WO2015159812A1 - 連続発酵による化学品の製造方法 - Google Patents

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strain
separation membrane
yeast
ethanol
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小林　宏治
健司 澤井
山田　勝成
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東レ株式会社
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    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a chemical product by continuous fermentation under low pH conditions.
  • Biomass-derived chemicals such as biodegradable polymer raw materials such as lactic acid and biofuels such as ethanol have become sustainable (sustainable) as well as carbon dioxide emissions into the atmosphere and the emergence of energy problems. It is attracting a great deal of attention as a life cycle assessment (LCA) compatible product.
  • LCA life cycle assessment
  • Patent Document 1 discloses a method for producing lactic acid by culturing yeast.
  • the pH of the culture solution is maintained by alkali neutralization.
  • gypsum may be affected by the influence of acidic substances such as sulfuric acid added to separate lactate in the subsequent separation / purification process depending on the amount of alkaline substance added.
  • the culture may be performed at a low pH.
  • Patent Document 2 it is not necessary to adjust the pH when performing ethanol fermentation with yeast using a sugar solution obtained by hydrolyzing biomass resources with an acid such as sulfuric acid, and the risk of contamination with bacteria is reduced at a lower pH. Therefore, it is described that sterilization of the culture medium and the fermentation apparatus becomes unnecessary.
  • a batch culture method, a fed-batch culture method, a continuous culture method, or the like is used as a method for culturing microorganisms.
  • Patent Document 5 the production rate and yield of a fermentation product can be improved by a continuous culture method using a separation membrane. It is disclosed.
  • Patent Document 5 a Saccharomyces cerevisiae NBRC10505 strain in which a lactate dehydrogenase gene is introduced into a chromosome as a lactic acid fermentation microorganism, or an NBRC10505 strain as an ethanol fermentation microorganism is used, and the culture solution is adjusted to pH 5.
  • a method for producing lactic acid or ethanol by continuous fermentation using a separation membrane is disclosed, and lactic acid or ethanol is continuously produced without any excess sugar as a fermentation raw material.
  • the present invention is as follows (1) to (5).
  • (1) A chemical product obtained by continuously filtering a yeast culture solution through a separation membrane, retaining or refluxing the unfiltered solution in the culture solution, and continuously fermenting the fermentation raw material to the culture solution at a pH of 3.5 or less. It is a manufacturing method, Comprising: As said yeast, the light absorbency in 600 nm of the culture solution obtained under the following conditions (a) is 20% or more of the light absorbency in 600 nm of the culture solution obtained under the following conditions (b). A method for producing a chemical product using yeast.
  • the yeast whose light absorbency in 600 nm of the culture solution obtained under the following conditions (c) is 20% or more of the light absorbency in 600 nm of the culture solution obtained under the following conditions (d) is used.
  • Condition (d) Culture is carried out in the same manner as in condition (c) except that the YPAD medium does not contain acetone.
  • FIG. 1 shows the residual sugar concentration of the culture solution during preculture in Comparative Examples 1 to 3 and Examples 1 to 3, and the residual sugar concentration in the filtrate from the start to the end of continuous fermentation using a separation membrane.
  • 0 hour indicates the start time of continuous fermentation using a separation membrane, and the time before that indicates the pre-culture period (19 hours).
  • FIG. 2 shows the residual sugar concentration of the culture solution during pre-culture in Examples 4 to 8, and the residual sugar concentration in the filtrate from the start to the end of continuous fermentation using a separation membrane.
  • 0 hour indicates the start time of continuous fermentation using a separation membrane, and the time before that indicates the pre-culture period (19 hours).
  • yeast used in the present invention will be described.
  • the yeast having resistance to vanillin used in the present invention includes the absorbance of the culture solution under the following conditions (a) and the culture solution under the following conditions (b).
  • the absorbance of the culture solution under the condition (a) is 20% or more of the absorbance of the culture solution under the following condition (b). It is preferably 30% or more, more preferably 40% or more, still more preferably 50% or more, still more preferably 60% or more, particularly preferably 70% or more, and most preferably 80% or more.
  • vanillin-resistant yeast can produce chemicals without a large amount of fermentation raw materials even in continuous fermentation using a separation membrane having a pH of 3.5 or less.
  • a large amount of fermentation raw material is a state in which the fermentation raw material is not consumed and remains in the filtrate obtained by filtering the culture solution through a separation membrane. If a large amount of fermentation raw material is left in the filtrate, the yield of the product with respect to the fermentation raw material invested in the fermentation will decrease, resulting in an increase in the cost of the product and an increase in the burden of removing the fermentation raw material in the purification stage. The smaller the fermentation raw material remaining in the filtrate, the better.
  • the conditions (a) and (b) of the vanillin resistance test will be described in detail.
  • YPAD medium is used as the medium for culturing the vanillin resistance test.
  • the composition of the YPAD medium here includes yeast extract 1% (w / v), bactopeptone 2% (w / v), glucose 2% (w / v), and adenine 0.04% (w / v). Medium.
  • Preparation of the YPAD medium of vanillin (final concentration 1 g / L) used in the condition (a) is preferably performed by adding a vanillin concentrate to a sterilized YPAD medium.
  • the vanillin concentrate is preferably adjusted to 100 to 200 g / L, but most preferably adjusted to 200 g / L. This is to reduce as much as possible the influence of growth by the organic solvent that dissolves vanillin.
  • DMSO is preferably used as the organic solvent for dissolving vanillin.
  • 25 ⁇ l of vanillin concentrate may be added to 5 ml of a YPAD medium containing vanillin.
  • 25 ⁇ l of DMSO alone should be added to the YPAD medium without vanillin. This is in order to take into account the influence of DMSO on proliferation.
  • the vanillin-resistant yeast used in the present invention preferably further has acetone resistance.
  • yeast having vanillin resistance and acetone resistance By using yeast having vanillin resistance and acetone resistance, the fermentation raw material remaining in the filtrate obtained by continuous fermentation using a separation membrane having a pH of 3.5 or less can be further reduced, and the chemical product is more efficiently produced. Can be produced.
  • the absorbance of the culture solution under the condition (c) is 20% or more of the absorbance of the culture solution under the condition (d).
  • it is 30% or more, more preferably 40% or more, more preferably 50% or more, more preferably 60% or more, more preferably 70% or more, and further preferably 80% or more.
  • Condition (c) Culturing for 40 hours in a YPAD medium containing 4% (v / v) acetone (absorbance at 600 nm at the start of culture is 0.2).
  • the conditions (c) and (d) for the acetone resistance test will be described in detail.
  • YPAD medium is used as the medium used for the culture of the acetone resistance test.
  • Preparation of YPAD medium containing 4% (v / v) acetone used in condition (c) is preferably performed by adding acetone to sterilized YPAD medium.
  • the culture temperature of the conditions (a) to (d) is not particularly limited as long as the yeast cells are sufficiently grown, but is preferably 28 to 30 ° C, more preferably 30 ° C.
  • the spectrophotometer used for measuring the absorbance of the culture broth under conditions (a) to (d) is not particularly limited, but under conditions (a) to (d), it is necessary to measure with the same spectrophotometer.
  • the vanillin resistant yeast (and vanillin resistant and acetone resistant yeast) used in the present invention can be selected by screening a vanillin resistant test (and an acetone resistant test) from yeast strains known to those skilled in the art.
  • the present specification also applies to a yeast that has a vanillin resistance test (and acetone resistance test) of 20% or more by subjecting a yeast having no vanillin resistance (and acetone resistance) to a mutation treatment known to those skilled in the art. It corresponds to vanillin resistant yeast (and vanillin resistant and acetone resistant yeast) as referred to in the text.
  • the fermentation raw material used in the method for producing a chemical product of the present invention contains a carbon source, nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the yeast, and can efficiently culture the yeast.
  • a carbon source nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the yeast, and can efficiently culture the yeast.
  • a natural medium or a synthetic medium can be used.
  • the carbon source glucose, fructose, sucrose, galactose, maltose, raffinose, trehalose, sorbose, cellobiose, lactose, melibiose, melezitose, inulin, xylose, arabinose, ribose, rhamnose, glucosamine, erythritol, ribitol
  • Mainly used as fermentation raw material is one or more kinds of saccharides selected from the group consisting of carbohydrates such as mannitol, glucitol, salicin, starch, starch or hydrolysates thereof, and saccharified liquid from biomass-derived cellulose.
  • Carbon sources such as organic acids such as acetic acid, propionic acid and citric acid, and alcohols such as ethanol and propanol can also be used as the main component of the fermentation raw material.
  • nitrogen source ammonium salt of inorganic acid or organic acid such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate or other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, corn steep liquor, etc. may be used. it can.
  • inorganic substances examples include potassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, and calcium carbonate. These carbon source, nitrogen source, inorganic salts and the like may be added all at once at the start of the culture, or may be added in portions during the culture or continuously.
  • the yeast used in the present invention requires a specific nutrient for growth
  • the nutrient can be added as a preparation or a natural product containing it.
  • an antifoamer can also be used as needed.
  • the culture solution refers to a solution obtained as a result of microorganisms assimilating and proliferating fermentation raw materials. You may change suitably the composition of the fermentation raw material to add from the fermentation raw material composition at the time of a culture
  • the total sugar concentration in the case where saccharides are the main ingredients for fermentation is not particularly limited, and may be as high as possible as long as it does not inhibit the production of chemicals by yeast. 500 g / L is preferable, and 20 to 300 g / L is more preferable.
  • the production efficiency of a chemical product can be evaluated by the yield of the produced chemical product relative to the main component of the fermentation raw material assimilated by the microorganism.
  • the production efficiency is calculated by the following equation (1). The value is evaluated as a yield.
  • the total input fermented raw material represents the total amount of the main components of the fermented raw material invested in the fermentation
  • the unused fermented raw material represents the total amount of the main components of the fermented raw material remaining without being consumed at the end of the fermentation.
  • the main component of the fermentation raw material remaining in the culture liquid without being assimilated by microorganisms at the end of fermentation and in the case of continuous fermentation, the culture liquid remains in the filtrate filtered through a separation membrane. Represents the main component of the fermented raw material.
  • the total product amount is the total production amount (g) of a chemical product.
  • the feed rate of the fermentation raw material during continuous fermentation is not particularly limited, but is preferably 4 g / (L ⁇ hr) or more. This is because if the supply rate of the fermentation raw material is lower than this, the effect of the present invention of suppressing the remaining fermentation raw material may be reduced.
  • the fermentation raw material supply rate is calculated by the following equation (1).
  • the separation membrane used in the present invention is not particularly limited as long as it has a function of separating and filtering a culture solution obtained by culturing using a microbial stirring type incubator or a stirring type bioreactor from microorganisms.
  • a ceramic film, a porous glass film, a porous organic polymer film, a metal fiber woven fabric, a nonwoven fabric, or the like can be used. Among these, a porous organic polymer film or a ceramic film is particularly preferable.
  • the separation membrane is preferably a separation membrane including a porous resin layer from the viewpoint of blocking performance, water permeability performance and separation performance, for example, stain resistance.
  • the separation membrane including the porous resin layer preferably has a porous resin layer that acts as a separation functional layer on the surface of the porous substrate.
  • the porous substrate supports the porous resin layer and gives strength to the separation membrane.
  • the separation membrane has a porous resin layer on the surface of the porous substrate
  • the porous resin layer penetrates into the porous substrate even if the porous resin layer penetrates into the porous substrate. It does not matter which is not necessary, and is selected according to the application.
  • the average thickness of the porous substrate is preferably 50 ⁇ m or more and 3000 ⁇ m or less.
  • the material of the porous substrate is made of an organic material and / or an inorganic material, and an organic fiber is preferably used.
  • the preferred porous substrate is a woven or non-woven fabric made of organic fibers such as cellulose fiber, cellulose triacetate fiber, polyester fiber, polypropylene fiber and polyethylene fiber. More preferably, the density control is relatively easy and the production is easy. Inexpensive nonwoven fabric is used.
  • An organic polymer film can be suitably used for the porous resin layer.
  • the material of the organic polymer film include polyethylene resin, polypropylene resin, polyvinyl chloride resin, polyvinylidene fluoride resin, polysulfone resin, polyethersulfone resin, polyacrylonitrile resin, cellulose resin, and the like. Examples thereof include cellulose triacetate resins.
  • the organic polymer film may be a mixture of resins mainly composed of these resins.
  • the main component means that the component is contained in an amount of 50% by weight or more, preferably 60% by weight or more.
  • the organic polymer film is made of a polyvinyl chloride resin, a polyvinylidene fluoride resin, a polysulfone resin, a polyethersulfone resin, which is easy to form a film with a solution and has excellent physical durability and chemical resistance.
  • Polyacrylonitrile-based resins are preferable, and polyvinylidene fluoride-based resins or resins containing them as the main components are most preferably used.
  • polyvinylidene fluoride-based resin a homopolymer of vinylidene fluoride is preferably used.
  • polyvinylidene fluoride resin a copolymer of a vinyl monomer copolymerizable with vinylidene fluoride is also preferably used.
  • vinyl monomers copolymerizable with vinylidene fluoride include tetrafluoroethylene, hexafluoropropylene, and ethylene trifluoride chloride.
  • the average pore diameter of the separation membrane is preferably 0.01 ⁇ m or more and less than 5 ⁇ m.
  • the average pore diameter of the separation membrane is 0.01 ⁇ m or more and less than 1 ⁇ m, it is possible to achieve both a high exclusion rate at which microorganisms do not leak and high water permeability, and to maintain water permeability for a long time. However, it can be implemented with higher accuracy and reproducibility.
  • the average pore diameter of the separation membrane is preferably less than 1 ⁇ m.
  • the average pore diameter of the separation membrane is preferably not too large compared to the size of the microorganism in order to prevent leakage of the microorganism, that is, the occurrence of a problem that the rejection rate decreases.
  • the average pore diameter is preferably 0.4 ⁇ m or less, and more preferably less than 0.2 ⁇ m.
  • the average pore diameter is more preferably 0.1 ⁇ m or less.
  • the average pore size of the separation membrane is preferably 0.01 ⁇ m or more. Yes, more preferably 0.02 ⁇ m or more, and still more preferably 0.04 ⁇ m or more.
  • the average pore diameter can be obtained by measuring and averaging the diameters of all pores that can be observed within a range of 9.2 ⁇ m ⁇ 10.4 ⁇ m in a scanning electron microscope observation at a magnification of 10,000 times. it can.
  • the average pore diameter can be obtained by taking a photograph of the surface of the membrane at a magnification of 10,000 using a scanning electron microscope and randomly selecting 10 or more, preferably 20 or more pores. Can be calculated and averaged.
  • a circle having an area equal to the area of the pores (equivalent circle) can be obtained by an image processing apparatus or the like, and the equivalent circle diameter can be obtained by the method of setting the diameter of the pores.
  • the standard deviation ⁇ of the average pore diameter of the separation membrane is preferably 0.1 ⁇ m or less.
  • the standard deviation ⁇ of the average pore diameter is N (the number of pores that can be observed within the above-mentioned range of 9.2 ⁇ m ⁇ 10.4 ⁇ m), each measured diameter is Xk, and the average pore diameter is X (ave) It is calculated by the following (formula 3).
  • the permeability of the fermentation broth is one of the important performances.
  • the pure water permeability coefficient of the separation membrane before use can be used as an index of the permeability of the separation membrane.
  • the pure water permeation coefficient of the separation membrane was 5.6 ⁇ 10 ⁇ 10 m 3 / m 2 / when the water permeability was measured at a head height of 1 m using purified water at a temperature of 25 ° C. by a reverse osmosis membrane.
  • the pure water permeability coefficient should be 5.6 ⁇ 10 ⁇ 10 m 3 / m 2 / s / pa to 6 ⁇ 10 ⁇ 7 m 3 / m 2 / s / pa.
  • the pure water permeability coefficient should be 5.6 ⁇ 10 ⁇ 10 m 3 / m 2 / s / pa to 6 ⁇ 10 ⁇ 7 m 3 / m 2 / s / pa.
  • the surface roughness is an average value of heights in a direction perpendicular to the surface.
  • the membrane surface roughness is one of the factors for facilitating separation of microorganisms adhering to the separation membrane surface by the membrane surface cleaning effect by the liquid flow by stirring or a circulation pump.
  • the surface roughness of the separation membrane is not particularly limited, and may be in a range in which microorganisms attached to the membrane and other solid substances are peeled off, but is preferably 0.1 ⁇ m or less. When the surface roughness is 0.1 ⁇ m or less, microorganisms adhering to the film and other solid substances are easily peeled off.
  • the membrane surface roughness of the separation membrane is 0.1 ⁇ m or less
  • the average pore diameter is 0.01 ⁇ m or more and less than 1 ⁇ m
  • the pure water permeability coefficient of the separation membrane is 2 ⁇ 10 ⁇ 9 m 3 / m 2.
  • the surface roughness of the separation membrane is preferably as small as possible.
  • the membrane surface roughness of the separation membrane was measured under the following conditions using the following atomic force microscope (AFM).
  • FAM atomic force microscope
  • Device Atomic force microscope device (“Nanoscope IIIa” manufactured by Digital Instruments)
  • Condition probe SiN cantilever manufactured by Digital Instruments
  • Scan mode Contact mode air measurement
  • Underwater tapping mode underwater measurement
  • Scanning range 10 ⁇ m, 25 ⁇ m square 5 ⁇ m
  • 10 ⁇ m square underwater measurement
  • Scanning resolution 512 ⁇ 512 -Sample preparation The membrane sample was immersed in ethanol at room temperature for 15 minutes, then immersed in RO water for 24 hours, washed, and then air-dried.
  • the RO water refers to water that has been filtered using a reverse osmosis membrane (RO membrane), which is a type of filtration membrane, to exclude impurities such as ions and salts.
  • RO membrane reverse osmosis membrane
  • the pore size of the RO membrane is approximately 2 nm or less.
  • the film surface roughness “drough” is calculated by the following (Equation 4) from the height of each point in the Z-axis direction by the above atomic force microscope (AFM).
  • the shape of the separation membrane is preferably a flat membrane.
  • the average thickness is selected according to the application.
  • the average thickness when the shape of the separation membrane is a flat membrane is preferably 20 ⁇ m or more and 5000 ⁇ m or less, and more preferably 50 ⁇ m or more and 2000 ⁇ m or less.
  • the shape of the separation membrane is preferably a hollow fiber membrane.
  • the inner diameter of the hollow fiber is preferably 200 ⁇ m or more and 5000 ⁇ m or less, and the film thickness is preferably 20 ⁇ m or more and 2000 ⁇ m or less.
  • a woven fabric or a knitted fabric in which organic fibers or inorganic fibers are formed in a cylindrical shape may be included in the hollow fiber.
  • the above-mentioned separation membrane can be manufactured by the manufacturing method described in WO2007 / 097260, for example.
  • the separation membrane in the present invention can be a membrane containing at least ceramics.
  • the ceramics in the present invention refers to those containing a metal oxide and baked and hardened by heat treatment at a high temperature.
  • the metal oxide include alumina, magnesia, titania, zirconia and the like.
  • the separation membrane may be formed of only a metal oxide, and may include silica, silicon carbide, mullite, cordierite, or the like, which is a compound of silica and a metal oxide.
  • Components other than the ceramics forming the separation membrane are not particularly limited as long as they can form a porous body as a separation membrane.
  • the shape is not particularly limited, and any of monolithic membrane, flat membrane, tubular membrane and the like can be used. From the viewpoint of filling efficiency into the container, a columnar structure and a structure having a through hole in the longitudinal direction is preferable. A monolith film is preferred from the viewpoint of increasing the filling efficiency.
  • the separation membrane When a separation membrane having a columnar structure is housed in a module container and used as a separation membrane module, the separation membrane can be modularized and filtered by selecting a suitable mode from an external pressure type and an internal pressure type.
  • the side where the separation membrane is in contact with the fermentation broth is referred to as the primary side
  • the side where the filtrate containing the chemical product is obtained by filtration is referred to as the secondary side.
  • the output of the circulation pump can be saved when cross-flow filtration is performed because the flow path on the primary side is narrow. Furthermore, the action of discharging turbidity deposited on the surface of the separation membrane to the outside of the module becomes stronger, which is preferable because the surface of the separation membrane is easily kept clean.
  • the internal pressure type separation membrane has an inlet and an outlet for the fermentation broth. In this case, it is preferable that the inlet and the outlet are in a state of through holes arranged in a straight line, since the liquid flow resistance becomes small. Further, since the separation membrane has a columnar structure and the through-holes are vacant in the longitudinal direction, the container for accommodating the separation membrane can be made thinner. When the separation membrane module is thin, it can be preferably used from the viewpoint of production and handling.
  • the porosity of the separation membrane is not particularly limited, but if it is too low, the filtration efficiency will deteriorate, and if it is too high, the strength will decrease. In order to achieve both the filtration efficiency and the strength of the separation membrane and to have resistance to repeated steam sterilization, it is preferably 20% or more and 60% or less.
  • the average pore diameter of the separation membrane is preferably 0.01 ⁇ m or more and 1 ⁇ m or less. If the membrane has an average pore diameter in this range, the separation membrane is less likely to block and the filtration efficiency is excellent. In addition, if the average pore size is in the range of 0.02 ⁇ m or more and 0.2 ⁇ m or less, fermentation by-products by microorganisms and cultured cells exemplified by proteins and polysaccharides, and microorganisms / cultured cells in the culture solution This is particularly preferable because clogging of a substance that easily clogs the separation membrane, such as a crushed cell produced by death, is less likely to occur.
  • the separation membrane having a columnar structure having a through hole has a secondary surface on the secondary side, it is preferable to provide a module container for collecting filtrate and use the module as a module in which the separation container is filled.
  • One or more separation membranes are filled in one module.
  • the module container is preferably made of a material that can withstand repeated steam sterilization.
  • raw materials that can withstand steam sterilization include stainless steel and ceramics having a low average porosity.
  • Such a ceramic membrane module can be manufactured by, for example, a manufacturing method described in WO2012 / 086763, but a commercially available one can also be used. Specific examples of commercially available products include MEMBLAROX microfiltration membranes (Pall), ceramic membrane filter cefilt MF membranes (NGK), and the like.
  • the yeast culture solution is filtered through a separation membrane, the unfiltered solution is retained or refluxed in the culture solution, and the fermentation raw material is added to the culture solution to recover the product from the filtrate. It is characterized by fermentation.
  • the transmembrane pressure difference during filtration using a separation membrane is not particularly limited as long as the fermentation broth can be filtered.
  • the organic polymer membrane is filtered at a transmembrane differential pressure higher than 150 kPa to filter the culture solution, the structure of the organic polymer membrane is likely to be destroyed, and the ability to produce chemicals is increased. May decrease.
  • the transmembrane pressure is lower than 0.1 kPa, the permeated water amount of the fermentation broth is often not sufficiently obtained, and the productivity when producing a chemical product tends to decrease.
  • the permeated water amount of the fermentation broth is increased by setting the transmembrane differential pressure, which is the filtration pressure, preferably in the range of 0.1 kPa to 150 kPa. Further, since there is no decrease in chemical production capacity due to destruction of the film structure, it is possible to maintain a high ability to produce chemical products.
  • the transmembrane pressure difference is preferably in the range of 0.1 kPa to 50 kPa, and more preferably in the range of 0.1 kPa to 20 kPa.
  • the temperature in yeast fermentation may be set to a temperature suitable for the yeast to be used, and is not particularly limited as long as the microorganism grows, but the temperature is in the range of 20 to 75 ° C.
  • the pH of the culture solution in continuous fermentation is adjusted to 4 or less.
  • the pH of the culture solution is adjusted to a predetermined value within the range of pH 4 or less with an inorganic or organic acid, an alkaline substance, urea, calcium carbonate, ammonia gas, or the like.
  • continuous fermentation filtration of the culture solution
  • continuous fermentation may be started after batch culture or fed-batch culture is performed at the initial stage of culture to increase the microorganism concentration.
  • the start timing of the medium supply and the filtration of the culture solution is not necessarily the same. Further, the medium supply and the filtration of the culture solution may be continuous or intermittent.
  • the concentration of microorganisms in the culture solution is preferably maintained in a state where the productivity of chemical products is high in order to obtain efficient productivity.
  • good production efficiency can be obtained by maintaining the concentration of microorganisms in the culture solution as a dry weight of 5 g / L or more.
  • the microorganism concentration in the culture tank may be adjusted by removing a part of the culture solution containing microorganisms from the fermenter and diluting with a medium.
  • the concentration of microorganisms in the fermenter becomes too high, clogging of the separation membrane is likely to occur, so avoiding clogging by removing a part of the culture solution containing microorganisms and diluting with a medium.
  • the production performance of chemicals may change depending on the concentration of microorganisms in the fermenter. Using the production performance as an indicator, remove a part of the culture solution containing microorganisms and dilute it in the medium to maintain the production performance. It is also possible.
  • the number of fermenters is not limited as long as it is a continuous fermentation culture method for producing a product while growing cells.
  • the continuous fermentation apparatus filters the yeast fermentation broth through a separation membrane, collects the product from the filtrate, holds or refluxs the unfiltered liquid in the fermentation broth, and uses the fermentation raw material as the fermentation broth.
  • a separation membrane collects the product from the filtrate, holds or refluxs the unfiltered liquid in the fermentation broth, and uses the fermentation raw material as the fermentation broth.
  • an organic polymer membrane a specific example is disclosed in WO2007 / 097260. The apparatus described can be used.
  • the chemical product produced according to the present invention is not particularly limited as long as it is a chemical product that can be produced by yeasts known to those skilled in the art (including yeasts that have been subjected to mutation treatment or genetic recombination), but is preferable.
  • yeasts known to those skilled in the art (including yeasts that have been subjected to mutation treatment or genetic recombination), but is preferable.
  • examples include organic acids or alcohols. Specific examples of organic acids include acetic acid, lactic acid, adipic acid, pyruvic acid, succinic acid, malic acid, itaconic acid, and citric acid.
  • Specific examples of alcohol include ethanol, 1,3-propanediol.
  • These chemicals are recovered from the filtrate by known methods (membrane separation, concentration, distillation, crystallization, extraction, etc.).
  • D-lactate dehydrogenase gene was used.
  • D-LDH D-lactate dehydrogenase gene derived from Limulus polyphemus
  • a homologous portion to the target site upstream and downstream of the DNA containing the D-LDH gene. Examples include, but are not limited to, a method of performing PCR using primers designed in such a manner and transforming the obtained PCR fragment into yeast.
  • the PCR fragment preferably contains a yeast selection marker such as an amino acid synthesis gene or a drug resistance gene.
  • the transformation was performed by a lithium acetate method using “YASTMAKER Yeast Transformation System” (manufactured by CLONETECH). For details, the attached protocol was followed.
  • the Saccharomyces cerevisiae NBRC10505 strain used as a host is a strain lacking the ability to synthesize tryptophan, and by the action of the TRP1 gene, it is possible to select a transformant having the gene introduced on a tryptophan-free medium.
  • D-LDH gene introduction into the transformant includes plasmid DNA from a transformant cultured in a YPAD medium using a genomic DNA extraction kit “Gen Torkun” (manufactured by TAKARA). Genomic DNA was extracted, and PCR was performed using “PreMix Taq” (manufactured by TAKARA) as a template. As a result, it was confirmed that the D-LDH gene was introduced into the PDC1 locus in all transformants.
  • NBRC10505 strain obtained by introducing D-LDH derived from the horseshoe crab at the PDC1 locus is hereinafter referred to as NBRC10505 / ⁇ PDC1 :: LDH strain.
  • D-lactate dehydrogenase gene derived from Limulus polyphemus (WO2010 / 140602.) was used.
  • the Saccharomyces cerevisiae NBRC2260 strain used as a host is a strain having no amino acid requirement, and the D-LDH gene was introduced on the drug-added medium by using a drug resistance gene such as geneticin (G418) or hygromycin. Selection of transformants is possible. Using G418 as a selection marker, transformation was performed in the same manner as in Reference Example 3. The obtained transformant was confirmed for D-LDH gene introduction in the same manner as in Reference Example 3. As a result, it was confirmed that the D-LDH gene was introduced into the PDC1 locus in all transformants.
  • NBRC2260 strain obtained by introducing D-LDH derived from American horseshoe crab at the PDC1 locus is hereinafter referred to as NBRC2260 / ⁇ PDC1 :: LDH strain.
  • a vanillin concentrate (200 g / L in DMSO) was prepared, and 25 ⁇ L of the vanillin concentrate was dispensed in 5 ml of YPAD medium to a final concentration of 1 g / L. 25 ⁇ l of DMSO alone was dispensed into the YPAD medium without vanillin.
  • Saccharomyces cerevisiae NBRC10505 strain is a yeast having no vanillin resistance.
  • Saccharomyces cerevisiae NBRC10505 strain was inoculated with platinum ears into 20 ml test tubes each containing 5 ml of YPAD medium, and cultured with shaking overnight at 30 ° C. (preculture).
  • the composition of the YPAD medium was 1% (w / v) yeast extract, 2% (w / v) bactopeptone, 2% (w / v) glucose, and 0.04% (w / v) adenine. 200 ⁇ l of acetone was dispensed in 5 ml of YPAD medium to a final concentration of 4% (v / v).
  • Saccharomyces cerevisiae NBRC10505 strain is a yeast that does not have acetone resistance.
  • Saccharomyces cerevisiae NBRC10505 / ⁇ PDC1 vanillin resistance test and acetone resistance test of LDH strain Saccharomyces cerevisiae NBRC10505 / ⁇ PDC1 :: LDH strain, which is a lactic acid fermentation yeast, was used in the same manner as in Reference Example 5. The values were calculated according to (Equation 6) and (Equation 7) (Table 2). As a result, it was found that the Saccharomyces cerevisiae NBRC10505 / ⁇ PDC1 :: LDH strain is a yeast that does not have vanillin resistance or acetone resistance.
  • Saccharomyces cerevisiae NBRC2260 / ⁇ PDC1 vanillin resistance test of LDH strain and acetone-resistant yeast
  • Saccharomyces cerevisiae NBRC2260 / ⁇ PDC1 LDH strain, which is a lactic acid fermentation yeast
  • the values were calculated according to (Equation 6) and (Equation 7) (Table 2).
  • the Saccharomyces cerevisiae NBRC2260 / ⁇ PDC1 :: LDH strain is a vanillin resistant and acetone resistant yeast.
  • Saccharomyces cerevisiae NITE BP-1087 Strain Saccharomyces cerevisiae NITE BP-1087, which is a low pH resistant yeast strain described in WO2012 / 147903 The values were calculated according to (Equation 6) and (Equation 7) (Table 2). As a result, the NITE BP-1087 strain was found to be a yeast that does not have vanillin resistance or acetone resistance.
  • Saccharomyces cerevisiae NITE BP-1089 Strain Saccharomyces cerevisiae NITE BP-1089, which is a low pH-resistant yeast strain described in WO2012 / 147903 The values were calculated according to (Equation 6) and (Equation 7) (Table 2). As a result, the NITE BP-1089 strain was found to be a yeast having no vanillin resistance and acetone resistance.
  • Saccharomyces cerevisiae NBRC10505 strain which is a yeast that does not have vanillin resistance or acetone resistance, as an ethanol-fermenting microorganism, and glucose as a fermentation material YPAD medium for continuous fermentation was used.
  • the composition of the YPAD medium for continuous fermentation was 1% (w / v) yeast extract, 2% (b / v) bactopeptone, 8% (w / v) glucose, and 0.04% (w / v) adenine. .
  • Saccharomyces cerevisiae NBRC10505 strain was inoculated into a 5 ml preculture medium shown in Table 3 in a test tube and cultured overnight with shaking (pre-culture).
  • the obtained culture solution was inoculated into 50 ml of a fresh preculture medium, and cultured with shaking in a 500 ml Sakaguchi flask at a temperature of 30 ° C. for 8 hours (preculture).
  • the preculture was inoculated into 2 L of YPAD medium for continuous fermentation (adjusted to pH 3.5 with 4N KOH before inoculation), and batch fermentation was performed under the following conditions (Table 4).
  • the yield was calculated according to (Equation 1).
  • Saccharomyces cerevisiae NBRC10505 strain produced ethanol without residual sugar in batch fermentation (pH 3).
  • Fermentation reactor capacity 2 (L) Fermentation reactor capacity: 1.5 (L) Temperature adjustment: 30 (° C) Aeration volume of fermentation reaction tank: 50 (mL / min) Fermentation reactor stirring speed: 400 (rpm) pH adjustment: adjusted to pH 3 with 4N KOH Sterilization: All culture tanks and culture media used are autoclaved at 121 ° C for 20 min under high pressure steam sterilization.
  • Candida pinnariae NBRC10307 strain which is a yeast that does not have vanillin resistance or acetone resistance, was used. Batch fermentation was performed under conditions to produce ethanol (Table 4). As a result, it was confirmed that Candida pinnariae NBRC10307 strain produced ethanol without residual sugar in batch fermentation (pH 3).
  • Pichia Stippitis BCRC 21777 Production of Ethanol by Batch Fermentation (pH 3) of Pichia Stippitis BCRC 21777 Strain Pichia Stippitis BCRC 21777, which is a vanillin-resistant yeast but not an acetone-resistant yeast, is used as an ethanol-fermenting microorganism. Batch fermentation was performed under the conditions described above to produce ethanol (Table 4). As a result, it was confirmed that Pichia stippitis BCRC 21777 strain produced ethanol without residual sugar in batch fermentation (pH 3).
  • Saccharomyces cerevisiae NBRC10505 strain ethanol production by separation membrane-based continuous fermentation (pH 3)
  • Saccharomyces cerevisiae NBRC10505 strain which is a yeast not having vanillin resistance and acetone resistance, was used as a medium.
  • Continuous culture using a separation membrane was performed using a YPAD medium for continuous fermentation having the same glucose as that of Reference Example 21 as the main ingredient of the fermentation raw material.
  • a hollow fiber form was adopted as the separation membrane element.
  • the composition of the YPAD medium for continuous fermentation was 1% yeast extract, 2% bactopeptone (w / v), 8% glucose (w / v), and 0.04% adenine (w / v).
  • Saccharomyces cerevisiae NBRC10505 strain was inoculated into a 5 ml preculture medium shown in Table 2 in a test tube and cultured overnight with shaking (previously cultured).
  • the obtained culture solution was inoculated into 50 ml of a fresh preculture medium, and cultured with shaking in a 500 ml Sakaguchi flask at a temperature of 30 ° C. for 8 hours (pre-culture).
  • Pre-culture medium was inoculated into 1.5 L YPAD medium for continuous fermentation (adjusted to pH 3 with 4N KOH before inoculation) in a continuous fermentation apparatus, and the fermentation reaction tank was stirred at 400 rpm with the attached stirrer. The aeration amount of the fermentation reaction tank, the temperature, and the pH were adjusted and cultured for 19 hours (pre-culture). Immediately after completion of the pre-culture, the fermenter circulation pump is operated, the medium is continuously supplied, and the filtration amount of the culture solution is controlled so that the amount of the fermentation solution in the continuous fermentation apparatus is 1.5 L under the following conditions. Ethanol was produced by continuous culture for 250 hours (Table 5). The yield was calculated according to (Equation 1).
  • Fermentation reactor capacity 2 (L) Separation membrane used: Polyvinylidene fluoride filtration membrane membrane separation element Effective filtration area: 473 (cm 2 ) Temperature adjustment: 30 (° C) Aeration volume of fermentation reaction tank: 50 (mL / min) Fermentation reactor stirring speed: 400 (rpm) pH adjustment: adjusted to pH 3 with 4N KOH Extraction amount of fermentation broth: 5.5 (L / Day) Sterilization: The culture tank containing the separation membrane element and the medium used are all autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes and autoclaved.
  • the membrane used was a membrane having the following properties, and the transmembrane pressure difference during filtration was changed between 0.1 and 19.8 kPa.
  • Average pore diameter 0.1 ⁇ m Standard deviation of average pore diameter: 0.035 ⁇ m
  • Film surface roughness 0.06 ⁇ m
  • Pure water permeability coefficient 50 ⁇ 10 ⁇ 9 m 3 / m 2 / s / pa.
  • FIG. 1 shows the residual sugar concentration of the culture solution during pre-culture and the residual sugar concentration in the filtrate from the start to the end of continuous fermentation using a separation membrane.
  • Comparative Example 2 Production of Ethanol by Separation Membrane Continuous Fermentation (pH 3) of Candida Pinnariae NBRC10307 Strain
  • Candida Pinnariae NBRC10307 which is a yeast that does not have vanillin resistance or acetone resistance, was used as Comparative Example 1
  • 230-hour continuous fermentation using a separation membrane was performed to produce ethanol (Table 5).
  • FIG. 1 shows the residual sugar concentration of the culture solution during pre-culture and the residual sugar concentration in the filtrate from the start to the end of continuous fermentation using a separation membrane.
  • FIG. 1 shows the residual sugar concentration of the culture solution during pre-culture and the residual sugar concentration in the filtrate from the start to the end of continuous fermentation using a separation membrane.
  • FIG. 1 shows the residual sugar concentration of the culture solution during pre-culture and the residual sugar concentration in the filtrate from the start to the end of continuous fermentation using a separation membrane.
  • the Pichia mexicana NBRC 10320 strain produced a large amount of residual sugar in the filtrate that was not consumed during continuous fermentation using a separation membrane (pH 3), resulting in a decrease in production efficiency. It was found that it is necessary to use a strain having vanillin resistance in order to suppress residual sugar under the condition of continuous fermentation using a separation membrane (pH 3) and to efficiently produce a chemical product.
  • Example 1 Production of Ethanol by Separation Membrane Continuous Fermentation (pH 3) of Saccharomyces cerevisiae NBRC2260 Strain Saccharomyces cerevisiae NBRC2260 strain, which is a vanillin-resistant and acetone-resistant yeast, was used as an ethanol-fermenting microorganism. Separation membrane utilization continuous fermentation was performed for 240 hours under the conditions to produce ethanol (Table 5).
  • FIG. 1 shows the residual sugar concentration of the culture solution during pre-culture and the residual sugar concentration in the filtrate from the start to the end of continuous fermentation using a separation membrane. As a result, it was found that Saccharomyces cerevisiae NBRC2260 strain can remarkably suppress residual sugar immediately after the start of continuous fermentation and can produce ethanol efficiently.
  • Example 2 Production of ethanol by continuous fermentation (pH 3) using a separation membrane of Krivellomyces marukinus NBRC272 strain
  • a separation membrane of Krivellomyces marukinus NBRC272 strain As a ethanol-fermenting microorganism, vanillin-resistant yeast and acetone-resistant yeast Kriveromyces marukinus NBRC272 strain was used, as in Comparative Example 1. Separation membrane-utilized continuous fermentation was performed for 220 hours under the above conditions to produce ethanol (Table 5).
  • FIG. 1 shows the residual sugar concentration of the culture solution during pre-culture and the residual sugar concentration in the filtrate from the start to the end of continuous fermentation using a separation membrane.
  • Krivellomyces marukinus NBRC272 strain can remarkably suppress residual sugar immediately after the start of continuous fermentation and can produce ethanol efficiently.
  • Example 3 Production of Ethanol by Separation Membrane Continuous Fermentation (pH 3) of Candida Tropicals NBRC199 Strain
  • Candida tropicals NBRC199 strain which is a vanillin-resistant yeast and an acetone-resistant yeast, was used as Comparative Example 1
  • the ethanol was produced by performing continuous fermentation using a separation membrane for 250 hours under the same conditions as in Table 5 (Table 5).
  • FIG. 1 shows the residual sugar concentration of the culture solution during pre-culture and the residual sugar concentration in the filtrate from the start to the end of continuous fermentation using a separation membrane.
  • the Candida tropicals NBRC199 strain can remarkably suppress residual sugar immediately after the start of continuous fermentation and can produce ethanol efficiently.
  • Example 4 Production of Ethanol by Separation Membrane Continuous Fermentation (pH 3) of Lindnera Meirae NBRC10858 Strain
  • the same as that of Comparative Example 1 was used. Separation membrane-use continuous fermentation was performed for 230 hours under the above conditions to produce ethanol (Table 5).
  • FIG. 2 shows the residual sugar concentration of the culture solution during the preculture and the residual sugar concentration in the filtrate from the start to the end of continuous fermentation using the separation membrane.
  • Lindnera meirae NBRC10858 strain can remarkably suppress residual sugar immediately after the start of continuous fermentation and can produce ethanol efficiently.
  • Example 5 Production of Ethanol by Separation Membrane Utilization Continuous Fermentation (pH 3) of Lindnera Fabiani NBRC1253 Strain
  • Lindnera Fabiani NBRC1253 strain which is a vanillin-resistant yeast and an acetone-resistant yeast, is used. Separation membrane-use continuous fermentation was performed for 230 hours under the above conditions to produce ethanol (Table 5).
  • FIG. 2 shows the residual sugar concentration of the culture solution during the preculture and the residual sugar concentration in the filtrate from the start to the end of continuous fermentation using the separation membrane.
  • Example 6 Production of Ethanol by Separation Membrane Continuous Fermentation (pH 3) of Candida methanosorbosa BCRC21489 Strain
  • Candida methanosorbosa BCRC21489 which is vanillin-resistant yeast and acetone-resistant yeast, was used as an ethanol-fermenting microorganism as in Comparative Example 1.
  • Separation membrane-use continuous fermentation was performed for 230 hours under the above conditions to produce ethanol (Table 5).
  • FIG. 2 shows the residual sugar concentration of the culture solution during the preculture and the residual sugar concentration in the filtrate from the start to the end of continuous fermentation using the separation membrane.
  • the Candida methanosorbosa BCRC21489 strain having vanillin resistance and acetone resistance can remarkably suppress residual sugar immediately after the start of continuous fermentation and can efficiently produce ethanol.
  • Example 7 Production of Ethanol by Separation Membrane Continuous Fermentation (pH 3) Using Pichia Stippitis BCRC21777 Strain Pichia Stippitis BCRC21777, which is a vanillin-resistant yeast but not an acetone-resistant yeast, was used as a comparative example.
  • the continuous fermentation using a separation membrane for 230 hours was performed under the same conditions as in No. 1 to produce ethanol (Table 5).
  • FIG. 2 shows the residual sugar concentration of the culture solution during the preculture and the residual sugar concentration in the filtrate from the start to the end of continuous fermentation using the separation membrane.
  • the Pichia Stipitis BCRC21777 strain produced residual sugar in the filtrate immediately after the start of continuous fermentation. However, if continuous fermentation was continued thereafter, residual sugar could be remarkably suppressed, producing ethanol efficiently. It turns out that you can.
  • Example 8 Production of Ethanol by Separation Membrane Utilization Continuous Separation (pH 3) of Candida voidini BCRC22528 Strain
  • Candida voidinii BCRC22528 strain which is a vanillin-resistant and acetone-resistant yeast, was used, as in Comparative Example 1.
  • Separation membrane utilization continuous fermentation was performed under conditions for 230 hours to produce ethanol (Table 5).
  • FIG. 2 shows the residual sugar concentration of the culture solution during the preculture and the residual sugar concentration in the filtrate from the start to the end of continuous fermentation using the separation membrane.
  • FIG. 2 shows the residual sugar concentration of the culture solution during the preculture and the residual sugar concentration in the filtrate from the start to the end of continuous fermentation using the separation membrane.
  • Saccharomyces cerevisiae NBRC10505 strain which is a yeast not having vanillin resistance or acetone resistance, as an ethanol fermentation microorganism
  • continuous fermentation using a separation membrane for 200 hours was performed under the same conditions as in Comparative Example 1 except that the pH was not adjusted to 3 and the pH was adjusted to 5 to produce ethanol (Table 6).
  • Saccharomyces cerevisiae NBRC10505 strain produced ethanol efficiently in continuous fermentation using a separation membrane (pH 5).
  • Saccharomyces cerevisiae NITE BP-1087 strain which is a yeast not having vanillin resistance or acetone resistance, was used. Batch fermentation was performed under the same conditions as in Reference Example 21 to produce lactic acid (Table 8). As a result, it was confirmed that Saccharomyces cerevisiae NITE BP-1087 strain produced lactic acid without residual sugar in batch fermentation (pH 3).
  • Saccharomyces cerevisiae NITE BP-1089 strain which is a yeast not having vanillin resistance or acetone resistance, was used. Batch fermentation was performed under the same conditions as in Reference Example 21 to produce lactic acid (Table 8). As a result, it was confirmed that Saccharomyces cerevisiae NITE BP-1089 strain produced lactic acid without residual sugar in batch fermentation (pH 3).
  • Saccharomyces cerevisiae NBRC10505 / ⁇ PDC1 LDH strain produced residual sugars in continuous fermentation using a separation membrane (pH 3), resulting in a decrease in production efficiency.
  • Example 9 Production of lactic acid by continuous fermentation (pH 3) using Saccharomyces cerevisiae NBRC2260 / ⁇ PDC1 :: LDH strain
  • Saccharomyces cerevisiae NBRC2260 / ⁇ PDC1 which is a vanillin-resistant and acetone-resistant yeast.
  • Lactic acid was produced by performing continuous fermentation using a separation membrane for 200 hours under the same conditions as in Comparative Example 1 except that 5N Ca (OH) 2 was used to adjust the pH of the preculture using the LDH strain (Table 7). ).
  • Saccharomyces cerevisiae NBRC10505 strain which is a yeast not having vanillin resistance or acetone resistance, was used to adjust the pH to 3 Except for 0.5, batch fermentation was performed under the same conditions as in Reference Example 37 to produce ethanol (Table 9). As a result, it was confirmed that Saccharomyces cerevisiae NBRC10505 strain produced lactic acid without residual sugar in batch fermentation (pH 3.5).
  • Reference Example 40 Production of ethanol by batch fermentation (pH 3.5) of Saccharomyces cerevisiae NBRC2260 strain Using Saccharomyces cerevisiae NBRC2260 strain, which is a vanillin-resistant and acetone-resistant yeast, as an ethanol-fermenting microorganism, the pH adjustment was adjusted to 3.5. Except that, batch fermentation was performed under the same conditions as in Reference Example 37 to produce ethanol (Table 9). As a result, it was confirmed that Saccharomyces cerevisiae NBRC 2260 strain produced lactic acid without residual sugar in batch fermentation (pH 3.5).
  • Comparative Example 8 Production of Ethanol by Separation Membrane Continuous Fermentation (pH 3.5) of Saccharomyces cerevisiae NBRC10505 Strain Saccharomyces cerevisiae NBRC10505, a yeast that does not have vanillin resistance or acetone resistance, was used as an ethanol fermentation microorganism. The ethanol was produced by performing continuous fermentation using a separation membrane for 225 hours under the same conditions as in Comparative Example 1 except that the pH was adjusted to 3.5 (Table 9). As a result, it was found that Saccharomyces cerevisiae NBRC10505 strain produced residual sugars in continuous fermentation using a separation membrane (pH 3.5), resulting in a decrease in production efficiency.
  • Example 10 Production of Saccharomyces cerevisiae NBRC2260 strain by continuous fermentation using a separation membrane (pH 3.5) Saccharomyces cerevisiae NBRC2260 strain, which is a vanillin-resistant and acetone-resistant yeast, was used as an ethanol-fermenting microorganism. Except for adjusting to 5, continuous fermentation using a separation membrane for 260 hours was performed under the same conditions as in Comparative Example 1 to produce ethanol (Table 9). As a result, it was found that residual sugar can be remarkably suppressed and ethanol can be produced efficiently.
  • a separation membrane pH 3.5
  • Saccharomyces cerevisiae NBRC10505 strain produced residual sugar in continuous fermentation using a separation membrane (sugar supply rate 2 g / (L ⁇ hr)), resulting in a decrease in production efficiency.
  • Saccharomyces cerevisiae NBRC10505 strain produced residual sugar in continuous fermentation using a separation membrane (sugar supply rate of 4 g / (L ⁇ hr)), resulting in a decrease in production efficiency.
  • Saccharomyces cerevisiae NBRC10505 strain produced residual sugar in continuous fermentation using a separation membrane (sugar supply rate of 8 g / (L ⁇ hr)), resulting in a decrease in production efficiency.
  • Saccharomyces cerevisiae NBRC10505 strain produced residual sugar in continuous fermentation using a separation membrane (sugar supply rate of 10 g / (L ⁇ hr)), resulting in a decrease in production efficiency.
  • Example 11 Production of ethanol by continuous fermentation (pH 3, sugar supply rate 2 g / (L ⁇ hr)) of Saccharomyces cerevisiae NBRC2260 strain Saccharomyces cerevisiae which is a vanillin resistant and acetone resistant yeast as an ethanol fermentation microorganism
  • Saccharomyces cerevisiae NBRC2260 strain Saccharomyces cerevisiae which is a vanillin resistant and acetone resistant yeast as an ethanol fermentation microorganism
  • a NBRC10505 strain a continuous fermentation using a separation membrane for 195 hours was performed under the same conditions as in Comparative Example 1 except that the extraction rate was set to 0.9 L / day and the sugar supply rate was set to 2 g / (L ⁇ hr).
  • To produce ethanol Table 11).
  • Saccharomyces cerevisiae NBRC2260 strain can remarkably suppress residual sugar and can produce ethanol efficiently.
  • Example 12 Production of ethanol by continuous fermentation (pH 3, sugar supply rate 4 g / (L ⁇ hr)) of Saccharomyces cerevisiae NBRC2260 strain
  • Saccharomyces cerevisiae which is a yeast resistant to vanillin and acetone.
  • a continuous fermentation using a separation membrane for 195 hours was performed under the same conditions as in Comparative Example 1 except that the extraction rate was set to 1.8 L / day and the sugar supply rate was set to 4 g / (L ⁇ hr).
  • Table 11 To produce ethanol (Table 11). As a result, it was found that residual sugar can be remarkably suppressed and ethanol can be produced efficiently.
  • Example 13 Production of ethanol by continuous fermentation using a separation membrane of Saccharomyces cerevisiae NBRC2260 strain (pH 3, sugar supply rate 5 g / (L ⁇ hr)) Saccharomyces cerevisiae which is a vanillin resistant and acetone resistant yeast as an ethanol fermentation microorganism
  • Saccharomyces cerevisiae which is a vanillin resistant and acetone resistant yeast
  • separation membrane-based continuous fermentation for 210 hours was performed under the same conditions as in Comparative Example 1 except that the extraction rate was set to 2.25 L / day and the sugar supply rate was set to 5 g / (L ⁇ hr).
  • To produce ethanol Table 11). As a result, it was found that residual sugar can be remarkably suppressed and ethanol can be produced efficiently.
  • Example 14 Production of ethanol by continuous fermentation (pH 3, sugar feed rate 8 g / (L ⁇ hr)) of Saccharomyces cerevisiae NBRC2260 strain Saccharomyces cerevisiae which is a vanillin resistant and acetone resistant yeast as an ethanol fermentation microorganism Using the NBRC 2260 strain, a continuous fermentation using a separation membrane for 195 hours was performed under the same conditions as in Comparative Example 1 except that the extraction rate was set to 3.6 L / day and the sugar supply rate was set to 8 g / (L ⁇ hr). To produce ethanol (Table 11). As a result, it was found that residual sugar can be remarkably suppressed and ethanol can be produced efficiently.
  • Example 15 Production of ethanol by continuous fermentation (pH 3, sugar supply rate 10 g / (L ⁇ hr)) of Saccharomyces cerevisiae NBRC2260 strain
  • Saccharomyces cerevisiae which is a yeast resistant to vanillin and acetone.
  • NBRC2260 strain was used, and the separation membrane was used for continuous fermentation for 205 hours under the same conditions as in Comparative Example 1 except that the extraction rate was set to 4.5 L / day and the sugar supply rate was set to 10 g / (L ⁇ hr).
  • Table 11 To produce ethanol (Table 11). As a result, it was found that residual sugar can be remarkably suppressed and ethanol can be produced efficiently.

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Abstract

　ｐＨ３．５以下の条件下での分離膜を利用した連続発酵による化学品の製造方法において、バニリン耐性を有する酵母を用いることによって、発酵原料が多量に余ることなく、効率よく化学品を製造することができる。

Description

連続発酵による化学品の製造方法
　本発明は、低ｐＨ条件下における連続発酵による化学品の製造方法に関するものである。
　乳酸などの生分解性ポリマー原料やエタノールなどのバイオ燃料に代表されるバイオマス由来の化学品は、大気中への二酸化炭素の排出問題やエネルギー問題の顕在化と共にサスティナビリティー（持続可能性）およびライフサイクルアセスメント（ＬＣＡ）対応型製品として強い注目を浴びている。
　乳酸などの有機酸を微生物により生産する場合、生産された有機酸による培養液ｐＨの低下は、目的とする有機酸の生産性低下を引き起こすことから、中和剤によって培養液のｐＨを一定に保つ必要がある。例えば特許文献１には、酵母を培養して乳酸を製造する方法が開示されており、酵母の乳酸生産性を維持するためにアルカリ中和により培養液のｐＨを維持している。しかし、培養液を水酸化カルシウム等のアルカリ性物質で中和すると、添加するアルカリ性物質の量によっては後段の分離・精製工程において乳酸塩を乖離するために添加する硫酸等の酸性物質の影響で石膏等の副生成物が生じる場合があり、それにより乳酸の分離・精製工程が煩雑になり、製造コスト高の要因になってしまう。すなわち、中和剤を使用する際は、中和剤そのものの原材料に加えて不要な石膏等の副生成物の除去・廃棄にさらなる費用がかかる。また、乳酸以外の有機酸においても、培養する際には培養液のｐＨを一定に保つために水酸化ナトリウムなどの中和剤が使用されている。そのため、細菌よりも低ｐＨに耐性のある酵母を用いた有機酸生産の検討が行われている。これは、酵母は細菌よりも低いｐＨで培養できるため、その分の中和剤の使用が低減できるからである。あるいは、低ｐＨに耐性を持つ微生物の改良が行われている。例えば特許文献３、特許文献４では、乳酸耐性を持つ変異株を用いた乳酸製造方法が開示されている。
　有機酸以外にエタノールなど他の化学品を生産する場合においても、低ｐＨで培養を行う場合がある。例えば特許文献２では、バイオマス資源を硫酸等の酸で加水分解した糖液を原料として酵母によるエタノール発酵を行う際にｐＨの調節が不要になり、さらに低ｐＨでは雑菌汚染のリスクが軽減されるため培地や発酵装置の殺菌が不要になることが記載されている。
　一般に、微生物の培養方法としてはバッチ培養法、フェドバッチ培養法または連続培養法などが用いられるが、特許文献５では分離膜を用いた連続培養方法によりも発酵産物の生産速度や収率が向上することが開示されている。
特開２００９－１７１８７９号公報 特開２００４－３４４０８４号公報 特開２０１０－１１５１１２号公報 ＷＯ２０１２／１４７９０３号 ＷＯ２００７／０９７２６０号
　上述したように特許文献５では、乳酸発酵微生物として乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を染色体中に導入したサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＢＲＣ１０５０５株、またはエタノール発酵微生物としてＮＢＲＣ１０５０５株を使用し、培養液をｐＨ５に調整しながら分離膜を用いた連続発酵することによる乳酸またはエタノールの製造方法が開示されており、乳酸またはエタノールは発酵原料である糖が余ることなく連続的に生産されている。
　しかしながら、本発明者は、低ｐＨ（ｐＨ３．５以下）条件下で特許文献５と同様の分離膜を用いた連続発酵を行うと、糖消費が非常に遅くなり、糖が消費されずに多量に余るという新たな課題を見出した。糖などの発酵原料が多量に余ると発酵に投じた発酵原料に対する生産物の収率が低下し、生産物のコストが高くなるばかりか、後の精製工程において発酵原料を除く負担が過度になるなどコスト面で悪影響が生じる。
　本発明者は鋭意検討した結果、分離膜を用いた連続発酵による化学品の製造方法において、バニリンに対して耐性を有する酵母を使用することで上記課題を解決できることを見出し、本発明に至った。
　すなわち、本発明は以下の（１）～（５）の通りである。
（１）酵母の培養液を分離膜で濾過し、未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を培養液に追加してｐＨ３．５以下の条件で連続発酵する化学品の製造方法であって、前記酵母として、以下の条件（ａ）下で得られる培養液の６００ｎｍにおける吸光度が、以下の条件（ｂ）下で得られる培養液の６００ｎｍにおける吸光度の２０％以上である酵母を用いる、化学品の製造方法。
条件（ａ）：バニリン（終濃度１ｇ／Ｌ）入りのＹＰＡＤ培地（培養開始時の６００ｎｍにおける吸光度が０．２）で４０時間培養する。
条件（ｂ）：バニリンを含まないＹＰＡＤ培地とする以外は条件（ａ）と同様に培養する。
（２）前記酵母として前記条件（ａ）下で得られる培養液の６００ｎｍにおける吸光度が、前記条件（ｂ）下で得られる培養液の６００ｎｍにおける吸光度の５０％以上である酵母を用いる、（１）に記載の化学品の製造方法。
（３）前記酵母として、以下の条件（ｃ）下で得られる培養液の６００ｎｍにおける吸光度が、以下の条件（ｄ）下で得られる培養液の６００ｎｍにおける吸光度の２０％以上である酵母を用いる、（１）または（２）に記載の化学品の製造方法。
条件（ｃ）：アセトン４％（ｖ／ｖ）入りのＹＰＡＤ培地（培養開始時の６００ｎｍにおける吸光度が０．２）で４０時間培養する。
条件（ｄ）：アセトンを含まないＹＰＡＤ培地とする以外は条件（ｃ）と同様に培養する。
（４）前記発酵原料の供給速度が４ｇ／（Ｌ・ｈｒ）以上である、（１）から（３）のいずれかに記載の化学品の製造方法。
（５）前記化学品が有機酸またはアルコールである、（１）または（４）のいずれかに記載の化学品の製造方法。
　本発明によれば、ｐＨ３．５以下の条件下で分離膜を用いた連続発酵をおこなっても、濾液中に発酵原料が多量に余ることなく、効率よく化学品を製造することができる。
図１は、比較例１から３、実施例１から３での前培養中の培養液の残糖濃度と、分離膜利用連続発酵開始から終了時までの濾液中の残糖濃度を示す。０時間は分離膜利用連続発酵開始時間を示し、それより前の時間は前培養期間（１９時間）を示す。 図２は、実施例４から８での前培養中の培養液の残糖濃度と、分離膜利用連続発酵開始から終了時までの濾液中の残糖濃度を示す。０時間は分離膜利用連続発酵開始時間を示し、それより前の時間は前培養期間（１９時間）を示す。
　まず、本発明で使用する酵母について説明する。
　本発明に使用するバニリンに耐性を有する酵母（以下、バニリン耐性酵母、という。）は、以下の条件（ａ）下での培養液の吸光度と、以下の条件（ｂ）下での培養液の吸光度と比較した試験（以下、バニリン耐性試験、という。）の結果、条件（ａ）下での培養液の吸光度が、以下の条件（ｂ）下での培養液の吸光度の２０％以上であることを特徴とし、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは５０％以上、さらにより好ましくは６０％以上、特に好ましくは７０％以上、最も好ましくは８０％以上である。
条件（ａ）：バニリン（終濃度１ｇ／Ｌ）入りのＹＰＡＤ培地（培養開始時の６００ｎｍにおける吸光度が０．２）で４０時間培養する。
条件（ｂ）：バニリンを含まないＹＰＡＤ培地とする以外は条件（ａ）と同様に培養する。
　メカニズムは不明であるが、バニリン耐性酵母はｐＨ３．５以下の分離膜を用いた連続発酵においても発酵原料が多量に余ることなく化学品が生産できる。なお、発酵原料が多量に余るとは、培養液を分離膜で濾過して得られた濾液中に発酵原料が消費されず残存している状態である。濾液中に発酵原料が多量に余ると、発酵に投じた発酵原料に対する生産物の収率が低下し、生産物のコストが高くなるばかりか、精製段階で発酵原料を除去する負担が増加するため、濾液に残存する発酵原料は、少ないほど好ましい。
　バニリン耐性試験の条件（ａ）および（ｂ）について詳細に説明する。条件（ａ）および（ｂ）での培養開始は６００ｎｍにおける吸光度が０．２（ＯＤ６００ｎｍ＝０．２）となるように調整する。その方法は特に限定されないが、前培養により酵母菌体を増殖させ、培養液の吸光度を測定し、本培養液でＯＤ６００ｎｍ＝０．２になるように植菌量を調整する方法、または、菌体を寒天プレートに生育させ、ＯＤ６００ｎｍ＝０．２になるように寒天プレートからの植菌量を調整する方法が挙げられる。
　バニリン耐性試験の培養に使用する培地はＹＰＡＤ培地を使用する。ここでいうＹＰＡＤ培地の組成は、酵母エキス１％（ｗ／ｖ）、バクトペプトン２％（ｗ／ｖ）、グルコース２％（ｗ／ｖ）、アデニン０．０４％（ｗ／ｖ）を含む培地である。
　条件（ａ）で使用するバニリン（終濃度１ｇ／Ｌ）のＹＰＡＤ培地の調整は、滅菌済のＹＰＡＤ培地にバニリン濃縮液を添加することが好ましい。バニリン濃縮液は１００から２００ｇ／Ｌに調整することが好ましいが、２００ｇ／Ｌに調整することが最も好ましい。これはバニリンを溶かす有機溶媒による増殖の影響をできるだけ低減するためである。また、バニリンを溶かす有機溶媒はＤＭＳＯを使用するのが良い。例えばバニリン濃縮液（２００ｇ／Ｌ）を作成したとすると、バニリンを含むＹＰＡＤ培地の作成は、５ｍｌのＹＰＡＤ培地に対し、バニリン濃縮液を２５μｌ入れると良い。ここで、バニリン無添加のＹＰＡＤ培地にはＤＭＳＯのみを２５μｌ入れるのが良い。これはＤＭＳＯによる増殖への影響を考慮するためである。
　本発明で使用するバニリン耐性酵母は、さらにアセトン耐性を有することが好ましい。バニリン耐性且つアセトン耐性を有する酵母を使用することで、ｐＨ３．５以下の分離膜を用いた連続発酵で得られる濾液中に残存する発酵原料をさらに低減することができ、より効率的に化学品を生産することができる。
　本発明に使用するアセトンに耐性を有する酵母（以下、アセトン耐性酵母、という。）は、以下の条件（ｃ）下での培養液の吸光度と、以下の条件（ｄ）下での培養液の吸光度と比較した試験（以下、アセトン耐性試験、という。）の結果、条件（ｃ）下での培養液の吸光度が、条件（ｄ）下での培養液の吸光度の２０％以上であることを特徴とし、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上である。
条件（ｃ）：アセトン４％（ｖ／ｖ）入りのＹＰＡＤ培地（培養開始時の６００ｎｍにおける吸光度が０．２）で４０時間培養する。
条件（ｄ）：アセトンを含まないＹＰＡＤ培地とする以外は条件（ｃ）と同様に培養する。
　アセトン耐性試験の条件（ｃ）および（ｄ）について詳細に説明する。条件（ｃ）および（ｄ）での培養開始は６００ｎｍにおける吸光度が０．２（ＯＤ６００ｎｍ＝０．２）となるように調整する。
　アセトン耐性試験の培養に使用する培地はＹＰＡＤ培地を使用する。
　条件（ｃ）で使用するアセトン４％（ｖ／ｖ）入りのＹＰＡＤ培地の調整は、滅菌済のＹＰＡＤ培地にアセトンを添加することが好ましい。
　条件（ａ）～（ｄ）の培養温度は、酵母菌体が十分に増殖する温度条件であれば特に限定されないが、２８～３０℃が好ましく、３０℃がより好ましい。
　条件（ａ）～（ｄ）での培養液の吸光度の測定に使用する分光光度計は特に制限はないが、条件（ａ）～（ｄ）では同じ分光光度計で測定する必要がある。
　本発明で用いられるバニリン耐性酵母（およびバニリン耐性且つアセトン耐性酵母）は、当業者に公知の酵母株からバニリン耐性試験（およびアセトン耐性試験）のスクリーニングにより選択することができ、具体例としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＢＲＣ２２６０株、クリベロマイセス・マルキアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｍａｒｘｉａｎｕｓ）ＮＢＲＣ２７２株、カンジダ・トロピカルス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）ＮＢＲＣ１９９株、リンドネラ・メイラエ（Ｌｉｎｄｎｅｒａ　ｆａｂｉｎｉｉ）ＮＢＲＣ１０８５８株、リンドネラ・ファビアニ（Ｌｉｎｄｎｅｒａ　ｆａｂｉａｎｉｉ）ＮＢＲＣ１２５３株、カンジダ・メタノソルボーサ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａ）ＢＣＲＣ２１４８９株、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ　ｓｔｉｐｉｔｉｓ）ＢＣＲＣ２１７７７株、カンジダ・ボイジニ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｂｏｉｄｉｎｉｉ）ＢＣＲＣ２２５２８株が挙げられる。また、バニリン耐性（およびアセトン耐性）のない酵母に当業者に公知の変異処理をすることによってバニリン耐性試験（およびアセトン耐性試験）の結果が２０％以上となった酵母についても、当然ながら本明細書でいうところのバニリン耐性酵母（およびバニリン耐性且つアセトン耐性酵母）に相当する。
　次に、分離膜を用いた連続発酵による化学品の製造方法について説明する。
　本発明の化学品の製造方法において使用する発酵原料としては、酵母が資化可能な炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該酵母の培養を効率的に行うことができるものであれば、天然培地、合成培地のいずれも使用することができる。具体的には、炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、ガラクトース、マルトース、ラフィノース、トレハロース、ソルボース、セロビオース、ラクトース、メリビオース、メレジトース、イヌリン、キシロース、アラビノース、リボース、ラムノース、グルコサミン、エリスリトール、リビトール、マンニトール、グルシトール、サリシン、スターチ、デンプン等の炭水化物またはその加水分解物、バイオマス由来のセルロースなどからの糖化液、からなる群から選択される1種類または２種類以上の、いわゆる糖類を発酵原料の主成分として使用することが好ましい。また、酢酸、プロピオン酸、クエン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコールなどの炭素源も発酵原料の主成分として用いることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物の他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等を用いることができる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどを用いることができる。これら炭素源、窒素源、無機塩類等は、培養開始時に一括して添加しても良いし、培養中分割して、または連続的に添加することもできる。
　本発明で使用される酵母が生育のために特定の栄養素を必要とする場合には、その栄養物を標品もしくはそれを含有する天然物として添加することができる。また、消泡剤も必要に応じて使用することができる。
　本発明において、培養液とは、微生物が発酵原料を資化して増殖した結果得られる液のことを言う。追加する発酵原料の組成は、目的とする化学品の生産性が高くなるように、培養開始時の発酵原料組成から適宜変更しても良い。
　発酵原料として糖類を主成分とする場合の総糖濃度は特に制限されず、酵母による化学品の生産を阻害しない範囲であれば可能な限り高い濃度であればよく、具体的には、１５～５００ｇ／Ｌが好ましく、２０～３００ｇ／Ｌがより好ましい。
　化学品の生産効率は、微生物に資化された発酵原料の主成分に対する生産された化学品の収率で評価することができるが、本明細書では、次の式（１）で計算される値を収率として評価する。
　収率（ｇ／ｇ）＝全生産物量（ｇ）÷｛全投入発酵原料（ｇ）－未利用発酵原料（ｇ）｝×１００・・・（式１）。
　ここで、全投入発酵原料とは発酵に投じられた発酵原料の主成分の総量を表し、未利用発酵原料とは発酵終了時に消費されずに残存している発酵原料の主成分の総量を表し、具体的には、バッチ発酵であれば発酵終了時に微生物に資化されずに培養液中に残存した発酵原料の主成分、連続発酵であれば培養液を分離膜で濾過した濾液中に残存した発酵原料の主成分を表す。全生産物量とは化学品の全生産量（ｇ）である。
　連続発酵中の発酵原料の供給速度については特に制限はされないが、４g／（Ｌ・ｈｒ）以上であることが好ましい。発酵原料の供給速度がこれよりも低くなると発酵原料の残存を抑制するという本発明の効果が薄れてしまう場合があるからである。ここで、発酵原料供給速度は、次の式（１）で計算される。
　発酵原料供給速度（g／（Ｌ・ｈｒ））＝培地中の発酵原料濃度（ｇ／Ｌ）×発酵槽に送られる発酵原料供給速度（Ｌ／ｈｒ）÷装置の運転液量（Ｌ）・・・（式２）。
　本発明に用いる分離膜については特に制限はなく、微生物の撹拌型培養器あるいは撹拌型バイオリアクターによる培養で得られた培養液を微生物から分離濾過する機能を有するものであればよく、例えば多孔質セラミック膜、多孔質ガラス膜、多孔質有機高分子膜、金属繊維編織体、不織布などを用いることができる。これらの中で特に多孔質有機高分子膜もしくはセラミック膜が好適である。
　分離膜は、阻止性能および透水性能や分離性能、例えば、耐汚れ性の点から、多孔質樹脂層を含む分離膜であることが好ましい。
　多孔質樹脂層を含む分離膜は、好ましくは、多孔質基材の表面に、分離機能層として作用とする多孔質樹脂層を有している。多孔質基材は、多孔質樹脂層を支持して分離膜に強度を与える。
　分離膜が、多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を有している場合、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していても、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していなくてもどちらでも良く、用途に応じて選択される。
　多孔質基材の平均厚みは、好ましくは５０μｍ以上３０００μｍ以下である。
　多孔質基材の材質は、有機材料および／または無機材料等からなり、有機繊維が望ましく用いられる。好ましい多孔質基材は、セルロース繊維、セルローストリアセテート繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維およびポリエチレン繊維などの有機繊維なる織布や不織布であり、より好ましくは、密度の制御が比較的容易であり製造も容易で安価な不織布が用いられる。
　多孔質樹脂層は、有機高分子膜を好適に使用することができる。有機高分子膜の材質としては、例えば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、セルロース系樹脂およびセルローストリアセテート系樹脂などが挙げられる。有機高分子膜は、これらの樹脂を主成分とする樹脂の混合物であってもよい。ここで主成分とは、その成分が５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上含有することをいう。有機高分子膜の材質は、溶液による製膜が容易で物理的耐久性や耐薬品性にも優れているポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂およびポリアクリロニトリル系樹脂が好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはそれを主成分とする樹脂が最も好ましく用いられる。
　ここで、ポリフッ化ビニリデン系樹脂としては、フッ化ビニリデンの単独重合体が好ましく用いられる。さらに、ポリフッ化ビニリデン系樹脂は、フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体との共重合体も好ましく用いられる。フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体としては、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレンおよび三フッ化塩化エチレンなどが例示される。
　分離膜は、発酵に使用される微生物が通過できなければよいが、発酵に使用される微生物の分泌物や発酵原料中の微粒子による目詰まりを起こりにくく、かつ、濾過性能が長期間安定に継続する範囲であることが望ましい。よって、分離膜の平均細孔径が、０.０１μｍ以上５μｍ未満であることが好ましい。また、分離膜の平均細孔径が、０.０１μｍ以上１μｍ未満であると、微生物がリークすることのない高い排除率と、高い透水性を両立させることができ、透水性を長時間保持することが、より高い精度と再現性を持って実施することができる。
　微生物の大きさに近いと、これらが直接孔を塞いでしまう場合があるので、分離膜の平均細孔径は１μｍ未満であることが好ましい。分離膜の平均細孔径は、微生物の漏出、すなわち排除率が低下する不具合の発生を防止するため、微生物の大きさと比較して大きすぎないことが好ましい。微生物のうち、細胞の小さい細菌などを用いる場合には、平均細孔径として０.４μｍ以下が好ましく、０.２μｍ未満であればより好適に実施することができる。
　また、微生物が所望の生産物である化学品以外の物質、例えば、タンパク質や多糖類など凝集しやすい物質を生産する場合があり、更に、発酵培養液中の微生物の一部が死滅することにより細胞の破砕物が生成する場合があり、これらの物質による分離膜の閉塞を回避するために、平均細孔径は０．１μｍ以下であることがさらに好適である。
　分離膜の平均細孔径が小さすぎると分離膜の透水性能が低下し、膜が汚れていなくても効率的な運転ができなくなるため、分離膜の平均細孔径は、好ましくは０.０１μｍ以上であり、より好ましくは０．０２μｍ以上であり、さらに好ましくは０．０４μｍ以上である。
　ここで、平均細孔径は、倍率１０，０００倍の走査型電子顕微鏡観察における、９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔すべての直径を測定し、平均することにより求めることができる。平均細孔径は、あるいは、膜表面を走査型電子顕微鏡を用いて倍率１０,０００倍で写真撮影し、１０個以上、好ましくは２０個以上の細孔を無作為に選び、それら細孔の直径を測定し、数平均して求めることができる。細孔が円状でない場合、画像処理装置等によって、細孔が有する面積と等しい面積を有する円（等価円）を求め、等価円直径を細孔の直径とする方法により求めることができる。
　分離膜の平均細孔径の標準偏差σは、０．１μｍ以下であることが好ましい。平均細孔径の標準偏差σは小さければ小さい方が望ましい。平均細孔径の標準偏差σは、上述の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔数をＮとして、測定した各々の直径をＸｋとし、細孔直径の平均をＸ（ａｖｅ）とした下記の（式３）により算出される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　本発明で用いられる分離膜においては、発酵培養液の透過性が重要な性能の一つである。分離膜の透過性の指標として、使用前の分離膜の純水透過係数を用いることができる。分離膜の純水透過係数は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、５．６×１０－１０ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上であることが好ましく、純水透過係数が、５．６×１０－１０ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０－７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下であれば、実用的に十分な透過水量が得られる。
　本発明で用いられる分離膜において、表面粗さとは、表面に対して垂直方向の高さの平均値である。膜表面粗さは、分離膜表面に付着した微生物が、撹拌や循環ポンプによる液流による膜面洗浄効果で剥離しやすくするための因子の一つである。分離膜の表面粗さは、特に制限はなく、膜に付着した微生物、ならびにその他の固形物が剥がれる範囲であればよいが、０.１μｍ以下であることが好ましい。表面粗さが０．１μｍ以下であると、膜に付着した微生物、ならびにその他の固形物が剥がれやすくなる。
　さらに好ましくは、分離膜の膜表面粗さが０.１μｍ以下であり、平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満であり、分離膜の純水透過係数が２×１０－９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上の分離膜を使用することにより、膜面洗浄に必要な動力を過度に必要としない運転が、より容易に可能であることがわかった。分離膜の表面粗さを、０.１μｍ以下とすることにより、微生物の濾過において、膜表面で発生する剪断力を低下させることができ、微生物の破壊が抑制され、分離膜の目詰まりも抑制されることにより、長期間安定な濾過が、より容易に可能になる。また、分離膜の表面粗さを、０.１μｍ以下とすることにより、より低い膜間差圧で連続発酵が実施可能であり、分離膜が目詰まりした場合でも高い膜間差圧で運転した場合に比べて、洗浄回復性が良好である。分離膜の目詰まりを抑えることにより、安定した連続発酵が可能になることから、分離膜の表面粗さは小さければ小さいほど好ましい。
　ここで、分離膜の膜表面粗さは、下記の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）を使用して、下記の条件で測定したものである。
・装置　　原子間力顕微鏡装置（Digital Instruments（株）製“Nanoscope IIIa”）
・条件　　探針　　　　ＳｉＮカンチレバー（Digital Instruments（株）製）
　　　　　走査モード　コンタクトモード（気中測定）
　　　　　　　　　　　水中タッピングモード（水中測定）
　　　　　走査範囲　　１０μｍ、２５μｍ四方（気中測定）
　　　　　　　　　　　５μｍ、１０μｍ四方（水中測定）
　　　　　走査解像度　５１２×５１２
・試料調製　測定に際し膜サンプルは、常温でエタノールに１５分浸漬後、ＲＯ水中に２４時間浸漬し洗浄した後、風乾し用いた。ＲＯ水とは、濾過膜の一種である逆浸透膜（ＲＯ膜）を用いて濾過し、イオンや塩類などの不純物を排除した水を指す。ＲＯ膜の孔の大きさは、概ね２ｎｍ以下である。
　膜表面粗さｄｒｏｕｇｈは、上記の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）により各ポイントのＺ軸方向の高さから、下記の（式４）により算出する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　分離膜の形状は、好ましくは平膜である。分離膜の形状が平膜の場合、その平均厚みは用途に応じて選択される。分離膜の形状が平膜の場合の平均厚みは、好ましくは２０μｍ以上５０００μｍ以下であり、より好ましくは５０μｍ以上２０００μｍ以下である。
　また、分離膜の形状は、好ましくは中空糸膜である。分離膜が中空糸膜の場合、中空糸の内径は、好ましくは２００μｍ以上５０００μｍ以下であり、膜厚は、好ましくは２０μｍ以上２０００μｍ以下である。また、有機繊維または無機繊維を筒状にした織物や編物を中空糸の内部に含んでいても良い。
　なお、前述の分離膜は、例えばＷＯ２００７／０９７２６０号に記載される製造方法により製造することができる。
　また、別の好ましい形態として、本発明における分離膜は、少なくともセラミックスを含む膜であり得る。本発明におけるセラミックスとは金属酸化物を含有し、高温での熱処理により焼き固められたものをさす。金属酸化物としては、アルミナ、マグネシア、チタニア、ジルコニアなどが例示できる。分離膜は金属酸化物のみから形成されてもよく、シリカや炭化珪素、シリカと金属酸化物の化合物であるムライトやコージェライトなどを含んでもよい。
　分離膜を形成するセラミックス以外の成分は、分離膜としての多孔質体をなすことができるものであれば特に限定されない。
　分離膜がセラミックスを含む場合もその形状には特に制限はなく、モノリス膜、平膜、管状膜などいずれも用いることができる。容器内への充填効率の観点から柱状構造であり、長手方向に貫通孔を有する構造のものが好ましい。充填効率が上げられる点から、好ましくはモノリス膜である。
　長手方向に貫通孔を有することが好ましい理由は以下のとおりである。柱状構造を有する分離膜をモジュール容器に収めて分離膜モジュールとして用いる場合は、分離膜は外圧式および内圧式のうちから好適な態様を選択してモジュール化、濾過することが可能となる。本発明においては、これ以降、分離膜が発酵培養液と接する側を１次側、濾過により化学品を含む濾液が得られる側を２次側とそれぞれ呼ぶこととする。
　内圧式モジュールを用いると、１次側の流路が狭いため、クロスフロー濾過を行う場合に循環ポンプの出力が節約できる。さらに、分離膜表面に堆積した濁質をモジュール外に排出する作用が強くなり、分離膜表面が清浄に保たれやすいため好ましい。ただし、この効果を得るためには、内圧式の分離膜が発酵培養液の入り口および出口を有していることが前提となる。このときの入り口および出口は一直線に配された貫通孔の状態であると、通液抵抗が小さくなるため好ましい。さらに分離膜が柱状構造で、貫通孔が長手方向に空いていることによって、分離膜を収める容器を細くすることが可能となる。分離膜モジュールが細いと、製造や取り扱いの観点から好ましく用いることが出来る。
　分離膜の気孔率は特に限定されないが、低すぎると濾過効率が悪くなり、高すぎると強度が低下してしまう。濾過効率と分離膜の強度を両立させ、繰り返し蒸気滅菌への耐性も持たせるためには、２０％以上６０％以下であることが好ましい。
　なお気孔率は、以下の（式５）より決定される。
気孔率［％］＝１００×（湿潤膜重量[ｇ]－乾燥膜重量[ｇ]）／水比重[ｇ／ｃｍ３]／（膜体積［ｃｍ３］）・・・（式５）。
　分離膜の平均気孔径は０．０１μｍ以上１μｍ以下であれば好ましく、この範囲の平均気孔径を有する膜であれば分離膜が閉塞しにくく、かつ濾過効率にも優れる。また、平均気孔径が０．０２μｍ以上０．２μｍ以下の範囲であれば、タンパク質、多糖類などに例示される微生物や培養細胞による発酵の副生成物や、培養液中の微生物/培養細胞が死滅して生じる細胞破砕物といった、分離膜を閉塞させやすい物質の閉塞が起きにくくなるため特に好ましい。
　貫通孔を有する柱状構造の分離膜は、外表面が２次側となるため、濾過液を集めるためにモジュール容器を設け、モジュール容器内に分離膜を充填したモジュールとして用いることが好ましい。１本のモジュールに充填される分離膜は１本以上である。
　モジュール容器は、繰り返しの蒸気滅菌処理に耐えうる原料からなることが好ましい。蒸気滅菌処理に耐えうる原料としては、たとえばステンレス鋼や、平均気孔率の低いセラミックスなどが例示される。
　このようなセラミック膜モジュールは、例えばＷＯ２０１２／０８６７６３に記載される製造方法により製造することができるが、市販のものを利用することもできる。市販のものとして具体的に例示すると、ＭＥＭＢＲＡＬＯＸ精密ろ過膜（Ｐａｌｌ）、セラミック膜フィルターセフィルトＭＦ膜（日本ガイシ）などが挙げられる。
　本発明での連続発酵は、酵母の培養液を分離膜で濾過し未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ発酵原料を培養液に追加して濾過液中から生産物を回収する連続発酵であることを特徴とする。
　分離膜による濾過時の膜間差圧は特に制限されることはなく、発酵培養液を濾過できればよい。しかし、培養液を濾過するために、有機高分子膜において１５０ｋＰａより高い膜間差圧で濾過処理すると、有機高分子膜の構造が破壊される可能性が高くなり、化学品を生産する能力が低下することがある。また、０．１ｋＰａより低い膜間差圧では、発酵培養液の透過水量が十分得られない場合が多く化学品を製造するときの生産性が低下する傾向がある。したがって、本発明の化学品の製造方法では、有機高分子膜においては、濾過圧力である膜間差圧を好ましくは０．１ｋＰａから１５０ｋＰａの範囲とすることにより、発酵培養液の透過水量が多く、膜の構造の破壊による化学品製造能力の低下もないことから、化学品を生産する能力を高く維持することが可能である。膜間差圧は、有機高分子膜においては、好ましくは０.１ｋＰａ以上５０ｋＰａ以下の範囲であり、さらに好ましくは０.１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲である。
　酵母の発酵における温度は、用いる酵母に適した温度を設定すればよく、微生物が生育する範囲であれば特に限定されないが、温度が２０～７５℃の範囲で行われる。
　連続発酵における培養液のｐＨは４以下に調整する。培養液のｐＨは、無機あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウム、アンモニアガスなどによって、ｐＨ４以下の範囲内のあらかじめ定められた値に調節する。
　本発明の化学品の製造方法では、培養初期にバッチ培養またはフェドバッチ培養を行って微生物濃度を高くした後に、連続発酵（培養液の濾過）を開始しても良い。また、高濃度の菌体をシードし、培養開始とともに連続発酵を行っても良い。本発明の化学品の製造方法では、適当な時期から、培地供給および培養液の濾過を行うことが可能である。培地供給と培養液の濾過の開始時期は、必ずしも同じである必要はない。また、培地供給と培養液の濾過は連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。
　培養液中の微生物の濃度は、化学品の生産性を高い状態で維持することが効率よい生産性を得るのに好ましい。培養液中の微生物の濃度は、一例として、乾燥重量として、５ｇ／Ｌ以上に維持することで良好な生産効率が得られる。
　連続発酵の途中において必要に応じて、発酵槽内から微生物を含んだ培養液の一部を取り除いた上、培地で希釈することによって、培養槽内の微生物濃度を調整してもよい。例えば、発酵槽内の微生物濃度が高くなりすぎると、分離膜の閉塞が発生しやすくなることから、微生物を含んだ培養液の一部を取り除き、培地で希釈することで、閉塞から回避することができることがある。また、発酵槽内の微生物濃度によって化学品の生産性能が変化することがあり、生産性能を指標として、微生物を含んだ培養液の一部を取り除いて培地で希釈することで生産性能を維持させることも可能である。
　本発明の化学品の製造方法では、菌体を増殖しつつ生産物を生成する連続発酵培養法であれば、発酵槽の数は問わない。
　連続発酵装置は、酵母の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を前記の発酵培養液に追加して濾過液中の生産物を回収する連続発酵による化学品の製造装置であれば特に制限はないが、具体例を挙げると、有機高分子膜を使用する際は、ＷＯ２００７／０９７２６０に記載される装置が使用できる。
　本発明により製造される化学品としては、当業者にとって公知の酵母（突然変異処理や遺伝子組換え操作が施された酵母も含む。）が生産できる化学品であれば特に制限はないが、好ましい例として有機酸またはアルコールを挙げることができる。有機酸の具体例としては、酢酸、乳酸、アジピン酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、クエン酸を挙げることができ、アルコールの具体例としては、エタノール、１，３－プロパンジオール、１，３－ブタンジオール、２，３－ブタンジオール、１,４－ブタンジオール、グリセロール、ブタノール、イソブタノール、２－ブタノール、イソプロパノールを挙げることができる。これら化学品は周知の方法（膜分離、濃縮、蒸留、晶析、抽出等）により濾過液より回収される。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
　（参考例１）グルコース、エタノールの分析方法
　培養液中のグルコース、エタノールの濃度は、下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ　ＳＨ１０１１（昭和電工株式会社製）
移動相：５ｍＭ　硫酸（流速０．６ｍＬ／分）
反応液：なし
検出方法：ＲＩ（示差屈折率）
温度：６５℃。
　（参考例２）乳酸の分析方法
　発酵液中の乳酸を下記に示すＨＰＬＣ条件で標品との比較により定量した。
カラム：Ｓｈｉｍ－Ｐａｃｋ　ＳＰＲ－Ｈ（株式会社島津製作所製）
移動相：５ｍＭ　ｐ－トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５ｍＭ　ｐ－トルエンスルホン酸、２０ｍＭ　ビストリス、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。
　（参考例３）Ｄ－乳酸脱水素酵素遺伝子のサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株のＰＤＣ１遺伝子座への導入
　Ｄ－乳酸脱水素酵素遺伝子（Ｄ－ＬＤＨ）としてアメリカカブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ　ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）由来のもの（ＷＯ２０１０／１４０６０２号参照。）を使用した。Ｄ－ＬＤＨ遺伝子を含むＤＮＡを染色体中のＰＤＣ１遺伝子のプロモーターの下流に相同組み換えで挿入する方法としては、Ｄ－ＬＤＨ遺伝子を含むＤＮＡの上流及び下流に、導入目的箇所に相同的な部分を付加するようにデザインしたプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ断片を酵母に形質転換する方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。また、形質転換株の選択を容易にするために、上記ＰＣＲ断片にはアミノ酸合成遺伝子や薬剤耐性遺伝子など酵母選択マーカーが含まれることが好ましい。
　形質転換は、“ＹＥＡＳＴＭＡＫＥＲ　Ｙｅａｓｔ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ”（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ社製）を用いた酢酸リチウム法により行った。詳細は、付属のプロトコールに従った。宿主とするサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株はトリプトファン合成能を欠損した株であり、ＴＲＰ１遺伝子の働きにより、トリプトファン非添加培地上で遺伝子の導入された形質転換体の選択が可能である。
　このようにして得られた形質転換体へのＤ－ＬＤＨ遺伝子導入の確認は、ＹＰＡＤ培地で培養した形質転換株から、ゲノムＤＮＡ抽出キット“Ｇｅｎとるくん”（ＴＡＫＡＲＡ社製）によりプラスミドＤＮＡを含むゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型として“ＰｒｅＭｉｘ　Ｔａｑ”（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いたＰＣＲにより行った。その結果、全ての形質転換体において、ＰＤＣ１座にＤ－ＬＤＨ遺伝子が導入されていることが確認された。
　前記工程で得られた、ＰＤＣ１座にアメリカカブトガニ由来のＤ－ＬＤＨが導入されたサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株を、以下、ＮＢＲＣ１０５０５／△ＰＤＣ１：：ＬＤＨ株と称す。
　（参考例４）Ｄ－乳酸脱水素酵素遺伝子のサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株のＰＤＣ１遺伝子座への導入
　Ｄ－乳酸脱水素酵素遺伝子（Ｄ－ＬＤＨ）としてアメリカカブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ　ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）由来のもの（ＷＯ２０１０／１４０６０２号参照。）を使用した。宿主とするサッカロマイセス・セレビシエ　ＮＢＲＣ２２６０株はアミノ酸要求性のない株であり、ジェネティシン（Ｇ４１８）やハイグロマイシンなどの薬剤の耐性遺伝子を使用することで、薬剤添加培地上でＤ－ＬＤＨ遺伝子の導入された形質転換体の選択が可能である。選択マーカーとしてＧ４１８を使用し、参考例３と同様の方法で形質転換を行った。得られた形質転換体は参考例３と同様の方法にてＤ－ＬＤＨ遺伝子導入の確認を行った。その結果、全ての形質転換体において、ＰＤＣ１座にＤ－ＬＤＨ遺伝子が導入されていることが確認された。
　前記工程で得られた、ＰＤＣ１座にアメリカカブトガニ由来のＤ－ＬＤＨが導入されたサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株を、以下、ＮＢＲＣ２２６０／△ＰＤＣ１：：ＬＤＨ株と称す。
　（参考例５）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株のバニリン耐性試験およびアセトン耐性試験
　［バニリン耐性試験］
　サッカロマイセス・セレビセＮＢＲＣ１０５０５株をそれぞれ５ｍｌのＹＰＡＤ培地を入れた２０ｍｌ容試験管に白金耳にて植菌し、３０℃で一晩振とう培養をおこなった（前培養）。ＹＰＡＤ培地の組成は酵母エキス１％（ｗ／ｖ）、バクトペプトン２％（ｗ／ｖ）、グルコース２％（ｗ／ｖ）、アデニン０．０４％（ｗ／ｖ）で行った。バニリン濃縮液（２００ｇ／Ｌ　ｉｎ　ＤＭＳＯ）を作成し、５ｍｌのＹＰＡＤ培地に終濃度１ｇ／Ｌになるように、バニリン濃縮液を２５μＬ分注した。バニリン無添加のＹＰＡＤ培地にはＤＭＳＯのみを２５μl分注した。前培養液をＹＰＡＤ培地（バニリン入り）、バニリン無添加ＹＰＡＤ培地にＯＤ＝０．２になるように植菌し、３０℃で４０時間振とう培養を行った。培養後、それぞれの株の培養液のＯＤ６００ｎｍを測定し、以下の（式５）に従って値を算出し、表１に示した。
ＹＰＡＤ培地（バニリン入）の６００ｎｍにおける吸光度÷ＹＰＡＤ培地の６００ｎｍにおける吸光度×１００・・・（式６）。
　その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株はバニリン耐性を持たない酵母であることが判明した。
　［アセトン耐性試験］
　サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株をそれぞれ５ｍｌのＹＰＡＤ培地を入れた２０ｍｌ容試験管に白金耳にて植菌し、３０℃で一晩振とう培養をおこなった（前培養）。ＹＰＡＤ培地の組成は酵母エキス１％（ｗ／ｖ）、バクトペプトン２％（ｗ／ｖ）、グルコース２％（ｗ／ｖ）、アデニン０．０４％（ｗ／ｖ）で行った。アセトンを、５ｍｌのＹＰＡＤ培地に終濃度４％（ｖ／ｖ）になるように、２００μｌ分注した。前培養液をＹＰＡＤ培地（アセトン入り）、アセトン無添加ＹＰＡＤ培地にＯＤ６００ｎｍ＝０．２になるように植菌し、３０℃で４０時間振とう培養を行った。培養後、それぞれの株の培養液のＯＤ６００ｎｍを測定し、以下の（式６）に従って値を算出し、表１に示した。
ＹＰＡＤ培地（アセトン入）の６００ｎｍにおける吸光度÷ＹＰＡＤ培地の６００ｎｍにおける吸光度×１００・・・（式７）。
　その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株はアセトン耐性を持たない酵母であることが判明した。
　（参考例６）カンジダ・ピングナリアエＮＢＲＣ１０３０７株のバニリン耐性試験およびアセトン耐性試験
　カンジダ・ピングナリアエＮＢＲＣ１０３０７株について、参考例５と同様の方法にて試験し、（式６）および（式７）に従って値を算出した（表１）。その結果、カンジダ・ピングナリアエＮＢＲＣ１０３０７株はバニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であることが判明した。
　（参考例７）ピキア・メキシカーナＮＢＲＣ１０３２０株のバニリン耐性試験
　ピキア・メキシカーナＮＢＲＣ１０３２０株について、参考例５と同様の方法にて試験し、（式６）および（式７）に従って値を算出した（表１）。その結果、ピキア・メキシカーナＮＢＲＣ１０３２０株はバニリン耐性酵母ではないが、アセトン耐性酵母であることが判明した。
　（参考例８）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株のバニリン耐性試験およびアセトン耐性試験
　サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株について、参考例５と同様の方法にて試験し、（式６）および（式７）に従って値を算出した（表１）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株はバニリン耐性且つアセトン耐性酵母であることが判明した。
　（参考例９）クリベロマイセス・マルキアヌスＮＢＲＣ２７２株のバニリン耐性試験およびアセトン耐性試験
　クリベロマイセス・マルキアヌスＮＢＲＣ２７２株について、参考例５と同様の方法にて試験し、（式６）および（式７）に従って値を算出した（表１）。その結果、クリベロマイセス・マルキアヌスＮＢＲＣ２７２株はバニリン耐性且つアセトン耐性酵母であることが判明した。
　（参考例１０）カンジダ・トロピカルスＮＢＲＣ１９９株のバニリン耐性試験およびアセトン耐性試験
　カンジダ・トロピカルスＮＢＲＣ１９９株について、参考例５と同様の方法にて試験し、（式６）および（式７）に従って値を算出した（表１）。その結果、カンジダ・トロピカルスＮＢＲＣ１９９株はバニリン耐性且つアセトン耐性酵母であることが判明した。
　（参考例１１）リンドネラ・メイラエＮＢＲＣ１０８５８株のバニリン耐性試験およびアセトン耐性試験
　リンドネラ・メイラエＮＢＲＣ１０８５８株について、参考例５と同様の方法にて試験し、（式６）および（式７）に従って値を算出した（表１）。その結果、リンドネラ・メイラエＮＢＲＣ１０８５８株はバニリン耐性且つアセトン耐性酵母であることが判明した。
　（参考例１２）リンドネラ・ファビアニＮＢＲＣ１２５３株のバニリン耐性試験およびアセトン耐性試験
　リンドネラ・ファビアニＮＢＲＣ１２５３株について、参考例５と同様の方法にて試験し、（式５）に従って値を算出した（表１）。その結果、リンドネラ・ファビアニＮＢＲＣ１２５３株はバニリン耐性且つアセトン耐性酵母であることが判明した。
　（参考例１３）カンジダ・メタノソルボーサＢＣＲＣ２１４８９株のバニリン耐性試験およびアセトン耐性試験
　カンジダ・メタノソルボーサＢＣＲＣ２１４８９株について、参考例５と同様の方法にて試験し、（式６）および（式７）に従って値を算出した（表１）。その結果、カンジダ・メタノソルボーサＢＣＲＣ２１４８９株はバニリン耐性且つアセトン耐性酵母であることが判明した。
　（参考例１４）ピキア・スティピティスＢＣＲＣ２１７７７株のバニリン耐性試験アセトン耐性試験
　ピキア・スティピティスＢＣＲＣ２１７７７株について、参考例５と同様の方法にて試験し、（式６）および（式７）に従って値を算出した（表１）。その結果、ピキア・スティピティスＢＣＲＣ２１７７７株はバニリン耐性酵母であるが、アセトン耐性酵母ではないことが判明した。
　（参考例１５）カンジダ・ボイジニＢＣＲＣ２２５２８株のバニリン耐性試験およびアセトン耐性酵母
　カンジダ・ボイジニＢＣＲＣ２２５２８株について、参考例５と同様の方法にて試験し、（式６）および（式７）に従って値を算出した（表１）。その結果、カンジダ・ボイジニＢＣＲＣ２２５２８株はバニリン耐性且つアセトン耐性酵母であることが判明した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　（参考例１６）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５／△ＰＤＣ１：：ＬＤＨ株のバニリン耐性試験およびアセトン耐性試験
　乳酸発酵酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５／△ＰＤＣ１：：ＬＤＨ株について、参考例５と同様の方法にて試験し、（式６）および（式７）に従って値を算出した（表２）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５／△ＰＤＣ１：：ＬＤＨ株はバニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であることが判明した。
　（参考例１７）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０／△ＰＤＣ１：：ＬＤＨ株のバニリン耐性試験およびアセトン耐性酵母
　乳酸発酵酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０／△ＰＤＣ１：：ＬＤＨ株について、参考例５と同様の方法にて試験し、（式６）および（式７）に従って値を算出した（表２）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０／△ＰＤＣ１：：ＬＤＨ株はバニリン耐性且つアセトン耐性酵母であることが判明した。
　（参考例１８）サッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ　ＢＰ－１０８７株のバニリン耐性試験およびアセトン耐性試験
　ＷＯ２０１２／１４７９０３号に記載されている低ｐＨ耐性酵母株であるサッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ　ＢＰ－１０８７株について、参考例５と同様の方法にて試験し、（式６）および（式７）に従って値を算出した（表２）。その結果、ＮＩＴＥ　ＢＰ－１０８７株はバニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であることが判明した。
　（参考例１９）サッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ　ＢＰ－１０８８株のバニリン耐性試験およびアセトン耐性試験
　ＷＯ２０１２／１４７９０３号に記載されている低ｐＨ耐性酵母株であるサッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ　ＢＰ－１０８８株について、参考例５と同様の方法にて試験し、（式６）および（式７）に従って値を算出した（表２）。その結果、ＮＩＴＥ　ＢＰ－１０８８株はバニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であることが判明した。
　（参考例２０）サッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ　ＢＰ－１０８９株のバニリン耐性試験およびアセトン耐性試験
　ＷＯ２０１２／１４７９０３号に記載されている低ｐＨ耐性酵母株であるサッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ　ＢＰ－１０８９株について、参考例５と同様の方法にて試験し、（式６）および（式７）に従って値を算出した（表２）。その結果、ＮＩＴＥ　ＢＰ－１０８９株はバニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であることが判明した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　（参考例２１）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株のバッチ発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株を用い、培地としてグルコースを発酵原料の主成分とする連続発酵用ＹＰＡＤ培地を用いた。連続発酵用ＹＰＡＤ培地の組成は酵母エキス１％（ｗ／ｖ）、バクトペプトン２％（ｗ／ｖ）、グルコース８％（ｗ／ｖ）、アデニン０．０４％（ｗ／ｖ）で行った。サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株を試験管で５ｍｌの表３に示す前培養培地に植菌し一晩振とう培養した（前々培養）。得られた培養液を、新鮮な前培養培地５０ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで８時間、３０℃の温度で振とう培養した（前培養）。前培養液を、２Ｌの連続発酵用ＹＰＡＤ培地（植菌前に４Ｎ　ＫＯＨによりｐＨ３.５に調整）に植菌し、以下の条件でバッチ発酵を行った（表４）。収率は（式１）に従って値を算出した。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株はバッチ発酵（ｐＨ３）では残糖無く、エタノールを生産することを確認した。
発酵反応槽容量：２（Ｌ）
発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
温度調整：３０（℃）
発酵反応槽通気量：５０（ｍＬ／分）
発酵反応槽撹拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：４Ｎ　ＫＯＨによりｐＨ３に調整
滅菌：培養槽、および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　（参考例２２）カンジダ・ピングナリアエＮＢＲＣ１０３０７株のバッチ発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるカンジダ・ピングナリアエＮＢＲＣ１０３０７株を用い、参考例２１と同様の条件でバッチ発酵を行い、エタノールを製造した（表４）。その結果、カンジダ・ピングナリアエＮＢＲＣ１０３０７株はバッチ発酵（ｐＨ３）では残糖無く、エタノールを生産することを確認した。
　（参考例２３）ピキア・メキシカーナＮＢＲＣ１０３２０株のバッチ発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性酵母ではないがアセトン耐性酵母であるピキア・メキシカーナＮＢＲＣ１０３２０株を用い、参考例２１と同様の条件でバッチ発酵を行い、エタノールを製造した（表４）。その結果、ピキア・メキシカーナＮＢＲＣ１０３２０株はバッチ発酵（ｐＨ３）では残糖無く、エタノールを生産することを確認した。
　（参考例２４）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株のバッチ発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株を用い、参考例２１と同様の条件でバッチ発酵を行い、エタノールを製造した（表４）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株はバッチ発酵（ｐＨ３）では残糖無く、エタノールを生産することを確認した。
　（参考例２５）クリベロマイセス・マルキアヌスＮＢＲＣ２７２株のバッチ発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるクリベロマイセス・マルキアヌスＮＢＲＣ２７２株を用い、参考例２１と同様の条件でバッチ発酵を行い、エタノールを製造した（表４）。その結果、クリベロマイセス・マルキアヌスＮＢＲＣ２７２株はバッチ発酵（ｐＨ３）では残糖無く、エタノールを生産することを確認した。
　（参考例２６）カンジダ・トロピカルスＮＢＲＣ１９９株のバッチ発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるカンジダ・トロピカルスＮＢＲＣ１９９株を用い、参考例２１と同様の条件でバッチ発酵を行い、エタノールを製造した（表４）。その結果、カンジダ・トロピカルスＮＢＲＣ１９９株はバッチ発酵（ｐＨ３）では残糖無く、エタノールを生産することを確認した。
　（参考例２７）リンドネラ・メイラエＮＢＲＣ１０８５８株のバッチ発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるリンドネラ・メイラエＮＢＲＣ１０８５８株を用い、参考例２１と同様の条件でバッチ発酵を行い、エタノールを製造した（表４）。その結果、リンドネラ・メイラエＮＢＲＣ１０８５８株はバッチ発酵（ｐＨ３）では残糖無く、エタノールを生産することを確認した。
　（参考例２８）リンドネラ・ファビアニＮＢＲＣ１２５３株のバッチ発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるリンドネラ・ファビアニＮＢＲＣ１２５３株を用い、参考例２１と同様の条件でバッチ発酵を行い、エタノールを製造した（表４）。その結果、リンドネラ・ファビアニＮＢＲＣ１２５３株はバッチ発酵（ｐＨ３）では残糖無く、エタノールを生産することを確認した。
　（参考例２９）カンジダ・メタノソルボーサＢＣＲＣ２１４８９株のバッチ発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるカンジダ・メタノソルボーサＢＣＲＣ２１４８９株を用い、参考例２１と同様の条件でバッチ発酵を行い、エタノールを製造した（表４）。その結果、カンジダ・メタノソルボーサＢＣＲＣ２１４８９株はバッチ発酵（ｐＨ３）では残糖無く、エタノールを生産することを確認した。
　（参考例３０）ピキア・スティピティスＢＣＲＣ２１７７７株のバッチ発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性酵母であるが、アセトン耐性酵母ではないピキア・スティピティスＢＣＲＣ２１７７７株を用い、参考例２１と同様の条件でバッチ発酵を行い、エタノールを製造した（表４）。その結果、ピキア・スティピティスＢＣＲＣ２１７７７株はバッチ発酵（ｐＨ３）では残糖無く、エタノールを生産することを確認した。
　（参考例３１）カンジダ・ボイジニＢＣＲＣ２２５２８株のバッチ発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるカンジダ・ボイジニＢＣＲＣ２２５２８株を用い、参考例２１と同様の条件でバッチ発酵を行い、エタノールを製造した（表４）。その結果、カンジダ・ボイジニＢＣＲＣ２２５２８株はバッチ発酵（ｐＨ３）では残糖無く、エタノールを生産することを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　（比較例１）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株を用い、培地として、参考例２１と同じグルコースを発酵原料の主成分とする連続発酵用ＹＰＡＤ培地を用い、分離膜を利用した連続培養を行なった。分離膜エレメントとしては中空糸の形態を採用した。連続発酵用ＹＰＡＤ培地の組成は酵母エキス１％、バクトペプトン２％（ｗ／ｖ）、グルコース８％（ｗ／ｖ）、アデニン０．０４％（ｗ／ｖ）で行った。サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株を試験管で５ｍｌの表２に示す前培養培地に植菌し一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を、新鮮な前培養培地５０ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで８時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、連続発酵装置の１．５Ｌの連続発酵用ＹＰＡＤ培地（植菌前に４Ｎ　ＫＯＨによりｐＨ３に調整）に植菌し、発酵反応槽を付属の撹拌機によって４００ｒｐｍで撹拌し、発酵反応槽の通気量の調整、温度調整、ｐＨの調整を行い、１９時間培養を行った（前培養）。前培養完了後、直ちに発酵液循環ポンプを稼動させ、さらに培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵液量を１．５Ｌとなるよう培養液の濾過量の制御を行いながら以下の条件で２５０時間の連続培養を行い、エタノールを製造した（表５）。収率は（式１）に従って値を算出した。
発酵反応槽容量：２（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積：４７３（ｃｍ２）
温度調整：３０（℃）
発酵反応槽通気量：５０（ｍＬ／分）
発酵反応槽撹拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：４Ｎ　ＫＯＨによりｐＨ３に調整
発酵液の抜き量：５．５（Ｌ／Ｄａｙ）
滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
　また、使用した膜は以下の性質を持つ膜であり、濾過時の膜間差圧は０．１～１９．８ｋＰａの間を推移させた。
平均細孔径：０．１μｍ
平均細孔径の標準偏差：０．０３５μｍ
膜表面粗さ：０．０６μｍ
純水透過係数：５０×１０－９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ。
　前培養中の培養液の残糖濃度と、分離膜利用連続発酵開始から終了時までの濾液中の残糖濃度を、図１に示す。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株は分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）では、連続発酵中に消費されなかった多量の残糖が濾液中に生じてしまい、生産効率が低下することが判明した。
　（比較例２）カンジダ・ピングナリアエＮＢＲＣ１０３０７株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるカンジダ・ピングナリアエＮＢＲＣ１０３０７株を用い、比較例１と同様の条件で２３０時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表５）。前培養中の培養液の残糖濃度と、分離膜利用連続発酵開始から終了時までの濾液中の残糖濃度を、図１に示す。その結果、カンジダ・ピングナリアエＮＢＲＣ１０３０７株は分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）では、連続発酵中に消費されなかった多量の残糖が濾液中に生じてしまい、生産効率が低下することが判明した。
　（比較例３）ピキア・メキシカーナＮＢＲＣ１０３２０株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性酵母ではないが、アセトン耐性酵母であるピキア・メキシカーナＮＢＲＣ１０３２０株を用い、比較例１と同様の条件で２１５時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表５）。前培養中の培養液の残糖濃度と、分離膜利用連続発酵開始から終了時までの濾液中の残糖濃度を、図１に示す。その結果、ピキア・メキシカーナＮＢＲＣ１０３２０株は分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）では連続発酵中に消費されなかった多量の残糖が濾液中に生じてしまい、生産効率が低下することが判明した。分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）の条件で残糖を抑制し、効率よく化学品を生産させるためには、バニリン耐性を有する株を用いることが必要であることが判明した。
　（実施例１）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株を用い、比較例１と同様の条件で２４０時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表５）。前培養中の培養液の残糖濃度と、分離膜利用連続発酵開始から終了時までの濾液中の残糖濃度を、図１に示す。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株は、連続発酵開始直後から顕著に残糖を抑制することができ、エタノールを効率よく生産できることが判明した。
　（実施例２）クリベロマイセス・マルキアヌスＮＢＲＣ２７２株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性酵母且つアセトン耐性酵母であるクリベロマイセス・マルキアヌスＮＢＲＣ２７２株を用い、比較例１と同様の条件で２２０時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表５）。前培養中の培養液の残糖濃度と、分離膜利用連続発酵開始から終了時までの濾液中の残糖濃度を、図１に示す。その結果、クリベロマイセス・マルキアヌスＮＢＲＣ２７２株は、連続発酵開始直後から顕著に残糖を抑制することができ、エタノールを効率よく生産できることが判明した。
　（実施例３）カンジダ・トロピカルスＮＢＲＣ１９９株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性酵母且つアセトン耐性酵母であるカンジダ・トロピカルスＮＢＲＣ１９９株を用い、比較例１と同様の条件で２５０時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表５）。前培養中の培養液の残糖濃度と、分離膜利用連続発酵開始から終了時までの濾液中の残糖濃度を、図１に示す。その結果、カンジダ・トロピカルスＮＢＲＣ１９９株は、連続発酵開始直後から顕著に残糖を抑制することができ、エタノールを効率よく生産できることが判明した。
　（実施例４）リンドネラ・メイラエＮＢＲＣ１０８５８株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性酵母且つアセトン耐性酵母であるリンドネラ・メイラエＮＢＲＣ１０８５８株を用い、比較例１と同様の条件で２３０時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表５）。前培養中の培養液の残糖濃度と、分離膜利用連続発酵開始から終了時までの濾液中の残糖濃度を、図２に示す。その結果、リンドネラ・メイラエＮＢＲＣ１０８５８株は、連続発酵開始直後から顕著に残糖を抑制することができ、エタノールを効率よく生産できることが判明した。
　（実施例５）リンドネラ・ファビアニＮＢＲＣ１２５３株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性酵母且つアセトン耐性酵母であるリンドネラ・ファビアニＮＢＲＣ１２５３株を用い、比較例１と同様の条件で２３０時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表５）。前培養中の培養液の残糖濃度と、分離膜利用連続発酵開始から終了時までの濾液中の残糖濃度を、図２に示す。その結果、リンドネラ・ファビアニＮＢＲＣ１２５３株は、連続発酵開始直後から顕著に残糖を抑制することができ、エタノールを効率よく生産できることが判明した。
　（実施例６）カンジダ・メタノソルボーサＢＣＲＣ２１４８９株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性酵母且つアセトン耐性酵母であるカンジダ・メタノソルボーサＢＣＲＣ２１４８９株を用い、比較例１と同様の条件で２３０時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表５）。前培養中の培養液の残糖濃度と、分離膜利用連続発酵開始から終了時までの濾液中の残糖濃度を、図２に示す。その結果、バニリン耐性且つアセトン耐性を有するカンジダ・メタノソルボーサＢＣＲＣ２１４８９株は、連続発酵開始直後から顕著に残糖を抑制することができ、エタノールを効率よく生産できることが判明した。
　（実施例７）ピキア・スティピティスＢＣＲＣ２１７７７株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性酵母であるが、アセトン耐性酵母ではないピキア・スティピティスＢＣＲＣ２１７７７株を用い、比較例１と同様の条件で２３０時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表５）。前培養中の培養液の残糖濃度と、分離膜利用連続発酵開始から終了時までの濾液中の残糖濃度を、図２に示す。その結果、ピキア・スティピティスＢＣＲＣ２１７７７株は、連続発酵開始直後は、濾液中に残糖が生じたが、その後も連続発酵を続けると、顕著に残糖を抑制することができ、エタノールを効率よく生産できることが判明した。
　（実施例８）カンジダ・ボイジニＢＣＲＣ２２５２８株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるカンジダ・ボイジニＢＣＲＣ２２５２８株を用い、比較例１と同様の条件で２３０時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表５）。前培養中の培養液の残糖濃度と、分離膜利用連続発酵開始から終了時までの濾液中の残糖濃度を、図２に示す。その結果、カンジダ・ボイジニＢＣＲＣ２２５２８株は、連続発酵開始直後時から顕著に残糖を抑制することができ、エタノールを効率よく生産できることが判明した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　（参考例３２）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ５）によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株を用い、植菌前にｐＨ３に調整しないことと、ｐＨ調整を５にする以外は比較例１と同様の条件で２００時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表６）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株は分離膜利用連続発酵（ｐＨ５）では効率よく、エタノールを生産することが判明した。
　（参考例３３）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ５）によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株を用い、植菌前にｐＨ３に調整しないことと、ｐＨ調整を５にする以外は比較例１と同様の条件で２１０時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表６）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株は効率よくエタノールを生産することが判明した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　（参考例３４）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５／△ＰＤＣ１：：ＬＤＨ株のバッチ発酵（ｐＨ３）による乳酸の製造
　乳酸発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５／△ＰＤＣ１：：ＬＤＨ株を用い、参考例２１と同様の条件でバッチ発酵を行い、乳酸を製造した（表７）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５／△ＰＤＣ１：：ＬＤＨ株はバッチ発酵（ｐＨ３）では残糖無く、乳酸を生産することを確認した。
　（参考例３５）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０／△ＰＤＣ１：：ＬＤＨ株のバッチ発酵（ｐＨ３）による乳酸の製造
　乳酸発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０／△ＰＤＣ１：：ＬＤＨ株を用い、参考例２１と同様の条件でバッチ発酵を行い、乳酸を製造した（表７）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０／△ＰＤＣ１：：ＬＤＨ株はバッチ発酵（ｐＨ３）では残糖無く、乳酸を生産することを確認した。
　（参考例３６）サッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ　ＢＰ－１０８７株のバッチ発酵（ｐＨ３）による乳酸の製造
　乳酸発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ　ＢＰ－１０８７株を用い、参考例２１と同様の条件でバッチ発酵を行い、乳酸を製造した（表８）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ　ＢＰ－１０８７株はバッチ発酵（ｐＨ３）では残糖無く、乳酸を生産することを確認した。
　（参考例３７）サッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ　ＢＰ－１０８８株のバッチ発酵（ｐＨ３）による乳酸の製造
　乳酸発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性酵母を持たない酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ　ＢＰ－１０８８株を用い、参考例２１と同様の条件でバッチ発酵を行い、乳酸を製造した（表８）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ　ＢＰ－１０８８株はバッチ発酵（ｐＨ３）では残糖無く、乳酸を生産することを確認した。
　（参考例３８）サッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ　ＢＰ－１０８９株のバッチ発酵（ｐＨ３）による乳酸の製造
　乳酸発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ　ＢＰ－１０８９株を用い、参考例２１と同様の条件でバッチ発酵を行い、乳酸を製造した（表８）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ　ＢＰ－１０８９株はバッチ発酵（ｐＨ３）では残糖無く、乳酸を生産することを確認した。
　（比較例４）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５／△ＰＤＣ１：：ＬＤＨ株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）による乳酸の製造
　乳酸発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５／△ＰＤＣ１：：ＬＤＨ株を用い、比較例１と同様の条件で１９０時間の分離膜利用連続発酵を行い、乳酸を製造した（表７）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５／△ＰＤＣ１：：ＬＤＨ株は分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）では残糖が生じ、生産効率が低下することが判明した。
　（実施例９）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０／△ＰＤＣ１::ＬＤＨ株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）による乳酸の製造
　乳酸発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０／△ＰＤＣ１：：ＬＤＨ株を用い、前培養のｐＨ調整に５Ｎ　Ｃａ（ＯＨ）２を使用すること以外は比較例１と同様の条件で２００時間の分離膜利用連続発酵を行い、乳酸を製造した（表７）。前培養中の培養液の残糖濃度と、分離膜利用連続発酵開始から終了時までの濾液中の残糖濃度を、図４に示す。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０／△ＰＤＣ１::ＬＤＨ株は、連続発酵開始時から、顕著に残糖を抑制することができ、乳酸を効率よく生産できることが判明した。
　（比較例５）サッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ　ＢＰ－１０８７株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）による乳酸の製造
　乳酸発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ　ＢＰ－１０８７株を用い、比較例１と同様の条件で１９０時間の分離膜利用連続発酵を行い、乳酸を製造した（表８）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ　ＢＰ－１０８７株は分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）では残糖が生じ、生産効率が低下することが判明した。つまり、低ｐＨ耐性酵母であってもバニリン耐性を持たなければ分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）では残糖が抑制されず、乳酸を効率よく生産できないことが判明した。
　（比較例６）サッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ　ＢＰ－１０８８株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）による乳酸の製造
　乳酸発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ　ＢＰ－１０８８株を用い、比較例１と同様の条件で２００時間の分離膜利用連続発酵を行い、乳酸を製造した（表８）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ　ＢＰ－１０８８株は分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）では残糖が生じ、生産効率が低下することが判明した。つまり、低ｐＨ耐性酵母であってもバニリン耐性を持たなければ分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）では残糖が抑制されず、乳酸を効率よく生産できないことが判明した。
　（比較例７）サッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ　ＢＰ－１０８９株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）による乳酸の製造
　乳酸発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ　ＢＰ－１０８９株を用い、比較例１と同様の条件で２１０時間の分離膜利用連続発酵を行い、乳酸を製造した（表８）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ　ＢＰ－１０８９株は分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）では残糖が生じ、生産効率が低下することが判明した。つまり、低ｐＨ耐性酵母であってもバニリン耐性を持たなければ分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）では残糖が抑制されず、乳酸を効率よく生産できないことが判明した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　（参考例３９）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株のバッチ発酵（ｐＨ３.５）によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株を用い、ｐＨ調整を３.５にする以外は参考例３７と同様の条件でバッチ発酵を行い、エタノールを製造した（表９）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株はバッチ発酵（ｐＨ３.５）では残糖無く、乳酸を生産することを確認した。
　（参考例４０）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株のバッチ発酵（ｐＨ３.５）によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株を用い、ｐＨ調整を３.５にする以外は参考例３７と同様の条件でバッチ発酵を行い、エタノールを製造した（表９）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株はバッチ発酵（ｐＨ３.５）では残糖無く、乳酸を生産することを確認した。
　（比較例８）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３.５）によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株を用い、ｐＨを３．５に調節する以外は比較例１と同様の条件で２２５時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表９）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株は分離膜利用連続発酵（ｐＨ３.５）では残糖が生じてしまい、生産効率が低下することが判明した。
　（実施例１０）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３.５）によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株を用い、ｐＨを３．５に調節する以外は比較例１と同様の条件で２６０時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表９）。その結果、顕著に残糖を抑制することができ、エタノールを効率よく生産できることが判明した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　（比較例９）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３、糖供給速度２g／（Ｌ・ｈｒ））によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株を用い、抜き速度を０．９Ｌ／ｄａｙに設定し、培地供給速度を２g／（Ｌ・ｈｒ）に設定する以外は比較例１と同様の条件で１９０時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表１０）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株は分離膜利用連続発酵（糖供給速度２g／（Ｌ・ｈｒ））では残糖が生じてしまい、生産効率が低下することが判明した。
　（比較例１０）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３、糖供給速度４g／（Ｌ・ｈｒ））によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株を用い、抜き速度を１．８Ｌ／ｄａｙに設定し、糖供給速度を４g／（Ｌ・ｈｒ）に設定する以外は比較例１と同様の条件で２００時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表１０）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株は分離膜利用連続発酵（糖供給速度４g／（Ｌ・ｈｒ））では残糖が生じてしまい、生産効率が低下することが判明した。
　（比較例１１）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３、糖供給速度５g／（Ｌ・ｈｒ））によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株を用い、抜き速度を２．２５Ｌ／ｄａｙに設定し、糖供給速度を５g／（Ｌ・ｈｒ）に設定する以外は比較例１と同様の条件で２１０時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表１０）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株は分離膜利用連続発酵（糖供給速度５g／（Ｌ・ｈｒ））では残糖が生じてしまい、生産効率が低下することが判明した。
　（比較例１２）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３、糖供給速度８g／（Ｌ・ｈｒ））によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株を用い、抜き速度を３．６Ｌ／ｄａｙに設定し、糖供給速度を８g／（Ｌ・ｈｒ）に設定する以外は比較例１と同様の条件で１９０時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表１０）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株は分離膜利用連続発酵（糖供給速度８g／（Ｌ・ｈｒ））では残糖が生じてしまい、生産効率が低下することが判明した。
　（比較例１３）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３、糖供給速度１０g／（Ｌ・ｈｒ））によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株を用い、抜き速度を４．５Ｌ／ｄａｙに設定し、糖供給速度を１０g／（Ｌ・ｈｒ）に設定する以外は比較例１と同様の条件で２００時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表１０）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株は分離膜利用連続発酵（糖供給速度１０g／（Ｌ・ｈｒ））では残糖が生じてしまい、生産効率が低下することが判明した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　（実施例１１）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３、糖供給速度２g／（Ｌ・ｈｒ））によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株を用い、抜き速度を０．９Ｌ／ｄａｙに設定し、糖供給速度を２g／（Ｌ・ｈｒ）に設定する以外は比較例１と同様の条件で１９５時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表１１）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株は、顕著に残糖を抑制することができ、エタノールを効率よく生産できることが判明した。
　（実施例１２）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３、糖供給速度４g／（Ｌ・ｈｒ））によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株を用い、抜き速度を１．８Ｌ／ｄａｙに設定し、糖供給速度を４g／（Ｌ・ｈｒ）に設定する以外は比較例１と同様の条件で１９５時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表１１）。その結果、顕著に残糖を抑制することができ、エタノールを効率よく生産できることが判明した。
　（実施例１３）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３、糖供給速度５g／（Ｌ・ｈｒ））によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株を用い、抜き速度を２．２５Ｌ／ｄａｙに設定し、糖供給速度を５g／（Ｌ・ｈｒ）に設定する以外は比較例１と同様の条件で２１０時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表１１）。その結果、顕著に残糖を抑制することができ、エタノールを効率よく生産できることが判明した。
　（実施例１４）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３、糖供給速度８g／（Ｌ・ｈｒ））によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株を用い、抜き速度を３．６Ｌ／ｄａｙに設定し、糖供給速度を８g／（Ｌ・ｈｒ）に設定する以外は比較例１と同様の条件で１９５時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表１１）。その結果、顕著に残糖を抑制することができ、エタノールを効率よく生産できることが判明した。
　（実施例１５）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３、糖供給速度１０g／（Ｌ・ｈｒ））によるエタノールの製造
　エタノール発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株を用い、抜き速度を４．５Ｌ／ｄａｙに設定し、糖供給速度を１０g／（Ｌ・ｈｒ）に設定する以外は比較例１と同様の条件で２０５時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表１１）。その結果、顕著に残糖を抑制することができ、エタノールを効率よく生産できることが判明した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　本発明によって、低ｐＨ条件下の分離膜を利用した連続発酵において糖が多量に余ることなく、種々の化学品の発酵生産の効率を向上させることができる。

Claims (5)

  1. 　酵母の培養液を分離膜で濾過し、未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を培養液に追加してｐＨ３．５以下の条件で連続発酵する化学品の製造方法であって、前記酵母として、以下の条件（ａ）下で得られる培養液の６００ｎｍにおける吸光度が、以下の条件（ｂ）下で得られる培養液の６００ｎｍにおける吸光度の２０％以上である酵母を用いる、化学品の製造方法。
    条件（ａ）：バニリン（終濃度１ｇ／Ｌ）入りのＹＰＡＤ培地（培養開始時の６００ｎｍにおける吸光度が０．２）で４０時間培養する。
    条件（ｂ）：バニリンを含まないＹＰＡＤ培地とする以外は条件（ａ）と同様に培養する。
  2. 　前記酵母として前記条件（ａ）下で得られる培養液の６００ｎｍにおける吸光度が、前記条件（ｂ）下で得られる培養液の６００ｎｍにおける吸光度の５０％以上である酵母を用いる、請求項１に記載の化学品の製造方法。
  3. 　前記酵母として、以下の条件（ｃ）下で得られる培養液の６００ｎｍにおける吸光度が、以下の条件（ｄ）下で得られる培養液の６００ｎｍにおける吸光度の２０％以上である酵母を用いる、請求項１または請求項２に記載の化学品の製造方法。
    条件（ｃ）：アセトン４％（ｖ／ｖ）入りのＹＰＡＤ培地（培養開始時の６００ｎｍにおける吸光度が０．２）で４０時間培養する。
    条件（ｄ）：アセトンを含まないＹＰＡＤ培地とする以外は条件（ｃ）と同様に培養する。
  4. 　前記発酵原料の供給速度が４ｇ／（Ｌ・ｈｒ）以上である、請求項１から３のいずれかに記載の化学品の製造方法。
  5. 　前記化学品が有機酸またはアルコールである、請求項１から４のいずれかに記載の化学品の製造方法。
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