WO2019054469A1 - エタノールの製造方法およびエタノール発酵液 - Google Patents

エタノールの製造方法およびエタノール発酵液 Download PDF

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WO2019054469A1
WO2019054469A1 PCT/JP2018/034116 JP2018034116W WO2019054469A1 WO 2019054469 A1 WO2019054469 A1 WO 2019054469A1 JP 2018034116 W JP2018034116 W JP 2018034116W WO 2019054469 A1 WO2019054469 A1 WO 2019054469A1
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ethanol
fermentation
microorganism
particles
microorganisms
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PCT/JP2018/034116
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寛之 水野
耳塚　孝
日笠　雅史
慎二郎 澤田
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東レ株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D3/00—Distillation or related exchange processes in which liquids are contacted with gaseous media, e.g. stripping
    • B01D3/001—Processes specially adapted for distillation or rectification of fermented solutions
    • B01D3/002—Processes specially adapted for distillation or rectification of fermented solutions by continuous methods
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing ethanol using a fermentation material containing cane molasses as a main component, and an ethanol fermentation liquid.
  • molasses As a method for producing ethanol, it is possible to obtain as a culture product by microorganisms from glucose, which is a 6-carbon sugar purified from edible biomass such as corn, and molasses (cane molasses) produced in the process of purifying sugar from sugar cane. It is common. Cane molasses is consumed as a large amount of ethanol fermentation material in sugar producing countries such as Brazil and Thailand, and is an important fermentation material.
  • Patent Document 1 a batch fermentation method, a fed-batch fermentation method or a continuous fermentation method is used as a method for producing ethanol by microbial culture, but in Patent Document 1, the production rate and yield of ethanol are improved by the continuous fermentation method using a separation membrane. It is disclosed that. On the other hand, the patent document does not describe the use of cane molasses-containing raw material. Further, in Patent Document 2, a culture solution obtained by a continuous fermentation method in which a plurality of fermenters are connected is centrifuged to be divided into a microorganism and an ethanol fermentation solution, and the ethanol fermentation solution from which the microorganism is removed is distilled, The method of returning to a fermenter is disclosed. On the other hand, in this patent document, although cane molasses containing raw material is used, the separation membrane is not used. It is common for the ethanol fermentation liquid thus obtained to concentrate and purify ethanol by subsequent distillation.
  • Patent Document 3 discloses a method of extinguishing bubbles by providing a stirring shaft at the bottom of a distillation column and rotating a stirring blade in order to suppress foaming during distillation.
  • the distillation column needs to periodically clean the dirt that adheres during operation, the working parts and complicated structures are disliked, so the situation where you can not but rely on the addition of an antifoamer to suppress foaming Met.
  • an object of the present invention is to provide a method capable of distilling without adding an antifoaming agent at the time of distillation, and such an ethanol fermented liquid.
  • the present invention is as the following (1) to (8).
  • the microorganism is cultured with a fermentation raw material containing cane molasses as a main component, the culture solution is filtered through a separation membrane to recover the ethanol-containing filtrate from which the microorganism has been separated, and the non-filtrate containing the microorganism is In the ethanol continuous fermentation step of maintaining or refluxing the reaction solution and adding the fermentation raw material to the culture solution, and the step of concentrating and purifying the ethanol-containing filtrate recovered in the continuous fermentation step by ethanol.
  • the microorganism is a microorganism in which particles having an average particle diameter of 100 nm or more are contained in the centrifugal supernatant of the culture solution, and the particles formed by the microorganism culture contained in the ethanol-containing filtrate have an average particle diameter of 40 to 80 nm. Is the way.
  • the ethanol-containing filtrate recovered in the ethanol continuous fermentation step or the ethanol fermentation even if it is an ethanol fermentation liquid using a fermentation raw material containing cane molasses having effervescence as a main component during distillation
  • foaming at the time of distillation can be remarkably suppressed, and stable bioethanol production by distillation becomes possible.
  • the present invention relates to an ethanol continuous fermentation process using a separation membrane by microorganisms, wherein particles having an average particle diameter of 100 nm or more are contained in a centrifugal supernatant of a culture solution containing cane molasses as a main component and a fermentation broth,
  • the present invention relates to a method for producing ethanol, which includes the step of concentrating and purifying the ethanol filtrate collected in step b) by distillation, and an ethanol fermentation solution containing particles of a specific average particle size formed by microbial culture.
  • the method for producing ethanol of the present invention will be described step by step, and the features of the ethanol fermentation liquid of the present invention will be described.
  • the microorganism used in the present invention is a microorganism having an ability to produce ethanol, and when the microorganism is cultured with a fermentation material containing cane molasses as a main component, the average particle size in the centrifugal supernatant of the culture solution There is no particular limitation as long as it is a microorganism containing particles of 100 nm or more.
  • Preferred specific examples of such microorganisms include yeasts such as baker's yeast often used in the fermentation industry, bacteria such as Escherichia coli and coryneform bacteria, filamentous fungi, actinomycetes and the like.
  • the microorganism producing ethanol is yeast.
  • yeast for example, Saccharomyces (Saccharomyces), Kluyveromyces (Kluyveromyces), and Schizosaccharomyces (Shizosaccharomyces) are preferable.
  • yeast belonging to the genus Shizosaccharomyces is preferred, and Shizosaccharomyces pombe, Shizosaccharomyces japonicus, Shizosaccharomyces octosporus or Shizosaccharomyces cryophilus can be suitably used.
  • the particle means an insoluble particulate matter other than the microorganism contained in a culture solution obtained by culturing with a fermentation raw material containing cane molasses as a main component.
  • the measurement of the average particle size of the particles present in the culture solution is performed by dynamic light scattering (DLS, photon correlation method). Specifically, the autocorrelation function is determined by Cumulant analysis from the fluctuation of the scattering intensity obtained by the measurement by the dynamic light scattering method, and after converting into the particle size distribution for the scattering intensity, the analysis range minimum value is 1 nm. The maximum value is converted to an average particle diameter of 5000 nm.
  • ELS-Z2 of Otsuka Electronics Co., Ltd. is used.
  • microorganisms are also present as particles in the culture solution
  • the microorganisms are precipitated by centrifuging the culture solution at room temperature under conditions of 1000 G for 10 minutes, and the average particles of particles contained in the centrifugation supernatant Measure the diameter.
  • the average particle diameter of the particles contained in the culture solution is 100 nm or more, preferably 300 nm or more, and more preferably 300 to 1500 nm.
  • the ethanol of the present invention can be obtained as shown in the following examples. The unexpected superior effect that foaming when the ethanol-containing filtrate recovered in the continuous fermentation process is subjected to distillation is brought about is brought about.
  • the upper limit of the average particle size of the particles is not particularly limited as long as the filtration flux is not reduced by the occurrence of membrane clogging, but the upper limit is the average particle size of particles which do not precipitate with microorganisms even by the centrifugation.
  • the upper limit is 1500 nm.
  • Cane molasses is a by-product produced in the process of sugar production from sugarcane juice or crude sugar. Specifically, it refers to a crystallization mother liquor containing a sugar component remaining after crystallization in the crystallization step in the sugar production process.
  • the crystallization step is usually performed a plurality of times, and the first sugar which is the crystal component obtained by performing the first crystallization, and further the crystallization of the remaining liquid of the first sugar (No.
  • Crystallization is repeated as in the second sugar which is the crystal component obtained by performing the crystallization, and the third sugar obtained by further crystallizing the remaining liquid of the second sugar (the second molasses),
  • the final stage of molasses obtained as mother liquor is called cane molasses.
  • inorganic salts other than sugar components are concentrated in cane molasses.
  • the cane molasses used in the present invention is preferably cane molasses after a large number of times of crystallization, and is cane molasses remaining after at least two or more times, more preferably three or more times of crystallization. preferable.
  • the sugar component contained in cane molasses contains sucrose, glucose, and fructose as main components, and may contain some other sugar components such as xylose and galactose.
  • the sugar concentration in cane molasses is generally about 200 to 800 g / L.
  • the sugar concentration in cane molasses can be quantified by known measurement methods such as HPLC.
  • Fermentation raw materials include all the nutrients necessary for the growth of microorganisms.
  • the fermentation raw material used in the present invention may contain cane molasses as a main component, and in addition, carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts and, if necessary, organic trace nutrients such as amino acids and vitamins are appropriately added. May be
  • the fermentation material containing cane molasses as a main component means that 50% by weight or more of the substances (excluding water) contained in the fermentation material is cane molasses.
  • saccharides such as glucose, sucrose, fructose, galactose, lactose, corn starch saccharified solution containing these saccharides, sweet sucrose molasses, sugar beet molasses, high test molasses, organic acids such as acetic acid, and alcohols such as ethanol
  • saccharides such as glucose, sucrose, fructose, galactose, lactose
  • corn starch saccharified solution containing these saccharides sweet sucrose molasses, sugar beet molasses, high test molasses
  • organic acids such as acetic acid
  • alcohols such as ethanol
  • Cellulose-containing biomass-derived sugar solution is preferably used in addition to the group, glycerin and the like.
  • cellulose-containing biomass examples include grass-based biomass such as bagasse, switch grass, corn stover, rice straw, and straw, and wood-based biomass such as trees and waste building materials.
  • grass-based biomass such as bagasse, switch grass, corn stover, rice straw, and straw
  • wood-based biomass such as trees and waste building materials.
  • the cellulose-containing biomass contains cellulose or hemicellulose, which is a polysaccharide obtained by dehydration condensation of sugars, and hydrolysis of such a polysaccharide produces a sugar solution that can be used as a fermentation raw material.
  • a method of hydrolyzing biomass to produce a sugar liquid using subcritical water at about 250 to 500 ° C. Japanese Patent Laid-Open No. 2003-212888
  • biomass treated with subcritical water a method of producing a sugar solution by further performing an enzyme treatment
  • a biomass is subjected to hydrolysis treatment with pressurized hot water at 240 to 280 ° C., and then subjected to a further enzyme treatment to give a sugar solution
  • a method of producing Japanese Patent No. 3041380. After the above treatment, the obtained sugar solution and cane molasses may be mixed and purified.
  • the method is disclosed, for example, in WO 2012/118171.
  • Nitrogen sources include ammonia gas, ammonia water, ammonium salts, urea, nitrates, and other organic nitrogen sources that are used supplementary, such as oil syrups, soybean hydrolysate, casein hydrolysates, other amino acids, vitamins, corn A steep liquor, yeast or yeast extract, peptides such as meat extract, peptone, various fermented microorganisms and their hydrolysates are used.
  • inorganic salts phosphates, magnesium salts, calcium salts, iron salts, manganese salts and the like can be added as appropriate.
  • the nutrient can be added and used as a preparation or a natural product containing it.
  • the ethanol continuous fermentation process using the microorganism and the fermentation raw material is a continuous fermentation process using a separation membrane, and specifically, the culture solution is filtered through the separation membrane to recover an ethanol-containing filtrate from which the microorganism is separated, Furthermore, it is a continuous fermentation process characterized by maintaining or refluxing a non-filtrate containing a microorganism in a culture solution and adding a fermentation raw material to the culture solution.
  • the separation membrane used in the ethanol continuous fermentation step is not particularly limited as long as it has a function of separating and filtering the fermentation liquid obtained by culturing the microorganism from the microorganism, and as the material, for example, a porous ceramic membrane, Although a porous glass membrane, a porous organic polymer membrane, a metal fiber woven fabric, a non-woven fabric and the like can be used, among these, a porous organic polymer membrane or a ceramic membrane is particularly preferable.
  • the separation membrane As a structure of the said separation membrane, it is preferable that it is a separation membrane which contains a porous resin layer as a functional layer, for example from the point of dirt resistance.
  • the separation membrane containing a porous resin layer preferably has a porous resin layer acting as a separation functional layer on the surface of the porous substrate.
  • the porous substrate supports the porous resin layer to give strength to the separation membrane.
  • the porous resin layer does not permeate the porous substrate even if the porous resin layer penetrates the porous substrate. Either way is fine.
  • the average thickness of the porous substrate is preferably 50 to 3000 ⁇ m.
  • the material of the porous substrate is made of an organic material and / or an inorganic material or the like, and an organic fiber is preferably used.
  • Preferred porous substrates are woven or non-woven fabrics made of organic fibers such as cellulose fibers, cellulose triacetate fibers, polyester fibers, polypropylene fibers and polyethylene fibers, and more preferably density control is relatively easy and production is also easy And inexpensive non-woven fabrics are used.
  • an organic polymer film can be suitably used as the porous resin layer.
  • the material of the organic polymer film include polyethylene resin, polypropylene resin, polyvinyl chloride resin, polyvinylidene fluoride resin, polysulfone resin, polyether sulfone resin, polyacrylonitrile resin, cellulose resin, Cellulose triacetate resin etc. are mentioned.
  • the organic polymer film may be a mixture of resins composed mainly of these resins.
  • the main component means that the component is contained in an amount of 50% by weight or more, preferably 60% by weight or more.
  • the material of the organic polymer film is polyvinyl chloride resin, polyvinylidene fluoride resin, polysulfone resin, polyether sulfone resin, which is easy to form a film by solution and is excellent also in physical durability and chemical resistance
  • Polyacrylonitrile-based resins are preferred, and polyvinylidene fluoride-based resins or resins containing them as the main component are most preferably used.
  • polyvinylidene fluoride resin a homopolymer of vinylidene fluoride is preferably used. Furthermore, as the polyvinylidene fluoride resin, a copolymer of vinylidene fluoride and a copolymerizable vinyl monomer is also preferably used. Examples of vinyl monomers copolymerizable with vinylidene fluoride include tetrafluoroethylene, hexafluoropropylene and trichlorofluoroethylene.
  • the separation membrane should have a pore diameter through which the microorganism used for culture can not pass, but clogging with the secretion of the microorganism used for culture and the fine particles in the fermentation raw material is unlikely to occur, and filtration is also possible. It is desirable that the performance be in a stable range for a long time. Therefore, the average pore diameter of the porous separation membrane is preferably 0.01 to 5 ⁇ m. Furthermore, more preferably, when the average pore diameter of the separation membrane is 0.01 to 1 ⁇ m, a high rejection rate without causing the leakage of microorganisms and a high water permeability can be compatible, and the water permeability can be long Can be held.
  • the average pore size of the separation membrane is preferably 1 ⁇ m or less.
  • the average pore size of the separation membrane is preferably not too large compared to the size of the microorganism in order to prevent the occurrence of the leakage of the microorganism, that is, the occurrence of a defect in which the rejection rate decreases.
  • the average pore diameter is preferably 0.4 ⁇ m or less, more preferably 0.2 ⁇ m or less, and still more preferably 0.1 ⁇ m or less.
  • the average pore size of the separation membrane in the present invention is preferably 0.01 ⁇ m or more. More preferably, it is 0.02 micrometer or more, More preferably, it is 0.04 micrometer or more.
  • the average pore diameter can be determined by measuring and averaging the diameters of all the pores that can be observed within the range of 9.2 ⁇ m ⁇ 10.4 ⁇ m in scanning electron microscopy at a magnification of 10,000 times. it can.
  • For the average pore diameter alternatively, photograph the surface of the membrane at a magnification of 10,000 times using a scanning electron microscope, and randomly select 10 or more pores, preferably 20 or more pores, and measure the diameters of the pores. It can also be determined by number average.
  • a circle equivalent circle having an area equal to the area of the pore is determined by an image processing apparatus or the like, and the circle diameter is determined by the equivalent circle diameter.
  • the standard deviation ⁇ of the average pore size of the separation membrane is preferably 0.1 ⁇ m or less.
  • N the number of pores observable in the above-mentioned 9.2 ⁇ m ⁇ 10.4 ⁇ m is N
  • the standard deviation ⁇ of the average pore diameter is Xk
  • the average diameter of the pores is X (ave). The following equation (1) is calculated.
  • the permeability of the culture solution is one of the important performances.
  • the pure water permeability coefficient of the separation membrane before use can be used as an indicator of the permeability of the separation membrane.
  • the pure water permeability coefficient of the separation membrane is calculated by measuring and measuring the water permeability with a head height of 1 m using purified water at a temperature of 25 ° C.
  • the pure water permeability coefficient is 5.6 ⁇ 10 ⁇ 10 m 3 / m 2 / s / pa or more 6 ⁇ 10 ⁇ 7 m 3 / m 2 / s / pa If it is pa or less, practically sufficient water permeability can be obtained.
  • the surface roughness is an average value of heights in the direction perpendicular to the surface.
  • the surface roughness of the membrane is one of the factors to make it easy for the microorganisms attached to the surface of the separation membrane to be exfoliated by the effect of cleaning the membrane surface by the liquid flow by stirring or a circulation pump.
  • the surface roughness of the separation membrane is not particularly limited as long as the microorganisms attached to the membrane and other solids can be peeled off, but it is preferably 0.1 ⁇ m or less. If the surface roughness is 0.1 ⁇ m or less, the microorganisms attached to the membrane and other solid matter are easily peeled off.
  • the membrane surface roughness of the separation membrane is 0.1 ⁇ m or less
  • the average pore diameter is 0.01 to 1 ⁇ m
  • the pure water permeability coefficient of the separation membrane is 2 ⁇ 10 ⁇ 9 m 3 / m 2 /
  • the surface roughness of the separation membrane is set to 0.1 ⁇ m or less, continuous fermentation can be performed with a lower transmembrane pressure, and even when the separation membrane is clogged, the operation was performed with a high transmembrane pressure. Compared with the case, the cleaning recovery is good. It is preferable that the surface roughness of the separation membrane be as small as possible, since the prevention of clogging of the separation membrane enables stable continuous fermentation.
  • the surface roughness of the separation membrane is measured using the following atomic force microscope (AFM) under the following conditions.
  • Apparatus Atomic force microscope apparatus ("Nanoscope IIIa” manufactured by Digital Instruments Co., Ltd.) ⁇ Condition Probe SiN cantilever (manufactured by Digital Instruments) Scanning mode Contact mode (air measurement) Underwater tapping mode (underwater measurement) Scanning range 10 ⁇ m, 25 ⁇ m square (air measurement) 5 ⁇ m, 10 ⁇ m square (in water) Scanning resolution 512 ⁇ 512 -Preparation of sample
  • the membrane sample was immersed in ethanol at normal temperature for 15 minutes, immersed in RO water for 24 hours, washed, and then air-dried.
  • RO water refers to water filtered using a reverse osmosis membrane (RO membrane), which is a type of filtration membrane, to remove impurities such as ions and salts.
  • RO membrane reverse osmosis membrane
  • the film surface roughness drough is calculated from the height in the Z-axis direction of each point by the above-mentioned atomic force microscope (AFM) according to the following equation (2).
  • the shape of the separation membrane is not particularly limited, and a flat membrane, a hollow fiber membrane and the like can be used, but a hollow fiber membrane is preferable.
  • the inner diameter of the hollow fiber is preferably 200 to 5000 ⁇ m, and the film thickness is preferably 20 to 2000 ⁇ m.
  • woven or knitted fabric in which organic fibers or inorganic fibers are tubular may be included in the inside of the hollow fiber.
  • the separation membrane can be produced, for example, by the production method described in WO2007 / 097260.
  • the transmembrane pressure during filtration in the ethanol continuous fermentation step is not particularly limited as long as the culture solution can be filtered. However, if the organic polymer membrane is filtered with a transmembrane pressure higher than 150 kPa in order to filter the culture solution, the structure of the organic polymer membrane is likely to be destroyed and the ability to produce ethanol is lowered. There is something to do. In addition, if the transmembrane pressure difference is less than 0.1 kPa, the amount of permeated water of the culture solution can not be obtained in many cases, and the productivity when producing ethanol tends to decrease.
  • the transmembrane pressure which is the filtration pressure is preferably in the range of 0.1 to 150 kPa, whereby the amount of permeated water of the culture solution is large.
  • the ability to produce ethanol can be maintained high because there is no decline in the ability to produce ethanol due to the destruction of the structure of
  • the transmembrane pressure is preferably in the range of 0.1 to 50 kPa, and more preferably in the range of 0.1 to 20 kPa, for an organic polymer membrane.
  • the temperature in the culture of the yeast may be set to a temperature suitable for the yeast to be used, and is not particularly limited as long as the microorganism is grown, but the temperature is in the range of 20 to 75.degree.
  • continuous fermentation filtration of fermentation liquid
  • continuous fermentation may be started after batch fermentation or fed-batch fermentation is performed at the initial stage of culture to increase the microorganism concentration.
  • high concentration of microorganisms may be seeded and continuous fermentation may be performed at the start of culture.
  • the fermentation raw material supply and the filtration of the culture solution may be continuous or intermittent.
  • the concentration of the microorganism in the culture solution is preferably high to maintain the productivity of ethanol in order to obtain efficient productivity.
  • concentration of the microorganism in the culture solution at, for example, 5 g / L or more as dry weight, good production efficiency can be obtained.
  • the microorganism in the fermenter is removed by removing a portion of the culture solution containing the microorganism from the inside of the fermenter and supplying and diluting the fermentation raw material as needed in the middle of the continuous fermentation
  • the concentration may be adjusted. For example, if the concentration of microorganisms in the fermenter is too high, the separation membrane is likely to be clogged. Therefore, a portion of the culture solution containing the microorganisms is removed, and the fermentation raw material is supplied and diluted. There are things that can be avoided from In the method for producing ethanol of the present invention, the number of fermentors does not matter.
  • the culture solution containing the microorganism is filtered through a separation membrane, ethanol is recovered from the filtrate, and the non-filtrate containing the microorganism is retained or refluxed in the culture solution, and the fermentation raw material
  • the apparatus for producing ethanol by continuous fermentation which adds ethanol to the above-mentioned culture solution and recovers ethanol in the filtrate, but specific examples are described in WO2007 / 097260, WO2010 / 038613 The device can be used.
  • distillation process As a distillation method of ethanol in the method for producing ethanol of the present invention, batch distillation or continuous distillation, which is an ethanol distillation method known to those skilled in the art, can be applied, but continuous distillation is preferably applied.
  • continuous distillation first, the ethanol filtrate vaporized by the heater is continuously introduced into the middle stage of the distillation column. Highly volatile ethanol-rich distillate is continuously obtained from the top of the distillation column, and bottom of the bottom is continuously rich in low-volatile components (impurity such as lactic acid and acetic acid) can get.
  • the distillation column is in a steady state by making the combined amount of the continuously obtained distillate and the bottoms the same as that of the continuously supplied raw material.
  • a rectification column with high separation performance can be preferably used as the shape of the distillation column.
  • the rectification column may be either a tray column or a packed column, but since the ethanol-containing filtrate recovered in the continuous fermentation step in the preceding stage is characterized by having a remarkably low foamability, it has foamability.
  • Continuous distillation by a packed column which is difficult to apply but at low equipment costs, can preferably be applied.
  • the measurement of the average particle size of the particles present in the ethanol fermentation liquid is performed by a dynamic light scattering method (DLS, photon correlation method).
  • the autocorrelation function is determined by Cumulant analysis from the fluctuation of the scattering intensity obtained by the measurement by the dynamic light scattering method, and after converting into the particle size distribution for the scattering intensity, the analysis range minimum value is The average particle diameter is converted to 1 nm and the maximum value is 5000 nm.
  • ELS-Z2 of Otsuka Electronics Co., Ltd. is used for measurement.
  • microorganisms may also be present as particles in the ethanol fermentation liquid
  • the microorganism is precipitated by centrifuging the room temperature ethanol fermentation liquid under the conditions of 1000 G for 10 minutes. Measure the average particle size of the particles contained in the clean.
  • the average particle diameter of the particles contained in the ethanol fermentation liquid is 40 to 80 nm, preferably 50 to 70 nm. Also, the particle size distribution of the particles is preferably in the range of 20 to 100 nm, more preferably in the range of 40 to 90 nm.
  • the ethanol fermentation liquid of the present invention is not particularly limited as long as it contains the particles, and may be, for example, an ethanol fermentation liquid containing a microorganism immediately after culture of the microorganism or an ethanol fermentation liquid from which the microorganism has been removed. It may be an ethanol fermentation liquid purified and concentrated by a method known to those skilled in the art as appropriate.
  • the concentration of ethanol contained in the ethanol fermentation solution of the present invention is not particularly limited, but is preferably 30 to 150 g / L, more preferably 50 to 120 g / L, and still more preferably 60 to 100 g / L. .
  • the ethanol fermentation liquid of this invention measured the transmittance
  • the time value exceeds 91% T, an unexpected superior effect of further suppressing foaming upon being subjected to distillation although the detailed action mechanism is not clear was confirmed in Examples described later. Therefore, regardless of whether the ethanol fermentation liquid of the present invention can be obtained by the above-mentioned continuous ethanol fermentation step, the transmittance of light at a wavelength of 300 nm is adjusted to 0.5 ⁇ 0.1% T with water. It is preferable that the transmittance at a light beam wavelength of 600 nm exceeds 91% T, and more preferably 94% T or more when diluted.
  • the transmittance of the ethanol fermentation liquid is a value measured by a UV-visible spectrophotometer. Specifically, distilled water is put in a 10 mm square quartz cuvette, and a background of transmittance of light wavelength from 200 nm to 800 nm is measured, and then the ethanol fermented liquid and distilled water are put in an empty cuvette by 300 nm. The mixture is mixed so that the transmittance of the light beam wavelength is 0.5 ⁇ 0.1% T, and the transmittance of the light beam wavelength of 600 nm is measured.
  • a UV-visible spectrophotometer in this measurement, a UV-Vis measuring device (V750) manufactured by JASCO Corporation may be used.
  • the ethanol fermentation liquid of the present invention is characterized by having a remarkably low foaming property, and thus can be preferably used as a raw material of ethanol for fuel which requires concentration and purification by distillation.
  • the effervescent property of ethanol is evaluated by the foam volume of the ethanol fermentation liquid, or the height of the foam when the ethanol fermentation liquid is subjected to a test simulating continuous distillation, as described in detail in the examples below. be able to.
  • Example 1 Continuous fermentation using a separation membrane using Schizosaccharomyces pombe strain NBRC 1628.
  • Continuous fermentation using a separation membrane using Schizosaccharomyces pombe strain NBRC 1628 as a microorganism and the fermentation raw material of Reference Example 2 as a culture medium Did.
  • As the separation membrane element the form of the hollow fiber described in JP-A-2010-22321 was adopted.
  • the Schizosaccharomyces pombe NBRC1628 strain was inoculated into a test tube into which 5 ml of the fermentation starting material of Reference Example 2 was added, and shake culture was performed overnight (pre-preculture).
  • the obtained culture broth was inoculated into a Erlenmeyer flask into which fresh 45 ml of the fermentation raw material of Reference Example 2 was added, and shake culture was performed at 30 ° C. and 120 rpm for 8 hours (pre-culture).
  • 35 mL of 50 mL of preculture liquid is separated, and inoculated into a continuous fermentation apparatus into which 700 mL of the fermentation raw material of Reference Example 2 is charged, and the fermentation reaction tank is stirred at 300 rpm by the attached stirrer and cultured for 24 hours went.
  • the culture solution circulation pump was operated to circulate the solution between the separation membrane element and the fermenter.
  • the filtration pump was operated to start the withdrawal of the culture solution from the separation membrane element.
  • Fermentation reaction tank capacity 2 (L) Used separation membrane: polyvinylidene fluoride filtration membrane separation element Effective filtration area: 218 (cm 2 ) Temperature control: 30 (° C) Fermentation reaction tank aeration: no aeration Fermentation reaction tank agitation speed: 300 (rpm) pH adjustment: Unadjusted filtration flux setting value: 0.1 (m 3 / m 2 / day) Sterilization: The separation membrane element and the fermenter are autoclaved at 121 ° C and 20 min.
  • High pressure steam sterilization Average pore size 0.1 ⁇ m Standard deviation of mean pore size: 0.035 ⁇ m Film surface roughness: 0.06 ⁇ m Pure water permeability coefficient: 50 ⁇ 10 ⁇ 9 m 3 / m 2 / s / pa.
  • the Schizosaccharomyces pombe NBRC1628 strain was inoculated into a test tube into which 5 ml of a fermentation raw material shown in Table 1 was added, and shake culture was performed overnight (pre-preculture).
  • the obtained culture broth was inoculated into a fresh 45 ml Erlenmeyer flask charged with the fermentation raw material shown in Table 1 and cultured with shaking at 30 ° C., 120 rpm for 8 hours (pre-culture).
  • 35 mL of 50 mL of pre-culture liquid is separated and inoculated into a continuous fermentation apparatus into which 700 mL of fermentation raw material shown in Table 1 is charged, and a fermentation reaction tank is stirred at 300 rpm by an attached stirrer, and the following fermentation conditions
  • the batch fermentation was performed for 48 hours, and 700 ml of ethanol fermentation liquid (fermentation liquid sample 2) having an ethanol concentration of 58 g / L was obtained.
  • Fermentation reaction tank capacity 2 (L) Temperature control: 30 (° C) Fermentation reaction tank aeration: no aeration Fermentation reaction tank agitation speed: 300 (rpm) pH adjustment: no adjustment.
  • Reference Example 4 Removal of Microorganisms from Batch Fermentation Liquid Because the fermentation liquid sample 2 obtained in Reference Example 3 contains a microorganism, the microorganism is precipitated by centrifugation at 1000 g for 10 minutes, and the supernatant liquid ( 600 ml of fermented liquid sample 3) was obtained.
  • Example 2 Distillation Test of Fermented Liquid Sample A test simulating a state inside the rectification column of continuous distillation was conducted. 300 ml fermented liquid samples 1 to 3 were separately added to a 500 ml round bottom flask, and the round bottom flask was heated by a mantle heater so that the liquid temperature sensor inside the round bottom flask maintained 95 ° C. A cooling condenser was attached to the outlet of the round bottom flask, and the evaporated ethanol was cooled and condensed by circulating cooling water at 4 ° C. to the condenser internal piping. As a result, for the fermented liquid samples 2 and 3, after boil, they quickly and vigorously foamed, and the bubbles reached the cooling condenser. As to one of the fermented liquid sample 1, surprisingly, it did not foam at all even if the distillation state was maintained for 5 hours.
  • Example 3 Evaluation of foamability
  • the foamability using the measuring cylinder described in "Oil Chemistry Vol. 42, No. 10 (1993) P. 737-734" is used.
  • a flow down test was conducted as an evaluation method.
  • a 500 ml measuring cylinder was set up, and 50 ml of the fermented solution was initially charged into the measuring cylinder separately from samples 1 to 3, into which 300 ml of samples 1 to 3 were separately dropped from a height of 45 cm, and the resulting foam volume was measured. .
  • the foam volume of fermentation liquid sample 1 was zero ml
  • the foam volumes of fermentation liquid samples 2 and 3 were 55 ml and 65 ml, respectively.
  • Example 4 Particle size distribution in ethanol fermentation liquid and measurement result of average particle size
  • the fermentation liquid samples 1 to 3 were centrifuged, and the average particle size of the obtained supernatant was measured. Specifically, each was centrifuged at 1,000 G at room temperature for 10 minutes, and 3 mL of each supernatant was collected. 30 ⁇ L of the collected supernatant was added to 970 ⁇ L of pH 5 citrate buffer for dilution, each diluted solution was placed in a 1 mL volume of disposable, and the average particle size was measured by dynamic light scattering.
  • the particle diameter was analyzed in the atmosphere at 25 ° C. using zeta potential and particle measurement system ELS-Z2 manufactured by Otsuka Electronics Co., Ltd. From the fluctuation of the scattering intensity obtained by dynamic light scattering, the autocorrelation function was determined by cumulant analysis, and converted to the particle size distribution for the scattering intensity.
  • the histogram analysis range of the particle size distribution has a minimum value of 1 nm and a maximum value of 5000 nm.
  • the obtained particle size distribution results are shown in FIG.
  • the expanded particle size distribution of only the fermented liquid sample 1 is shown in FIG.
  • Table 2 shows the summary of the average particle size and the foam volume of fermented liquid samples 1 to 3.
  • Example 5 Effervescent Property of Ethanol Fermented Liquid Sample
  • the effervescent property of the ethanol fermented liquid sample was evaluated in a test simulating continuous distillation.
  • a stirrer chip and 3 ml of the above-mentioned fermented liquid samples 1 to 3 were separately added to a test tube made of Tokyo Glass Machinery Co., Ltd. (20 ml transparent with common stoppered test tube scale), and a cooling tube set at 10 ° C. was attached on the top.
  • KF-82M magnetic stirrer
  • the heating was performed while stirring at 400 ⁇ 20 rpm.
  • foaming of more than 7 cm from the liquid surface was observed between 5 and 10 minutes after the start of heating.
  • the one fermented liquid sample 1 surprisingly remained completely unfoamed, confirming the same results as the foamability test of Example 3.
  • Example 6 Determination of the effervescent threshold of ethanol fermented liquid based on permeability 40 ml each of 80 ml of the prepared fermented liquid prepared in the same manner as sample 2 is put into Falcon 50 ml polypropylene conical tube and centrifuged at 10000 G for 60 minutes , Separated the particles and the supernatant. The sedimented particles were washed three times with water and centrifuged, and after the third centrifugation, the supernatant was discarded and dried with a freeze dryer (FDU-1200, manufactured by Tokyo Rika Kikai Co., Ltd.). The dry weight at this time was 520 mg.
  • FDU-1200 manufactured by Tokyo Rika Kikai Co., Ltd.
  • the particles were diluted with water to prepare a 104 mg / ml solution (particle solution).
  • particle solution Prepare a solution that makes the volume ratio of the supernatant: particle solution 1000: 0, 997: 3, 970: 30, 900: 100, 800: 200, 700: 300, 600: 400 by centrifugation at 10000 G for 60 minutes. did.
  • the transmittance of the solution at a wavelength of 600 nm was measured to be 97.6, 97.3, 91.8, 85.9, 84.5, respectively. It became 83.0 and 81.9.
  • the distillation test method similar to Example 5 was performed with each liquid, and analysis of the permeability and the presence or absence of foaming was performed.
  • the measurement of the permeability is considered to be a method by which the foamability can be simply measured.
  • Example 7 Measurement of Permeability of Fermented Liquid Sample
  • the measurement of the above-mentioned fermented liquid sample 1, sample 2 and sample 3 was performed.
  • the transmittance of light having a wavelength of 600 nm was 94.7% T for sample 1, 54.6% T for sample 2, and 90.7% T for sample 3. That is, even in the case of an actual fermented liquid sample, when the transmittance of the light beam wavelength of 600 nm is 91% T as a boundary, foaming does not occur as in Example 3 and Reference Example 5 above 91% T, while at 91% T or less It was confirmed that foaming occurred.
  • the ethanol fermentation liquid obtained by the ethanol production method of the present invention, or the ethanol fermentation liquid specified in the present invention can be used as a so-called bioethanol as a sustainable fuel or an industrial raw material.

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Abstract

本発明は、微生物をケーンモラセスを主成分として含む発酵原料で培養し、培養液を分離膜で濾過して微生物が分離されたエタノール含有濾過液を回収し、さらに微生物を含む未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ発酵原料を培養液に追加するエタノール連続発酵工程、および該連続発酵工程で回収されるエタノール含有濾過液を蒸留によりエタノール濃縮精製する工程を含むエタノールの製造方法において、前記微生物が前記培養液の遠心上清中に平均粒子径が１００ｎｍ以上の粒子を含有せしめる微生物であり、前記エタノール含有濾過液に含まれる前記微生物培養により形成される粒子の平均粒子径が４０～８０ｎｍである方法、あるいは微生物培養により形成される該微生物以外の粒子として平均粒子径が４０～８０ｎｍの粒子を含み、バガスの水熱処理時の成分を含まないエタノール発酵液であり、本発明により消泡剤を添加せずともエタノール発酵液の蒸留精製が可能となる。

Description

エタノールの製造方法およびエタノール発酵液
　本発明は、ケーンモラセスを主成分として含有する発酵原料を用いたエタノールの製造方法およびエタノール発酵液に関する。
　発酵によるアルコールの製造は、古くから研究の行われていた分野であるが、特に発酵によりバイオエタノールを製造する技術は、世界全体の地球環境意識の高まりや原油価格の高騰等を背景に、石油資源の消費を抑え、二酸化炭素の排出量を低減して、持続可能な（サスティナブルな）燃料や工業原料を生産することができる技術として近年再び注目を集めている。
　エタノールの製造方法としては、とうもろこしなどの可食性バイオマスから精製した六炭糖であるグルコースや、サトウキビから砂糖を精製する過程で生じる糖蜜（ケーンモラセス）を原料として、微生物による培養産物として得るのが一般的である。ケーンモラセスは、ブラジルやタイなどの砂糖生産国においてはエタノール発酵原料として多量に消費されており、重要な発酵原料となっている。
　一般に、微生物培養によるエタノールの製造方法としてはバッチ発酵法、フェドバッチ発酵法または連続発酵法などが用いられるが、特許文献１では分離膜を用いた連続発酵方法によりエタノールの生産速度や収率が向上することが開示されている。一方で当該特許文献では、ケーンモラセス含有原料の使用に関する記載はない。また、特許文献２では複数の発酵槽を連結した連続発酵法により得られる培養液を遠心分離することで、微生物とエタノール発酵液に分けて、微生物を除去したエタノール発酵液は蒸留を行い、微生物については発酵槽に戻す方法が開示されている。一方で当特許文献では、ケーンモラセス含有原料を使用しているが、分離膜を用いていない。このように得られたエタノール発酵液が、次に蒸留を行うことでエタノールを濃縮精製することは一般的である。
　工業的に行われる蒸留は、回分式蒸留と連続式蒸留に分類される。燃料用エタノールは大量消費される化学品であるため、大量処理を行う必要があり、その場合には連続式蒸留が行われることが一般的である。
　このエタノール発酵液の蒸留において、蒸留塔内で発泡現象が発生すると圧力損失が上昇し，最終的にはフラッディング状態に到達し，連続式蒸留の運転継続が困難となる課題があった。一般的な解決方法としては、消泡剤を添加することで行われるが、多額の費用を要するのみならず、消泡剤自体は異物として、蒸留塔の塔頂からの留出液もしくは蒸留塔の塔底からの缶出液に混入される。また、蒸留塔内に残留して蒸留に悪影響を及ぼすので、消泡剤の添加は好ましくない手段と考えられている。
　そこで特許文献３では、蒸留時の発泡を抑制するため、蒸留塔の塔底に攪拌軸を設けて攪拌翼を回転させることで泡を消す方法が開示されている。しかしながら蒸留塔は、運転で付着する汚れを定期的に洗浄する必要があるため、稼働部や複雑な構造は嫌われるため、依然として発泡を抑制するためには消泡剤の添加に頼るしかない状況であった。
ＷＯ２００７／０９７２６０ ＷＯ２０１１／１３５５８８ 特開平６－３３５６２７号公報
　特許文献２に記載されているように、ケーンモラセスを主成分として含有する発酵原料および微生物としてシゾサッカロマイセス属を用いエタノール発酵法を行い蒸留検討した結果、従来から言われているとおりに発泡が激しく発生し消泡剤を添加する必要があることを確認した。
　そこで本発明では、蒸留時に消泡剤を添加せずとも蒸留可能な方法およびそのようなエタノール発酵液を提供することを目的とする。
　本発明者は鋭意検討した結果、ケーンモラセスを主成分として含有する発酵原料を用いたエタノール発酵液でも、分離膜を利用した連続発酵法によりエタノール発酵液を得れば、蒸留時に驚くべきことに発泡が全く発生しないことを見出し、本発明に至った。
　すなわち、本発明は以下の（１）～（８）の通りである。
（１）微生物をケーンモラセスを主成分として含む発酵原料で培養し、培養液を分離膜で濾過して微生物が分離されたエタノール含有濾過液を回収し、さらに微生物を含む未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ発酵原料を培養液に追加するエタノール連続発酵工程、および該連続発酵工程で回収されるエタノール含有濾過液を蒸留によりエタノール濃縮精製する工程を含むエタノールの製造方法において、前記微生物が前記培養液の遠心上清中に平均粒子径が１００ｎｍ以上の粒子を含有せしめる微生物であり、前記エタノール含有濾過液に含まれる前記微生物培養により形成される粒子の平均粒子径が４０～８０ｎｍである、方法。
（２）前記粒子の平均粒子径が３００ｎｍ以上である、（１）に記載のエタノールの製造方法。
（３）前記微生物がシゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母である、（１）または（２）に記載のエタノールの製造方法。
（４）前記エタノール含有濾過液に含まれる、前記微生物培養により形成される粒子の粒子径分布が粒子径２０～１００ｎｍの範囲内である、（１）～（３）のいずれかに記載のエタノールの製造方法。
（５）前記蒸留が連続式蒸留である、（１）～（４）のいずれかに記載のエタノールの製造方法。
（６）微生物培養により形成される該微生物以外の粒子として平均粒子径が４０～８０ｎｍの粒子を含み、バガスの水熱処理時の成分を含まない、エタノール発酵液。
（７）前記粒子の粒子径分布が粒子径２０～１００ｎｍの範囲内である、（６）に記載のエタノール発酵液。
（８）３００ｎｍの光線波長の透過度が０．５±０．１％Ｔとなるように希釈した場合での、６００ｎｍの光線波長の透過度が９１％Ｔ超である、エタノール発酵液。
　本発明によれば、蒸留時に発泡性のあるケーンモラセスを主成分として含有する発酵原料を用いたエタノール発酵液であっても、前記エタノール連続発酵工程で回収されるエタノール含有濾過液または前記エタノール発酵液を蒸留工程に供することで蒸留時の発泡を顕著に抑制することができ、蒸留による安定したバイオエタノール生産が可能となる。
エタノール発酵液１から３の粒子径分布結果 エタノール発酵液１の粒子径分布結果（拡大）
　本発明は、ケーンモラセスを主成分として含有する発酵原料とする培養液の遠心上清中に平均粒子径が１００ｎｍ以上の粒子を含有せしめる微生物による分離膜利用エタノール連続発酵工程、および該連続発酵工程で回収されるエタノール濾過液を蒸留により濃縮精製する工程を含むエタノールの製造方法、ならびに微生物培養によって形成される特定の平均粒子径の粒子を含むエタノール発酵液に関する。以下、本発明のエタノールの製造方法について工程毎に説明し、また、本発明のエタノール発酵液の特徴について説明する。
　［エタノール連続発酵工程］
　本発明で使用する微生物は、エタノールを生産する能力を有する微生物であり、かつ、当該微生物をケーンモラセスを主成分として含む発酵原料で培養した際に、培養液の遠心上清中に平均粒子径が１００ｎｍ以上の粒子を含有せしめる微生物であれば特に制限はない。そのような微生物の好ましい具体例としては、発酵工業においてよく使用されるパン酵母などの酵母、大腸菌、コリネ型細菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌などが挙げられる。自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。エタノール生産する微生物として好ましくは酵母である。酵母としては、例えばサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）が好ましい。中でもＳｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に属する酵母が好ましく、Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ、Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓまたはＳｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｒｙｏｐｈｉｌｕｓを好適に用いることができる。
　前記粒子とは、ケーンモラセスを主成分として含む発酵原料で培養して得られる培養液中に含まれる微生物以外の不溶性の粒状物質を意味する。培養液中に存在する粒子の平均粒子径の測定は、動的光散乱法（ＤＬＳ、光子相関法）により行う。具体的には、動的光散乱法による測定によって得られた散乱強度の揺らぎから、キュムラント（Ｃｕｍｕｌａｎｔ）解析によって自己相関関数を求め、散乱強度に対する粒度分布へ変換した後に、解析範囲最小値を１ｎｍ、最大値を５０００ｎｍとして平均粒子径に換算する。測定には、大塚電子株式会社のＥＬＳ－Ｚ２を用いる。また、培養液中には微生物も粒子として存在していることから、室温の培養液を１０００Ｇ、１０分の条件で遠心することにより微生物を沈殿させ、その遠心上清に含まれる粒子の平均粒子径を測定する。
　前記培養液に含まれる前記粒子の平均粒子径は１００ｎｍ以上であり、好ましくは３００ｎｍ以上、より好ましくは３００～１５００ｎｍである。このような平均粒子径が１００ｎｍ以上の粒子を培養液中に含有せしめる微生物を利用することで、詳細な作用機序は明らかではないが、後述の実施例で示されるように、本発明のエタノール連続発酵工程で回収されるエタノール含有濾過液を蒸留に供した際の発泡が抑制されるという予想外の優れた効果がもたらされる。なお、前記粒子の平均粒子径の上限は、膜閉塞の発生により濾過フラックスを低下させない範囲においては特に制限されないが、前記遠心によっても微生物とともに沈殿しないような粒子の平均粒子径が上限となり、好ましい上限値としては１５００ｎｍである。
　ケーンモラセスとは、サトウキビの絞り汁あるいは粗糖より、製糖の過程で生成する副産物である。具体的には、製糖過程における結晶化工程で結晶化の後に残った糖成分を含む晶析母液のことを指す。一般的に、結晶化工程は、複数回行うことが通常であり、１回目の結晶化を行い得た結晶成分である１番糖、さらに１番糖の残り液（１番糖蜜）の結晶化を行い得た結晶成分である２番糖、さらに２番糖の残り液（２番糖蜜）の結晶化を行い得た３番糖、のように結晶化を繰り返し行い、その際に残った晶析母液として得た最終段階の糖蜜のことをケーンモラセスという。結晶化の回数が多くなるに伴い、糖成分以外の無機塩がケーンモラセス中に濃縮される。本発明で使用するケーンモラセスとしては、結晶化回数が多く経た後のケーンモラセスであることが好ましく、少なくとも２回以上、さらに好ましくは３回以上結晶化を行った後に残るケーンモラセスであることが好ましい。ケーンモラセスに含まれる糖成分としては、スクロース、グルコース、フルクトースを主成分として含んでおり、キシロース、ガラクトースなどのその他の糖成分も若干含まれる場合がある。ケーンモラセス中の糖濃度は、一般的に２００～８００ｇ／Ｌ程度である。ケーンモラセス中の糖濃度は、ＨＰＬＣなどの公知の測定手法によって定量することができる。
　発酵原料とは、微生物が増殖するために必要な栄養が全て含まれるものである。本発明で使用する発酵原料にはケーンモラセスが主成分として含まれていればよく、その他、炭素源、窒素源、無機塩類、および必要に応じてアミノ酸、ビタミンなどの有機微量栄養素を適宜添加してもよい。なお、本発明においてケーンモラセスを主成分として含む発酵原料とは、発酵原料に含まれる物質（水を除く）のうち５０重量パーセント以上がケーンモラセスであることを意味する。
　炭素源としては、グルコース、スクロース、フルクトース、ガラクトース、ラクトース等の糖類、これら糖類を含有するコーン澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、更には酢酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類、グリセリンなどの他、セルロース含有バイオマス由来糖液が好ましく使用される。
　セルロース含有バイオマスとしては、バガス、スイッチグラス、コーンストーバー、稲わら、麦わらなど草木系バイオマスと、樹木、廃建材などの木質系バイオマスなどを例として挙げることができる。セルロース含有バイオマスは、糖が脱水縮合した多糖であるセルロースあるいはヘミセルロースを含有しており、こうした多糖を加水分解することで発酵原料として利用可能な糖液が製造される。
　セルロース含有バイオマス由来糖液の調製方法は特に制限はなく、こうした糖の製造方法としては、濃硫酸を使用してバイオマスを酸加水分解して糖液を製造する方法（特表平１１－５０６９３４号公報、特開２００５－２２９８２１号公報）、バイオマスを希硫酸で加水分解処理した後に、さらにセルラーゼなどの酵素処理することより糖液を製造する方法が開示されている（Ａ．Ａｄｅｎら、“Ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ　Ｂｉｏｍａｓｓ ｔｏ　Ｅｔｈａｎｏｌ　Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ　Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ　Ｃｏ－Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｄｉｌｕｔｅ　Ａｃｉｄ　Ｐｒｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｆｏｒ　Ｃｏｒｎ　Ｓｔｏｖｅｒ”ＮＲＥＬ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ（２００２））。また酸を使用しない方法として、２５０～５００℃程度の亜臨界水を使用しバイオマスを加水分解して糖液を製造する方法（特開２００３－２１２８８８号公報）、またバイオマスを亜臨界水処理した後に、さらに酵素処理することにより糖液を製造する方法（特開２００１－９５５９７号公報）、バイオマスを２４０～２８０℃の加圧熱水で加水分解処理した後に、さらに酵素処理することにより糖液を製造する方法（特許３０４１３８０号公報）が開示されている。以上のような処理の後、得られた糖液とケーンモラセスを混合して精製してもよい。その方法は、例えば、ＷＯ２０１２／１１８１７１に開示されている。
　窒素源としてはアンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵微生物およびその加水分解物などが使用される。
　無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等を適宜添加することができる。
　また、本発明に使用する微生物が生育のために特定の栄養素を必要とする場合にはその栄養物を標品もしくはそれを含有する天然物として添加して使用できる。
　前記微生物および発酵原料を用いるエタノール連続発酵工程は分離膜を用いた連続発酵工程であり、具体的には、培養液を分離膜で濾過して微生物が分離されたエタノール含有濾過液を回収し、さらに微生物を含む未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ発酵原料を培養液に追加することを特徴とする連続発酵工程である。
　エタノール連続発酵工程で用いられる分離膜については、微生物の培養で得られた発酵液を微生物から分離濾過する機能を有するものであれば特に制限はなく、材質としては、例えば、多孔質セラミック膜、多孔質ガラス膜、多孔質有機高分子膜、金属繊維編織体、不織布などを用いることができるが、これらの中で特に多孔質有機高分子膜もしくはセラミック膜が好適である。
　前記分離膜の構成としては、例えば、耐汚れ性の点から、多孔質樹脂層を機能層として含む分離膜であることが好ましい。
　多孔質樹脂層を含む分離膜は、好ましくは、多孔質基材の表面に、分離機能層として作用とする多孔質樹脂層を有している。多孔質基材は、多孔質樹脂層を支持して分離膜に強度を与える。また、多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を有している場合、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していても、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していなくてもどちらでも良い。
　多孔質基材の平均厚みは、好ましくは５０～３０００μｍである。
　多孔質基材の材質は、有機材料および／または無機材料等からなり、有機繊維が望ましく用いられる。好ましい多孔質基材は、セルロース繊維、セルローストリアセテート繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維およびポリエチレン繊維などの有機繊維なる織布や不織布であり、より好ましくは、密度の制御が比較的容易であり製造も容易で安価な不織布が用いられる。
　多孔質樹脂層は、有機高分子膜を好適に使用することができる。有機高分子膜の材質としては、例えば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、セルロース系樹脂およびセルローストリアセテート系樹脂などが挙げられる。有機高分子膜は、これらの樹脂を主成分とする樹脂の混合物であってもよい。ここで主成分とは、その成分が５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上含有することをいう。有機高分子膜の材質は、溶液による製膜が容易で物理的耐久性や耐薬品性にも優れているポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂およびポリアクリロニトリル系樹脂が好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはそれを主成分とする樹脂が最も好ましく用いられる。
　ここで、ポリフッ化ビニリデン系樹脂としては、フッ化ビニリデンの単独重合体が好ましく用いられる。さらに、ポリフッ化ビニリデン系樹脂は、フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体との共重合体も好ましく用いられる。フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体としては、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレンおよび三塩化フッ化エチレンなどが例示される。
　前記分離膜は、培養に使用される微生物が通過できない細孔径を有していればよいが、培養に使用される微生物の分泌物や発酵原料中の微粒子による目詰まりが起こりにくく、かつ、濾過性能が長期間安定に継続する範囲であることが望ましい。よって、多孔性分離膜の平均細孔径が、０.０１～５μｍであることが好ましい。また、さらに好ましくは、分離膜の平均細孔径が、０.０１～１μｍであると、微生物がリークすることのない高い排除率と、高い透水性を両立させることができ、透水性を長時間保持することができる。
　微生物の大きさに近いと、これらが直接孔を塞いでしまう場合があるので、分離膜の平均細孔径は１μｍ以下であることが好ましい。分離膜の平均細孔径は、微生物の漏出、すなわち排除率が低下する不具合の発生を防止するため、微生物の大きさと比較して大きすぎないことが好ましい。微生物のうち、細胞の小さい細菌などを用いる場合には、平均細孔径として０.４μｍ以下が好ましく、０.２μｍ以下がより好ましく、０．１μｍ以下がさらに好ましい。平均細孔径が小さすぎると分離膜の透水性能が低下し、膜が汚れていなくても効率的な運転ができなくなるため、本発明における分離膜の平均細孔径は、好ましくは０.０１μｍ以上であり、より好ましくは０．０２μｍ以上であり、さらに好ましくは０．０４μｍ以上である。
　ここで、平均細孔径は、倍率１０，０００倍の走査型電子顕微鏡観察における、９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔すべての直径を測定し、平均することにより求めることができる。平均細孔径は、あるいは膜表面を、走査型電子顕微鏡を用いて倍率１０,０００倍で写真撮影し、１０個以上、好ましくは２０個以上の細孔を無作為に選び、それら細孔の直径を測定し、数平均して求めることもできる。細孔が円状でない場合、画像処理装置等によって、細孔が有する面積と等しい面積を有する円（等価円）を求め、等価円直径を細孔の直径とする方法により求められる。
　前記分離膜の平均細孔径の標準偏差σは、０．１μｍ以下であることが好ましい。平均細孔径の標準偏差σは小さければ小さい方が望ましい。平均細孔径の標準偏差σは、上述の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔数をＮとして、測定した各々の直径をＸｋとし、細孔直径の平均をＸ（ａｖｅ）とした下記の（式１）により算出される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　前記分離膜においては、培養液の透過性が重要な性能の一つである。分離膜の透過性の指標として、使用前の分離膜の純水透過係数を用いることができる。本発明において、分離膜の純水透過係数は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、５．６×１０－１０ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上であることが好ましく、純水透過係数が、５．６×１０－１０ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０－７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下であれば、実用的に十分な透過水量が得られる。
　前記分離膜において、表面粗さとは、表面に対して垂直方向の高さの平均値である。膜表面粗さは、分離膜表面に付着した微生物が、撹拌や循環ポンプによる液流による膜面洗浄効果で剥離しやすくするための因子の一つである。分離膜の表面粗さは、特に制限はなく、膜に付着した微生物、ならびにその他の固形物が剥がれる範囲であればよいが、０.１μｍ以下であることが好ましい。表面粗さが０．１μｍ以下であると、膜に付着した微生物、ならびにその他の固形物が剥がれやすくなる。
　さらに好ましくは、分離膜の膜表面粗さが０.１μｍ以下であり、平均細孔径が０.０１～１μｍであり、分離膜の純水透過係数が２×１０－９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上の分離膜を使用することにより、膜面洗浄に必要な動力を過度に必要としない運転が、より容易に可能であることがわかった。分離膜の表面粗さを、０.１μｍ以下とすることにより、微生物の濾過において、膜表面で発生する剪断力を低下させることができ、微生物の破壊が抑制され、分離膜の目詰まりも抑制されることにより、長期間安定な濾過が、より容易に可能になる。また、分離膜の表面粗さを、０.１μｍ以下とすることにより、より低い膜間差圧で連続発酵が実施可能であり、分離膜が目詰まりした場合でも高い膜間差圧で運転した場合に比べて、洗浄回復性が良好である。分離膜の目詰まりを抑えることにより、安定した連続発酵が可能になることから、分離膜の表面粗さは小さければ小さいほど好ましい。
　ここで、分離膜の膜表面粗さは、下記の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）を使用して、下記の条件で測定したものである。
・装置　　原子間力顕微鏡装置（Digital Instruments（株）製“Nanoscope IIIa”）
・条件　　探針　　　　ＳｉＮカンチレバー（Digital Instruments（株）製）
　　　　　走査モード　コンタクトモード（気中測定）
　　　　　　　　　　　水中タッピングモード（水中測定）
　　　　　走査範囲　　１０μｍ、２５μｍ四方（気中測定）
　　　　　　　　　　　５μｍ、１０μｍ四方（水中測定）
　　　　　走査解像度　５１２×５１２
・試料調製　測定に際し膜サンプルは、常温でエタノールに１５分浸漬後、ＲＯ水中に２４時間浸漬し洗浄した後、風乾し用いた。ＲＯ水とは、濾過膜の一種である逆浸透膜（ＲＯ膜）を用いて濾過し、イオンや塩類などの不純物を排除した水を指す。ＲＯ膜の孔の大きさは、概ね２ｎｍ以下である。
　膜表面粗さｄｒｏｕｇｈは、上記の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）により各ポイントのＺ軸方向の高さから、下記の（式２）により算出する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　前記分離膜の形状は特に限定されず、平膜や中空糸膜などを用いることができるが、好ましくは中空糸膜である。分離膜が中空糸膜の場合、中空糸の内径は、好ましくは２００～５０００μｍであり、膜厚は、好ましくは２０～２０００μｍである。また、有機繊維または無機繊維を筒状にした織物や編物を中空糸の内部に含んでいても良い。
　なお、前記分離膜は、例えばＷＯ２００７／０９７２６０に記載される製造方法により製造することができる。
　エタノール連続発酵工程での濾過時の膜間差圧は特に制限されることはなく、培養液を濾過できればよい。しかし、培養液を濾過するために、有機高分子膜において１５０ｋＰａより高い膜間差圧で濾過処理すると、有機高分子膜の構造が破壊される可能性が高くなり、エタノールを生産する能力が低下することがある。また、０．１ｋＰａより低い膜間差圧では、培養液の透過水量が十分得られない場合が多くエタノールを製造するときの生産性が低下する傾向がある。したがって、本発明のエタノールの製造方法では、有機高分子膜においては、濾過圧力である膜間差圧を好ましくは０．１～１５０ｋＰａの範囲とすることにより、培養液の透過水量が多く、膜の構造の破壊によるエタノール製造能力の低下もないことから、エタノールを生産する能力を高く維持することが可能である。膜間差圧は、有機高分子膜においては、好ましくは０.１～５０ｋＰａの範囲であり、さらに好ましくは０.１～２０ｋＰａの範囲である。
　酵母の培養における温度は、用いる酵母に適した温度を設定すればよく、微生物が生育する範囲であれば特に限定されないが、温度が２０～７５℃の範囲で行われる。
　本発明のエタノールの製造方法では、培養初期にバッチ発酵またはフェドバッチ発酵を行って微生物濃度を高くした後に、連続発酵（発酵液の濾過）を開始しても良い。また、高濃度の微生物をシードし、培養開始とともに連続発酵を行っても良い。本発明のエタノールの製造方法では、適当な時期から、発酵原料の供給および培養液の濾過を行うことが可能である。発酵原料の供給と培養液の濾過の開始時期は、必ずしも同じである必要はない。また、発酵原料供給と培養液の濾過は連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。
　培養液中の微生物の濃度は、エタノールの生産性を高い状態で維持することが効率よい生産性を得るのに好ましい。培養液中の微生物の濃度は、一例として、乾燥重量として、５ｇ／Ｌ以上に維持することで良好な生産効率が得られる。
　エタノール連続発酵工程では、連続発酵の途中において必要に応じて、発酵槽内から微生物を含んだ培養液の一部を取り除いた上、発酵原料を供給して希釈することによって、発酵槽内の微生物濃度を調整してもよい。例えば、発酵槽内の微生物濃度が高くなりすぎると、分離膜の閉塞が発生しやすくなることから、微生物を含んだ培養液の一部を取り除き、発酵原料を供給して希釈することで、閉塞から回避することができることがある。本発明のエタノールの製造方法では、発酵槽の数は問わない。
　本発明で用いられる連続発酵装置は、微生物を含む培養液を分離膜で濾過し、濾液からエタノールを回収するとともに微生物を含む未濾過液を前記の培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を前記の培養液に追加して濾過液中のエタノールを回収する連続発酵によるエタノールの製造装置であれば特に制限はないが、具体例を挙げると、ＷＯ２００７／０９７２６０、ＷＯ２０１０／０３８６１３に記載される装置が使用できる。
　［蒸留工程］
　本発明のエタノールの製造方法でのエタノールの蒸留方法としては、当業者にとって公知のエタノール蒸留方法である回分式蒸留または連続式蒸留が適用できるが、連続蒸留が好ましく適用される。連続蒸留の方法としては、まず、加熱器で気化した前記エタノール濾過液を連続的に蒸留塔の中段に導入する。蒸留塔の頂上からは揮発性の高いエタノールに富んだ留出液が連続的に得られ、底部からは揮発性の低い成分に富んだ（乳酸や酢酸などの不純物）缶出液が連続的に得られる。連続的に得られる留出液と缶出液を合わせた量が連続的に供給される原料と同量になるようにすることで蒸留塔は定常状態となる。
　蒸留塔の形状としては、分離性能の高い精留塔が好ましく利用できる。精留塔としては棚段塔と充填塔のいずれでも良いが、前段の連続発酵工程で回収されるエタノール含有濾過液は発泡性が顕著に低いという特徴があることから、発泡性がある場合に適用が困難であるが設備コストが安価である充填塔による連続蒸留を好ましく適用できる。
　［エタノール発酵液］
　前記エタノール連続発酵工程で回収されるエタノール含有濾過液には、平均粒子径が４０～８０ｎｍである、前記微生物培養によって形成される微生物以外の不溶性の粒状物質（以下、単に「粒子」という。）が含まれる。微生物培養によって本粒子が生じること自体が新規な知見であるため、本粒子の組成等の分析方法は当業者の技術常識として確立しておらず、本粒子は微生物培養によって形成される副産物であることしか明らかでないが、本粒子がエタノール含有濾過液に含まれることにより、詳細な作用機序は明らかではないものの蒸留に供した際の発泡が抑制されるという予想外の優れた効果が後述の実施例で確認された。従って、前記エタノール連続発酵工程によって得られるものであるかどうかに関わらず、平均粒子径が４０～８０ｎｍの前記粒子を含むことで特定されるエタノール発酵液そのものも本発明の一態様である。
　前記エタノール発酵液中に存在する粒子の平均粒子径の測定は、動的光散乱法（ＤＬＳ、光子相関法）により行う。具体的には、動的光散乱法による測定によって得られた散乱強度の揺らぎから、キュムラント（Ｃｕｍｕｌａｎｔ）解析によって自己相関関数を求め、散乱強度に対する粒子径分布へ変換した後に、解析範囲最小値を１ｎｍ、最大値を５０００ｎｍとして平均粒子径に換算する。測定には、大塚電子株式会社のＥＬＳ－Ｚ２を用いる。また、エタノール発酵液中には微生物も粒子として存在している場合もあることから、その場合は室温のエタノール発酵液を１０００Ｇ、１０分の条件で遠心することにより微生物を沈殿させ、その遠心上清に含まれる粒子の平均粒子径を測定する。
　前記エタノール発酵液が含有する前記粒子の平均粒子径は４０～８０ｎｍであるが、好ましくは５０～７０ｎｍである。また、前記粒子の粒子径分布は、好ましくは２０～１００ｎｍの範囲内であり、より好ましくは４０～９０ｎｍの範囲内である。
　本発明のエタノール発酵液は前記粒子を含んでいれば特に制限はなく、例えば、微生物培養直後の微生物を含むエタノール発酵液や微生物を除去したエタノール発酵液であってもよく、また、微生物を除去後に適宜当業者に公知の方法により精製・濃縮したエタノール発酵液であってもよい。
　本発明のエタノール発酵液に含まれるエタノール濃度についても特に制限はないが、好ましくは３０～１５０ｇ／Ｌであり、より好ましくは５０～１２０ｇ／Ｌであり、さらに好ましくは６０～１００ｇ／Ｌである。
　また、本発明のエタノール発酵液は、３００ｎｍの光線波長の透過度が０．５±０．１％Ｔとなるように水で希釈したエタノール発酵希釈液について６００ｎｍの光線波長の透過度を測定したときの値が９１％Ｔを超えると、詳細な作用機序は明らかではないものの蒸留に供した際の発泡がさらに抑制されるという予想外の優れた効果が後述の実施例で確認された。したがって、本発明のエタノール発酵液は、前記エタノール連続発酵工程によって得られるものであるかどうかにかかわらず、３００ｎｍの光線波長の透過度を０．５±０．１％Ｔとなるように水で希釈した時の、６００ｎｍの光線波長の透過度が９１％Ｔを超えることが好ましく、９４％Ｔ以上であることがより好ましい。
　前記エタノール発酵液の透過度は、紫外可視分光光度計により測定された値である。具体的には、１０ｍｍ角の石英キュベットに蒸留水を入れ、２００ｎｍから８００ｎｍまでの光線波長の透過度のバックグラウンドを測定し、そののち、空のキュベットに前記エタノール発酵液と蒸留水を、３００ｎｍの光線波長の透過度が０．５±０．１％Ｔとなるように混合し、６００ｎｍの光線波長の透過度を測定する。本測定での紫外可視分光光度計としては日本分光株式会社製ＵＶ－Ｖｉｓ測定器（Ｖ７５０）を用いればよい。
　本発明のエタノール発酵液は発泡性が顕著に低いという特徴があるため、蒸留による濃縮精製が必要な燃料用エタノールの原料として好ましく利用できる。エタノール発泡性とは、後述の実施例にて詳細が説明されるとおり、エタノール発酵液の泡沫体積や、エタノール発酵液を連続式蒸留を模した試験に供した場合の泡の高さで評価することができる。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
　（参考例１）糖類、エタノールの分析方法
　原料中の糖類、エタノール濃度は、下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ　ＳＨ１０１１（昭和電工株式会社製）
移動相：５ｍＭ　硫酸（流速０．６ｍＬ／分）
反応液：なし
検出方法：ＲＩ（示差屈折率）
温度：６５℃。
　（参考例２）発酵原料の調製
ケーンモラセス重量と水重量を１：３で混合し、発酵原料を得た。参考例１に示す方法により糖類を分析した結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　（実施例１）シゾサッカロマイセス・ポンベＮＢＲＣ１６２８株を用いた分離膜を利用した連続発酵
　微生物としてシゾサッカロマイセス・ポンベＮＢＲＣ１６２８株、培地として参考例２の発酵原料を用い、分離膜を利用した連続発酵を行なった。分離膜エレメントとしては特開２０１０－２２３２１に記載の中空糸の形態を採用した。シゾサッカロマイセス・ポンベＮＢＲＣ１６２８株を５ｍｌの参考例２の発酵原料を投入した試験管に植菌し一晩振とう培養した（前々培養）。得られた培養液を、新鮮な４５ｍｌの参考例２の発酵原料を投入した三角フラスコに植菌し、３０℃、１２０ｒｐｍで８時間振とう培養した（前培養）。前培養液５０ｍＬのうち３５ｍＬを分取して、７００ｍＬの参考例２の発酵原料を投入した連続発酵装置に植菌し、発酵反応槽を付属の撹拌機によって３００ｒｐｍで撹拌し、２４時間培養を行った。なお、植菌後直ちに培養液循環ポンプを稼動させ、分離膜エレメントと発酵槽間の液循環をおこなった。前培養終了後、濾過ポンプを稼動させて分離膜エレメントより培養液の抜き出しを開始した。濾過開始後は、連続発酵装置の培養液量を７００ｍＬになるよう発酵原料添加制御を行いながら以下の連続発酵条件で約２００時間の連続発酵を行い、その際にエタノール濃度６４ｇ／Ｌのエタノール含有濾過液（発酵液サンプル１）を７００ｍｌ得た。
　［連続発酵条件］
発酵反応槽容量：２（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン製濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積：２１８（ｃｍ２）
温度調整：３０（℃）
発酵反応槽通気量：無通気
発酵反応槽撹拌速度：３００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：無調整
濾過フラックス設定値：０．１（ｍ３／ｍ２／日）
滅菌：分離膜エレメントおよび発酵槽は１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌
平均細孔径：０．１μｍ
平均細孔径の標準偏差：０．０３５μｍ
膜表面粗さ：０．０６μｍ
純水透過係数：５０×１０－９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ。
　（参考例３）シゾサッカロマイセス・ポンベＮＢＲＣ１６２８株を用いたバッチ発酵
　実施例１と発酵原料、微生物、前培養条件、発酵条件同一にしたバッチ発酵を行った。ただし分離膜による培養液の濾過は行わない。
　シゾサッカロマイセス・ポンベＮＢＲＣ１６２８株を５ｍｌの表１に示す発酵原料を投入した試験管に植菌し一晩振とう培養した（前々培養）。得られた培養液を、新鮮な４５ｍｌの表１に示す発酵原料を投入した三角フラスコに植菌し、３０℃、１２０ｒｐｍで８時間振とう培養した（前培養）。前培養液５０ｍＬのうち３５ｍＬを分取して、７００ｍＬの表１に示す発酵原料を投入した連続発酵装置に植菌し、発酵反応槽を付属の撹拌機によって３００ｒｐｍで撹拌し、以下の発酵条件で４８時間バッチ発酵を行い、その際にエタノール濃度５８ｇ／Ｌのエタノール発酵液（発酵液サンプル２）を７００ｍｌ得た。
　［バッチ発酵条件］
発酵反応槽容量：２（Ｌ）
温度調整：３０（℃）
発酵反応槽通気量：無通気
発酵反応槽撹拌速度：３００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：無調整。
　（参考例４）バッチ発酵液からの微生物除去
　参考例３で得られた発酵液サンプル２には微生物が含有されているため、１０００ｇ、１０分間の遠心分離により微生物沈殿させ、その上清液（発酵液サンプル３）を６００ｍｌ得た。
　（実施例２）発酵液サンプルの蒸留試験
　連続式蒸留の精留塔内部の状態を模した試験を行った。３００ｍｌ発酵液サンプル１から３を別々に、５００ｍｌ容丸底フラスコに加え、丸底フラスコをマントルヒーターにより、丸底フラスコ内部の液温センサーが９５℃を維持するように加熱運転した。丸底フラスコの出口には冷却コンデンサーを装着し、４℃の冷却水をコンデンサー内部配管に循環することで、蒸発したエタノールを冷却し凝縮させた。その結果、発酵液サンプル２および３については沸騰後速やかに激しく発泡し、冷却コンデンサーにまで泡が到達してしまった。一方の発酵液サンプル１については驚くべきことに５時間の蒸留状態を維持しても全く発泡しないままであった。
　（実施例３）発泡性の評価
　発泡性の評価を行うために、「油化学　第４２巻、第１０号（１９９３）Ｐ.７３７－７３４」に記載されているメスシリンダーを用いた発泡性の評価方法である、流下法による試験を行った。５００ｍｌのメスシリンダーを立て、サンプル１から３を別々に５０ｍｌ発酵液をメスシリンダーに最初に仕込み、そこへ３００ｍｌのサンプル１から３を別々に４５ｃｍの高さから流下させ、生ずる泡沫体積を測定した。その結果、発酵液サンプル１の泡沫体積はゼロｍｌであり、発酵液サンプル２おとび３の泡沫体積は、それぞれ５５ｍｌおよび６５ｍｌであった。
　実施例２および３の結果より、発酵液サンプル１は全く発泡しないという驚くべき特性を備えていることが明らかになった。
　（実施例４）エタノール発酵液中の粒子径分布および平均粒子径測定結果
　発酵液サンプル１から３を遠心分離し、得られた上清の平均粒子径測定を実施した。具体的にはそれぞれを室温下１，０００Ｇで１０分間遠心して、それぞれの上清３ｍＬを回収した。回収した上清３０μＬをｐＨ５のクエン酸緩衝液９７０μＬに加えて希釈し、希釈した各溶液を１ｍＬ容量のディスポセルに入れ、動的光散乱により平均粒子径を測定した。
　［測定条件］
・光源のピンホールサイズ：１００μｍ
・測定波長：６６０ｎｍ
・測定角度：１６５°
・測定積算回数：７０回
・溶媒屈折率：１．３３１３
・溶媒粘度：０．８８５２ｃｐ。
　次に、測定結果を以下の条件にて解析した。
　［解析条件］
　粒子径の解析には、大塚電子株式会社のゼータ電位・粒子測定システムＥＬＳ－Ｚ２を用い、２５℃の条件で、大気中で測定を行った。動的光散乱によって得られた散乱強度の揺らぎからキュムラント解析によって自己相関関数を求め、散乱強度に対する粒度分布へ変換した。粒度分布のヒストグラム解析範囲は最小値を１ｎｍ、最大値を５０００ｎｍとした。得られた粒子径分布結果を図１に示す。発酵液サンプル１のみの拡大した粒子径分布を図２に示す。また、表２には発酵液サンプル１から３の平均粒子径と泡沫体積の結果まとめを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　その結果、図１および表２に示したように、原料であるケーンモラセスには粒子は含まれず、微生物培養により粒子が形成されることがわかった。またエタノール発酵液中に、微生物培養により形成される平均粒子径５８ｎｍを含有するエタノール発酵液は、発泡を顕著に抑制できることがわかった。
　（実施例５）エタノール発酵液サンプルの発泡性
　連続式蒸留を模した試験にてエタノール発酵液サンプルの発泡性評価を行った。東京ガラス機械製試験管（共通共栓試験管目盛付２０ｍｌ透明）にスターラーチップと、前述の発酵液サンプル１から３を別々に、３ｍｌ加え、上部に１０℃に設定した冷却管を装着した。１６０℃に設定した東京理化器械株式会社製の温調付きオイルバスに試験管内発酵液液面とオイルバス液面が等しくなるように設置して、ＹＡＺＡＷＡ社製マグネティックスターラー（ＫＦ－８２Ｍ）を用いて４００±２０ｒｐｍで攪拌しながら加熱を行った。その結果、発酵液サンプル２および３については加熱開始後５分から１０分の間で液面から７ｃｍを超える発泡がみられた。一方の発酵液サンプル１については驚くべきことに全く発泡しないままであり、実施例３の発泡性試験と同じ結果を確認した。
　（参考例５）エタノール発酵液サンプルの透過度の測定
　紫外可視分光光度計として日本分光株式会社製ＵＶ－Ｖｉｓ測定器（Ｖ７５０）と、日本分光株式会社製の１０ｍｍ角石英キュベットを使用して測定を行った。キュベットに和光純薬株式会社製蒸留水を２ｍｌ加えて、２００ｎｍから８００ｎｍまでの光線波長の透過度のバックグラウンドを測定した。そののち、空のキュベットに発酵液を加えて測定を行い、３００ｎｍの光線波長の透過度が０．５±０．１％Ｔになるように適宜発酵液を蒸留水で希釈した。その希釈液を用いて６００ｎｍの光線波長の透過度を測定した。
　（実施例６）透過度によるエタノール発酵液の発泡性の閾値の決定
　サンプル２と同様にして調製した発酵液８０ｍｌをファルコン社製５０ｍｌポリプロピレンコニカルチューブに４０ｍｌずつ入れ、１００００Ｇで６０分遠心分離を行い、粒子と上清を分離した。沈降した粒子を３回水洗と遠心分離を行い、３回目の遠心分離終了後上清を捨て、東京理化器械株式会社製凍結乾燥器（ＦＤＵ－１２００）で乾燥させた。この時の乾燥重量は５２０ｍｇであった。この粒子を水で希釈し、１０４ｍｇ／ｍｌの溶液（粒子溶液）を調製した。１００００Ｇで６０分遠心分離した上清：粒子溶液が体積比で１０００：０、９９７：３、９７０：３０、９００：１００、８００：２００、７００：３００，６００：４００となるような溶液を調製した。参考例５の透過度の測定方法に従い、各溶液の６００ｎｍの光線波長の透過度の測定を行ったところ、それぞれ、９７．６、９７．３、９１．８、８５．９、８４．５、８３．０、８１．９となった。それぞれの液で実施例５と同様の蒸留試験方法を行い、透過度と発泡の有無の解析を行った。その結果、６００ｎｍの光線波長の透過度９１％Ｔを境界として、それ以上では液面から７ｃｍ以上の発泡が見られず、それ以下だと７ｃｍ以上発泡する結果が得られた。透過度の測定は発泡性を簡易的に測定できる方法と考えられる。
　（実施例７）発酵液サンプルの透過度測定
　参考例５の透過度の測定方法に従い、前述の発酵液サンプル１、サンプル２、サンプル３の測定を行った。その結果、６００ｎｍの光線波長の透過度はサンプル１では９４．７％Ｔ、サンプル２では５４．６％Ｔ、サンプル３では９０．７％Ｔとなった。つまり、実際の発酵液サンプルでも６００ｎｍの光線波長の透過度が９１％Ｔを境として、９１％Ｔ超では実施例３、参考例５の通り、発泡は起こらず、一方、９１％Ｔ以下では発泡が生じることを確認した。
　本発明のエタノール製造方法により得られるエタノール発酵液、あるいは本発明で特定されるエタノール発酵液は、いわゆるバイオエタノールとしてサスティナブルな燃料または工業用原料として利用することができる。
 

Claims (8)

  1. 　微生物をケーンモラセスを主成分として含む発酵原料で培養し、培養液を分離膜で濾過して微生物が分離されたエタノール含有濾過液を回収し、さらに微生物を含む未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ発酵原料を培養液に追加するエタノール連続発酵工程、および該連続発酵工程で回収されるエタノール含有濾過液を蒸留によりエタノール濃縮精製する工程を含むエタノールの製造方法において、前記微生物が前記培養液の遠心上清中に平均粒子径が１００ｎｍ以上の粒子を含有せしめる微生物であり、前記エタノール含有濾過液に含まれる前記微生物培養により形成される粒子の平均粒子径が４０～８０ｎｍである、方法。
  2. 　前記粒子の平均粒子径が３００ｎｍ以上である、請求項１に記載のエタノールの製造方法。
  3. 　前記微生物がシゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母である、請求項１または２に記載のエタノールの製造方法。
  4. 　前記エタノール含有濾過液に含まれる、前記微生物培養により形成される粒子の粒子径分布が粒子径２０～１００ｎｍの範囲内である、請求項１～３のいずれかに記載のエタノールの製造方法。
  5. 　前記蒸留が連続式蒸留である、請求項１～４のいずれかに記載のエタノールの製造方法。
  6. 　微生物培養により形成される該微生物以外の粒子として平均粒子径が４０～８０ｎｍの粒子を含み、バガスの水熱処理時の成分を含まない、エタノール発酵液。
  7. 　前記粒子の粒子径分布が粒子径２０～１００ｎｍの範囲内である、請求項６に記載のエタノール発酵液。
  8. 　３００ｎｍの光線波長の透過度が０．５±０．１％Ｔとなるように水で希釈した場合での、６００ｎｍの光線波長の透過度が９１％Ｔ超である、エタノール発酵液。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020196697A1 (ja) * 2019-03-27 2020-10-01 東レ株式会社 植物成長促進剤
CN112014495A (zh) * 2020-08-14 2020-12-01 北京首钢朗泽新能源科技有限公司 一种乙醇发酵液中杂醇油组分的检测方法及应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007097260A1 (ja) * 2006-02-24 2007-08-30 Toray Industries, Inc. 化学品の製造方法、および、連続発酵装置
WO2011093241A1 (ja) * 2010-01-28 2011-08-04 東レ株式会社 連続発酵による化学品の製造方法
WO2011135588A2 (en) * 2010-04-29 2011-11-03 Shree Renuka Sugars Limited A continuous process for the preparation of alcohol
WO2017159764A1 (ja) * 2016-03-17 2017-09-21 東レ株式会社 化学品の製造方法および微生物の培養方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007097260A1 (ja) * 2006-02-24 2007-08-30 Toray Industries, Inc. 化学品の製造方法、および、連続発酵装置
WO2011093241A1 (ja) * 2010-01-28 2011-08-04 東レ株式会社 連続発酵による化学品の製造方法
WO2011135588A2 (en) * 2010-04-29 2011-11-03 Shree Renuka Sugars Limited A continuous process for the preparation of alcohol
WO2017159764A1 (ja) * 2016-03-17 2017-09-21 東レ株式会社 化学品の製造方法および微生物の培養方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020196697A1 (ja) * 2019-03-27 2020-10-01 東レ株式会社 植物成長促進剤
CN112014495A (zh) * 2020-08-14 2020-12-01 北京首钢朗泽新能源科技有限公司 一种乙醇发酵液中杂醇油组分的检测方法及应用
CN112014495B (zh) * 2020-08-14 2022-11-22 北京首钢朗泽科技股份有限公司 一种乙醇发酵液中杂醇油组分的检测方法及应用

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