JPWO2017159764A1 - 化学品の製造方法および微生物の培養方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)微生物を、ケーンモラセスを主成分として含む発酵原料で培養し、培養液を分離膜で濾過して微生物が分離された化学品を含む濾過液を回収し、さらに微生物を含む未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ発酵原料を培養液に追加して連続発酵する化学品の製造方法において、前記培養液の遠心上清中に平均粒子径が100nm以上の粒子を含有せしめる微生物を培養する、化学品の製造方法。
(2)前記粒子の平均粒子径が300nm以上である、(1)に記載の化学品の製造方法。
(3)前記発酵原料がケーンモラセスおよびセルロース含有バイオマス由来糖液の混合物を含む、(1)または(2)に記載の化学品の製造方法。
(4)前記微生物がシゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属に属する酵母である、(1)〜(3)のいずれかに記載の化学品の製造方法。
(5)微生物を、ケーンモラセスを主成分として含む発酵原料で培養し、培養液を分離膜で濾過して微生物を含む未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ発酵原料を培養液に追加して連続培養する微生物の培養方法において、前記培養液の遠心上清中に平均粒子径100nm以上の粒子を含有せしめる微生物を培養する、微生物の培養方法。
・装置 原子間力顕微鏡装置(Digital Instruments(株)製“Nanoscope IIIa”)
・条件 探針 SiNカンチレバー(Digital Instruments(株)製)
走査モード コンタクトモード(気中測定)
水中タッピングモード(水中測定)
走査範囲 10μm、25μm四方(気中測定)
5μm、10μm四方(水中測定)
走査解像度 512×512
・試料調製 測定に際し膜サンプルは、常温でエタノールに15分浸漬後、RO水中に24時間浸漬し洗浄した後、風乾し用いた。RO水とは、濾過膜の一種である逆浸透膜(RO膜)を用いて濾過し、イオンや塩類などの不純物を排除した水を指す。RO膜の孔の大きさは、概ね2nm以下である。
原料中の糖類、エタノール濃度は、下記に示すHPLC条件で、標品との比較により定量した。
カラム:Shodex SH1011(昭和電工株式会社製)
移動相:5mM 硫酸(流速0.6mL/分)
反応液:なし
検出方法:RI(示差屈折率)
温度:65℃。
バガスを水熱処理して得られる固形分(C6画分)および水を混合し、固形分仕込濃度10%とした混合液に糖化酵素を20mg/g−乾燥バガスを添加して48時間糖化反応を行った。なお、糖化反応は50℃で行い、pH制御は行わなかった。48時間後に最終的に表1に示す割合になるようにケーンモラセスを添加した後に、フィルタープレスによって糖化残渣と糖化液の固液分離を行い、その後、精密濾過膜、限外濾過膜を通じて、ケーンモラセス含有原料を得た。参考例1に示す方法によるケーンモラセス含有原料の分析結果を表2に示す。
培養微生物としてエタノール生産酵母シゾサッカロマイセス・ポンベNBRC1628株、培地として表2に示すケーンモラセス含有原料を用い、分離膜を利用した連続培養を行なった。分離膜エレメントとしては特開2010−22321に記載の中空糸の形態を採用した。シゾサッカロマイセス・ポンベNBRC1628株を5mlの表2に示す原料を投入した試験管に植菌し一晩振とう培養した(前々々培養)。得られた培養液を、新鮮な45mlの表2に示す原料を投入した三角フラスコに植菌し、30℃、120rpmで8時間振とう培養した(前々培養)。前々培養液50mLのうち35mLを分取して、700mLの表2に示すケーンモラセス含有原料を投入した連続発酵装置に植菌し、発酵反応槽を付属の撹拌機によって300rpmで撹拌し、24時間培養を行った(前培養)。なお、植菌後直ちに発酵液循環ポンプを稼動させ、分離膜モジュールと発酵槽間の液循環をおこなった。前培養終了後、ろ過ポンプを稼動させて分離膜モジュールより発酵液の抜き出しを開始した。ろ過開始後は、連続発酵装置の発酵液量を700mLになるよう発酵原料添加制御を行いながら以下の連続発酵条件で約300時間の連続培養を行った。連続培養中の膜間差圧およびろ過速度の推移を図1に示す。
発酵反応槽容量:2(L)
使用分離膜:ポリフッ化ビニリデン製ろ過膜
膜分離エレメント有効濾過面積:218(cm2)
温度調整:30(℃)
発酵反応槽通気量:無通気
発酵反応槽撹拌速度:300(rpm)
pH調整:無調整
ろ過フラックス設定値:0.1(m3/m2/日)
滅菌:分離膜エレメントを含む培養槽は121℃、20minのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌
平均細孔径:0.1μm
平均細孔径の標準偏差:0.035μm
膜表面粗さ:0.06μm
純水透過係数:50×10−9m3/m2/s/pa。
培養微生物としてエタノール生産酵母のサッカロマイセス・セレビセNBRC2260株を用いた以外は実施例1と同様の方法にて連続培養を行った。連続培養中の膜間差圧およびろ過フラックスの推移を図2に示す。図2に示したように、300時間の連続培養中、100時間を経過した後から膜間差圧の急激な上昇が起こり、膜閉塞が起こったためろ過フラックスも設定値より低下していくことがわかった。また、連続培養終了時点のエタノール濃度は65g/Lであった。
次に、表2に示すケーンモラセス含有原料のみを用いた連続ろ過試験を行った。ろ過中の温度、攪拌速度、pH等の条件は実施例1に記載した方法と同様の方法で行った。600時間の連続ろ過試験中の膜間差圧およびろ過フラックスの推移を図3に示す。図3に示したように膜間差圧はほぼ一定であり、膜閉塞も起こらずろ過フラックスも安定して一定値で推移した。
培養微生物としてシゾサッカロマイセス・ジャポニカスNBRC1609株を用いた以外は実施例1と同様の方法にて連続培養を行った。連続培養中の膜間差圧およびろ過フラックスの推移を図4に示す。図4に示したように、約300時間の連続培養中、膜間差圧はほぼ一定であり、膜閉塞も起こらずろ過フラックスも安定して一定値で推移した。
培養微生物としてエタノール生産酵母のサッカロマイセス・セレビセNBRC2260株を用い、発酵原料として表3に示すケーンモラセス非含有原料を用いて実施例1と同様の方法で連続培養を行った。ただし設定ろ過フラックスは0.2(m3/m2/日)で実施した。連続培養中の膜間差圧およびろ過速度の推移を図5に示す。
実施例1、実施例2、比較例1、参考例3のそれぞれの培養液および、ケーンモラセス含有原料を遠心分離し、得られた上清の平均粒子径測定を実施した。具体的には、参考例2のケーンモラセス含有原料を5mL加えた試験管に、シゾサッカロマイセス・ポンベNBRC1628株、NBRC1609株またはサッカロマイセス・セレビセNBRC2260株を植菌し、30℃、120rpmで72時間培養した。各酵母培養液および参考例3のケーンモラセス含有原料を1000×Gで10分間遠心して、それぞれの上清3mLを回収した。回収した上清30μLをpH5のクエン酸緩衝液970μLに加えて希釈し、希釈した各溶液を1mL容量のディスポセルに入れ、動的光散乱により平均粒子径を測定した。
・光源のピンホールサイズ:100μm
・測定波長:660nm
・測定角度:165°
・測定積算回数:70回
・溶媒屈折率:1.3313
・溶媒粘度:0.8852cp。
粒子径の解析には、大塚電子株式会社のゼータ電位・粒子測定システムELS−Z2を用い、25℃の条件で、大気中で測定を行った。動的光散乱によって得られた散乱強度の揺らぎからキュムラント解析によって自己相関関数を求め、散乱強度に対する粒度分布へ変換した。粒度分布のヒストグラム解析範囲は最小値を1nm、最大値を5000nmとした。得られた平均粒子径を表4に示す。
Claims (5)
- 微生物を、ケーンモラセスを主成分として含む発酵原料で培養し、培養液を分離膜で濾過して微生物が分離された化学品を含む濾過液を回収し、さらに微生物を含む未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ発酵原料を培養液に追加して連続発酵する化学品の製造方法において、前記培養液の遠心上清中に平均粒子径が100nm以上の粒子を含有せしめる微生物を培養する、化学品の製造方法。
- 前記粒子の平均粒子径が300nm以上である、請求項1に記載の化学品の製造方法。
- 前記発酵原料がケーンモラセスおよびセルロース含有バイオマス由来糖液の混合物を含む、請求項1または2に記載の化学品の製造方法。
- 前記微生物がシゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属に属する酵母である、請求項1〜3のいずれかに記載の化学品の製造方法。
- 微生物を、ケーンモラセスを主成分として含む発酵原料で培養し、培養液を分離膜で濾過して微生物を含む未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ発酵原料を培養液に追加して連続培養する微生物の培養方法において、前記培養液の遠心上清中に平均粒子径100nm以上の粒子を含有せしめる微生物を培養する、微生物の培養方法。
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