed for 48 hours and the transmembrane pressure difference was adjusted to 0.1 to 19.8 kPa.
  • Comparative Example 15 Production of D-lactic acid by continuous fermentation of Candida utilis using mixed sugar as a fermentation raw material
  • Candida utilis CuLpLDH strain was used as a microorganism, and continuous fermentation was performed without using a separation membrane.
  • the pre-culture was performed for 40 hours, the pH was adjusted to 6.0 with 1N calcium hydroxide, and the medium was the same as in Comparative Example 6 except that the D-lactic acid fermentation mixed sugar medium 2 shown in Table 24 was used.
  • D-lactic acid was produced by continuous fermentation for 290 hours (Table 25).
  • Example 7 Production of D-lactic acid by continuous fermentation using a separation membrane of Candida utilis using mixed sugar as a fermentation raw material 1 Using Candida utilis CuLpLDH strain as a microorganism, continuous fermentation using a separation membrane was performed. The pre-culture was performed for 50 hours, the pH was adjusted to 6.0 with 1N calcium hydroxide, and the medium was used under the same conditions as in Example 4 except that the D-lactic acid fermentation mixed sugar medium 2 shown in Table 24 was used. D-lactic acid was produced by continuous fermentation for 310 hours.
  • the preculture was inoculated into 1 L of ethanol fermentation medium 2 having the composition shown in Table 26, and subjected to batch fermentation for 16 hours under the following operating conditions while adjusting the temperature and pH to produce ethanol (Table 28). ).
  • Culture tank capacity 2 (L) Temperature adjustment: 30 (° C) Kla: 30 (h -1 ) pH adjustment: adjusted to pH 6 with 5N Ca (OH) 2 Sterilization: All fermenters and culture media are autoclaved at 121 ° C. for 20 min under high pressure steam sterilization.
  • Comparative Example 17 Production of Ethanol by Batch Fermentation of Escherichia coli Using Mixed Sugar as Fermentation Raw Material 24 Using ethanol-fermented mixed sugar medium 4 having the composition shown in Table 27 as the fermentation medium under the same conditions as in Comparative Example 16 Time batch fermentation was performed to produce ethanol (Table 28).
  • Ethanol was produced for 290 hours while controlling the medium supply rate so that the drawing rate of the culture solution containing microorganisms was constant and the amount of the culture solution in the culture tank was 1.5 L (Table 28).
  • Culture tank capacity 2 (L) Temperature adjustment: 30 (° C) Kla: 30 (h -1 ) pH adjustment: adjusted to pH 6 with 5N Ca (OH) 2 Fermentation liquid withdrawal rate: 2 L / day Sterilization: All fermenters and culture media are autoclaved at 121 ° C for 20 min under high pressure steam sterilization.
  • Example 8 Production of ethanol by continuous fermentation using Escherichia coli separation membrane using mixed sugar as a fermentation raw material
  • Escherichia coli KO11 strain was cultured overnight at 30 ° C. in 2 mL of a preculture medium (glucose 20 g / L, yeast extract 10 g / L, tryptone 5 g / L, NaCl 5 g / L) in a test tube. ).
  • the obtained culture solution was inoculated into a 50 mL preculture medium in a 500 mL pleated Erlenmeyer flask and cultured overnight (pre-culture).
  • the transmembrane pressure difference during filtration ranges from 0.1 to 19.8 kPa.
  • the ethanol was produced by continuous fermentation for 310 hours (Table 28).
  • Fermenter capacity 2 (L) Separation membrane used: Polyvinylidene fluoride filtration membrane separation element Effective filtration area: 473 cm 2 Pure water permeability coefficient of separation membrane: 50 ⁇ 10 ⁇ 9 m 3 / m 2 / s / Pa Separation membrane average pore size: 0.1 ⁇ m Standard deviation of average pore diameter: ⁇ 0.035 ⁇ m Separation membrane surface roughness: 0.06 ⁇ m Temperature adjustment: 30 (° C) pH adjustment: adjusted to pH 6 with 5N Ca (OH) 2 Fermentation liquid withdrawal rate: 2 L / day Sterilization: All fermenters and separation media including separation membrane elements are autoclaved at 121 ° C. for 20 min under high pressure steam sterilization.
  • Example 9 Production of L-lactic acid by continuous culture using Bacillus coagulans separation membrane using biomass-derived sugar liquid (glucose, xylose) as fermentation raw material Biomass-derived sugar liquid was used as a fermentation raw material.
  • biomass-derived sugar liquid glucose, xylose
  • the medium shown in Table 29 was used as the lactic acid fermentation sugar solution medium. Lactic acid was produced by continuous culture using a separation membrane for 260 hours under the same conditions as in Example 1 except that the medium used and the neutralizing agent were changed to 4N KOH.
  • Example 10 Production of Ethanol by Continuous Culture Using Escherichia coli Separation Membrane Using Biomass-derived Sugar (Glucose, Xylose) as Fermentation Raw Material As in Example 8 using the ethanol fermentation sugar solution medium shown in Table 27 Under these conditions, continuous culture using a separation membrane was performed for 295 hours to produce ethanol.
  • Biomass-derived Sugar Glucose, Xylose
  • Comparative Example 24 Production of Ethanol by Continuous Culture of Candida tropicalis Using Mixed Sugar as Fermentation Raw Material Continuous culture for 350 hours under the same conditions as in Comparative Example 6 using ethanol fermentation mixed sugar medium 5 shown in Table 33 To produce ethanol (Table 34).
  • Example 11 Production of ethanol by continuous culture using a separation membrane of Candida tropicalis using mixed sugar (glucose, xylose) as fermentation raw material 2 Using ethanol-fermented mixed sugar medium 5 shown in Table 33, continuous culture was performed for 360 hours under the same conditions as in Example 4 to produce ethanol (Table 34).
  • Example 12 Production of ethanol by continuous fermentation using a ceramic separation membrane of Candida tropicalis using mixed sugar as a fermentation raw material 3
  • Candida tropicalis NBRC0199 strain was used for continuous fermentation using a ceramic separation membrane.
  • the medium shown in Table 33 was used as the fermentation medium.
  • Candida tropicalis NBRC0199 strain was cultured in a test tube with shaking in 2 mL of YPD medium at 30 ° C. overnight (pre-culture).
  • the obtained culture broth was inoculated into a 500 mL pleated Erlenmeyer flask containing 50 mL of YPD medium and cultured overnight with shaking (pre-culture).
  • the culture solution was inoculated into a membrane-separated continuous fermentation apparatus (apparatus shown in FIG.
  • Culture tank capacity 2L Separation membrane used: Celfit microfiltration membrane monolith ⁇ 4-19 (NGK) Membrane separation element length: 500mm Separation membrane average pore size: 0.1 ⁇ m Temperature adjustment: 30 ° C Aeration volume of fermentation reaction tank: 100 (mL / min) Fermentation reactor stirring speed: 800 (rpm) pH adjustment: None.
  • Example 13 Production of 2,3-butanediol by continuous culture using a separation membrane made of Paenibacillus polymixer ceramic using a mixed sugar (glucose, xylose) as a fermentation raw material 2
  • Paenibacillus polymixer ATCC12321 strain continuous fermentation using a ceramic separation membrane was performed.
  • Paenibacillus polymixer ATCC12321 strain was cultured overnight at 30 ° C. in 2 mL of a preculture medium (glucose 5 g / L, peptone 5 g / L, yeast extract 3 g / L, malt extract 3 g / L) in a test tube. culture).
  • the obtained culture solution was inoculated into a 50 mL preculture medium in a 500 mL pleated Erlenmeyer flask and cultured overnight (pre-culture).
  • the culture solution Prior to inoculation, the culture solution was inoculated into a continuous culture apparatus (apparatus shown in FIG. 2 of WO2007 / 097260) containing a 2,3-butanediol fermentation mixed sugar medium having the composition shown in Table 16 to adjust the temperature and pH.
  • batch fermentation was performed for 30 hours under the following operating conditions (preculture). After completion of the preculture, continuous culture was started immediately using a 2,3-butanediol fermentation mixed sugar medium having the composition shown in Table 16 to produce 2,3-butanediol.
  • 2,3-butanediol was produced by continuous fermentation for 300 hours while adjusting the transmembrane pressure difference during filtration to 500 kPa or less (Table 35).
  • Fermenter capacity 2 (L) Separation membrane used: Celfit microfiltration membrane monolith ⁇ 4-19 (NGK) Membrane separation element length: 500mm Separation membrane average pore size: 0.1 ⁇ m Temperature adjustment: 30 (° C) Aeration volume of fermentation reaction tank: 100 (mL / min) Fermentation reactor stirring speed: 800 (rpm) pH adjustment: adjusted to pH 6.5 with 5N Ca (OH) 2
  • the efficiency of fermentation production of various chemicals using fermentation raw materials containing pentose and hexose can be greatly improved.

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Abstract

［課題］六炭糖と五炭糖の混合糖を発酵原料とした高収率の化学品の製造方法を提供すること。 ［解決手段］微生物の培養液を分離膜で濾過すること、未濾過液を培養液に保持または還流すること、発酵原料を培養液に追加すること、および濾過液中の生産物を回収することを含む、連続発酵による化学品の製造方法であって、前記微生物がカタボライト抑制を受ける微生物であり、前記発酵原料が六炭糖および五炭糖を含む、化学品の製造方法を提供した。

Description

化学品の製造方法
　本発明は、六炭糖および五炭糖を含む発酵原料を使用した連続発酵による化学品の製造方法に関する。
　乳酸などの生分解性ポリマー原料やエタノールなどのバイオ燃料に代表されるバイオマス由来の化学品は、大気中への二酸化炭素の排出問題やエネルギー問題の顕在化と共にサスティナビリティー（持続可能性）およびライフサイクルアセスメント（ＬＣＡ）対応型製品として強い注目を浴びている。これら生分解性ポリマー原料やバイオ燃料の製造方法としては、とうもろこしなどの可食性バイオマスから精製した六炭糖であるグルコースを微生物の発酵原料に使用し、発酵産物として得るのが一般的であるが、可食性バイオマスを使用すると、食料と競合することから価格高騰が引き起こされ、安定した原料の調達ができなくなる恐れがある。そこで、稲わらなどの非可食性バイオマス由来の糖を微生物の発酵原料に使用する試みが行われている（特許文献１参照。）。
　非可食性バイオマス由来の糖を発酵原料に使用する際には、非可食バイオマスに含まれるセルロース、ヘミセルロースなどを糖化酵素によって糖に分解するが、この際にグルコースなどの六炭糖だけではなく、キシロースなどの五炭糖も同時に得られ、非可食性バイオマス由来の糖を微生物の発酵原料に使用する場合、六炭糖と五炭糖の混合糖を発酵原料として使用することになる（特許文献１参照。）。
　六炭糖と五炭糖の混合糖である非可食性バイオマス由来の糖を微生物の発酵原料とした発酵方法としては連続発酵が採用されうるが、実際に連続発酵した場合の発酵収率については確認されていない（特許文献１参照。）。一方で、六炭糖と五炭糖の混合糖を発酵原料として連続発酵する場合、培地が連続的に発酵に利用されるため、バッチ発酵の場合よりもカタボライト抑制を連続的に受けることによってバッチ発酵よりも発酵収率が著しく低下してしまうことも知られている（非特許文献１参照。）。したがって、六炭糖と五炭糖の混合糖を微生物の発酵原料とした連続発酵によって発酵収率を向上させようとする場合、カタボライト抑制を受けないような微生物を用いる必要があると考えるのがこれまでの技術常識であった。
ＷＯ２０１０／０６７７８５
Ｄｏ　Ｙｕｎ　Ｋｉｍ，Ｓｅｏｎｇ　Ｃｈｕｎ　Ｙｉｍ，Ｐｙｕｎｇ　Ｃｈｅｏｎ　Ｌｅｅ，Ｗｏｏ　Ｇｉ　Ｌｅｅ，Ｓａｎｇ　Ｙｕｐ　Ｌｅｅ，Ｈｏ　Ｎａｍ　Ｃｈａｎｇ，Ｂａｔｃｈ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｕｃｃｉｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｆｒｏｍ　ｗｏｏｄ　ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ　ｂｙ　Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ　ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ　ＭＢＥＬ５５Ｅ，Ｅｎｚｙｍｅ　ａｎｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３５，（２００４），６４８－６５３．
　生分解性ポリマー原料やバイオ燃料を発酵生産する微生物として、カタボライト抑制を受けるものが数多く知られている。一方、前述のとおり、六炭糖と五炭糖の混合糖を微生物の発酵原料として連続発酵をした場合には、カタボライト抑制により発酵収率が著しく低下してしまうことが知られている。そこで本発明は、六炭糖と五炭糖の混合糖をカタボライト抑制を受ける微生物の発酵原料として連続発酵する場合の発酵収率の向上を課題とするものである。
　本発明者は、上記課題を鋭意検討した結果、六炭糖と五炭糖の混合糖を微生物の発酵原料として連続発酵する化学品の製造方法において、カタボライト抑制を有する微生物を、分離膜を用いた連続発酵を行なうことで上記課題を解決することを見出し、本発明に至ったものである。
　すなわち、本発明は以下の（１）～（５）の通りである。
（１）微生物の培養液を分離膜で濾過すること、未濾過液を培養液に保持または還流すること、発酵原料を培養液に追加すること、および濾過液中の生産物を回収することを含む、連続発酵による化学品の製造方法であって、前記微生物がカタボライト抑制を受ける微生物であり、前記発酵原料が六炭糖および五炭糖を含む、化学品の製造方法。
（２）前記濾過液総量の五炭糖の濃度が５ｇ／Ｌ以下である、（１）に記載の化学品の製造方法。
（３）前記発酵原料中に含まれる六炭糖と五炭糖の重量比率が１：９～９：１である、（１）または（２）に記載の化学品の製造方法。
（４）前記発酵原料がバイオマス由来の糖液を含む、（１）または（２）に記載の化学品の製造方法。
（５）前記五炭糖がキシロースである、（１）から（４）のいずれかに記載の化学品の製造方法。
　本発明によれば、六炭糖と五炭糖の混合糖をカタボライト抑制を受ける微生物の発酵原料とするにもかかわらず、化学品を高収率で製造することができる。
　本発明は、微生物を発酵原料で培養して化学品を発酵生産する化学品の製造方法において、培養液を分離膜で濾過し未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を培養液に追加して濾過液中の生産物を回収する連続発酵する化学品の製造方法であって、カタボライト抑制を受ける前記微生物を用い、かつ、前記発酵原料が六炭糖および五炭糖を含むことを特徴とする化学品の製造方法である。
　本発明の化学品の製造方法においては、発酵原料の炭素源には五炭糖と六炭糖を含む混合糖が含まれる。五炭糖とは、糖を構成する炭素の数が５つのものであり、ペントース（Ｐｅｎｔｏｓｅ）とも呼ばれる。１位にアルデヒド基をもつアルドペントースと２位にケトン基をもつケトペントースがある。アルドペントースとしては、キシロース、アラビノース、リボース、リキソースが挙げられ、ケトペントースとしては、リブロース、キシルロースが挙げられる。本発明で用いる五炭糖としては、微生物が資化できるものであればいずれでも良いが、自然界での存在割合や入手のしやすさなどの観点から、好ましくはキシロース、アラビノースであり、より好ましくはキシロースである。
　六炭糖とは、糖を構成する炭素の数が６つのものであり、ヘキソース（Ｈｅｘｏｓｅ）とも呼ばれる。１位にアルデヒド基をもつアルドースと２位にケトン基をもつケトースがある。アルドースとしては、グルコース、マンノース、ガラクトース、アロース、グロース、タロースなどが挙げられ、ケトースとしては、フルクトース、プシコース、ソルボースなどが挙げられる。本発明で用いる六炭糖としては、微生物が資化できるものであればいずれでも良いが、自然界での存在割合や入手のしやすさなどの観点から、好ましくはグルコース、マンノース、ガラクトースであり、より好ましくはグルコースである。
　本発明で使用される混合糖に関しては特に限定されないが、六炭糖と五炭糖を両方含むことが知られているセルロース含有バイオマス由来糖液が好ましく使用される。セルロース含有バイオマスには、バガス、スイッチグラス、コーンストーバー、稲わら、麦わらなど草木系バイオマスと、樹木、廃建材などの木質系バイオマスなどを例として挙げることができる。セルロース含有バイオマスは、糖が脱水縮合した多糖であるセルロースあるいはヘミセルロースを含有しており、こうした多糖を加水分解することで発酵原料として利用可能な糖液が製造される。セルロース含有バイオマス由来糖液の調製方法は、どのような方法であってもよく、こうした糖の製造方法としては、濃硫酸を使用してバイオマスを酸加水分解して糖液を製造する方法（特表平１１－５０６９３４号公報、特開２００５－２２９８２１号公報）、バイオマスを希硫酸で加水分解処理した後に、さらにセルラーゼなどの酵素処理することより糖液を製造する方法が開示されている（Ａ．Ａｄｅｎら、“ＬｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃＢｉｏｍａｓｓ　ｔｏ　Ｅｔｈａｎｏｌ　Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ　Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ　Ｃｏ－Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｄｉｌｕｔｅ　Ａｃｉｄ　Ｐｒｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｆｏｒ　Ｃｏｒｎ　Ｓｔｏｖｅｒ”ＮＲＥＬ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｒｅｐｏｒｔ（２００２））。また酸を使用しない方法として、２５０～５００℃程度の亜臨界水を使用しバイオマスを加水分解して糖液を製造する方法（特開２００３－２１２８８８号公報）、またバイオマスを亜臨界水処理した後に、さらに酵素処理することにより糖液を製造する方法（特開２００１－９５５９７号公報）、バイオマスを２４０～２８０℃の加圧熱水で加水分解処理した後に、さらに酵素処理することにより糖液を製造する方法（特許３０４１３８０号公報）が開示されている。以上のような処理の後、得られた糖液を精製してもよい。その方法は、例えばＷＯ２０１０／０６７７８５に開示されている。
　混合糖に含まれる五炭糖と六炭糖の重量比率は特に制限はないが、混合糖中の五炭糖と六炭糖の重量比率として（五炭糖）：（六炭糖）と表すと、１：９～９：１が好ましい。これは、混合糖としてセルロース含有バイオマス由来糖液を想定した場合の糖比率である。
　本発明に使用する発酵原料に含まれる総糖濃度は特に制限されず、微生物の化学品の生産を阻害しない範囲であれば可能な限り高い濃度であることが好ましい。具体的には、培地中の炭素源の濃度は、１５～５００ｇ／Ｌが好ましく、２０～３００ｇ／Ｌがより好ましい。総濃度が１５ｇ／Ｌ以下であると、五炭糖からの収率向上の効果が低下してしまうことがある。また、総糖濃度が低いと化学品の生産効率も低下してしまう。
　本発明に使用する発酵原料に含まれる六炭糖濃度は、上記の総糖濃度、五炭糖と六炭糖の割合の範囲において特に限定されないが、本発明の化学品の製造方法を用いれば、六炭糖を濃度５ｇ／Ｌ以上含む混合糖液においても良好な収率を得ることができる。
　本発明で使用する発酵原料は、炭素源、窒素源、無機塩類、および必要に応じてアミノ酸、およびビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する通常の液体培地が良い。
　本発明で使用する窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば、油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜添加使用することができる。
　本発明で使用される微生物が生育のために特定の栄養素を必要とする場合には、その栄養物を標品もしくはそれを含有する天然物として添加する。また、消泡剤も必要に応じて使用する。本発明において、培養液とは、発酵原料に微生物が増殖した結果得られる液のことを言う。追加する発酵原料の組成は、目的とする化学品の生産性が高くなるように、培養開始時の発酵原料組成から適宜変更しても良い。
　次に、本発明において分離膜として用いられる多孔性膜について説明する。
　本発明に用いる多孔質膜については特に制限はなく、微生物の撹拌型培養器あるいは撹拌型バイオリアクターによる培養で得られた培養液を微生物から分離濾過する機能を有するものであればよく、例えば多孔質セラミック膜、多孔質ガラス膜、多孔質有機高分子膜、金属繊維編織体、不織布などを用いることができる。これらの中で特に多孔質有機高分子膜もしくはセラミック膜が好適である。
　本発明で分離膜として用いられる多孔性膜の構成について説明する。本発明で用いられる多孔性膜は、好ましくは、被処理水の水質や用途に応じた分離性能と透水性能を有するものである。
　多孔性膜は、阻止性能および透水性能や分離性能、例えば、耐汚れ性の点から、多孔質樹脂層を含む多孔性膜であることが好ましい。
　多孔質樹脂層を含む多孔性膜は、好ましくは、多孔質基材の表面に、分離機能層として作用とする多孔質樹脂層を有している。多孔質基材は、多孔質樹脂層を支持して分離膜に強度を与える。
　本発明で用いられる多孔性膜が、多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を有している場合、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していても、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していなくてもどちらでも良く、用途に応じて選択される。
　多孔質基材の平均厚みは、好ましくは５０μｍ以上３０００μｍ以下である。
　多孔質基材の材質は、有機材料および／または無機材料等からなり、有機繊維が望ましく用いられる。好ましい多孔質基材は、セルロース繊維、セルローストリアセテート繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維およびポリエチレン繊維などの有機繊維なる織布や不織布であり、より好ましくは、密度の制御が比較的容易であり製造も容易で安価な不織布が用いられる。
　多孔質樹脂層は、有機高分子膜を好適に使用することができる。有機高分子膜の材質としては、例えば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、セルロース系樹脂およびセルローストリアセテート系樹脂などが挙げられる。有機高分子膜は、これらの樹脂を主成分とする樹脂の混合物であってもよい。ここで主成分とは、その成分が５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上含有することをいう。有機高分子膜の材質は、溶液による製膜が容易で物理的耐久性や耐薬品性にも優れているポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂およびポリアクリロニトリル系樹脂が好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはそれを主成分とする樹脂が最も好ましく用いられる。
　ここで、ポリフッ化ビニリデン系樹脂としては、フッ化ビニリデンの単独重合体が好ましく用いられる。さらに、ポリフッ化ビニリデン系樹脂は、フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体との共重合体も好ましく用いられる。フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体としては、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレンおよび三塩化フッ化エチレンなどが例示される。
　本発明で分離膜として使用される多孔性膜は、特に制限はなく、発酵に使用される微生物が通過できなければよいが、発酵に使用される微生物の分泌物や発酵原料中の微粒子による目詰まりを起こりにくく、かつ、濾過性能が長期間安定に継続する範囲であることが望ましい。よって、多孔性分離膜の平均細孔径が、０.０１μｍ以上５μｍ未満であることが好ましい。また、さらに好ましくは、多孔性膜の平均細孔径が、０.０１μｍ以上１μｍ未満であると、微生物がリークすることのない高い排除率と、高い透水性を両立させることができ、透水性を長時間保持することが、より高い精度と再現性を持って実施することができる。
　微生物の大きさに近いと、これらが直接孔を塞いでしまう場合があるので、多孔性膜の平均細孔径は１μｍ未満であることが好ましい。多孔性膜の平均細孔径は、微生物の漏出、すなわち排除率が低下する不具合の発生を防止するため、微生物の大きさと比較して大きすぎないことが好ましい。微生物のうち、細胞の小さい細菌などを用いる場合には、平均細孔径として０.４μｍ以下が好ましく、０.２μｍ未満であればより好適に実施することができる。
　また、微生物が所望の生産物である化学品以外の物質、例えば、タンパク質や多糖類など凝集しやすい物質を生産する場合があり、更に、発酵培養液中の微生物の一部が死滅することにより細胞の破砕物が生成する場合があり、これらの物質による多孔性膜の閉塞を回避するために、平均細孔径は０．１μｍ以下であることがさらに好適である。
　平均細孔径が小さすぎると多孔性膜の透水性能が低下し、膜が汚れていなくても効率的な運転ができなくなるため、本発明における多孔性膜の平均細孔径は、好ましくは０.０１μｍ以上であり、より好ましくは０．０２μｍ以上であり、さらに好ましくは０．０４μｍ以上である。
　ここで、平均細孔径は、倍率１０，０００倍の走査型電子顕微鏡観察における、９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔すべての直径を測定し、平均することにより求めることができる。平均細孔径は、あるいは、膜表面を走査型電子顕微鏡を用いて倍率１０,０００倍で写真撮影し、１０個以上、好ましくは２０個以上の細孔を無作為に選び、それら細孔の直径を測定し、数平均して求めることもできる。細孔が円状でない場合、画像処理装置等によって、細孔が有する面積と等しい面積を有する円（等価円）を求め、等価円直径を細孔の直径とする方法により求めることができる。
　本発明で用いられる多孔性膜の平均細孔径の標準偏差σは、０．１μｍ以下であることが好ましい。平均細孔径の標準偏差σは小さければ小さい方が望ましい。平均細孔径の標準偏差σは、上述の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔数をＮとして、測定した各々の直径をＸｋとし、細孔直径の平均をＸ（ａｖｅ）とした下記の（式１）により算出される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　本発明で用いられる多孔性膜においては、発酵培養液の透過性が重要な性能の一つである。多孔性膜の透過性の指標として、使用前の多孔性膜の純水透過係数を用いることができる。本発明において、多孔性膜の純水透過係数は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、５．６×１０－１０ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上であることが好ましく、純水透過係数が、５．６×１０－１０ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０－７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下であれば、実用的に十分な透過水量が得られる。
　本発明で用いられる多孔性膜において、表面粗さとは、表面に対して垂直方向の高さの平均値である。膜表面粗さは、分離膜表面に付着した微生物が、撹拌や循環ポンプによる液流による膜面洗浄効果で剥離しやすくするための因子の一つである。多孔性膜の表面粗さは、特に制限はなく、膜に付着した微生物、ならびにその他の固形物が剥がれる範囲であればよいが、０.１μｍ以下であることが好ましい。表面粗さが０．１μｍ以下であると、膜に付着した微生物、ならびにその他の固形物が剥がれやすくなる。
　さらに好ましくは、多孔性膜の膜表面粗さが０.１μｍ以下であり、平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満であり、多孔性膜の純水透過係数が２×１０－９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上の多孔性膜を使用することにより、膜面洗浄に必要な動力を過度に必要としない運転が、より容易に可能であることがわかった。多孔性膜の表面粗さを、０.１μｍ以下とすることにより、微生物の濾過において、膜表面で発生する剪断力を低下させることができ、微生物の破壊が抑制され、多孔性膜の目詰まりも抑制されることにより、長期間安定な濾過が、より容易に可能になる。また、多孔性膜の表面粗さを、０.１μｍ以下とすることにより、より低い膜間差圧で連続発酵が実施可能であり、多孔性膜が目詰まりした場合でも高い膜間差圧で運転した場合に比べて、洗浄回復性が良好である。多孔性膜の目詰まりを抑えることにより、安定した連続発酵が可能になることから、多孔性膜の表面粗さは小さければ小さいほど好ましい。
　ここで、多孔性膜の膜表面粗さは、下記の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）を使用して、下記の条件で測定したものである。
・装置　　原子間力顕微鏡装置（Digital Instruments（株）製“Nanoscope IIIa”）
・条件　　探針　　　　ＳｉＮカンチレバー（Digital Instruments（株）製）
　　　　　走査モード　コンタクトモード（気中測定）
　　　　　　　　　　　水中タッピングモード（水中測定）
　　　　　走査範囲　　１０μｍ、２５μｍ四方（気中測定）
　　　　　　　　　　　５μｍ、１０μｍ四方（水中測定）
　　　　　走査解像度　５１２×５１２
・試料調製　測定に際し膜サンプルは、常温でエタノールに１５分浸漬後、ＲＯ水中に２４時間浸漬し洗浄した後、風乾し用いた。ＲＯ水とは、濾過膜の一種である逆浸透膜（ＲＯ膜）を用いて濾過し、イオンや塩類などの不純物を排除した水を指す。ＲＯ膜の孔の大きさは、概ね２ｎｍ以下である。
　膜表面粗さｄｒｏｕｇｈは、上記の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）により各ポイントのＺ軸方向の高さから、下記の（式２）により算出する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　本発明で用いられる多孔性膜の形状は、好ましくは平膜である。多孔性膜の形状が平膜の場合、その平均厚みは用途に応じて選択される。多孔性膜の形状が平膜の場合の平均厚みは、好ましくは２０μｍ以上５０００μｍ以下であり、より好ましくは５０μｍ以上２０００μｍ以下である。また、本発明で用いられる多孔性膜の形状は、好ましくは中空糸膜である。多孔性膜が中空糸膜の場合、中空糸の内径は、好ましくは２００μｍ以上５０００μｍ以下であり、膜厚は、好ましくは２０μｍ以上２０００μｍ以下である。また、有機繊維または無機繊維を筒状にした織物や編物を中空糸の内部に含んでいても良い。
　なお、前述の多孔性膜は、例えばＷＯ２００７／０９７２６０に記載される製造方法により製造することができる。
　また、別の好ましい形態として、本発明における分離膜は、少なくともセラミックスを含む膜であり得る。本発明におけるセラミックスとは金属酸化物を含有し、高温での熱処理により焼き固められたものをさす。金属酸化物としては、アルミナ、マグネシア、チタニア、ジルコニアなどが例示できる。分離膜は金属酸化物のみから形成されてもよく、シリカや炭化珪素、シリカと金属酸化物の化合物であるムライトやコージェライトなどを含んでもよい。
　分離膜を形成するセラミックス以外の成分は、分離膜としての多孔質体をなすことができるものであれば特に限定されない。
　分離膜がセラミックスを含む場合もその形状には特に制限はなく、モノリス膜、平膜、管状膜などいずれも用いることができる。容器内への充填効率の観点から柱状構造であり、長手方向に貫通孔を有する構造のものが好ましい。充填効率が上げられる点から、好ましくはモノリス膜である。
　長手方向に貫通孔を有することが好ましい理由は以下のとおりである。柱状構造を有する分離膜をモジュール容器に収めて分離膜モジュールとして用いる場合は、分離膜は外圧式および内圧式のうちから好適な態様を選択してモジュール化、濾過することが可能となる。本発明においては、これ以降、分離膜が発酵培養液と接する側を１次側、濾過により化学品を含む濾液が得られる側を２次側とそれぞれ呼ぶこととする。
　内圧式モジュールを用いると、１次側の流路が狭いため、クロスフロー濾過を行う場合に循環ポンプの出力が節約できる。さらに、分離膜表面に堆積した濁質をモジュール外に排出する作用が強くなり、分離膜表面が清浄に保たれやすいため好ましい。ただし、この効果を得るためには、内圧式の分離膜が発酵培養液の入り口および出口を有していることが前提となる。このときの入り口および出口は一直線に配された貫通孔の状態であると、通液抵抗が小さくなるため好ましい。さらに分離膜が柱状構造で、貫通孔が長手方向に空いていることによって、分離膜を収める容器を細くすることが可能となる。分離膜モジュールが細いと、製造や取り扱いの観点から好ましく用いることが出来る。
　分離膜の気孔率は特に限定されないが、低すぎると濾過効率が悪くなり、高すぎると強度が低下してしまう。濾過効率と分離膜の強度を両立させ、繰り返し蒸気滅菌への耐性も持たせるためには、２０％以上６０％以下であることが好ましい。
　なお気孔率は、以下の式より決定される。
気孔率［％］＝１００×（湿潤膜重量[ｇ]－乾燥膜重量[ｇ]）／水比重[ｇ／ｃｍ３]／（膜体積［ｃｍ３］）。
　分離膜の平均気孔径は０．０１μｍ以上１μｍ以下であれば好ましく、この範囲の平均気孔径を有する膜であれば分離膜が閉塞しにくく、かつ濾過効率にも優れる。また、平均気孔径が０．０２μｍ以上０．２μｍ以下の範囲であれば、タンパク質、多糖類などに例示される微生物や培養細胞による発酵の副生成物や、培養液中の微生物/培養細胞が死滅して生じる細胞破砕物といった、分離膜を閉塞させやすい物質の閉塞が起きにくくなるため特に好ましい。
　貫通孔を有する柱状構造の分離膜は、外表面が２次側となるため、濾過液を集めるためにモジュール容器を設け、モジュール容器内に分離膜を充填したモジュールとして用いることが好ましい。１本のモジュールに充填される分離膜は１本以上である。
　モジュール容器は、繰り返しの蒸気滅菌処理に耐えうる原料からなることが好ましい。蒸気滅菌処理に耐えうる原料としては、たとえばステンレス鋼や、平均気孔率の低いセラミックスなどが例示される。
　このようなセラミック膜モジュールは、例えばＷＯ２０１２／０８６７６３に記載される製造方法により製造することができるが、市販のものを利用することもできる。市販のものとして具体的に例示すると、ＭＥＭＢＲＡＬＯＸ精密ろ過膜（Ｐａｌｌ）、セラミック膜フィルターセフィルトＭＦ膜（日本ガイシ）などが挙げられる。
　次に、連続発酵について説明する。
　本発明の化学品の製造方法においては、濾過時の膜間差圧は特に制限されることはなく、発酵培養液を濾過できればよい。しかし、培養液を濾過するために、有機高分子膜において１５０ｋＰａより高い膜間差圧で濾過処理すると、有機高分子膜の構造が破壊される可能性が高くなり、化学品を生産する能力が低下することがある。また、０．１ｋＰａより低い膜間差圧では、発酵培養液の透過水量が十分得られない場合があり、化学品を製造するときの生産性が低下する傾向がある。したがって、本発明の化学品の製造方法では、有機高分子膜においては、濾過圧力である膜間差圧を好ましくは０．１ｋＰａから１５０ｋＰａの範囲とすることにより、発酵培養液の透過水量が多く、膜の構造の破壊による化学品製造能力の低下もないことから、化学品を生産する能力を高く維持することが可能である。膜間差圧は、有機高分子膜においては、好ましくは０.１ｋＰａ以上５０ｋＰａ以下の範囲であり、さらに好ましくは０.１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲である。
　セラミック膜を用いる場合においても、濾過時の膜間差圧は特に制限されることはなく、発酵培養液を濾過できればよいが、５００ｋＰａ以下が好ましい。５００ｋＰａ以上で運転すると、膜の目詰まりが発生し、連続発酵運転に不具合を生じることがある。
　濾過の駆動力としては、発酵液と多孔性膜処理水の液位差（水頭差）を利用したサイホン、またはクロスフロー循環ポンプにより分離膜に膜間差圧を発生させることができる。また、濾過の駆動力として分離膜２次側に吸引ポンプを設置してもよい。また、クロスフロー循環ポンプを使用する場合には、吸引圧力により膜間差圧を制御することができる。更に、発酵液側の圧力を導入する気体または液体の圧力によっても膜間差圧を制御することができる。これら圧力制御を行う場合には、発酵液側の圧力と多孔性膜処理水側の圧力差をもって膜間差圧とし、膜間差圧の制御に用いることができる。
　本発明では、分離膜を透過した濾過液総量の五炭糖の濃度が５ｇ／ｌ以下に保持されることが好ましい。六炭糖と五炭糖の混合糖を含む発酵原料を使用して、カタボライト抑制を受ける微生物を用いて連続発酵を行うと、培地が連続的に発酵に利用されるため、バッチ発酵の場合よりもカタボライト抑制を連続的に受け、その結果、五炭糖のみが培養液中に大量に残り、生産収率が低下してしまうが、本発明では、連続発酵に分離膜を使用することでカタボライト抑制を受ける微生物を用いても濾過液総量の五炭糖濃度を５ｇ／ｌ以下に保持することができ、その結果、分離膜を使用しない連続発酵に比べて化学品の生産収率を向上することができる。分離膜で得られた濾過液総量に五炭糖が５ｇ／ｌ以上残ってしまうと、五炭糖からの収率向上の効果が低下してしまうことがあり、その結果、生産収率も低下してしまうことがある。なお、ここで言う生産収率とは、連続培養における生産収率であり、次の（式３）で計算され、ある一定期間内で原料炭素源を消費し生成された化学品量（ｇ）を、その期間の投入炭素源量（ｇ）で除して求められる。この際に、生産物を生産するのに利用されなかった糖も、投入炭素源量の中に計算される。
生産収率（ｇ／ｇ）＝生産物量（ｇ）÷投入炭素源量（ｇ）・・・（式３）。
　濾過液総量の五炭糖の濃度は培養条件によって調節することができる。例えば、発酵原料中に含まれる糖の濃度、糖の供給速度や希釈率を変化させることで、濾過液総量の五炭糖の濃度を減らすことも可能である。あるいは、発酵原料中に含まれる栄養源を増加させることで、微生物の糖の消費を向上させ、濾過液総量の五炭糖の濃度を減らすことも可能である。
　本発明において、微生物の発酵培養において、ｐＨ、温度は微生物が生育する範囲であれば特に限定されないが、ｐＨが４～８で温度が２０～７５℃の範囲で行われるのが好ましい。培養液のｐＨは、無機あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウム、アンモニアガスなどによって、通常、ｐＨ４～８範囲内のあらかじめ定められた値に調節する。酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を２１％以上に保つ、あるいは培養液を加圧する、攪拌速度を上げる、通気量を上げるなどの手段を用いることができる。
　また、本発明の化学品の製造方法では、培養初期にバッチ培養またはフェドバッチ培養を行って微生物濃度を高くした後に、連続発酵（培養液の濾過）を開始しても良い。また、高濃度の菌体をシードし、培養開始とともに連続発酵を行っても良い。本発明の化学品の製造方法では、適当な時期から、培地供給および培養液の濾過を行うことが可能である。培地供給と培養液の濾過の開始時期は、必ずしも同じである必要はない。また、培地供給と培養液の濾過は連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。
　原料培養液には、菌体増殖に必要な栄養素を添加し、菌体増殖が連続的に行われるようにすればよい。培養液中の微生物の濃度は、化学品の生産性を高い状態で維持することが効率よい生産性を得るのに好ましい。培養液中の微生物の濃度は、一例として、乾燥重量として、５ｇ／Ｌ以上に維持することで良好な生産効率が得られる。
　本発明の化学品の製造方法では、連続発酵の途中において必要に応じて、発酵槽内から微生物を含んだ培養液の一部を取り除いた上、培地で希釈することによって、培養槽内の微生物濃度を調整してもよい。例えば、発酵槽内の微生物濃度が高くなりすぎると、分離膜の閉塞が発生しやすくなることから、微生物を含んだ培養液の一部を取り除き、培地で希釈することで、閉塞から回避することができることがある。また、発酵槽内の微生物濃度によって化学品の生産性能が変化することがあり、生産性能を指標として、微生物を含んだ培養液の一部を取り除いて培地で希釈することで生産性能を維持させることも可能である。
　本発明の化学品の製造方法では、菌体を増殖しつつ生産物を生成する連続発酵培養法であれば、発酵槽の数は問わない。
　本発明では、従来のバッチ培養と比較して、高い体積生産速度が得られ、極めて効率のよい連続発酵生産が可能となる。ここで、連続発酵培養における生産速度は、次の式（４）で計算される。
発酵生産速度（ｇ／Ｌ／ｈｒ）＝濾液中の生産物濃度（ｇ／Ｌ）×発酵培養液抜き取り速度（Ｌ／ｈｒ）÷装置の運転液量（Ｌ）・・・（式４）。
　また、バッチ培養での発酵生産速度は、原料炭素源をすべて消費した時点の生産物量（ｇ）を、炭素源の消費に要した時間（ｈｒ）とその時点の発酵培養液量（Ｌ）で除して求められる。
　また、連続培養における収率は、次の式（５）で計算され、ある一定期間内で原料炭素源を消費し生成された化学品量（ｇ）を、その期間の投入炭素源量（ｇ）から微生物が利用できなかった未利用炭素源量（ｇ）を引いた値で除して求められる。本明細書で言う収率とは、特に断らない限りこのことを指す。
収率（ｇ／ｇ）＝生産物量（ｇ）÷｛投入炭素源量（ｇ）－未利用炭素源量（ｇ）｝・・・・（式５）。
　本発明で用いられる連続発酵装置は、微生物の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を前記の発酵培養液に追加して濾過液中の生産物を回収する連続発酵による化学品の製造装置であれば特に制限はないが、具体例を挙げると、有機高分子膜を使用する際は、ＷＯ２００７／０９７２６０に記載される装置が使用できる。また、セラミック膜を使用する際は、ＷＯ２０１２／０８６７６３に記載される装置が使用できる。
　次に、本発明の化学品の製造方法に用いることができる微生物について説明する。
　本発明で用いられるカタボライト抑制を受ける微生物とは、一般に五炭糖を資化する微生物を発酵する際に、六炭糖と五炭糖を含む混合糖を含む発酵原料を使用すると、五炭糖の消費が抑えられてしまう微生物のことを言うが、本発明においてはより具体的に、グルコースとキシロースの資化能を有する微生物を使用したバッチ培養において、キシロース単独の培地でのキシロースの消費速度よりも、グルコースとキシロースを含む混合糖の培地でのキシロースの消費速度が遅い微生物について「カタボライト抑制を受ける微生物である」と言う。
　ここで、キシロース単独の培地でのキシロースの消費速度とは、下記の（式６）により算出される。
キシロースの消費速度（ｇ／Ｌ／ｈｒ）＝培養開始時の発酵原料に含まれる総キシロース量（ｇ）÷培養開始から発酵原料に含まれるキシロースを完全に消費し尽くすまでに費やした時間（ｈｒ）÷発酵液量（Ｌ）・・・（式６）。
　また、グルコースとキシロースを含む混合糖の培地でのキシロースの消費速度とは、グルコースとキシロースを含む混合糖の培地でのグルコース存在下でのキシロースの消費速度のことであり、下記の（式７）により算出される。
キシロースの消費速度（ｇ／Ｌ／ｈｒ）＝培養開始時から時間Tまでに消費されたキシロース量（ｇ）÷培養開始から時間Ｔまでの時間（ｈｒ）÷発酵液量（Ｌ）・・・（式７）。
　（式６）および（式７）において、キシロースの消費速度を算出する際、混合糖でのグルコースとキシロースの重量比率は１：１で行なう。また、キシロースの消費速度を比較する際、糖濃度は微生物が残存糖なく完全に消費できる濃度であれば特に限定されない。また、キシロース単独の培地でのキシロースの糖濃度と、グルコースとキシロースを含む混合糖の培地での総糖濃度は同じにする。
　また（式７）において、時間Ｔはグルコースが完全に消費された時間である。時間Ｔは、サンプリングした培養液をＨＰＬＣまたはキット、センサーによりグルコース濃度を測定し、求めることができる。ただし、グルコースが完全に消費された時間が、キシロースが完全に消費された時間よりも遅い場合は、時間Ｔはキシロースが完全に消費された時間とする。この場合においても時間Ｔはグルコース濃度の測定方法と同様に、キシロース濃度を測定することで求めることができる。また、培養中に中和剤添加やサンプリングなどで発酵液量が変化した場合は、培養液に追加した液量または減らした液量を考慮して計算を行うものとする。
　カタボライト抑制を受ける微生物は、発酵工業においてよく使用されるパン酵母などの酵母、大腸菌、コリネ型細菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌などから選択され、具体例として、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、パチソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属、クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、デバリオミセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、イッサチェンキア属（Ｉｓｓａｃｈｅｎｋｉａ）、ブレタノミセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、リンドネラ属（Ｌｉｎｄｎｅｒａ）、ウィッカーハモミセス属（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ）などの酵母、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属などの腸内細菌類や、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属などの乳酸菌類、またアクチノプラネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属などの放線菌類やバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アエロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アンプラリエラ（Ａｍｐｕｌｌａｒｉｅｌｌａ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属に属する微生物から選択されうる。
　また、カタボライト抑制を受ける微生物は、自然環境から単離されたものであっても、本来五炭糖を資化しないが突然変異や遺伝子組換えによって五炭糖を資化するように改変された微生物からも選択されうる。遺伝子組換えによって五炭糖を資化するように改変された微生物の具体例としては、遺伝子組換えにより五炭糖の代謝遺伝子を導入あるいは強化された微生物が挙げられる。特に、五炭糖のなかでもキシロースの代謝遺伝子については、キシロースイソメラーゼ、キシロースレダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼ、キシルロースキナーゼなどの酵素が例示され、こうした遺伝子組換え手法によりキシロースの資化性を付与された微生物としては、特表２００６－５２５０２９号公報、特開２００９－１１２２８９号公報、特表２０１０－５０４７５６号公報などに記載された微生物を例示できる。
　本発明により製造される化学品としては、上記微生物が発酵培養液中に生産する物質であれば制限はなく、アルコール、有機酸、アミノ酸、核酸など発酵工業において大量生産されている物質を挙げることができる。例えば、アルコールとしては、エタノール、１，３－プロパンジオール、１，３－ブタンジオール、２，３－ブタンジオール、１,４－ブタンジオール、グリセロール、ブタノール、イソブタノール、２－ブタノール、イソプロパノールなど、有機酸としては、酢酸、乳酸、アジピン酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、クエン酸、核酸であれば、イノシン、グアノシンなどのヌクレオシド、イノシン酸、グアニル酸などのヌクレオチド、また、カタベリンなどのジアミン化合物を挙げることができる。また、本発明は、酵素、抗生物質、組み換えタンパク質のような物質の生産に適用することも可能である。これら化学品は周知の方法（膜分離、濃縮、蒸留、晶析、抽出等）により濾過液より回収することができる。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
　（参考例１）グルコース、キシロース、エタノール、２，３－ブタンジオールの分析方法
　発酵液中のグルコース、キシロース、エタノールおよび２，３－ブタンジオールの濃度は、下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ　ＳＨ１０１１（昭和電工株式会社製）
移動相：５ｍＭ　硫酸（流速０．６ｍＬ／分）
反応液：なし
検出方法：ＲＩ（示差屈折率）
温度：６５℃。
　（参考例２）乳酸の分析方法
　発酵液中の乳酸を下記に示すＨＰＬＣ条件で標品との比較により定量した。
カラム：Ｓｈｉｍ－Ｐａｃｋ　ＳＰＲ－Ｈ（株式会社島津製作所製）
移動相：５ｍＭ　ｐ－トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５ｍＭ　ｐ－トルエンスルホン酸、２０ｍＭ　ビストリス、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。
　（参考例３）バチルス・コアギュランスでのキシロース消費速度算出
　乳酸発酵微生物であるバチルス・コアギュランスＮＢＲＣ１２７１４株の乳酸発酵時のキシロース消費速度を算出した。培地として表１に示す組成の乳酸発酵キシロース培地と表２に示す乳酸発酵混合糖培地１を用いた。適宜、サンプリングを行い、培養液中のグルコースおよびキシロースの濃度は参考例１の方法により、生産物である乳酸の濃度は参考例２の方法により測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　バチルス・コアギュランスＮＢＲＣ１２７１４株を炭酸カルシウムと共にフラスコで５０ｍＬの前培養培地(ポリペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物１ｇ／Ｌ）で２４時間振とう培養した（前培養）。前培養液を窒素ガスでパージした１Ｌの乳酸発酵キシロース培地、乳酸発酵混合糖培地１にそれぞれ植菌し、以下の条件でバッチ発酵を行った。
発酵反応槽容量：２（Ｌ）
温度調整：５０（℃）
反応槽通気量（窒素ガス）：１００（ｍＬ／分）
反応槽攪拌速度：２００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：５Ｎ　Ｃａ（ＯＨ）２によりｐＨ７に調整
滅菌：培養槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
　乳酸発酵キシロース培地と乳酸発酵混合糖培地１でのキシロース消費速度を前述の（式６）および（式７）に従い算出し、表７に示した。この結果から、バチルス・コアギュランスＮＢＲＣ１２７１４株はカタボライト抑制を受ける微生物であると判断した。
　（参考例４）キャンディダ・トロピカリスでのキシロース消費速度算出
　エタノール発酵微生物であるキャンディダ・トロピカリスＮＢＲＣ０１９９株のエタノール発酵時のキシロース消費速度を算出した。培地として表３に示す組成のエタノール発酵キシロース培地と表４に示すエタノール発酵混合糖培地１を用いた。適宜、サンプリングを行い、培養液中のグルコースおよびキシロースの濃度と、生産物であるエタノールの濃度は参考例１の方法により測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　キャンディダ・トロピカリスＮＢＲＣ０１９９株を試験管で２ｍＬのＹＰＤ培地にて３０℃で一晩振とう培養した（前々培養）。得られた培養液を新鮮なＹＰＤ培地５０ｍＬに植菌し、５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコで一晩振とう培養した（前培養）。前培養液を、２Ｌのエタノール発酵キシロース培地およびエタノール発酵混合糖培地に植菌し、以下の条件でバッチ培養を行った。
発酵反応槽容量：２（Ｌ）
温度調整：３０（℃）
反応槽通気量：１００（ｍＬ／分）
反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：なし
滅菌：培養槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
　エタノール発酵キシロース培地とエタノール発酵混合糖培地１でのキシロース消費速度を前述の（式６）および（式７）に従い算出し、表７に示した。この結果、キャンディダ・トロピカリスＮＢＲＣ０１９９株はカタボライト抑制を受ける微生物であると判断した。
　（参考例５）パエニバチラス・ポリミキサでのキシロース消費速度算出
　２，３－ブタンジオール発酵微生物であるパエニバチラス・ポリミキサＡＴＣＣ１２３２１株の２，３－ブタンジオール発酵時のキシロース消費速度を算出した。培地として表５に示す組成の２，３－ブタンジオール発酵キシロース培地と表６に示す２，３－ブタンジオール発酵混合糖培地１を用いた。適宜、サンプリングを行い、培養液中のグルコースおよびキシロースの濃度と、生産物である２，３－ブタンジオールの濃度は参考例１の方法により測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　パエニバチラス・ポリミキサＡＴＣＣ１２３２１株を試験管で５０ｍＬの前培養培地(グルコース５ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌ）で２４時間振とう培養した（前培養）。前培養液を１Ｌの２，３－ブタンジオール発酵キシロース培地と２，３－ブタンジオール発酵混合糖培地にそれぞれ植菌し、以下の条件でバッチ培養を行った。
発酵反応槽容量：２（Ｌ）
温度調整：３０（℃）
反応槽通気量：１００（ｍＬ／分）
反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：５Ｎ　ＮａＯＨによりｐＨ６．５に調整
滅菌：培養槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
　２，３－ブタンジオール発酵キシロース培地と２，３－ブタンジオール発酵混合糖培地１でのキシロース消費速度を前述の（式６）および（式７）に従い算出し、表７に示した。この結果、パエニバチラス・ポリミキサＡＴＣＣ１２３２１株はカタボライト抑制を受ける微生物であると判断した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　（比較例１）六炭糖（グルコース）を発酵原料にしたバチルス・コアギュランスのバッチ培養によるＬ－乳酸の製造
　Ｌ－乳酸発酵微生物としてバチルス・コアギュランスＮＢＲＣ１２７１４株を用い、培地として表８に示す組成の乳酸発酵培地を用いた。バチルス・コアギュランスＮＢＲＣ１２７１４株を炭酸カルシウムと共にフラスコで５０ｍＬの前培養培地(ポリペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物１ｇ／Ｌ）で２４時間振とう培養した（前培養）。前培養液を窒素ガスでパージした１Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、参考例３の条件で９６時間のバッチ培養を行った（表１１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　（比較例２）混合糖（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたバチルス・コアギュランスのバッチ培養によるＬ－乳酸の製造
　バチルス・コアギュランスＮＢＲＣ１２７１４株を表２に示す乳酸発酵混合糖培地を用いて比較例１と同様の条件で１２８時間のバッチ培養を行った（表１１）。
　（比較例３）混合糖（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたバチルス・コアギュランスの連続培養によるＬ－乳酸の製造
　混合糖（グルコース、キシロース）を発酵原料にした表２に示す組成の乳酸発酵混合糖培地１を用いた分離膜を利用しない連続培養を行なった。バチルス・コアギュランスＮＢＲＣ１２７１４株を上記比較例１の前培養と同じ条件で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、前培養液を窒素ガスでパージした１.５Ｌの乳酸発酵混合糖培地に植菌し、発酵反応槽を付属の撹拌機によって２００ｒｐｍで撹拌し、発酵反応槽を窒素で満たし、温度調整を行い、培養液中の糖が完全に消費されるまでバッチ培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、前培養完了後、直ちに発酵液抜きポンプを稼動させ、さらに培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵液量を１．５Ｌとなるよう微生物を含む培養液の引き抜き量の制御を行いながら以下の条件で３００時間の連続培養を行い、乳酸を製造した（表１１）。
発酵反応槽容量：：２(Ｌ)
温度調整：５０（℃）
反応槽通気量（窒素ガス）：１００（ｍＬ／分）
反応槽攪拌速度：２００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：５Ｎ　Ｃａ（ＯＨ）２によりｐＨ７に調整
発酵液の抜き量：３（Ｌ／Ｄａｙ）
滅菌：培養槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
　（実施例１）混合糖（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたバチルス・コアギュランスの分離膜利用連続培養によるＬ－乳酸の製造１
　混合糖（グルコース、キシロース）を発酵原料にした表２に示す組成の乳酸発酵混合糖培地を用いた分離膜を利用した連続培養を行なった。分離膜エレメントとしては中空糸の形態を採用した。バチルス・コアギュランスＮＢＲＣ１２７１４株を上記比較例１の前培養と同じ条件で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、前培養液を窒素ガスでパージした１.５Ｌの乳酸発酵混合糖培地に植菌し、発酵反応槽を付属の撹拌機によって２００ｒｐｍで撹拌し、発酵反応槽を窒素で満たし、温度調整を行い、培養液中の糖が完全に消費されるまでバッチ培養を行った（前培養）。前培養完了後、直ちに発酵液循環ポンプを稼動させ、さらに培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵液量を１．５Ｌとなるよう培養液の濾過量の制御を行いながら以下の条件で２９０時間の連続培養を行い、乳酸を製造した（表１１）。
発酵反応槽容量：２（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積：４７３（ｃｍ２）
温度調整：５０（℃）
発酵反応槽通気量（窒素ガス）：１００（ｍＬ／分）
発酵反応槽攪拌速度：２００（ｒｐｍ）
発酵液の抜き量：３（Ｌ／Ｄａｙ）
滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
　また、使用した膜は以下の性質を持つ膜であり、濾過時の膜間差圧は０．１～２０ｋＰａの間を推移させた。
平均細孔径：０．１μｍ
平均細孔径の標準偏差：０．０３５μｍ
膜表面粗さ：０．０６μｍ
純水透過係数：５０×１０－９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ。
　（実施例２）混合糖（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたバチルス・コアギュランスの分離膜利用連続培養２
　表９に示す乳酸発酵混合糖培地２を用い、実施例１と同様の条件で３０５時間の分離膜利用連続培養を行い、Ｌ－乳酸を製造した（表１１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　（実施例３）混合糖（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたバチルス・コアギュランスの分離膜利用連続培養３
　表１０に示す乳酸発酵混合糖培地３を用い、実施例１と同様の条件で３００時間の分離膜利用連続培養を行い、Ｌ－乳酸を製造した（表１１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　（比較例４）六炭糖（グルコース）を発酵原料にしたキャンディダ・トロピカリスのバッチ培養によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物としてキャンディダ・トロピカリスＮＢＲＣ０１９９株を用い、培地として表１２に示す組成のエタノール発酵培地を用いた。キャンディダ・トロピカリスＮＢＲＣ０１９９株を試験管で２ｍＬのＹＰＤ培地にて３０℃で一晩振とう培養した（前々培養）。得られた培養液を新鮮なＹＰＤ培地５０ｍＬに植菌し、５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコで一晩振とう培養した（前培養）。前培養液を、１．５Ｌのエタノール発酵培地に植菌し、以下の条件で１６時間のバッチ培養を行い、エタノールを製造した（表１４）。
発酵反応槽容量：２(Ｌ)
温度調整：３０（℃）
反応槽通気量：１００（ｍＬ／分）
反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：なし
滅菌：培養槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　（比較例５）混合糖（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたキャンディダ・トロピカリスのバッチ培養によるエタノールの製造
　表１３に示すエタノール発酵混合糖培地２を用い、比較例４と同様の条件で２３時間のバッチ培養を行い、エタノールを製造した（表１４）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　（比較例６）混合糖を発酵原料にしたキャンディダ・トロピカリスの連続培養によるエタノールの製造
　培地として表１３に示すエタノール発酵混合糖培地２を用いた分離膜を利用しない連続発酵を行った。キャンディダ・トロピカリスＮＢＲＣ０１９９株を試験管で２ｍＬのＹＰＤ培地にて３０℃で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮なＹＰＤ培地５０ｍＬに植菌し、５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコで一晩振とう培養した（前々培養）。１．５Ｌのエタノール発酵混合糖培地２の入った連続発酵装置に前々培養液を植菌し、発酵反応槽を付属の撹拌機によって８００ｒｐｍで撹拌して、発酵反応槽の通気量の調整、温度調整を行い、１６時間培養を行った（前培養）。前培養完了後、直ちに発酵液抜きポンプを稼動させ、さらに培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵液量を１．５Ｌとなるよう微生物を含む培養液の引き抜き量の制御を行いながら以下の条件で２９５時間の連続培養を行い、エタノールを製造した（表１４）。
発酵反応槽容量：２（Ｌ）
温度調整：３０（℃）
発酵反応槽通気量：１００（ｍＬ／分）
発酵反応槽撹拌速度：８００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：なし
発酵液の抜き量：１（Ｌ／Ｄａｙ）
滅菌：培養槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
　（実施例４）混合糖（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたキャンディダ・トロピカリスの分離膜を利用した連続培養によるエタノールの製造
　培地として表１３に示す組成のエタノール発酵混合糖培地２を用いた分離膜を利用した連続発酵を行った。分離膜エレメントとしては平膜の形態を採用した。キャンディダ・トロピカリスＮＢＲＣ０１９９株を試験管で２ｍＬのＹＰＤ培地にて３０℃で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮なＹＰＤ培地５０ｍＬに植菌し、５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコで一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、連続発酵装置の１．５Ｌのエタノール発酵混合糖培地２に植菌し、発酵反応槽を付属の撹拌機によって８００ｒｐｍで撹拌し、発酵反応槽の通気量の調整、温度調整を行い、３６時間培養を行った（前培養）。前培養完了後、直ちに発酵液循環ポンプを稼動させ、さらに培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵液量を１．５Ｌとなるよう培養液の濾過量の制御を行いながら以下の条件で３００時間の連続培養を行い、エタノールを製造した（表１４）。
発酵反応槽容量：２（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積：１２０（ｃｍ２）
温度調整：３０（℃）
発酵反応槽通気量：１００（ｍＬ／分）
発酵反応槽撹拌速度：８００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：なし
発酵液の抜き量：１（Ｌ／Ｄａｙ）
滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
　また、使用した膜は実施例１と同様の性質の膜を使用し、濾過時の膜間差圧は０．１～１９．８ｋＰａの間を推移させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　（比較例７）六炭糖（グルコース）を発酵原料にしたパエニバチラス・ポリミキサのバッチ培養による２，３－ブタンジオールの製造
　２，３－ブタンジオール微生物であるパエニバチラス・ポリミキサＡＴＣＣ１２３２１株を用い、培地として表１５に示す組成の２，３－ブタンジオール発酵培地を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　パエニバチラス・ポリミキサＡＴＣＣ１２３２１株を試験管で５０ｍＬの前培養培地（グルコース５ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌ）で２４時間振とう培養した（前培養）。前培養液を１Ｌの２，３－ブタンジオール発酵培地に植菌し、以下の条件で２７時間のバッチ培養を行い、２，３－ブタンジオールを製造した（表１７）。
発酵反応槽容量：２(Ｌ)
温度調整：３０（℃）
反応槽通気量：１００（ｍＬ／分）
反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：５Ｎ　ＮａＯＨによりｐＨ６．５に調整
滅菌：培養槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
　（比較例８）混合糖（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたパエニバチラス・ポリミキサのバッチ培養による２，３－ブタンジオールの製造
　表１６に示す混合糖２，３－ブタンジオール発酵培地２を用い、比較例７と同様の条件で５０時間のバッチ培養を行い、２，３－ブタンジオールを製造した（表１７）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　（比較例９）混合糖（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたパエニバチラス・ポリミキサの連続培養による２，３－ブタンジオールの製造
　混合糖（グルコース、キシロース）を発酵原料にした分離膜を利用しない連続培養を行なった。パエニバチラス・ポリミキサＡＴＣＣ１２３２１株を上記比較例７の前培養と同じ条件で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、１．２Ｌの表１７に示す混合糖２，３－ブタンジオール発酵培地２に植菌し、発酵反応槽を付属の撹拌機によって２００ｒｐｍで撹拌し、温度調整を行い、培養液中の糖が完全に消費されるまでバッチ培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、前培養完了後、直ちに発酵液抜きポンプを稼動させ、さらに培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵液量を１．２Ｌとなるよう微生物を含む培養液の引き抜き量の制御を行いながら以下の条件で２８０時間の連続培養を行い、２，３－ブタンジオールを製造した（表１７）。
発酵反応槽容量：２（Ｌ）
温度調整：３０（℃）
反応槽通気量：１００（ｍＬ／分）
反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：５Ｎ　ＮａＯＨによりｐＨ６．５に調整
発酵液の抜き量：０．６（Ｌ／Ｄａｙ）
滅菌：培養槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
　（実施例５）混合糖（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたパエニバチラス・ポリミキサの分離膜を利用した連続培養による２，３－ブタンジオールの製造
　混合糖（グルコース、キシロース）を発酵原料にした分離膜を利用した連続培養を行なった。分離膜エレメントとしては平膜の形態を採用した。パエニバチラス・ポリミキサ ＡＴＣＣ１２３２１株を上記比較例７の前培養と同じ条件で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、前培養液を１．２Ｌの混合糖２，３－ブタンジオール発酵培地２に植菌し、発酵反応槽を付属の撹拌機によって２００ｒｐｍで撹拌し、温度調整を行い、培養液中の糖が完全に消費されるまでバッチ培養を行った（前培養）。前培養完了後、直ちに発酵液循環ポンプを稼動させ、さらに培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵液量を１．２Ｌとなるよう培養液の濾過量の制御を行いながら以下の条件で３１０時間の連続培養を行い、２，３－ブタンジオールを製造した（表１７）。
発酵反応槽容量：２（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積：１２０（ｃｍ２）
温度調整：３０（℃）
発酵反応槽通気量：１００（ｍＬ／分）
発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
発酵液の抜き量：０．６Ｌ／Ｄａｙ
滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
　また、使用した膜は実施例１と同様の性質の膜を使用し、濾過時の膜間差圧は０．１～２０ｋＰａの間を推移させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　（参考例６）ピキア・スティピティスでのキシロース消費速度算出
　参考例４と同様の条件でバッチ培養を行い、培地として表３に示す組成のエタノール発酵キシロース培地と表４に示すエタノール発酵混合糖培地１を用い、エタノール発酵微生物であるピキア・スティピティスＮＢＲＣ１６８７株のエタノール発酵時のキシロース消費速度を算出した。
　エタノール発酵キシロース培地とエタノール発酵混合糖培地１でのキシロース消費速度を前述の（式６）および（式７）に従い算出し、表２２に示した。この結果、ピキア・スティピティスＮＢＲＣ１６８７株はカタボライト抑制を受ける微生物であると判断した。
　（参考例７）キャンディダ・ユーティリスでのキシロース消費速度算出
　微生物として、ＷＯ２０１０／１４０６０２に開示された方法によって作製したキャンディダ・ユーティリスＣｕＬｐＬＤＨ株を用いた。培地として表１８に示す組成のＤ－乳酸発酵キシロース培地と表１９に示すＤ－乳酸発酵混合糖培地１を用いた。ｐＨを１Ｎ　水酸化カルシウムでｐＨ６．０に調整する以外は、比較例１と同様の条件で４０時間バッチ培養を行い、Ｄ-乳酸発酵時のキシロース消費速度を算出した。
　Ｄ－乳酸発酵キシロース培地とＤ－乳酸発酵混合糖培地１でのキシロース消費速度を前述の（式６）および（式７）に従い算出し、表２２に示した。この結果、キャンディダ・ユーティリスＣｕＬｐＬＤＨ株はカタボライト抑制を受ける微生物であると判断した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　（参考例８）エシェリシア・コリＫＯ１１株でのキシロース消費速度算出
　エタノール発酵微生物であるエシェリシア・コリＫＯ１１株のエタノール発酵時のキシロース消費速度を算出した。培地として表２０に示す組成のエタノール発酵キシロース培地２と表２１に示すエタノール発酵混合糖培地３を用いた。適宜、サンプリングを行い、培養液中のグルコースおよびキシロースの濃度と、生産物であるエタノールの濃度は参考例１の方法により測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
　エシェリシア・コリＫＯ１１株を試験管で２ｍＬの前培養培地（グルコース２０ｇ／Ｌ　酵母エキス１０ｇ／Ｌ、トリプトン　５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ　５ｇ／Ｌ）にて３０℃で一晩培養した（前々培養）。得られた培養液を５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコに入った５０ｍＬの前培養培地に植菌し、一晩培養した（前培養）。前培養液を１．５Ｌのエタノール発酵キシロース培地２とエタノール発酵混合糖培地３にそれぞれ植菌し、温度調整およびｐＨ調整を行いながら以下に示す運転条件にて１６時間バッチ発酵を行なった。
培養槽容量：２（Ｌ）
温度調整：３０（℃）
発酵反応槽通気量：１００（ｍＬ／分）
発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：５Ｎ　Ｃａ（ＯＨ）２によりｐＨ６に調整
滅菌：発酵槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
　エタノール発酵キシロース培地２とエタノール発酵混合糖培地３でのキシロース消費速度を前述の（式６）および（式７）に従い算出し、表２２に示した。この結果、エシェリシア・コリＫＯ１１株はカタボライト抑制を受ける微生物であると判断した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
　（比較例１０）六炭糖を発酵原料にしたピキア・スティピティスのバッチ培養によるエタノールの製造
　微生物として、ピキア・スティピティスＮＢＲＣ１６８７株を用い、比較例４と同様の条件で２３時間バッチ培養を行い、エタノールを製造した。（表２３）
　（比較例１１）混合糖を発酵原料にしたピキア・スティピティスのバッチ培養によるエタノールの製造
　微生物として、ピキア・スティピティスＮＢＲＣ１６８７株を用い、比較例５と同様の条件で４０時間バッチ培養を行い、エタノールを製造した（表２３）。
　（比較例１２）混合糖を発酵原料にしたピキア・スティピティスの連続発酵によるエタノールの製造
　微生物として、ピキア・スティピティスＮＢＲＣ１６８７株を用い、混合糖原料にて分離膜を利用しない連続発酵を行った。前培養時間を４０時間とする以外は比較例６と同様の条件で行い、２９８時間の連続発酵によりエタノールを製造した（表２３）。
　（実施例６）混合糖を発酵原料にしたピキア・スティピティスの分離膜を利用した連続発酵によるエタノールの製造１
　微生物として、ピキア・スティピティスＮＢＲＣ１６８７株を用い、分離膜を利用した連続発酵を行った。前培養を４８時間とし、膜間差圧を０．１～１９．８ｋＰａとした以外は実施例４と同様の条件で行い、３０５時間の連続発酵によりエタノールを製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
　（比較例１３）六炭糖を発酵原料にしたキャンディダ・ユーティリスのバッチ培養によるＤ－乳酸の製造
　微生物として、ＷＯ２０１０／１４０６０２に開示された方法によって作製したキャンディダ・ユーティリスＣｕＬｐＬＤＨ株を用いた。ｐＨを１Ｎ　水酸化カルシウムでｐＨ６．０に調整し、培地は表２４に示すＤ－乳酸発酵混合糖培地２を使用する以外は、比較例４と同様の条件で２３時間バッチ培養を行い、Ｄ－乳酸を製造した（表２５）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
　（比較例１４）混合糖を発酵原料にしたキャンディダ・ユーティリスのバッチ培養によるＤ－乳酸の製造
　微生物としてキャンディダ・ユーティリスＣｕＬｐＬＤＨ株を用い、ｐＨを１Ｎ　水酸化カルシウムでｐＨ６．０に調整し、培地は表２４に示すＤ－乳酸発酵混合糖培地２を使用する以外は、比較例５と同様の条件で４０時間バッチ培養を行い、Ｄ－乳酸を製造した（表２５）。
　（比較例１５）混合糖を発酵原料にしたキャンディダ・ユーティリスの連続発酵によるＤ－乳酸の製造
　微生物としてキャンディダ・ユーティリスＣｕＬｐＬＤＨ株を用い、分離膜を利用しない連続発酵を行った。前培養を４０時間とし、ｐＨを１Ｎ　水酸化カルシウムでｐＨ６．０に調整し、培地は表２４に示すＤ－乳酸発酵混合糖培地２を使用する以外は比較例６と同様の条件で行い、２９０時間の連続発酵によりＤ－乳酸を製造した（表２５）。
　（実施例７）混合糖を発酵原料にしたキャンディダ・ユーティリスの分離膜を利用した連続発酵によるＤ－乳酸の製造１
　微生物としてキャンディダ・ユーティリスＣｕＬｐＬＤＨ株を用い、分離膜を利用した連続発酵を行った。前培養を５０時間とし、ｐＨを１Ｎ　水酸化カルシウムでｐＨ６．０に調整し、培地は表２４に示すＤ－乳酸発酵混合糖培地２を使用する以外は実施例４と同様の条件で行い、３１０時間の連続発酵によりＤ－乳酸を製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
　（比較例１６）六炭糖を発酵原料にしたエシェリシア・コリのバッチ発酵によるエタノールの製造
　エシェリシア・コリＫＯ１１株を試験管で２ｍＬの前培養培地（グルコース２０ｇ／Ｌ酵母エキス１０ｇ／Ｌ、トリプトン５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ）にて３０℃で一晩培養した（前々培養）。得られた培養液を５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコに入った５０ｍＬの前培養培地に植菌し、一晩培養した（前培養）。前培養液を表２６に示す組成の１Ｌのエタノール発酵培地２に植菌し、温度調整およびｐＨ調整を行いながら以下に示す運転条件にて１６時間バッチ発酵を行い、エタノールを製造した（表２８）。
培養槽容量：２（Ｌ）
温度調整：３０（℃）
Ｋｌａ：３０（ｈ－１）
ｐＨ調整：５Ｎ　Ｃａ（ＯＨ）２によりｐＨ６に調整
滅菌：発酵槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
　（比較例１７）混合糖を発酵原料にしたエシェリシア・コリのバッチ発酵によるエタノールの製造
　発酵培地として表２７に示す組成のエタノール発酵混合糖培地４を用いて、比較例１６と同様の条件で２４時間バッチ発酵を行い、エタノールを製造した（表２８）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
　（比較例３）混合糖を発酵原料にしたエシェリシア・コリの連続発酵によるエタノールの製造
　混合糖を発酵原料にした、分離膜を利用しない連続発酵を行った。エシェリシア・コリＫＯ１１株を試験管で２ｍＬの前培養培地（グルコース　２０ｇ／Ｌ、酵母エキス　１０ｇ／Ｌ、トリプトン　５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ　５ｇ／Ｌ）にて３０℃で一晩培養した（前々々培養）。得られた培養液を５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコに入った５０ｍＬの前培養培地に植菌し、一晩培養した（前々培養）。前々培養液を表２７に示す組成のエタノール発酵混合糖培地４の入った連続培養装置（ＷＯ２００７／０９７２６０の図２に示す装置より分離膜エレメントを除いたもの）に植菌し、温度調整およびｐＨ調整を行いながら以下に示す運転条件にて２４時間バッチ発酵を行った（前培養）。前培養完了後、直ちに連続培養を開始し、エタノールの製造を行った。表２７に示す組成のエタノール発酵混合糖培地３の供給と微生物を含む培養液の引き抜きにはペリスタ・バイオミニポンプＡＣ－２１２０型（ＡＴＴＯ社）を用いて、培養槽内に直接培地供給を行い、培養槽内から直接微生物を含む培養液の引き抜きを行った。微生物を含む培養液の引き抜き速度を一定にして、培養槽内の培養液量を１．５Ｌとなるように培地供給速度を制御しながら２９０時間エタノール製造を行った（表２８）。
培養槽容量：２（Ｌ）
温度調整：３０（℃）
Ｋｌａ：３０（ｈ－１）
ｐＨ調整：５Ｎ　Ｃａ（ＯＨ）２によりｐＨ６に調整
発酵液の抜き速度：２Ｌ／ｄａｙ
滅菌：発酵槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
　（実施例８）混合糖を発酵原料にしたエシェリシア・コリの分離膜利用連続発酵によるエタノールの製造
　混合糖を発酵原料にした、分離膜を利用した連続発酵を行った。エシェリシア・コリＫＯ１１株を試験管で２ｍＬの前培養培地（グルコース　２０ｇ／Ｌ、酵母エキス　１０ｇ／Ｌ、トリプトン　５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ　５ｇ／Ｌ）にて３０℃で一晩培養した（前々々培養）。得られた培養液を５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコに入った５０ｍＬの前培養培地に植菌し、一晩培養した（前々培養）。前々培養液を、表２７に示す組成のエタノール発酵混合糖培地４の入った膜一体型の以下の条件を具備した連続発酵装置（ＷＯ２００７／０９７２６０の図２に示す装置）に植菌し、温度調整およびｐＨ調整を行いながら以下に示す運転条件にて２４時間バッチ発酵を行った（前培養）。前培養完了後、直ちに連続培養を開始し、エタノールの製造を行った。表２７に示す組成のエタノール発酵混合糖培地３の供給と培養液の濾過にはペリスタ・バイオミニポンプＡＣ－２１２０型（ＡＴＴＯ社）を用いた。培地供給は培養槽内に直接行い、培養液の濾過は分離膜を固定したエレメントを通して行った。培養液の濾過速度を一定にして、培養槽内の培養液量を１．５Ｌとなるように培地供給速度を制御しつつ、濾過時の膜間差圧は０．１～１９．８ｋＰａの範囲を推移させることで、３１０時間の連続発酵によりエタノールを製造した（表２８）。
発酵槽容量：２（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデンろ過膜
膜分離エレメント有効濾過面積：４７３ｃｍ２
分離膜の純水透過係数：５０×１０－９ｍ３／ｍ２／ｓ／Ｐａ
分離膜の平均細孔径：０．１μｍ
平均細孔径の標準偏差：±０．０３５μｍ
分離膜の表面粗さ：０．０６μｍ
温度調整：３０（℃）
ｐＨ調整：５Ｎ　Ｃａ（ＯＨ）２によりｐＨ６に調整
発酵液の抜き速度：２Ｌ／ｄａｙ
滅菌：分離膜エレメントを含む発酵槽および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
　（比較例１９）バイオマス由来の糖液（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたバチルス・コアギュランスのバッチ培養によるＬ－乳酸の製造
　発酵原料として、バイオマス由来の糖液を使用した。乳酸発酵糖液培地は、ＷＯ２０１０／０６７７８５の実施例２に記載のナノ濾過膜による調製方法にて調製したセルロース糖化液を使用し、適宜試薬により表２９に示すとおり調製した。使用した培地と、中和剤を４Ｎ　ＫＯＨにする以外は、比較例２と同様の条件で７０時間バッチ培養を行い、Ｌ－乳酸を製造した（表３０）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
　（比較例２０）バイオマス由来の糖液（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたバチルス・コアギュランスの連続培養によるＬ－乳酸の製造
　発酵原料として、バイオマス由来の糖液を使用した。乳酸発酵糖液培地は、比較例１９と同様に表２９記載の培地を用いた。使用した培地と、中和剤を４Ｎ　ＫＯＨにする以外は、比較例３と同様の条件で２５０時間の連続培養を行い、乳酸を製造した（表３０）。
　（実施例９）バイオマス由来の糖液（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたバチルス・コアギュランスの分離膜利用連続培養によるＬ－乳酸の製造
　発酵原料として、バイオマス由来の糖液を使用した。乳酸発酵糖液培地は、比較例１９と同様に表２９記載の培地を用いた。使用した培地と、中和剤を４Ｎ　ＫＯＨにする以外は、実施例１と同様の条件で２６０時間の分離膜利用連続培養を行い、乳酸を製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
　（比較例２１）バイオマス由来の糖液（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたエシェリシア・コリのバッチ培養によるエタノールの製造
　発酵原料として、バイオマス由来の糖液を使用した。エタノール発酵糖液培地は、ＷＯ２０１０／０６７７８５の実施例２に記載のナノ濾過膜による調製方法にて調製したセルロース糖化液を使用し、適宜試薬により表３１に示すとおり調製した。使用した培地以外は、比較例１７と同様の条件で２３時間バッチ培養を行い、エタノールを製造した（表３２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
　（比較例２２）バイオマス由来の糖液（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたエシェリシア・コリの連続培養によるエタノールの製造
　エタノール発酵糖液培地は、比較例２１と同様に表３１記載の培地を用い、比較例１８と同様の条件で２８５時間の連続培養を行い、エタノールを製造した（表３２）。
　（実施例１０）バイオマス由来の糖液（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたエシェリシア・コリの分離膜利用連続培養によるエタノールの製造
　表２７に示すエタノール発酵糖液培地を用い、実施例８と同様の条件で２９５時間の分離膜利用連続培養を行い、エタノールを製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
　（比較例２３）混合糖（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたキャンディダ・トロピカリスのバッチ培養によるエタノールの製造２
　表３３に示すエタノール発酵混合糖培地５を用い、比較例４と同様の条件で４５時間のバッチ培養を行い、エタノールを製造した（表３４）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000035
　（比較例２４）混合糖を発酵原料にしたキャンディダ・トロピカリスの連続培養によるエタノールの製造
　表３３に示すエタノール発酵混合糖培地５を用い、比較例６と同様の条件で３５０時間の連続培養を行い、エタノールを製造した（表３４）。
　（実施例１１）混合糖（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたキャンディダ・トロピカリスの分離膜を利用した連続培養によるエタノールの製造２
　表３３に示すエタノール発酵混合糖培地５を用い、実施例４と同様の条件で３６０時間の連続培養を行い、エタノールを製造した（表３４）。
　（実施例１２）混合糖を発酵原料にしたキャンディダ・トロピカリスのセラミック製分離膜を利用した連続発酵によるエタノールの製造３
　キャンディダ・トロピカリスＮＢＲＣ０１９９株を用い、セラミック製分離膜を利用した連続発酵を行った。発酵培地は表３３に示す培地を使用した。キャンディダ・トロピカリスＮＢＲＣ０１９９株を試験管で２ｍＬのＹＰＤ培地にて３０℃で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液をＹＰＤ培地５０ｍＬの入った５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコに植菌し、一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、１．５ＬのＹＰＤＸ培地の入った膜分離型の連続発酵装置（ＷＯ２０１２／０８６７６３の図１２に示す装置）に植菌し、培養槽を付属の撹拌機によって８００ｒｐｍで撹拌し、培養槽の通気速度の調整、温度調整を行い、３６時間培養を行った（前培養）。前培養完了後、直ちに連続発酵を開始した。濾過時の膜間差圧は５００ｋＰａ以下となるよう調整しながら、４００時間の連続発酵によりエタノールを製造した（表３４）。
培養槽容量：２Ｌ
使用分離膜：Ｃｅｌｆｉｔ精密ろ過膜　モノリス　φ４－１９（日本ガイシ）
膜分離エレメント長さ：５００ｍｍ
分離膜の平均細孔径：０．１μｍ
温度調整：３０℃
発酵反応槽通気量：１００（ｍＬ／分）
発酵反応槽撹拌速度：８００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：なし。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000036
　（実施例１３）混合糖（グルコース、キシロース）を発酵原料にしたパエニバチラス・ポリミキサセラミック製分離膜を利用した連続培養による２，３－ブタンジオールの製造２
　パエニバチラス・ポリミキサＡＴＣＣ１２３２１株を用い、セラミック製分離膜を利用した連続発酵を行った。パエニバチラス・ポリミキサＡＴＣＣ１２３２１株を試験管で２ｍＬの前培養培地（グルコース５ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌ）にて３０℃で一晩培養した（前々々培養）。得られた培養液を５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコに入った５０ｍＬの前培養培地に植菌し、一晩培養した（前々培養）。前々培養液を表１６に示す組成の２，３－ブタンジオール発酵混合糖培地の入った連続培養装置（ＷＯ２００７／０９７２６０の図２に示す装置）に植菌し、温度調整およびｐＨ調整を行いながら以下に示す運転条件にて３０時間バッチ発酵を行った（前培養）。前培養完了後、表１６に示す組成の２，３－ブタンジオール発酵混合糖培地を用いて直ちに連続培養を開始し、２，３－ブタンジオールの製造を行った。濾過時の膜間差圧は５００ｋＰａ以下となるよう調整しながら、３００時間の連続発酵により２，３－ブタンジオールを製造した（表３５）。
発酵槽容量：２（Ｌ）
使用分離膜：Ｃｅｌｆｉｔ精密ろ過膜　モノリス　φ４－１９（日本ガイシ）
膜分離エレメント長さ：５００ｍｍ
分離膜の平均細孔径：０．１μｍ
温度調整：３０（℃）
発酵反応槽通気量：１００（ｍＬ／分）
発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：５Ｎ　Ｃａ（ＯＨ）２によりｐＨ６．５に調整
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000037
　本発明によって、五炭糖および六炭糖を含む発酵原料を用いた種々の化学品の発酵生産の効率を大幅に向上させることができる。

Claims (5)

  1. 　微生物の培養液を分離膜で濾過すること、未濾過液を培養液に保持または還流すること、発酵原料を培養液に追加すること、および濾過液中の生産物を回収することを含む、連続発酵による化学品の製造方法であって、前記微生物がカタボライト抑制を受ける微生物であり、前記発酵原料が六炭糖および五炭糖を含む、化学品の製造方法。
  2. 　前記濾過液総量の五炭糖の濃度が５ｇ／Ｌ以下である、請求項１に記載の化学品の製造方法。
  3. 　前記発酵原料中に含まれる六炭糖と五炭糖の重量比率が１：９～９：１である、請求項１または２に記載の化学品の製造方法。
  4. 　前記発酵原料がバイオマス由来の糖液を含む、請求項１または２に記載の化学品の製造方法。
  5. 　前記五炭糖がキシロースである、請求項１から４のいずれかに記載の化学品の製造方法。
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