JP2008048721A - 連続発酵装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】微生物もしくは培養細胞の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を前記の発酵培養液に追加する連続発酵による化学品の製造装置であって、微生物を発酵させるための発酵反応槽1と、その発酵反応槽内部に配設され分離膜を備えた発酵培養液を濾過するための分離膜エレメント2と、該分離膜エレメントに接続され濾過された発酵生産物を排出するための手段と、該分離膜の膜間差圧を0.1から20kPaの範囲に制御するための手段からなる。
【選択図】図1
Description
・装置:原子間力顕微鏡装置(Digital Instruments(株)製Nanoscope IIIa)
・条件:探針 SiNカンチレバー(Digital Instruments(株)製)
:走査モード コンタクトモード(気中測定)
水中タッピングモード(水中測定)
:走査範囲 10μm,25μm 四方(気中測定)
5μm,10μm 四方(水中測定)
:走査解像度 512×512
・試料調製
測定に際し膜サンプルは常温でエタノールに15分浸漬後RO水中に24時間浸漬し洗浄した後風乾し用いた。RO水とは、ろ過膜の一種である逆浸透膜(RO膜)を用いてろ過し、イオンや塩類などの不純物を排除した水を指す。RO膜の孔の大きさは、概ね2nm以下である。
・発酵生産速度(g/L/hr)=抜き取り液中の生産物濃度(g/L)×発酵培養液抜き取り速度(L/hr)÷装置の運転液量(L) ・・・・(式3)
また、バッチ培養での発酵生産速度は、原料炭素源をすべて消費した時点の生産物量(g)を、炭素源の消費に要した時間(h)とその時点の培養液量(L)で除して求められる。
乳酸生産能力を持つ酵母株を、下記のように造成した。具体的には、ヒト由来LDH遺伝子を酵母ゲノム上のPDC1プロモーターの下流に連結することにより、L−乳酸生産能力を持つ酵母株を造成する。ポリメラーゼ・チェーン・リアクション(PCR)には、La−Taq(宝酒造社製)、あるいはKOD-Plus-polymerase(東洋紡社製)を用い、付属の取扱説明に従って行った。
・カラム:Shim-Pack SPR-H(島津社製)
・移動相:5mM p−トルエンスルホン酸(流速0.8mL/min)
・反応液:5mM p−トルエンスルホン酸、20mM ビストリス、0.1mM EDTA・2Na(流速0.8mL/min)
・検出方法:電気伝導度
・温度:45℃。
・また、L−乳酸の光学純度測定は以下の条件でHPLC法により測定した。
・カラム:TSK-gel Enantio L1(東ソー社製)
・移動相 :1mM 硫酸銅水溶液
・流速:1.0ml/min
・検出方法 :UV254nm
・温度 :30℃
また、L−乳酸の光学純度は、次式で計算される。
・光学純度(%)=100×(L−D)/(L+D)
(ここで、LはL−乳酸の濃度を表し、DはD−乳酸の濃度を表す。)
HPLC分析の結果、4g/LのL−乳酸が検出され、D−乳酸は検出限界以下であった。以上の検討により、この形質転換体がL−乳酸生産能力を持つことが確認された。得られた形質転換細胞を酵母SW−1株として、続く実施例に用いた。
樹脂としてポリフッ化ビニリデン(PVDF)樹脂を、そして溶媒としてN,N−ジメチルアセトアミド(DMAc)をそれぞれ用い、これらを90℃の温度下に十分に攪拌し、次の組成を有する原液を得た。
・PVDF:13.0重量%
・DMAc:87.0重量%
次に、上記原液を25℃の温度に冷却した後、あらかじめガラス板上に貼り付けて置いた、密度が0.48g/cm3で、厚みが220μmのポリエステル繊維製不織布(多孔質基材)に塗布し、直ちに次の組成を有する25℃の温度の凝固浴中に5分間浸漬して、多孔質基材に多孔質樹脂層が形成された多孔性膜を得た。
・水 :30.0重量%
・DMAc:70.0重量%
この多孔性膜をガラス板から剥がした後、80℃の温度の熱水に3回浸漬してDMAcを洗い出し、分離膜(多孔性膜)を得た。多孔質樹脂層表面の9.2μm×10.4μmの範囲内を、倍率10,000倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は0.1μmであった。次に、上記の分離膜について純水透過係数を評価したところ、50×10-9m3/m2・s・Paであった。透水量の測定は、逆浸透膜による25℃の温度の精製水を用い、水頭差1mで行った。また、平均細孔径の標準偏差 は0.035μmで、膜表面粗さは0.06μmであった。このようにして参考例2で作製した多孔性膜は本発明に好適に用いることが出来る。
樹脂としてポリフッ化ビニリデン(PVDF)樹脂を、開孔剤として分子量が約20,000のポリエチレングリコール(PEG)を、溶媒としてN,N−ジメチルアセトアミド(DMAc)を、そして非溶媒として純水をそれぞれ用い、これらを90℃の温度下に十分に攪拌し、次の組成を有する原液を得た。
・PVDF:13.0重量%
・PEG : 5.5重量%
・DMAc:78.0重量%
・純水 : 3.5重量%
次に、上記原液を25℃の温度に冷却した後、密度が0.48g/cm3 で、厚みが220μmのポリエステル繊維製不織布(多孔質基材)に塗布し、塗布後、直ちに25℃の温度の純水中に5分間浸漬し、さらに80℃の温度の熱水に3回浸漬してDMAcおよびPEGを洗い出し、分離膜を得た。この分離膜の原液を塗布した側における、多孔質樹脂層表面の9.2μm×10.4μmの範囲内を、倍率10,000倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は0.02μmであった。この分離膜について純水透過係数を評価したところ、2×10-9m3/m2・s・Paであった。透水量の測定は、逆浸透膜による25℃の温度の精製水を用い、水頭差1mで行った。平均細孔径の標準偏差 は0.0055μmで、膜表面粗さは0.1μmであった。このようにして参考例3で作製した多孔性膜は本発明に好適に用いることが出来る。
次に示す組成の原液を用いた他は、参考例3と同様にして分離膜を得た。
・PVDF:13.0重量%
・PEG: 5.5重量%
・DMAc:81.5重量%
この分離膜の原液を塗布した側における、多孔質樹脂層表面の9.2μm×10.4μmの範囲内を、倍率10,000倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は0.19μmであり、この分離膜について純水透過係数を評価したところ、100×10-9m3/m2・s・Paであった。透水量の測定は、逆浸透膜による25℃の温度の精製水を用い、水頭差1mで行った。また、平均細孔径の標準偏差 は0.060μmで、膜表面粗さは0.08μmであった。このようにして参考例4で作製した多孔性膜は本発明に好適に用いることが出来る。
図1の膜分離型の連続発酵装置を稼働させることにより、L−乳酸連続発酵系が得られるかどうかを調べるため、表1に示す組成の乳酸発酵培地を用い、この装置の連続発酵試験を行った。該培地は、121℃の温度で15分間、高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。また、分離膜には参考例2で作製した多孔性膜を用いた。この実施例1における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
・発酵反応槽容量:1.5(L)
・使用分離膜:PVDF濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積:120平方cm
・温度調整:30(℃)
・発酵反応槽通気量:0.1(L/min)
・発酵反応槽攪拌速度:400(rpm)
・pH調整:1N NaOHによりpH5に調整
・滅菌:分離膜エレメント2を含む発酵反応槽1、および使用培地は総て121℃、20minのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌
・膜透過水量制御:膜分離槽水頭差により流量を制御(膜間差圧として2 kPa以下に制御した。)。
・膜透過水量制御:膜分離槽水頭差により流量を制御(水頭差は2m以内で制御した。)。
図1の連続発酵装置を稼働させることにより、L−乳酸連続発酵系が得られるかどうかを調べるため、表1に示す組成の乳酸発酵培地を用い、この装置の連続発酵試験を行った。該培地は、121℃の温度で15分間、高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜エレメント部材2には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。また、分離膜には参考例1で作製した多孔性膜を用いた。この実施例2における運転条件は、特に断らない限り次のとおりである。
・反応槽容量:1.5(L)
・発酵反応槽容量:1.5(L)
・使用分離膜:PVDF濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積:120平方cm
・温度調整:30(℃)
・発酵反応槽通気量:0.05(L/min)
・乳酸発酵培地供給速度:50〜300ml/hr.の範囲で可変制御
・発酵反応槽攪拌速度:800(rpm)
・pH調整:1N NaOHによりpH5に調整
・膜透過水量制御:膜間差圧による流量制御。
80時間〜160時間:0.1kPa以上2kPa以下で制御
160時間〜240時間:0.1kPa以上20kPa以下で制御)
・滅菌:分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て121℃、20minの
オートクレーブにより高圧蒸気滅菌
・膜透過水量制御:膜分離槽水頭差により流量を制御(水頭差は2m以内で制御した。)。
分離膜に参考例3で作製した多孔性膜を用い、実施例2と同様のL−乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表2に示す。その結果、安定したL−乳酸の連続発酵による製造が可能であることが確認できた。連続発酵の期間中の膜間差圧は、2kPa以下0.1以上で推移した。
分離膜に参考例4で作製した多孔性膜を用い、実施例2と同様のL−乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表2に示す。その結果、安定したL−乳酸の連続発酵による製造が可能であることが確認できた。連続発酵の期間中の膜間差圧は、2kPa以下0.1以上で推移した。
図1に示す膜分離型の連続発酵装置を用いることにより、L−乳酸発酵生産性が向上するかどうかを調べるため、微生物を用いた発酵形態として最も典型的な回分発酵を行い、その乳酸生産性を評価した。表1に示す乳酸発酵培地を用い、図1の連続発酵装置で分離膜エレメントによる濾過を行うことなく回分発酵試験を行った。該培地は、121℃の温度で15分間、高圧蒸気滅菌して用いた。この比較例1でも、微生物として参考例1で造成した酵母SW−1株を用い、生産物である乳酸の濃度の評価には、参考例1に示したHPLCを用いて評価し、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーC”(登録商標)(和光純薬)を用いた。比較例1の運転条件を次に示す。
・発酵反応槽容量(乳酸発酵培地量):1(L)
・温度調整:30(℃)
・発酵反応槽通気量:0.1(L/min)
・発酵反応槽攪拌速度:400(rpm)
・pH調整:1N NaOHによりpH5に調整
まず、SW−1株を試験管で5mlの乳酸発酵培地で一晩振とう培養した(前々培養)。前々培養液を新鮮な乳酸発酵培地100mlに植菌し500ml容坂口フラスコで24時間振とう培養した(前培養)。前培養液を膜分離型連続発酵装置の1.5Lの乳酸発酵培地に植菌し、発酵反応槽1を付属の攪拌機5で400rpmで攪拌し、発酵反応槽1を通気した。温度調整、pH調整を行い、発酵培養液循環ポンプ10を稼働させることなく、回分発酵培養を行った。このときの菌体増殖量は、600nmでの吸光度で15であった。回分発酵の結果を、実施例1の連続発酵試験で得られたL―乳酸発酵生産性を比較して表2に示す。
2 分離膜エレメント
3 水頭差制御装置
4 気体供給装置
5 攪拌機
6 レベルセンサ
7 培地供給ポンプ
8 pH調整溶液供給ポンプ
9 pHセンサ・制御装置
10 温度調節器
11 支持板
12 流路材
13 分離膜
14 凹部
15 集水パイプ
Claims (11)
- 微生物もしくは培養細胞の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を前記の発酵培養液に追加する連続発酵による化学品の製造装置であって、微生物もしくは培養細胞を発酵させるための発酵反応槽と、その発酵反応槽内部に配設され分離膜を備えた発酵培養液を濾過するための分離膜エレメントと、該分離膜エレメントに接続され濾過された発酵生産物を含む透過液を排出するための手段と、該分離膜の膜間差圧を0.1から20kPaの範囲に制御するための手段からなり、該分離膜が平均細孔径0.01μm以上1μm未満の細孔を有する多孔性膜であることを特徴とする連続発酵装置。
- 多孔性膜の純水透過係数が、2×10-9m3/m2/s/pa以上6×10-7m3/m2/s/pa以下である請求項1記載の連続発酵装置。
- 多孔性膜の平均細孔径が0.01μm以上0.2μm未満の範囲内にあり、かつ、その平均細孔径の標準偏差が0.1μm以下である請求項1または2に記載の連続発酵装置。
- 多孔性膜の膜表面粗さが0.1μm以下の多孔性膜である請求項1から3のいずれかに記載の連続発酵装置。
- 多孔性膜が多孔質樹脂層を含む多孔性膜である請求項1から4のいずれかに記載の連続発酵装置。
- 多孔質樹脂層の素材がポリフッ化ビニリデンである請求項1から5のいずれかに記載の連続発酵装置。
- 膜間差圧を制御するための手段が、発酵培養液と多孔性膜処理水の液位差を制御する水頭差制御装置である請求項1から6のいずれかに記載の連続発酵装置。
- 膜間差圧を制御するための手段が、加圧ポンプまたは/および吸引ポンプである請求項1から7のいずれかに記載の連続発酵装置。
- 膜間差圧を制御するための手段が、気体または液体の圧力である請求項1から8のいずれかに記載の連続発酵装置。
- 多孔性膜を含む分離膜エレメントを構成する部材が高圧蒸気滅菌操作に耐性である請求項1から9のいずれかに記載の連続発酵装置。
- 化学品がL−乳酸である請求項1から10のいずれかに記載の連続発酵装置。
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