CN111148842A

CN111148842A - 乙醇的制造方法和乙醇发酵液

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Publication number: CN111148842A
Application number: CN201880059312.6A
Authority: CN
Inventors: 水野宽之; 耳冢孝; 日笠雅史; 泽田慎二郎
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2017-09-15
Filing date: 2018-09-14
Publication date: 2020-05-12
Also published as: WO2019054469A1; BR112020004870A2; PH12020500463A1; US20200263208A1; AU2018333982A1; JPWO2019054469A1

Abstract

本发明是乙醇的制造方法或乙醇发酵液，上述乙醇的制造方法包含下述工序：将微生物用包含甘蔗糖蜜作为主成分的发酵原料进行培养，将培养液用分离膜过滤而分离出微生物，回收所得的含有乙醇的过滤液，进一步将包含微生物的未过滤液保持在或回流到培养液中，并且在培养液中补加发酵原料的乙醇连续发酵工序；以及将在该连续发酵工序中回收的含有乙醇的过滤液通过蒸馏进行乙醇浓缩精制的工序，上述微生物是使上述培养液的离心上清液中含有平均粒径为100nm以上的粒子的微生物，上述含有乙醇的过滤液所包含的通过上述微生物培养形成的粒子的平均粒径为40～80nm。上述乙醇发酵液包含通过微生物培养形成的除该微生物以外的粒子，且不包含蔗渣的水热处理时的成分，上述述粒子是平均粒径为40～80nm的粒子。通过本发明，即使不添加消泡剂也能够进行乙醇发酵液的蒸馏精制。

Description

乙醇的制造方法和乙醇发酵液

技术领域

本发明涉及使用了含有甘蔗糖蜜作为主成分的发酵原料的乙醇的制造方法以及乙醇发酵液。

背景技术

通过发酵制造乙醇自古以来就是进行研究的领域，但特别是通过发酵制造生物乙醇的技术，在世界整体的地球环境意识的提高、原油价格的暴涨等背景下，作为能够抑制石油资源的消耗，降低二氧化碳的排放量，生产可持续的(sustainable)燃料、工业原料的技术而近年来再次受到关注。

作为乙醇的制造方法，一般以作为从玉米等可食性生物质精制的六碳糖的葡萄糖、在从甘蔗精制砂糖的过程中产生的糖蜜(甘蔗糖蜜)作为原料，作为微生物的培养产物而获得。甘蔗糖蜜在巴西、泰国等砂糖生产国作为乙醇发酵原料被大量消耗，成为重要的发酵原料。

一般而言，作为采用微生物培养的乙醇的制造方法，使用分批发酵法、补料分批发酵法或连续发酵法等，在专利文献1中公开了通过使用了分离膜的连续发酵方法而乙醇的生产速度、收率提高。另一方面，在该专利文献中，没有与含有甘蔗糖蜜的原料的使用有关的记载。此外，在专利文献2中公开了将通过连接了多个发酵槽的连续发酵法而获得的培养液离心分离，从而分成微生物和乙醇发酵液，将除去了微生物的乙醇发酵液进行蒸馏，对于微生物使其返回发酵槽的方法。另一方面，在该专利文献中，虽然使用含有甘蔗糖蜜的原料，但不使用分离膜。这样获得的乙醇发酵液一般通过接下来进行蒸馏来将乙醇浓缩精制。

工业上进行的蒸馏分类为间歇式蒸馏和连续式蒸馏。因为燃料用乙醇是被大量消耗的化学品，因此需要进行大量处理，在该情况下一般进行连续式蒸馏。

在该乙醇发酵液的蒸馏中，如果在蒸馏塔内发生发泡现象，则具有压力损失上升，最终达到液泛状态，连续式蒸馏的持续运转变得困难的课题。作为一般的解决方法，虽然通过添加消泡剂来进行，但不仅需要巨额的费用，而且消泡剂本身作为异物而混入到来自蒸馏塔的塔顶的馏出液或来自蒸馏塔的塔底的塔底液。此外，由于在蒸馏塔内残留而对蒸馏带来不良影响，因此消泡剂的添加被认为是不优选的手段。

因此在专利文献3中公开了为了抑制蒸馏时的发泡，通过在蒸馏塔的塔底设置搅拌轴而使搅拌翼旋转来消除泡的方法。然而，蒸馏塔需要将通过运转而附着的污垢定期洗涤，因此忌避工作部、复杂结构，因而依然是为了抑制发泡而只能依赖于消泡剂的添加的状况。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2007/097260

专利文献2：WO2011/135588

专利文献3：日本特开平6-335627号公报

发明内容

发明所要解决的课题

如专利文献2所记载那样，使用了含有甘蔗糖蜜作为主成分的发酵原料和作为微生物的裂殖糖酵母属进行乙醇发酵法，进行了蒸馏研究，结果，如一直以来所说的那样，确认了发泡剧烈发生而需要添加消泡剂。

因此本发明的目的是提供在蒸馏时即使不添加消泡剂也能够蒸馏的方法以及这样的乙醇发酵液。

用于解决课题的方法

本发明人进行了深入研究，结果发现，即使是使用了含有甘蔗糖蜜作为主成分的发酵原料的乙醇发酵液，如果通过利用了分离膜的连续发酵法而获得乙醇发酵液，在蒸馏时也令人惊讶地完全不发生发泡，从而完成了本发明。

即，本发明如以下(1)～(8)那样。

(1)一种乙醇的制造方法，其包含下述工序：将微生物用包含甘蔗糖蜜作为主成分的发酵原料进行培养，将培养液用分离膜过滤而分离出微生物，回收所得的含有乙醇的过滤液，进一步将包含微生物的未过滤液保持在或回流到培养液中，并且在培养液中补加发酵原料的乙醇连续发酵工序；以及将在该连续发酵工序中回收的含有乙醇的过滤液通过蒸馏进行乙醇浓缩精制的工序，上述微生物是使上述培养液的离心上清液中含有平均粒径为100nm以上的粒子的微生物，上述含有乙醇的过滤液所包含的通过上述微生物培养形成的粒子的平均粒径为40～80nm。

(2)根据(1)所述的乙醇的制造方法，上述培养液的离心上清液中含有的上述粒子的平均粒径为300nm以上。

(3)根据(1)或(2)所述的乙醇的制造方法，上述微生物为属于裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)的酵母。

(4)根据(1)～(3)中任一项所述的乙醇的制造方法，上述含有乙醇的过滤液所包含的通过上述微生物培养形成的粒子的粒径分布为粒径20～100nm的范围内。

(5)根据(1)～(4)中任一项所述的乙醇的制造方法，上述蒸馏为连续式蒸馏。

(6)一种乙醇发酵液，其包含通过微生物培养形成的除该微生物以外的粒子，且不包含蔗渣的水热处理时的成分，上述粒子是平均粒径为40～80nm的粒子。

(7)根据(6)所述的乙醇发酵液，上述粒子的粒径分布为粒径20～100nm的范围内。

(8)一种乙醇发酵液，在将其用水稀释到300nm的光线波长的透射率变为0.5±0.1％T的情况下，600nm的光线波长的透射率超过91％T。

发明的效果

根据本发明，即使对于使用了在蒸馏时具有发泡性的含有甘蔗糖蜜作为主成分的发酵原料的乙醇发酵液，也能够通过将在上述乙醇连续发酵工序中回收的含有乙醇的过滤液或上述乙醇发酵液供于蒸馏工序，从而显著抑制蒸馏时的发泡，能够通过蒸馏进行稳定的生物乙醇生产。

附图说明

图1为乙醇发酵液1～3的粒径分布结果

图2为乙醇发酵液1的粒径分布结果(放大)

具体实施方式

本发明涉及乙醇的制造方法、以及包含通过微生物培养形成的特定平均粒径的粒子的乙醇发酵液，上述乙醇的制造方法包含下述工序：通过使成为含有甘蔗糖蜜作为主成分的发酵原料的培养液的离心上清液中含有平均粒径为100nm以上的粒子的微生物进行的利用分离膜的乙醇连续发酵工序；以及将在该连续发酵工序中回收的乙醇过滤液通过蒸馏而浓缩精制的工序。以下，关于本发明的乙醇的制造方法，对每个工序进行说明，此外，对本发明的乙醇发酵液的特征进行说明。

[乙醇连续发酵工序]

本发明中使用的微生物为具有生产乙醇的能力的微生物，并且，只要是在将该微生物用包含甘蔗糖蜜作为主成分的发酵原料进行培养时，使培养液的离心上清液中含有平均粒径为100nm以上的粒子的微生物，就没有特别限制。作为这样的微生物的优选的具体例，可举出在发酵工业中经常使用的面包酵母等酵母、大肠杆菌、棒状杆菌等细菌、丝状菌、放线菌等。可以为从自然环境分离的微生物，此外，也可以为通过突变、基因重组而一部分性质被改变了的微生物。作为进行乙醇生产的微生物，优选为酵母。作为酵母，例如优选酵母菌属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、裂殖糖酵母属(Shizosaccharomyces)。其中，优选为属于裂殖糖酵母属的酵母，粟酒裂殖酵母(Shizosaccharomyces pombe)、日本裂殖酵母(Shizosaccharomyces japonicus)、八孢裂殖酵母(Shizosaccharomyces octosporus)或嗜冷裂殖酵母(Shizosaccharomycescryophilus)可以适合使用。

上述粒子，是指用包含甘蔗糖蜜作为主成分的发酵原料进行培养而获得的培养液中所包含的除微生物以外的不溶性的粒状物质。在培养液中存在的粒子的平均粒径的测定通过动态光散射法(DLS，光子相关法)进行。具体而言，由通过采用动态光散射法的测定而获得的散射强度的摇摆，通过累积量(Cumulant)分析求出自相关函数，向相对于散射强度的粒度分布转换后，将分析范围最小值设为1nm、最大值设为5000nm而换算为平均粒径。测定使用大塚电子株式会社的ELS-Z2。此外，在培养液中微生物也作为粒子而存在，因此将室温的培养液在1000G、10分钟的条件下离心从而使微生物沉淀，测定该离心上清液所包含的粒子的平均粒径。

上述培养液所包含的上述粒子的平均粒径为100nm以上，优选为300nm以上，更优选为300～1500nm。通过利用使培养液中含有这样的平均粒径为100nm以上的粒子的微生物，从而虽然详细的作用机制不清楚，但如后述实施例所示那样，带来将在本发明的乙醇连续发酵工序中回收的含有乙醇的过滤液供于蒸馏时的发泡被抑制这样的预料不到的优异效果。另外，上述粒子的平均粒径的上限在不由于发生膜堵塞而使过滤通量降低的范围内，没有特别限制，但即使通过上述离心也不会与微生物一起沉淀那样的粒子的平均粒径成为上限，作为优选的上限值，为1500nm。

所谓甘蔗糖蜜，是由甘蔗的榨汁或粗糖，在制糖的过程中生成的副产物。具体而言，是指在制糖过程中的结晶化工序中在结晶化后残留的包含糖成分的晶析母液。一般而言，结晶化工序通常进行多次，如作为进行第1次结晶化而获得的结晶成分的第1糖、作为进一步进行第1糖的残余液(第1糖蜜)的结晶化而获得的结晶成分的第2糖、进一步进行第2糖的残余液(第2糖蜜)的结晶化而获得的第3糖那样反复进行结晶化，将此时作为残留的晶析母液而获得的最终阶段的糖蜜称为甘蔗糖蜜。随着结晶化的次数变多，除糖成分以外的无机盐在甘蔗糖蜜中被浓缩。作为在本发明中使用的甘蔗糖蜜，优选为结晶化次数经过多次后的甘蔗糖蜜，优选为进行至少2次以上，进一步优选为进行3次以上结晶化后残留的甘蔗糖蜜。作为甘蔗糖蜜所包含的糖成分，有时包含蔗糖、葡萄糖、果糖作为主成分，也包含若干木糖、半乳糖等其它糖成分。甘蔗糖蜜中的糖浓度一般为200～800g/L左右。甘蔗糖蜜中的糖浓度可以通过HPLC等公知的测定方法而定量。

所谓发酵原料，是包含微生物增殖所需的全部营养的原料。在本发明中使用的发酵原料中只要包含甘蔗糖蜜作为主成分即可，除此以外，可以适当添加碳源、氮源、无机盐类、和根据需要的氨基酸、维生素等有机微量营养素。另外，在本发明中所谓包含甘蔗糖蜜作为主成分的发酵原料，是指发酵原料所包含的物质(除水以外)之中的50重量％以上为甘蔗糖蜜。

作为碳源，除了葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、乳糖等糖类、含有这些糖类的玉米淀糖粉化液、甘薯糖蜜、甜菜糖蜜、高级糖蜜、以及乙酸等有机酸、乙醇等醇类、甘油等以外，还优选使用来源于含有纤维素的生物质的糖液。

作为含有纤维素的生物质，可以举出蔗渣、柳枝稷、玉米秸秆、稻秸、麦秸等草木系生物质、和树木、废建材等木质系生物质等作为例子。含有纤维素的生物质含有作为糖进行了脱水缩合的多糖的纤维素或半纤维素，通过将这样的多糖水解从而制造能够作为发酵原料利用的糖液。

来源于含有纤维素的生物质的糖液的调制方法没有特别限制，作为这样的糖的制造方法，公开了使用浓硫酸将生物质进行酸水解而制造糖液的方法(日本特表平11-506934号公报、日本特开2005-229821号公报)；通过将生物质用稀硫酸进行了水解处理后，进一步进行纤维素酶等的酶处理而制造糖液的方法(A.Aden等，“Lignocellulosic Biomass toEthanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute AcidPrehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover”NREL Technical Report(2002))。此外作为不使用酸的方法，公开了使用250～500℃左右的亚临界水将生物质水解而制造糖液的方法(日本特开2003-212888号公报)；以及在将生物质进行了亚临界水处理后进一步进行酶处理从而制造糖液的方法(日本特开2001-95597号公报)；将生物质用240～280℃的加压热水进行水解处理后进一步进行酶处理从而制造糖液的方法(日本专利3041380号公报)。可以在以上那样的处理后，将所得的糖液与甘蔗糖蜜混合而精制。该方法在例如WO2012/118171中公开。

作为氮源，使用氨气、氨水、铵盐类、脲、硝酸盐类、其它辅助使用的有机氮源例如油粕类、大豆水解液、酪蛋白分解物、其它氨基酸、维生素类、玉米浆、酵母或酵母提取物、肉提取物、蛋白胨等肽类、各种发酵微生物及其水解物等。

作为无机盐类，可以适当添加磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐等。

此外，在为了本发明所使用的微生物繁殖而需要特定营养素的情况下，可以将该营养物作为制剂或含有其的天然物添加而使用。

使用上述微生物和发酵原料的乙醇连续发酵工序为使用了分离膜的连续发酵工序，具体而言，是下述连续发酵工序，其特征在于，将培养液用分离膜过滤而分离出微生物，回收所得的含有乙醇的过滤液，进一步将包含微生物的未过滤液保持在或回流到培养液中，并且在培养液中补加发酵原料。

关于在乙醇连续发酵工序中使用的分离膜，只要具有将通过微生物的培养而获得的发酵液从微生物分离过滤的功能，就没有特别限制，作为材质，可以使用例如，多孔质陶瓷膜、多孔质玻璃膜、多孔质有机高分子膜、金属纤维编织体、无纺布等，其中特别是多孔质有机高分子膜或陶瓷膜是适合的。

作为上述分离膜的构成，例如，从耐污垢性方面考虑，优选为包含多孔质树脂层作为功能层的分离膜。

包含多孔质树脂层的分离膜优选在多孔质基材的表面具有作为分离功能层起作用的多孔质树脂层。多孔质基材支持多孔质树脂层而对分离膜提供强度。此外，在多孔质基材的表面具有多孔质树脂层的情况下，可以多孔质树脂层渗透到多孔质基材，也可以多孔质树脂层不渗透到多孔质基材，哪种都可以。

多孔质基材的平均厚度优选为50～3000μm。

多孔质基材的材质由有机材料和/或无机材料等形成，期望使用有机纤维。优选的多孔质基材为由纤维素纤维、三乙酸纤维素纤维、聚酯纤维、聚丙烯纤维和聚乙烯纤维等有机纤维形成的织物、无纺布，更优选使用密度的控制比较容易、制造也容易且便宜的无纺布。

多孔质树脂层可以适合使用有机高分子膜。作为有机高分子膜的材质，可举出例如，聚乙烯系树脂、聚丙烯系树脂、聚氯乙烯系树脂、聚1,1-二氟乙烯系树脂、聚砜系树脂、聚醚砜系树脂、聚丙烯腈系树脂、纤维素系树脂和三乙酸纤维素系树脂等。有机高分子膜可以为以这些树脂作为主成分的树脂的混合物。这里所谓主成分，是指该成分含有50重量％以上，优选为60重量％以上。有机高分子膜的材质优选为采用溶液的制膜容易且物理耐久性、耐化学性也优异的聚氯乙烯系树脂、聚1,1-二氟乙烯系树脂、聚砜系树脂、聚醚砜系树脂和聚丙烯腈系树脂，最优选使用聚1,1-二氟乙烯系树脂或以其作为主成分的树脂。

这里，作为聚1,1-二氟乙烯系树脂，优选使用1,1-二氟乙烯的均聚物。进一步，聚1,1-二氟乙烯系树脂也优选使用与能够与1,1-二氟乙烯共聚的乙烯基系单体的共聚物。作为能够与1,1-二氟乙烯共聚的乙烯基系单体，可例示四氟乙烯、六氟丙烯和三氯化氟化乙烯等。

上述分离膜只要具有培养所使用的微生物不能通过的细孔径即可，但期望不易发生由培养所使用的微生物的分泌物、发酵原料中的微粒引起的堵塞，并且，过滤性能为长期稳定地持续的范围。因此，多孔性分离膜的平均细孔径优选为0.01～5μm。此外，进一步优选如果分离膜的平均细孔径为0.01～1μm，则能够使微生物不会泄漏的高排除率、与高透水性同时成立，能够长时间保持透水性。

如果与微生物的大小接近，则有时它们直接堵塞孔，因此分离膜的平均细孔径优选为1μm以下。为了防止微生物的漏出、即排除率降低的不良状况的发生，分离膜的平均细孔径优选与微生物的大小相比不过大。微生物之中，在使用细胞小的细菌等的情况下，作为平均细孔径，优选为0.4μm以下，更优选为0.2μm以下，进一步优选为0.1μm以下。如果平均细孔径过小则分离膜的透水性能降低，即使膜未污染也不能进行有效率的运转，因此本发明中的分离膜的平均细孔径优选为0.01μm以上，更优选为0.02μm以上，进一步优选为0.04μm以上。

这里，平均细孔径可以通过测定倍率10,000倍的扫描型电子显微镜观察中的、在9.2μm×10.4μm的范围内能够观察到的全部细孔的直径，进行平均而求出。或者，平均细孔径也可以通过将膜表面使用扫描型电子显微镜以倍率10,000倍拍摄照片，任选选择10个以上、优选为20个以上的细孔，测定这些细孔的直径，进行数均而求出。在细孔不是圆形的情况下，通过下述方法求出：通过图像处理装置等，求出具有与细孔所具有的面积相等面积的圆(等效圆)，使等效圆直径为细孔的直径的方法。

上述分离膜的平均细孔径的标准偏差σ优选为0.1μm以下。平均细孔径的标准偏差σ越小越好。关于平均细孔径的标准偏差σ通过将在上述的9.2μm×10.4μm的范围内能够观察到的细孔数设为N，将测定的各个直径设为Xk，将细孔直径的平均设为X(ave)的下述的(式1)而算出。

在上述分离膜中，培养液的透过性为重要的性能之一。作为分离膜的透过性的指标，可以使用：使用前的分离膜的纯水透过系数。在本发明中，在使用由反渗透膜得到的25℃的温度的精制水，以头高度1m测定透水量而计算时，分离膜的纯水透过系数优选为5.6×10^-10m³/m²/s/pa以上，如果纯水透过系数为5.6×10^-10m³/m²/s/pa以上且6×10^-7m³/m²/s/pa以下，则可获得实用上充分的透过水量。

在上述分离膜中，所谓表面粗糙度，是相对于表面为垂直方向的高度的平均值。膜表面粗糙度是为了附着于分离膜表面的微生物易于通过由搅拌、循环泵引起的液流带来的膜面洗涤效果而剥离的因子之一。分离膜的表面粗糙度没有特别限制，只要是附着于膜的微生物、以及其它固体物质能剥落的范围即可，优选为0.1μm以下。如果表面粗糙度为0.1μm以下，则附着于膜的微生物、以及其它固体物质易于剥落。

可知进一步优选通过使用分离膜的膜表面粗糙度为0.1μm以下，平均细孔径为0.01～1μm，分离膜的纯水透过系数为2×10^-9m³/m²/s/pa以上的分离膜，从而使不过度需要膜面洗涤所需要的动力的运转能够更容易。通过使分离膜的表面粗糙度为0.1μm以下，从而在微生物的过滤中，可以使在膜表面产生的剪切力降低，抑制微生物的破坏，也抑制分离膜的堵塞，从而长期稳定的过滤能够更容易。此外，通过使分离膜的表面粗糙度为0.1μm以下，从而能够以更低的膜间差压实施连续发酵，即使在分离膜堵塞的情况下与以高膜间差压运转的情况相比，洗涤恢复性也良好。通过抑制分离膜的堵塞，从而能够进行稳定的连续发酵，因此分离膜的表面粗糙度越小越优选。

这里，分离膜的膜表面粗糙度是使用下述原子力显微镜装置(AFM)，在下述条件下测定的。

·装置原子力显微镜装置(Digital Instruments(株)制“Nanoscope IIIa”)

·条件探针 SiN悬臂(Digital Instruments(株)制)

扫描模式接触模式(气中测定)

水中轻敲模式(水中测定)

扫描范围 10μm，25μm见方(气中测定)

5μm，10μm见方(水中测定)

扫描分辨率 512×512

·试样调制在测定时膜样品在常温下浸渍于乙醇15分钟后，在RO水中浸渍24小时并洗涤后，风干而使用。所谓RO水，是指使用作为过滤膜的一种的反渗透膜(RO膜)进行过滤，排除了离子、盐类等杂质的水。RO膜的孔的大小为大致2nm以下。

膜表面粗糙度drough通过上述原子力显微镜装置(AFM)由各点的Z轴方向的高度，通过下述(式2)而算出。

d_rough：表面粗糙度(μm)

Z_n：Z轴方向的高度(μm)

扫描范围的平均高度(μm)

N：测定样品的数

上述分离膜的形状没有特别限定，可以使用平膜、中空丝膜等，但优选为中空丝膜。在分离膜为中空丝膜的情况下，中空丝的内径为优选为200～5000μm，膜厚优选为20～2000μm。此外，可以在中空丝的内部包含使有机纤维或无机纤维为筒状的机织物、针织物。

另外，上述分离膜可以通过例如WO2007/097260所记载的制造方法而制造。

乙醇连续发酵工序中的过滤时的膜间差压没有特别限制，只要可以将培养液过滤即可。然而，为了将培养液过滤，如果在有机高分子膜中以比150kPa高的膜间差压进行过滤处理，则破坏有机高分子膜的结构的可能性变高，有时生产乙醇的能力降低。此外，对于低于0.1kPa的膜间差压，不能充分获得培养液的透过水量的情况多，有制造乙醇时的生产性降低的倾向。因此，对于本发明的乙醇的制造方法，在有机高分子膜中，通过使作为过滤压力的膜间差压优选为0.1～150kPa的范围，从而培养液的透过水量多，膜的结构的破坏引起的乙醇制造能力的降低也没有，因此能够将生产乙醇的能力维持得高。在有机高分子膜中，膜间差压优选为0.1～50kPa的范围，进一步优选为0.1～20kPa的范围。

酵母的培养中的温度只要设定适于所使用的酵母的温度即可，只要是微生物繁殖的范围，就没有特别限定，可以在温度为20～75℃的范围进行。

本发明的乙醇的制造方法中，可以在培养初期进行分批发酵或补料分批发酵而使微生物浓度提高后，开始连续发酵(发酵液的过滤)。此外，可以接种高浓度的微生物，在培养开始的同时进行连续发酵。本发明的乙醇的制造方法中，能够从适当的时期起进行发酵原料的供给和培养液的过滤。发酵原料的供给和培养液的过滤的开始时期未必相同。此外，发酵原料供给和培养液的过滤可以为连续的，也可以为间歇的。

关于培养液中的微生物的浓度，将乙醇的生产性维持在高状态下对于获得效率好的生产性是优选的。关于培养液中的微生物的浓度，作为一例，作为干燥重量，通过维持于5g/L以上而获得良好的生产效率。

对于乙醇连续发酵工序，在连续发酵的中途根据需要从发酵槽内将包含微生物的培养液的一部分除去后，供给发酵原料进行稀释，从而可以调整发酵槽内的微生物浓度。例如，如果发酵槽内的微生物浓度过高，则易于发生分离膜的堵塞，因此通过将包含微生物的培养液的一部分除去，供给发酵原料进行稀释，从而有时可以避免堵塞。对于本发明的乙醇的制造方法，与发酵槽的数无关。

本发明中使用的连续发酵装置只要是将包含微生物的培养液用分离膜过滤，从滤液回收乙醇并且将包含微生物的未过滤液保持或回流到上述培养液，并且，在培养液中补加发酵原料并回收过滤液中的乙醇的采用连续发酵的乙醇的制造装置，就没有特别限制，如果举出具体例，则可以使用WO2007/097260、WO2010/038613所记载的装置。

[蒸馏工序]

作为本发明的乙醇的制造方法中的乙醇的蒸馏方法，可以应用作为对于本领域技术人员而言公知的乙醇蒸馏方法的间歇式蒸馏或连续式蒸馏，优选应用连续蒸馏。作为连续蒸馏的方法，首先，将通过加热器而气化了的上述乙醇过滤液连续地导入到蒸馏塔的中段。从蒸馏塔的顶上连续地获得富含挥发性高的乙醇的馏出液，从底部连续地获得富含挥发性低的成分(乳酸、乙酸等杂质)的塔底液。通过使将连续地获得的馏出液与塔底液合起来的量成为与连续地供给的原料同量，蒸馏塔变为稳定状态。

作为蒸馏塔的形状，可以优选利用分离性能高的精馏塔。作为精馏塔，可以为板式塔和填充塔的任一者，但在前段的连续发酵工序中回收的含有乙醇的过滤液具有发泡性显著低这样的特征，因此可以优选应用在具有发泡性的情况下难以应用但设备成本便宜的采用填充塔的连续蒸馏。

[乙醇发酵液]

在上述乙醇连续发酵工序中回收的含有乙醇的过滤液中，包含平均粒径为40～80nm的、通过上述微生物培养形成的除微生物以外的不溶性的粒状物质(以下，简称为“粒子”)。通过微生物培养而产生本粒子本身是新的认识，因此本粒子的组成等的分析方法没有作为本领域技术人员的技术常识而确立，仅仅明确了本粒子是通过微生物培养形成的副产物，但通过本粒子包含于含有乙醇的过滤液，从而虽然详细的作用机制不清楚但供于蒸馏时的发泡被抑制这样的预料不到的优异效果在后述实施例中被确认了。因此，与是否是通过上述乙醇连续发酵工序而获得的无关，通过包含平均粒径为40～80nm的上述粒子而特定的乙醇发酵液本身也是本发明的一方案。

上述乙醇发酵液中存在的粒子的平均粒径的测定通过动态光散射法(DLS，光子相关法)进行。具体而言，由通过采用动态光散射法的测定而获得的散射强度的摇摆，通过累积量(Cumulant)分析求出自相关函数，向相对于散射强度的粒径分布转换后，将分析范围最小值设为1nm、最大值设为5000nm而换算为平均粒径。测定使用大塚电子株式会社的ELS-Z2。此外，也有在乙醇发酵液中微生物也作为粒子存在的情况，因此在该情况下通过将室温的乙醇发酵液在1000G、10分钟的条件下离心从而使微生物沉淀，测定该离心上清液所包含的粒子的平均粒径。

上述乙醇发酵液所含有的上述粒子的平均粒径为40～80nm，优选为50～70nm。此外，上述粒子的粒径分布优选为20～100nm的范围内，更优选为40～90nm的范围内。

本发明的乙醇发酵液只要包含上述粒子，就没有特别限制，例如，可以为微生物刚培养后的包含微生物的乙醇发酵液、将微生物除去了的乙醇发酵液，此外，可以为将微生物除去后适当通过本领域技术人员公知的方法进行了精制/浓缩的乙醇发酵液。

关于本发明的乙醇发酵液所包含的乙醇浓度，也没有特别限制，优选为30～150g/L，更优选为50～120g/L，进一步优选为60～100g/L。

此外，本发明的乙醇发酵液如果对于在将其用水稀释到300nm的光线波长的透射率变为0.5±0.1％T的乙醇发酵稀释液，测定600nm的光线波长的透射率时的值超过91％T，则虽然详细的作用机制不清楚，但是供于蒸馏时的发泡被进一步抑制这样的预料不到的优异效果在后述实施例中被确认了。因此，与是否为通过上述乙醇连续发酵工序而获得的无关地，本发明的乙醇发酵液优选在将其用水稀释到300nm的光线波长的透射率变为0.5±0.1％T的情况下，600nm的光线波长的透射率超过91％T，更优选为94％T以上。

上述乙醇发酵液的透射率为通过紫外可见分光光度计测定的值。具体而言，在10mm见方的石英吸收池中加入蒸馏水，测定200nm～800nm的光线波长的透射率的背景，然后，在空的吸收池中将上述乙醇发酵液与蒸馏水以300nm的光线波长的透射率变为0.5±0.1％T的方式混合，测定600nm的光线波长的透射率。作为本测定中的紫外可见分光光度计，只要使用日本分光株式会社制UV-Vis测定仪(V750)即可。

本发明的乙醇发酵液由于具有发泡性显著低这样的特征，因此可以作为需要采用蒸馏的浓缩精制的燃料用乙醇的原料而优选利用。所谓乙醇发泡性，如在后述实施例中详细说明的那样，可以通过乙醇发酵液的泡沫体积、将乙醇发酵液供于模仿了连续式蒸馏的试验的情况下的泡的高度进行评价。

实施例

以下，举出实施例具体地说明本发明。但是，本发明不限定于这些实施例。

(参考例1)糖类、乙醇的分析方法

原料中的糖类、乙醇浓度在下述所示的HPLC条件下，通过与标准品的比较进行了定量。

柱：Shodex SH1011(昭和电工株式会社制)

流动相：5mM硫酸(流速0.6mL/分钟)

反应液：无

检测方法：RI(差示折射率)

温度：65℃。

(参考例2)发酵原料的调制

将甘蔗糖蜜重量与水重量以1:3混合，获得了发酵原料。通过参考例1所示的方法分析了糖类，将所得的结果示于表1中。

表1

(实施例1)使用粟酒裂殖酵母NBRC1628株利用分离膜的连续发酵

作为微生物使用粟酒裂殖酵母NBRC1628株，作为培养基使用参考例2的发酵原料，进行利用了分离膜的连续发酵。作为分离膜元件采用了日本特开2010-22321所记载的中空丝的形态。在将粟酒裂殖酵母NBRC1628株接种到加入了5ml参考例2的发酵原料的试管中并振荡培养一晚(前预培养)。将所得的培养液接种到加入了新鲜的45ml参考例2的发酵原料的锥形烧瓶中，在30℃、120rpm下振荡培养8小时(预培养)。分取预培养液50mL之中的35mL，接种到加入了700mL参考例2的发酵原料的连续发酵装置中，将发酵反应槽通过附属的搅拌机以300rpm进行搅拌，进行了24小时培养。另外，在接种后立即使培养液循环泵工作，进行分离膜元件与发酵槽间的液体循环。在预培养结束后，使过滤泵工作而开始从分离膜元件取出培养液。在过滤开始后，一边以使连续发酵装置的培养液量为700mL的方式进行发酵原料添加控制一边在以下连续发酵条件下进行约200小时的连续发酵，此时获得了乙醇浓度64g/L的含有乙醇的过滤液(发酵液样品1)700ml。

[连续发酵条件]

发酵反应槽容量：2(L)

使用分离膜：聚1,1-二氟乙烯制过滤膜

膜分离元件有效过滤面积：218(cm²)

温度调整：30(℃)

发酵反应槽通气量：无通气

发酵反应槽搅拌速度：300(rpm)

pH调整：无调整

过滤通量设定值：0.1(m³/m²/天)

灭菌：分离膜元件和发酵槽通过121℃、20min的高压釜进行高压蒸气灭菌

平均细孔径：0.1μm

平均细孔径的标准偏差：0.035μm

膜表面粗糙度：0.06μm

纯水透过系数：50×10^-9m³/m²/s/pa。

(参考例3)使用粟酒裂殖酵母NBRC1628株的分批发酵

进行与实施例1发酵原料、微生物、预培养条件、发酵条件相同的分批发酵。然而不进行采用分离膜的培养液的过滤。

将粟酒裂殖酵母NBRC1628株接种到加入了5ml表1所示的发酵原料的试管中并振荡培养一晚(前预培养)。将所得的培养液接种到加入了新鲜的45ml表1所示的发酵原料的锥形烧瓶中，在30℃、120rpm下振荡培养8小时(预培养)。分取预培养液50mL之中的35mL，接种到加入了700mL表1所示的发酵原料的连续发酵装置中，将发酵反应槽通过附属的搅拌机以300rpm进行搅拌，在以下发酵条件下进行48小时分批发酵，此时获得了乙醇浓度58g/L的乙醇发酵液(发酵液样品2)700ml。

[分批发酵条件]

发酵反应槽容量：2(L)

温度调整：30(℃)

发酵反应槽通气量：无通气

发酵反应槽搅拌速度：300(rpm)

pH调整：无调整。

(参考例4)从分批发酵液的微生物除去

参考例3中获得的发酵液样品2中含有微生物，因此通过1000g、10分钟的离心分离使微生物沉淀，获得了其上清液液(发酵液样品3)600ml。

(实施例2)发酵液样品的蒸馏试验

进行了模仿了连续式蒸馏的精馏塔内部的状态的试验。将300ml发酵液样品1～3分别加入到500ml容量圆底烧瓶中，将圆底烧瓶通过有罩加热器，以圆底烧瓶内部的液体温度传感器维持95℃的方式加热运转。在圆底烧瓶的出口安装冷却冷凝器，将4℃的冷却水在电容器内部配管循环，从而将蒸发了的乙醇冷却并使其冷凝。其结果，关于发酵液样品2和3，在沸腾后迅速地剧烈发泡，直到泡达到冷却冷凝器为止。另一方面关于发酵液样品1，令人惊讶的是，即使维持5小时的蒸馏状态，也完全不发泡。

(实施例3)发泡性的评价

为了进行发泡性的评价，进行了作为“油化学第42卷，第10号(1993)P.737-734”所记载的使用了量筒的发泡性的评价方法的、采用流下法的试验。立起500ml的量筒，对于样品1～3分别将50ml发酵液最初加入到量筒中，向其中使300ml的样品1～3分别从45cm的高度流下，测定了产生的泡沫体积。其结果，发酵液样品1的泡沫体积为零ml，发酵液样品2和3的泡沫体积分别为55ml和65ml。

由实施例2和3的结果明确了，发酵液样品1具备完全不发泡这样的令人惊讶的特性。

(实施例4)乙醇发酵液中的粒径分布和平均粒径测定结果

将发酵液样品1～3离心分离，实施了所得的上清液的平均粒径测定。具体而言，将各自在室温下以1,000G离心10分钟，回收各个上清液3mL。将回收的上清液30μL加入到pH5的柠檬酸缓冲液970μL中进行稀释，将稀释的各溶液加入到1mL容量的一次性比色池中，通过动态光散射测定了平均粒径。

[测定条件]

·光源的针孔尺寸：100μm

·测定波长：660nm

·测定角度：165°

·测定累计次数：70次

·溶剂折射率：1.3313

·溶剂粘度：0.8852cp。

接下来，将测定结果在以下条件下进行分析。

[分析条件]

粒径的分析使用大塚电子株式会社的ζ电位-粒子测定系统ELS-Z2，在25℃的条件下在大气中进行了测定。由通过动态光散射获得的散射强度的摇摆，通过累积量分析求出自相关函数，向相对于散射强度的粒度分布转换。粒度分布的直方图分析范围是最小值为1nm、最大值为5000nm。将所得的粒径分布结果示于图1中。将仅放大了发酵液样品1的粒径分布示于图2中。此外，在表2中显示发酵液样品1～3的平均粒径和泡沫体积的结果汇总。

表2

其结果，如图1和表2所示那样，可知作为原料的甘蔗糖蜜不包含粒子，通过微生物培养形成粒子。此外可知在乙醇发酵液中，含有通过微生物培养形成的平均粒径58nm的乙醇发酵液可以显著地抑制发泡。

(实施例5)乙醇发酵液样品的发泡性

利用模仿了连续式蒸馏的试验进行了乙醇发酵液样品的发泡性评价。在東京ガラス機械制试管(共同共栓试管带刻度20ml透明)中分别加入搅拌子、和3ml上述发酵液样品1～3，在上部安装设定于10℃的冷却管。在设定于160℃的东京理化器械株式会社制的带温调的油浴中以试管内发酵液液面与油浴液面相等的方式设置，一边使用YAZAWA社制电磁搅拌器(KF-82M)以400±20rpm搅拌一边进行加热。其结果，关于发酵液样品2和3，在加热开始后在5分钟～10分钟期间观察到从液面超过7cm的发泡。关于一方的发酵液样品1，令人惊讶的是，为完全不发泡的状态，确认了与实施例3的发泡性试验相同的结果。

(参考例5)乙醇发酵液样品的透射率的测定

作为紫外可见分光光度计，使用日本分光株式会社制UV-Vis测定仪(V750)、和日本分光株式会社制的10mm见方石英吸收池进行测定。在吸收池中加入2ml和光纯药株式会社制蒸馏水，测定了200nm～800nm的光线波长的透射率的背景。然后，在空的吸收池中加入发酵液进行测定，以300nm的光线波长的透射率变为0.5±0.1％T的方式适当将发酵液用蒸馏水进行了稀释。使用该稀释液测定了600nm的光线波长的透射率。

(实施例6)采用透射率的乙醇发酵液的发泡性的阈值的决定

将与样品2同样地操作而调制的发酵液80ml加入到ファルコン社制50ml聚丙烯锥形管中各40ml，以10000G进行60分钟离心分离，将粒子与上清液分离。将沉降的粒子进行3次水洗和离心分离，舍弃第3次的离心分离结束后上清液，用东京理化器械株式会社制冷冻干燥器(FDU-1200)使其干燥。此时的干燥重量为520mg。将该粒子用水进行稀释，调制出104mg/ml的溶液(粒子溶液)。调制出以10000G离心分离了60分钟的上清液:粒子溶液以体积比计为1000:0、997:3、970:30、900:100、800:200、700:300、600:400那样的溶液。按照参考例5的透射率的测定方法，进行了各溶液的600nm的光线波长的透射率的测定，结果分别为97.6、97.3、91.8、85.9、84.5、83.0、81.9。用各个液体进行与实施例5同样的蒸馏试验方法，进行了透射率和发泡的有无的分析。其结果，以600nm的光线波长的透射率91％T为界，如果为其以上则观察不到距液面为7cm以上的发泡，如果为其以下则获得了进行7cm以上发泡的结果。透射率的测定可以认为是可以简易地测定发泡性的方法。

(实施例7)发酵液样品的透射率测定

按照参考例5的透射率的测定方法，进行了上述发酵液样品1、样品2、样品3的测定。其结果，600nm的光线波长的透射率对于样品1为94.7％T，对于样品2为54.6％T，对于样品3为90.7％T。即，实际的发酵液样品也是600nm的光线波长的透射率以91％T为界，如果超过91％T则如实施例3、参考例5那样不发生发泡，另一方面，如果为91％T以下则确认了产生发泡。

产业可利用性

通过本发明的乙醇制造方法获得的乙醇发酵液、或通过本发明而特定的乙醇发酵液可以制成所谓生物乙醇而作为可持续的燃料或工业用原料利用。

Claims

1.一种乙醇的制造方法，其包含下述工序：将微生物用包含甘蔗糖蜜作为主成分的发酵原料进行培养，将培养液用分离膜过滤而分离出微生物，回收所得的含有乙醇的过滤液，进一步将包含微生物的未过滤液保持在或回流到培养液中，并且在培养液中补加发酵原料的乙醇连续发酵工序；以及将在该连续发酵工序中回收的含有乙醇的过滤液通过蒸馏进行乙醇浓缩精制的工序，

所述微生物是使所述培养液的离心上清液中含有平均粒径为100nm以上的粒子的微生物，所述含有乙醇的过滤液所包含的通过所述微生物培养形成的粒子的平均粒径为40～80nm。

2.根据权利要求1所述的乙醇的制造方法，所述培养液的离心上清液中含有的所述粒子的平均粒径为300nm以上。

3.根据权利要求1或2所述的乙醇的制造方法，所述微生物为属于裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的酵母。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的乙醇的制造方法，所述含有乙醇的过滤液所包含的通过所述微生物培养形成的粒子的粒径分布为粒径20～100nm的范围内。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的乙醇的制造方法，所述蒸馏为连续式蒸馏。

6.一种乙醇发酵液，其包含通过微生物培养形成的除该微生物以外的粒子，且不包含蔗渣的水热处理时的成分，所述粒子是平均粒径为40～80nm的粒子。

7.根据权利要求6所述的乙醇发酵液，所述粒子的粒径分布为粒径20～100nm的范围内。

8.一种乙醇发酵液，在将其用水稀释到300nm的光线波长的透射率变为0.5±0.1％T的情况下，600nm的光线波长的透射率超过91％T。