CN106164280A - 利用连续发酵的化学品的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为通过pH值3.5以下的条件下的利用分离膜的连续发酵进行的化学品的制造方法,通过使用具有香草醛耐性的酵母,从而可以不大量剩余发酵原料,效率良好地制造化学品。
Description
技术领域
本发明涉及利用低pH值条件下的连续发酵的化学品的制造方法。
背景技术
以乳酸等生物降解性聚合物原料、乙醇等生物燃料为代表的生物质来源的化学品随着向大气中的二氧化碳的排放问题、能源问题的显现而作为可持续性(sustainability)和生命周期评价(LCA)对应型制品而受到强烈关注。
在通过微生物来生产乳酸等有机酸的情况下,由所生产的有机酸带来的培养液pH值的降低引起目标的有机酸的生产性降低,因此需要通过中和剂将培养液的pH值保持于一定。例如专利文献1中公开了培养酵母来制造乳酸的方法,为了维持酵母的乳酸生产性,通过碱中和来维持培养液的pH值。然而,如果将培养液用氢氧化钙等碱性物质进行中和,则根据所添加的碱性物质的量,在后期的分离、精制工序中由于受到为了离解乳酸盐而添加的硫酸等酸性物质的影响因此有时产生石膏等副生成物,由此乳酸的分离、精制工序变得复杂,会成为制造成本高的原因。即,在使用中和剂时,除了中和剂自身的原材料以外,不需要的石膏等副生成物的除去、废弃需要进一步的费用。此外,即使对于乳酸以外的有机酸,培养时为了将培养液的pH值保持于一定,也使用了氢氧化钠等中和剂。因此,进行了使用与细菌相比对低pH值具有耐性的酵母的有机酸生产的研究。这是因为,酵母与细菌相比可以在低pH值进行培养,因此可以降低对应的中和剂的使用。或者进行了对低pH值具有耐性的微生物的改良。例如专利文献3、专利文献4中公开了使用具有乳酸耐性的突变株的乳酸制造方法。
除了有机酸以外,即使在生产乙醇等其它化学品的情况下,有时在低pH值进行培养。例如专利文献2中记载了,将生物质资源用硫酸等酸进行了水解的糖液作为原料来进行利用酵母的乙醇发酵时,不需要pH值的调节,进一步在低pH值时,减轻杂菌污染的风险,因此不需要培养基、发酵装置的杀菌。
一般而言,作为微生物的培养方法,使用了分批培养法、补料分批培养法或连续培养法等,但在专利文献5中公开了通过使用了分离膜的连续培养方法,发酵产物的生产速度、收率也提高。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2009-171879号公报
专利文献2:日本特开2004-344084号公报
专利文献3:日本特开2010-115112号公报
专利文献4:WO2012/147903号
专利文献5:WO2007/097260号
发明内容
发明所要解决的课题
如上述那样,专利文献5中公开了利用作为乳酸发酵微生物使用将乳酸脱氢酶基因导入至染色体中的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NBRC10505株、或作为乙醇发酵微生物使用NBRC10505株,将培养液的pH值调整至5并且使用了分离膜的连续发酵的乳酸或乙醇的制造方法,没有剩余作为发酵原料的糖而连续地生产乳酸或乙醇。
然而,本发明人发现:如果在低pH值(pH值3.5以下)条件下进行与专利文献5同样的使用了分离膜的连续发酵,则糖消耗变得非常地慢,糖未被消耗而大量剩余这样的新课题。如果糖等发酵原料大量剩余,则产物相对于投入于发酵的发酵原料的收率降低,不仅产物的成本变高,而且在随后的精制工序中除去发酵原料的负担变得过度等成本方面产生不良影响。
用于解决课题的方法
本发明人进行了深入研究,结果发现,在利用使用了分离膜的连续发酵的化学品的制造方法中,通过使用对香草醛具有耐性的酵母,从而可以解决上述课题,由此完成本发明。
即,本发明如以下的(1)~(5)所述。
(1)一种化学品的制造方法,是将酵母的培养液用分离膜进行过滤,将未滤过液保持在培养液中或回流到培养液中,并且,将发酵原料追加到培养液中,在pH值3.5以下的条件下进行连续发酵的化学品的制造方法,作为上述酵母,使用在以下的条件(a)下获得的培养液的600nm下的吸光度为在以下的条件(b)下获得的培养液的600nm下的吸光度的20%以上的酵母。
条件(a):用加有香草醛(终浓度1g/L)的YPAD培养基(培养开始时的600nm下的吸光度为0.2)培养40小时。
条件(b):除了使YPAD培养基不含香草醛以外,与条件(a)同样地培养。
(2)根据(1)所述的化学品的制造方法,作为上述酵母,使用在上述条件(a)下获得的培养液的600nm下的吸光度为在上述条件(b)下获得的培养液的600nm下的吸光度的50%以上的酵母。
(3)根据(1)或(2)所述的化学品的制造方法,作为上述酵母,使用在以下的条件(c)下获得的培养液的600nm下的吸光度为在以下的条件(d)下获得的培养液的600nm下的吸光度的20%以上的酵母。
条件(c):用加有丙酮4%(v/v)的YPAD培养基(培养开始时的600nm下的吸光度为0.2)培养40小时。
条件(d):除了使YPAD培养基不含丙酮以外,与条件(c)同样地培养。
(4)根据(1)~(3)的任一项所述的化学品的制造方法,上述发酵原料的供给速度为4g/(L·hr)以上。
(5)根据(1)或(4)的任一项所述的化学品的制造方法,上述化学品为有机酸或醇。
发明的效果
根据本发明,即使在pH值3.5以下的条件下进行使用了分离膜的连续发酵,也可以在滤液中不大量剩余发酵原料,效率良好地制造化学品。
附图说明
图1表示比较例1~3、实施例1~3中的前培养中的培养液的残糖浓度以及从利用分离膜的连续发酵开始至结束时的滤液中的残糖浓度。0小时表示利用分离膜的连续发酵开始时间,在此之前的时间表示前培养时间(19小时)。
图2表示实施例4~8中的前培养中的培养液的残糖浓度以及从利用分离膜的连续发酵开始至结束时的滤液中的残糖浓度。0小时表示利用分离膜的连续发酵开始时间,在此之前的时间表示前培养时间(19小时)。
具体实施方式
首先,对本发明所使用的酵母进行说明。
本发明所使用的对香草醛具有耐性的酵母(以下,称为香草醛耐性酵母。)的特征在于:将在以下的条件(a)下的培养液的吸光度与在以下的条件(b)下的培养液的吸光度进行了比较的试验(以下,称为香草醛耐性试验。)的结果是,条件(a)下的培养液的吸光度为以下的条件(b)下的培养液的吸光度的20%以上,优选为30%以上,更优选为40%以上,进一步优选为50%以上,进一步更优选为60%以上,特别优选为70%以上,最优选为80%以上。
条件(a):用加有香草醛(终浓度1g/L)的YPAD培养基(培养开始时的600nm下的吸光度为0.2)培养40小时。
条件(b):除了使YPAD培养基不含香草醛以外,与条件(a)同样地培养。
机理不清楚,但香草醛耐性酵母在pH值3.5以下的使用了分离膜的连续发酵中也可以没有大量剩余发酵原料地生产化学品。另外,所谓发酵原料大量剩余,是指在将培养液用分离膜进行过滤而得的滤液中不消耗发酵原料而残存了的状态。如果在滤液中大量剩余发酵原料,则产物相对于投入于发酵的发酵原料的收率降低,不仅产物的成本变高,而且在精制阶段除去发酵原料的负担增加,因此滤液中残存的发酵原料越少越优选。
对香草醛耐性试验的条件(a)和(b)进行详细地说明。条件(a)和(b)下的培养开始是以使600nm下的吸光度成为0.2(OD600nm=0.2)的方式进行调整。其方法没有特别限定,可举出下述方法:通过前培养使酵母菌体增殖,测定培养液的吸光度,在本培养液中以成为OD600nm=0.2的方式调整接种量的方法;或者使菌体在琼脂平板上生长,以成为OD600nm=0.2的方式调整从琼脂平板的接种量的方法。
香草醛耐性试验的培养所使用的培养基使用YPAD培养基。这里所谓YPAD培养基的组成是包含酵母提取物1%(w/v)、细菌蛋白胨(Bacto Peptone)2%(w/v)、葡萄糖2%(w/v)和腺嘌呤0.04%(w/v)的培养基。
条件(a)下使用的香草醛(终浓度1g/L)的YPAD培养基的调整优选在灭菌完的YPAD培养基中添加香草醛浓缩液。香草醛浓缩液优选调整为100~200g/L,最优选调整成200g/L。这是因为尽量降低由溶解香草醛的有机溶剂带来的增殖的影响。此外,溶解香草醛的有机溶剂使用DMSO为好。例如如果制成香草醛浓缩液(200g/L),则包含香草醛的YPAD培养基的制作时,相对于5ml的YPAD培养基加入香草醛浓缩液25μl为好。这里,未添加香草醛的YPAD培养基中仅加入DMSO 25μl为好。这是因为考虑由DMSO带来的对增殖的影响。
本发明所使用的香草醛耐性酵母优选进一步具有丙酮耐性。通过使用具有香草醛耐性且丙酮耐性的酵母,从而可以进一步降低通过pH值3.5以下的使用了分离膜的连续发酵而获得的滤液中残存的发酵原料,更有效率地生产化学品。
本发明所使用的对丙酮具有耐性的酵母(以下,称为丙酮耐性酵母。)的特征在于:将在以下的条件(c)下的培养液的吸光度与在以下的条件(d)下的培养液的吸光度进行了比较的试验(以下,称为丙酮耐性试验。)的结果是,条件(c)下的培养液的吸光度为条件(d)下的培养液的吸光度的20%以上,优选为30%以上,更优选为40%以上,更优选为50%以上,更优选为60%以上,更优选为70%以上,进一步优选为80%以上。
条件(c):用加有丙酮4%(v/v)的YPAD培养基(培养开始时的600nm下的吸光度为0.2)培养40小时。
条件(d):除了使YPAD培养基不含丙酮以外,与条件(c)同样地培养。
对丙酮耐性试验的条件(c)和(d)进行详细地说明。条件(c)和(d)下的培养开始是以使600nm下的吸光度成为0.2(OD600nm=0.2)的方式进行调整。
丙酮耐性试验的培养所使用的培养基使用YPAD培养基。
条件(c)下使用的加有丙酮4%(v/v)的YPAD培养基的调整优选在灭菌完的YPAD培养基中添加丙酮。
条件(a)~(d)的培养温度只要是酵母菌体充分地增殖的温度条件,就没有特别限定,优选为28~30℃,更优选为30℃。
条件(a)~(d)下的培养液的吸光度的测定所使用的分光光度计没有特别限制,条件(a)~(d)下需要利用相同分光光度计进行测定。
本发明所使用的香草醛耐性酵母(和香草醛耐性且丙酮耐性酵母)可以从本领域技术人员所公知的酵母株中通过香草醛耐性试验(和丙酮耐性试验)的筛选来选择,作为具体例,可举出酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NBRC2260株、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)NBRC272株、热带假丝酵母(Candida tropicalis)NBRC199株、Lindnera fabinii NBRC10858株、Lindnera fabianii NBRC1253株、Candidamethanosorbosa BCRC21489株、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)BCRC21777株、甲基营养酵母(Candida boidinii)BCRC22528株。此外,关于通过对没有香草醛耐性(和丙酮耐性)的酵母进行本领域技术人员所公知的突变处理来使香草醛耐性试验(和丙酮耐性试验)的结果成为20%以上的酵母,当然相当于本说明书中所谓的香草醛耐性酵母(和香草醛耐性且丙酮耐性酵母)。
接下来,对利用使用了分离膜的连续发酵的化学品的制造方法进行说明。
作为本发明的化学品的制造方法中使用的发酵原料,只要是含有酵母能够同化的碳源、氮源、无机盐类等,可以有效率地进行该酵母的培养的发酵原料,则天然培养基、合成培养基都可以使用。具体而言,作为碳源,优选使用将选自葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、麦芽糖、棉子糖、海藻糖、山梨糖、纤维二糖、乳糖、蜜二糖、松三糖、菊粉、木糖、阿拉伯糖、核糖、鼠李糖、葡糖胺、赤藓醇、核糖醇、甘露糖醇、葡萄糖醇、水扬苷、淀粉(Starch,スターチ)、淀粉(デンプン)等碳水化合物或其水解物、来自生物质来源的纤维素等的糖化液中的1种或2种以上的所谓糖类作为发酵原料的主成分。此外,乙酸、丙酸、柠檬酸等有机酸、乙醇、丙醇等醇等碳源也可以用作发酵原料的主成分。作为氮源,除了氨、氯化铵、硫酸铵、乙酸铵、磷酸铵等无机酸或有机酸的铵盐或其它含氮化合物以外,可以使用蛋白胨、肉膏、玉米浆等。作为无机物,可以使用磷酸二氢钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。这些碳源、氮源、无机盐类等可以在培养开始时一并添加,也可以在培养中分开添加或连续地添加。
本发明所使用的酵母为了生长而需要特定的营养素的情况下,可以以标准品或含有该营养物的天然物的形式添加该营养物。此外,消泡剂也可以根据需要使用。
在本发明中,所谓培养液,是指微生物将发酵原料同化而增殖的结果得到的液体。关于追加的发酵原料的组成,为了提高目标的化学品的生产性,可以由培养开始时的发酵原料组成适当变更。
作为发酵原料以糖类作为主成分的情况下的总糖浓度没有特别限制,如果是不阻碍利用酵母的化学品的生产的范围,则只要是尽可能高的浓度即可,具体而言,优选为15~500g/L,更优选为20~300g/L。
化学品的生产效率可以以被生产的化学品相对于被微生物同化了的发酵原料的主成分的收率进行评价,本说明书中,将通过下式(1)计算出的值作为收率进行评价。
收率(g/g)=总产物量(g)÷{总投入发酵原料(g)-未利用发酵原料(g)}×100···(式1)。
这里,所谓总投入发酵原料,表示投入于发酵的发酵原料的主成分的总量,所谓未利用发酵原料,表示发酵结束时未被消耗而残存的发酵原料的主成分的总量,具体而言,如果是分批发酵,则表示发酵结束时未被微生物同化而在培养液中残存的发酵原料的主成分;如果是连续发酵,则表示将培养液用分离膜进行了过滤的滤液中残存的发酵原料的主成分。所谓总产物量,为化学品的总生产量(g)。
对于连续发酵中的发酵原料的供给速度,没有特别限制,优选为4g/(L·hr)以上。这是因为如果发酵原料的供给速度比4g/(L·hr)低,则有时抑制发酵原料的残存这样的本发明的效果减弱。这里,发酵原料供给速度由下式(1)计算。
发酵原料供给速度(g/(L·hr))=培养基中的发酵原料浓度(g/L)×送至发酵槽的发酵原料供给速度(L/hr)÷装置的操作液量(L)···(式2)。
对于本发明所使用的分离膜,没有特别限制,只要是具有将微生物的利用搅拌型培养器或搅拌型生物反应器进行培养获得的培养液从微生物分离过滤的功能的分离膜即可,可以使用例如多孔质陶瓷膜、多孔质玻璃膜、多孔质有机高分子膜、金属纤维编织体、非织造布等。其中多孔质有机高分子膜或陶瓷膜特别适合。
分离膜从阻止性能和透水性能、分离性能,例如,耐污染性方面出发,优选为包含多孔质树脂层的分离膜。
包含多孔质树脂层的分离膜优选在多孔质基材的表面具有作为分离功能层起作用的多孔质树脂层。多孔质基材支持多孔质树脂层以对分离膜提供强度。
分离膜在多孔质基材的表面具有多孔质树脂层的情况下,可以在多孔质基材中渗透多孔质树脂层,也可以在多孔质基材中不渗透多孔质树脂层,根据用途进行选择。
多孔质基材的平均厚度优选为50μm以上3000μm以下。
多孔质基材的材质包含有机材料和/或无机材料等,期望使用有机纤维。优选的多孔质基材是由纤维素纤维、三乙酸纤维素纤维、聚酯纤维、聚丙烯纤维和聚乙烯纤维等有机纤维形成的织造布、非织造布,更优选使用密度的控制比较容易,制造也容易且便宜的非织造布。
多孔质树脂层可以适合使用有机高分子膜。作为有机高分子膜的材质,可举出例如,聚乙烯系树脂、聚丙烯系树脂、聚氯乙烯系树脂、聚1,1-二氟乙烯系树脂、聚砜系树脂、聚醚砜系树脂、聚丙烯腈系树脂、纤维素系树脂和三乙酸纤维素系树脂等。有机高分子膜可以为将这些树脂作为主成分的树脂的混合物。这里所谓主成分,是指含有该成分为50重量%以上,优选为60重量%以上。有机高分子膜的材质优选为容易利用溶液进行制膜且物理耐久性、耐化学性也优异的聚氯乙烯系树脂、聚1,1-二氟乙烯系树脂、聚砜系树脂、聚醚砜系树脂和聚丙烯腈系树脂,最优选使用聚1,1-二氟乙烯系树脂或将聚1,1-二氟乙烯系树脂作为主成分的树脂。
这里,作为聚1,1-二氟乙烯系树脂,优选使用1,1-二氟乙烯的均聚物。进一步,聚1,1-二氟乙烯系树脂还优选使用与能够与1,1-二氟乙烯共聚的乙烯基系单体的共聚物。作为能够与1,1-二氟乙烯共聚的乙烯基系单体,可例示四氟乙烯、六氟丙烯和三氟氯乙烯等。
分离膜只要发酵所使用的微生物不能通过即可,期望是不易引起由发酵所使用的微生物的分泌物、发酵原料中的微粒带来的堵塞,并且过滤性能长期稳定地持续的范围。因此,分离膜的平均细孔径优选为0.01μm以上且小于5μm。此外,如果分离膜的平均细孔径为0.01μm以上且小于1μm,则可以兼具微生物不渗漏的高排除率和高透水性,可以具有更高精度和再现性地实施长时间保持透水性。
如果接近微生物的大小,则有时它们会直接堵塞孔,因此分离膜的平均细孔径优选小于1μm。关于分离膜的平均细孔径,为了防止微生物的漏出,即排除率降低的不良状况的发生,优选与微生物的大小相比不过大。在微生物中,使用细胞小的细菌等的情况下,作为平均细孔径优选为0.4μm以下,如果小于0.2μm,则可以更适当地实施。
此外,微生物有时生产作为所期望的产物的化学品以外的物质,例如,蛋白质、多糖类等易于凝集的物质,进一步,有时发酵培养液中的微生物的一部分由于凋亡而生成细胞的破碎物,为了避免由这些物质带来的分离膜的闭塞,平均细孔径为0.1μm以下是进一步适合的。
如果分离膜的平均细孔径过小,则分离膜的透水性能降低,即使膜未被污染也变得不能有效率的操作,因此分离膜的平均细孔径优选为0.01μm以上,更优选为0.02μm以上,进一步优选为0.04μm以上。
这里,平均细孔径可以通过测定在倍率10,000倍的扫描型电子显微镜观察中在9.2μm×10.4μm的范围内可以观察到的全部细孔的直径,进行平均而求出。平均细孔径或者可以使用扫描型电子显微镜以倍率10,000倍对膜表面进行照片拍摄,任意地选择10个以上、优选为20个以上的细孔,测定这些细孔的直径,进行数均而求出。在细孔不是圆状的情况下,可以通过下述方法来求出:通过图像处理装置等,求出具有与细孔所具有的面积相等的面积的圆(等效圆),将等效圆直径作为细孔的直径。
分离膜的平均细孔径的标准偏差σ优选为0.1μm以下。平均细孔径的标准偏差σ越小越优选。平均细孔径的标准偏差σ通过将上述9.2μm×10.4μm的范围内可以观察到的细孔数作为N,将测定的各个直径作为Xk,将细孔直径的平均作为X(ave)的下述(式3)来算出。
[数1]
在本发明所使用的分离膜中,发酵培养液的透过性是重要的性能之一。作为分离膜的透过性的指标,可以使用使用前的分离膜的纯水透过系数。分离膜的纯水透过系数在使用利用反渗透膜得到的25℃温度的精制水,以头高(head height)1m测定透水量来算出时,优选为5.6×10-10m3/m2/s/pa以上,纯水透过系数如果为5.6×10-10m3/m2/s/pa以上6×10-7m3/m2/s/pa以下,则实用上可获得充分的透过水量。
在本发明所使用的分离膜中,所谓表面粗糙度,是相对于表面垂直方向的高度的平均值。膜表面粗糙度是附着于分离膜表面的微生物易于由于搅拌、循环泵的液流所导致的膜面洗涤效果而剥离的原因之一。分离膜的表面粗糙度没有特别限制,只要是附着于膜的微生物、以及其它固体物质剥落的范围即可,优选为0.1μm以下。如果表面粗糙度为0.1μm以下,则附着于膜的微生物、以及其它固体物质易于剥落。
可知进一步优选通过使用分离膜的膜表面粗糙度为0.1μm以下,平均细孔径为0.01μm以上且小于1μm,分离膜的纯水透过系数为2×10-9m3/m2/s/pa以上的分离膜,从而能够更容易地进行操作,不需要过度的膜面洗涤所需要的动力。通过使分离膜的表面粗糙度为0.1μm以下,从而在微生物的过滤中,可以使膜表面上产生的剪切力降低,抑制微生物的破坏,也抑制分离膜的堵塞,从而能够更容易地进行长期稳定的过滤。此外,通过使分离膜的表面粗糙度为0.1μm以下,从而能够以更低的膜间差压实施连续发酵,即使在分离膜堵塞了的情况下,与以高膜间差压操作的情况相比,洗涤恢复性良好。通过抑制分离膜的堵塞,从而能够进行稳定的连续发酵,因此分离膜的表面粗糙度越小越优选。
这里,分离膜的膜表面粗糙度是使用下述原子力显微镜装置(AFM),在下述条件下测定的。
·装置 原子力显微镜装置(Digital Instruments(株)制“Nanoscope IIIa”)
·试样调制 测定时膜样品在常温下在乙醇中浸渍15分钟,然后在RO水中浸渍24小时并进行洗涤后,风干并使用。所谓RO水,是指使用作为过滤膜的一种的反渗透膜(RO膜)进行过滤,排除了离子、盐类等杂质的水。RO膜的孔的大小为大致2nm以下。
膜表面粗糙度drough通过上述原子力显微镜装置(AFM)由各点的Z轴方向的高度,通过下述(式4)来算出。
[数2]
drougb:平均表面粗糙度(μm)
Zn:2轴方向的高度(μm)
扫描范围的平均高度(μm)
分离膜的形状优选为平膜。在分离膜的形状为平膜的情况下,其平均厚度可根据用途进行选择。分离膜的形状为平膜的情况下的平均厚度优选为20μm以上5000μm以下,更优选为50μm以上2000μm以下。
此外,分离膜的形状优选为中空纤维膜。在分离膜为中空纤维膜的情况下,中空纤维的内径优选为200μm以上5000μm以下,膜厚优选为20μm以上2000μm以下。此外,可以在中空纤维的内部包含将有机纤维或无机纤维制成了筒状的织物、编物。
另外,上述分离膜可以通过例如WO2007/097260号所记载的制造方法来制造。
此外,作为其它优选的形态,本发明中的分离膜可以是至少包含陶瓷的膜。本发明中的所谓陶瓷,是指含有金属氧化物,通过高温下的热处理而烧结的陶瓷。作为金属氧化物,可以例示氧化铝、氧化镁、二氧化钛、氧化锆等。分离膜可以仅由金属氧化物形成,可以包含二氧化硅、碳化硅、二氧化硅与作为金属氧化物的化合物的莫来石、堇青石等。
形成分离膜的陶瓷以外的成分只要是可以形成作为分离膜的多孔质体的成分,就没有特别限定。
在分离膜包含陶瓷的情况下,其形状没有特别限制,整装膜(monolithmembrane)、平膜、管状膜等都可以使用。从在容器内的填充效率的观点出发,为柱状结构,优选为在长度方向具有贯通孔的结构。从填充效率提高方面出发,优选为整装膜。
优选在长度方向具有贯通孔的理由如下。在将具有柱状结构的分离膜收纳于组件容器作为分离膜组件使用的情况下,分离膜能够从外压式和内压式中选择适合的形态进行组件化、过滤。在本发明中,以下,将分离膜与发酵培养液相接的一侧称为1次侧,将通过过滤而获得包含化学品的滤液的一侧称为2次侧。
如果使用内压式组件,则1次侧的流路窄,因此在进行交叉流过滤的情况下,可以节约循环泵的输出。进一步,将堆积于分离膜表面的浊质排放至组件外的作用变强,分离膜表面易于保持清洁,因此优选。然而,为了获得该效果,前提是内压式的分离膜具有发酵培养液的入口和出口。如果此时的入口和出口是配置成一条直线的贯通孔的状态,则通液阻力变小,因此优选。进一步通过分离膜为柱状结构,贯通孔在长度方向空出,从而能够使收纳分离膜的容器变细。如果分离膜组件细,则从制造、操作的观点出发,可以优选使用。
分离膜的气孔率没有特别限定,如果过低则过滤效率变差,如果过高则强度会降低。为了兼具过滤效率和分离膜的强度,还保持对反复蒸气灭菌的耐性,优选为20%以上60%以下。
另外气孔率通过以下的(式5)来确定。
气孔率[%]=100×(湿润膜重量[g]-干燥膜重量[g])/水比重[g/cm3]/(膜体积[cm3])···(式5)。
分离膜的平均气孔径如果为0.01μm以上1μm以下则优选,如果为具有该范围的平均气孔径的膜,则分离膜不易闭塞,并且过滤效率也优异。此外,如果平均气孔径为0.02μm以上0.2μm以下的范围,则由蛋白质、多糖类等所例示的由微生物、培养细胞产生的发酵的副生成物、培养液中的微生物/培养细胞凋亡而产生的细胞破碎物这样的易于使分离膜闭塞的物质的闭塞不易发生,因此特别优选。
具有贯通孔的柱状结构的分离膜作为下述组件使用:由于外表面成为2次侧,因此为了收集过滤液,优选设置组件容器,在组件容器内填充有分离膜。填充在1个组件中的分离膜为1个以上。
组件容器优选包含能够耐受反复的蒸气灭菌处理的原料。作为能够耐受蒸气灭菌处理的原料,可以例示例如不锈钢、平均气孔率低的陶瓷等。
这样的陶瓷膜组件可以通过例如WO2012/086763所记载的制造方法来制造,还可以利用市售的陶瓷膜组件。作为市售的陶瓷膜组件,如果具体地例示,则可举出MEMBRALOX精密过滤膜(Pall)、陶瓷膜过滤器-Cefilt MF膜(日本ガイシ)等。
本发明中的连续发酵的特征在于:将酵母的培养液用分离膜进行过滤,将未滤过液保持在培养液中或回流到培养液中,并且将发酵原料追加到培养液中,从过滤液中回收产物的连续发酵。
利用分离膜进行过滤时的膜间差压没有特别限制,只要可以过滤发酵培养液即可。然而,为了过滤培养液,如果对有机高分子膜以高于150kPa的膜间差压进行过滤处理,则有机高分子膜的结构被破坏的可能性变高,有时生产化学品的能力降低。此外,在低于0.1kPa的膜间差压时,有未充分获得发酵培养液的透过水量的情况多,制造化学品时的生产性降低的倾向。因此,在本发明的化学品的制造方法中,对于有机高分子膜,通过使作为过滤压力的膜间差压优选为0.1kPa~150kPa的范围,从而发酵培养液的透过水量多,也没有由于膜的结构的破坏带来的化学品制造能力的降低,因此能够将生产化学品的能力维持得高。关于膜间差压,对于有机高分子膜而言,优选为0.1kPa以上50kPa以下的范围,进一步优选为0.1kPa以上20kPa以下的范围。
酵母的发酵时的温度只要设定为适于所用的酵母的温度即可,如果为微生物生长的范围,则没有特别限定,但在温度为20~75℃的范围内进行。
连续发酵时的培养液的pH值调整为4以下。培养液的pH值通过无机酸或有机酸、碱性物质、以及脲、碳酸钙、氨气等,调节成pH值4以下的范围内的预先规定的值。
在本发明的化学品的制造方法中,可以在培养初期进行分批培养或补料分批培养以提高微生物浓度之后,开始连续发酵(培养液的过滤)。此外,可以将高浓度的菌体播种,与培养开始同时进行连续发酵。在本发明的化学品的制造方法中,能够从适当的时期开始进行培养基供给和培养液的过滤。培养基供给和培养液的过滤的开始时期不需要一定相同。此外,培养基供给和培养液的过滤可以是连续的,也可以是间歇的。
关于培养液中的微生物的浓度,以高的状态维持化学品的生产性对于获得效率良好的生产性而言是优选的。关于培养液中的微生物的浓度,作为一例,作为干燥重量,通过维持于5g/L以上,从而可以获得良好的生产效率。
在连续发酵的中途,可以根据需要,通过从发酵槽内除去包含微生物的培养液的一部分,之后用培养基进行稀释,从而调整培养槽内的微生物浓度。例如,如果发酵槽内的微生物浓度变得过高,则分离膜的闭塞易于发生,因此通过除去包含微生物的培养液的一部分,用培养基进行稀释,从而有时可以避免闭塞。此外,有时根据发酵槽内的微生物浓度而化学品的生产性能变化,也能够将生产性能作为指标,除去包含微生物的培养液的一部分,用培养基进行稀释,从而维持生产性能。
本发明的化学品的制造方法中,只要是将菌体增殖的同时生成产物的连续发酵培养法,则无论发酵槽的数目如何。
连续发酵装置只要是利用将酵母的发酵培养液用分离膜进行过滤,从滤液回收产物并且将未滤过液保持在上述发酵培养液中或回流到上述发酵培养液中,并且,将发酵原料追加到上述发酵培养液中回收过滤液中的产物的连续发酵的化学品的制造装置,就没有特别限制,如果举出具体例,则在使用有机高分子膜时,可以使用WO2007/097260所记载的装置。
作为通过本发明制造的化学品,只要是对于本领域技术人员而言公知的酵母(还包含实施了突变处理、基因重组操作的酵母。)可以生产的化学品,就没有特别限制,作为优选的例子,可举出有机酸或醇。作为有机酸的具体例,可举出乙酸、乳酸、己二酸、丙酮酸、琥珀酸、苹果酸、衣康酸、柠檬酸,作为醇的具体例,可举出乙醇、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇、2,3-丁二醇、1,4-丁二醇、甘油、丁醇、异丁醇、2-丁醇、异丙醇。这些化学品通过公知的方法(膜分离、浓缩、蒸馏、晶析、提取等)由过滤液回收。
实施例
以下,举出实施例来具体地说明本发明。但是,本发明不限定于此。
(参考例1)葡萄糖、乙醇的分析方法
培养液中的葡萄糖、乙醇的浓度在下述所示的HPLC条件下,通过与标准品的比较进行了定量。
柱:Shodex SH1011(昭和电工株式会社制)
流动相:5mM硫酸(流速0.6mL/分钟)
反应液:无
检测方法:RI(差示折射率)
温度:65℃。
(参考例2)乳酸的分析方法
将发酵液中的乳酸在下述所示的HPLC条件下通过与标准品的比较进行了定量。
柱:Shim-Pack SPR-H(株式会社岛津制作所制)
流动相:5mM对甲苯磺酸(流速0.8mL/min)
反应液:5mM对甲苯磺酸,20mM bis tris,0.1mM EDTA·2Na(流速0.8mL/min)
检测方法:电导率
温度:45℃。
(参考例3)D-乳酸脱氢酶基因向酿酒酵母NBRC10505株的PDC1基因座的导入
作为D-乳酸脱氢酶基因(D-LDH),使用了美国鲎(Limulus polyphemus)来源的基因(参照WO2010/140602号。)。作为将包含D-LDH基因的DNA通过同源重组插入到染色体中的PDC1基因的启动子的下游的方法,可举出在包含D-LDH基因的DNA的上游和下游,使用以附加与导入目标位置同源的部分的方式设计而成的引物来进行PCR,将所得的PCR片段转化成酵母的方法,但不限定于此。此外,为了使转化株的选择变得容易,上述PCR片段优选包含氨基酸合成基因、抗药性基因等酵母选择标记。
转化是通过使用了“YEASTMAKER酵母转化系统(YEASTMAKER YeastTransformation System)”(CLONETECH社制)的乙酸锂法来进行的。详细情况按照附属的实验方法。作为宿主的酿酒酵母NBRC10505株是欠缺了色氨酸合成能力的株,通过TRP1基因的作用,能够在未添加色氨酸的培养基上进行导入了基因的转化体的选择。
D-LDH基因向这样获得的转化体的导入的确认如下进行:从用YPAD培养基进行了培养的转化株,通过基因组DNA提取试剂盒“Genとるくん”(TAKARA社制)来提取包含质粒DNA的基因组DNA,将其作为模板通过使用了“PreMix Taq”(TAKARA社制)的PCR来进行。其结果是在全部转化体中,确认到D-LDH基因导入至PDC1座。
将由上述工序获得的美国鲎来源的D-LDH导入至PDC1座的酿酒酵母NBRC10505株以下称为NBRC10505/△PDC1::LDH株。
(参考例4)D-乳酸脱氢酶基因向酿酒酵母NBRC2260株的PDC1基因座的导入
作为D-乳酸脱氢酶基因(D-LDH),使用了美国鲎(Limulus polyphemus)来源的基因(参照WO2010/140602号。)。作为宿主的酿酒酵母NBRC2260株是没有氨基酸要求性的株,通过使用遗传霉素(G418)、潮霉素等抗药性基因,从而能够在加药培养基上进行导入了D-LDH基因的转化体的选择。作为选择标记使用G418,采用与参考例3同样的方法进行了转化。所得的转化体采用与参考例3同样的方法进行了D-LDH基因导入的确认。其结果是在全部转化体中,确认到D-LDH基因导入至PDC1座。
将由上述工序获得的美国鲎来源的D-LDH导入至PDC1座的酿酒酵母NBRC2260株以下称为NBRC2260/△PDC1::LDH株。
(参考例5)酿酒酵母NBRC10505株的香草醛耐性试验和丙酮耐性试验
[香草醛耐性试验]
将酿酒酵母NBRC10505株分别利用铂环接种于加有5ml的YPAD培养基的20ml容积试管中,在30℃进行振荡培养一晚(前培养)。YPAD培养基的组成以酵母提取物1%(w/v)、细菌蛋白胨2%(w/v)、葡萄糖2%(w/v)、腺嘌呤0.04%(w/v)进行。制成香草醛浓缩液(在DMSO中为200g/L),在5ml的YPAD培养基中以终浓度成为1g/L的方式,分注香草醛浓缩液25μL。未添加香草醛的YPAD培养基中仅分注25μl的DMSO。将前培养液在YPAD培养基(加有香草醛)、未添加香草醛YPAD培养基中以成为OD=0.2的方式进行接种,在30℃进行40小时振荡培养。培养后,测定各个株的培养液的OD600nm,按照以下的(式5)来算出值,示于表1中。
YPAD培养基(加有香草醛)的600nm下的吸光度÷YPAD培养基的600nm下的吸光度×100···(式6)。
其结果表明酿酒酵母NBRC10505株是不具有香草醛耐性的酵母。
[丙酮耐性试验]
将酿酒酵母NBRC10505株分别利用铂环接种于加有5ml的YPAD培养基的20ml容积试管中,在30℃进行振荡培养一晚(前培养)。YPAD培养基的组成以酵母提取物1%(w/v)、细菌蛋白胨2%(w/v)、葡萄糖2%(w/v)、腺嘌呤0.04%(w/v)进行。在5ml的YPAD培养基中以终浓度成为4%(v/v)的方式分注200μl丙酮。将前培养液在YPAD培养基(加有丙酮)、丙酮未添加YPAD培养基中以成为OD600nm=0.2的方式进行接种,在30℃进行40小时振荡培养。培养后,测定各个株的培养液的OD600nm,按照以下的(式6)算出值,示于表1中。
YPAD培养基(加有丙酮)的600nm下的吸光度÷YPAD培养基的600nm下的吸光度×100···(式7)。
其结果表明酿酒酵母NBRC10505株是不具有丙酮耐性的酵母。
(参考例6)candida pignaliae NBRC10307株的香草醛耐性试验和丙酮耐性试验
对于candida pignaliae NBRC10307株,采用与参考例5同样的方法进行试验,按照(式6)和(式7)算出值(表1)。其结果表明candida pignaliae NBRC10307株是不具有香草醛耐性和丙酮耐性的酵母。
(参考例7)墨西哥毕赤酵母NBRC10320株的香草醛耐性试验
对于墨西哥毕赤酵母NBRC10320株,采用与参考例5同样的方法进行试验,按照(式6)和(式7)算出值(表1)。其结果表明墨西哥毕赤酵母NBRC10320株不是香草醛耐性酵母而是丙酮耐性酵母。
(参考例8)酿酒酵母NBRC2260株的香草醛耐性试验和丙酮耐性试验
对于酿酒酵母NBRC2260株,采用与参考例5同样的方法进行试验,按照(式6)和(式7)算出值(表1)。其结果表明酿酒酵母NBRC2260株是香草醛耐性且丙酮耐性酵母。
(参考例9)马克斯克鲁维酵母NBRC272株的香草醛耐性试验和丙酮耐性试验
对于马克斯克鲁维酵母NBRC272株,采用与参考例5同样的方法进行试验,按照(式6)和(式7)算出值(表1)。其结果表明马克斯克鲁维酵母NBRC272株是香草醛耐性且丙酮耐性酵母。
(参考例10)热带假丝酵母NBRC199株的香草醛耐性试验和丙酮耐性试验
对于热带假丝酵母NBRC199株,采用与参考例5同样的方法进行试验,按照(式6)和(式7)算出值(表1)。其结果表明热带假丝酵母NBRC199株是香草醛耐性且丙酮耐性酵母。
(参考例11)Lindnera fabinii NBRC10858株的香草醛耐性试验和丙酮耐性试验
对于Lindnera fabinii NBRC10858株,采用与参考例5同样的方法进行试验,按照(式6)和(式7)算出值(表1)。其结果表明Lindnera fabinii NBRC10858株是香草醛耐性且丙酮耐性酵母。
(参考例12)Lindnera fabianii NBRC1253株的香草醛耐性试验和丙酮耐性试验
对于Lindnera fabianii NBRC1253株,采用与参考例5同样的方法进行试验,按照(式5)算出值(表1)。其结果表明Lindnera fabianii NBRC1253株是香草醛耐性且丙酮耐性酵母。
(参考例13)Candida methanosorbosa BCRC21489株的香草醛耐性试验和丙酮耐性试验
对于Candida methanosorbosa BCRC21489株,采用与参考例5同样的方法进行试验,按照(式6)和(式7)算出值(表1)。其结果表明Candida methanosorbosa BCRC21489株是香草醛耐性且丙酮耐性酵母。
(参考例14)树干毕赤酵母BCRC21777株的香草醛耐性试验丙酮耐性试验
对于树干毕赤酵母BCRC21777株,采用与参考例5同样的方法进行试验,按照(式6)和(式7)算出值(表1)。其结果表明树干毕赤酵母BCRC21777株是香草醛耐性酵母但不是丙酮耐性酵母。
(参考例15)甲基营养酵母BCRC22528株的香草醛耐性试验和丙酮耐性酵母
对于甲基营养酵母BCRC22528株,采用与参考例5同样的方法进行试验,按照(式6)和(式7)算出值(表1)。其结果表明甲基营养酵母BCRC22528株是香草醛耐性且丙酮耐性酵母。
[表1]
(参考例16)酿酒酵母NBRC10505/△PDC1::LDH株的香草醛耐性试验和丙酮耐性试验
对于作为乳酸发酵酵母的酿酒酵母NBRC10505/△PDC1::LDH株,采用与参考例5同样的方法进行试验,按照(式6)和(式7)算出值(表2)。其结果表明酿酒酵母NBRC10505/△PDC1::LDH株是不具有香草醛耐性和丙酮耐性的酵母。
(参考例17)酿酒酵母NBRC2260/△PDC1::LDH株的香草醛耐性试验和丙酮耐性酵母
对于作为乳酸发酵酵母的酿酒酵母NBRC2260/△PDC1::LDH株,采用与参考例5同样的方法进行试验,按照(式6)和(式7)算出值(表2)。其结果表明酿酒酵母NBRC2260/△PDC1::LDH株是香草醛耐性且丙酮耐性酵母。
(参考例18)酿酒酵母NITE BP-1087株的香草醛耐性试验和丙酮耐性试验
对于WO2012/147903号所记载的作为低pH值耐性酵母株的酿酒酵母NITE BP-1087株,采用与参考例5同样的方法进行试验,按照(式6)和(式7)算出值(表2)。其结果表明NITEBP-1087株是不具有香草醛耐性和丙酮耐性的酵母。
(参考例19)酿酒酵母NITE BP-1088株的香草醛耐性试验和丙酮耐性试验
对于WO2012/147903号所记载的作为低pH值耐性酵母株的酿酒酵母NITE BP-1088株,采用与参考例5同样的方法进行试验,按照(式6)和(式7)算出值(表2)。其结果表明NITEBP-1088株是不具有香草醛耐性和丙酮耐性的酵母。
(参考例20)酿酒酵母NITE BP-1089株的香草醛耐性试验和丙酮耐性试验
对于WO2012/147903号所记载的作为低pH值耐性酵母株的酿酒酵母NITE BP-1089株,采用与参考例5同样的方法进行试验,按照(式6)和(式7)算出值(表2)。其结果表明NITEBP-1089株是不具有香草醛耐性和丙酮耐性的酵母。
[表2]
表2香草醛耐性试验结果2(乳酸发酵微生物)
(参考例21)酿酒酵母NBRC10505株的利用分批发酵(pH值3)进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用作为不具有香草醛耐性和丙酮耐性的酵母的酿酒酵母NBRC10505株,作为培养基,使用将葡萄糖作为发酵原料的主成分的连续发酵用YPAD培养基。连续发酵用YPAD培养基的组成以酵母提取物1%(w/v)、细菌蛋白胨2%(w/v)、葡萄糖8%(w/v)、腺嘌呤0.04%(w/v)进行。将酿酒酵母NBRC10505株用试管接种于5ml的表3所示的前培养培养基中,振荡培养一晚(前前培养)。将所得的培养液接种于新鲜的前培养培养基50ml,用500ml容积坂口烧瓶在30℃的温度振荡培养8小时(前培养)。将前培养液接种于2L的连续发酵用YPAD培养基(接种前通过4N KOH将pH值调整为3.5),在以下的条件下进行了分批发酵(表4)。收率按照(式1)算出值。其结果确认到酿酒酵母NBRC10505株在分批发酵(pH值3)时没有残糖,生产乙醇。
发酵反应槽容量:2(L)
发酵反应槽容量:1.5(L)
温度调整:30(℃)
发酵反应槽通气量:50(mL/分钟)
发酵反应槽搅拌速度:400(rpm)
pH值调整:通过4N KOH将pH值调整为3
灭菌:培养槽和使用培养基全部通过121℃,20min的高压灭菌器进行高压蒸气灭菌。
[表3]
表3
前培养培养基
单位(1/升)
(参考例22)candida pignaliae NBRC10307株的利用分批发酵(pH值3)进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用作为不具有香草醛耐性和丙酮耐性的酵母的candidapignaliae NBRC10307株,采用与参考例21同样的条件进行分批发酵,制造出乙醇(表4)。其结果确认到candida pignaliae NBRC10307株在分批发酵(pH值3)时没有残糖,生产乙醇。
(参考例23)墨西哥毕赤酵母NBRC10320株的利用分批发酵(pH值3)进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用不是香草醛耐性酵母而是丙酮耐性酵母的墨西哥毕赤酵母NBRC10320株,采用与参考例21同样的条件进行分批发酵,制造出乙醇(表4)。其结果确认到墨西哥毕赤酵母NBRC10320株在分批发酵(pH值3)时没有残糖,生产乙醇。
(参考例24)酿酒酵母NBRC2260株的利用分批发酵(pH值3)进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用作为香草醛耐性且丙酮耐性酵母的酿酒酵母NBRC2260株,采用与参考例21同样的条件进行分批发酵,制造出乙醇(表4)。其结果确认到酿酒酵母NBRC2260株在分批发酵(pH值3)时没有残糖,生产乙醇。
(参考例25)马克斯克鲁维酵母NBRC272株的利用分批发酵(pH值3)进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用作为香草醛耐性且丙酮耐性酵母的马克斯克鲁维酵母NBRC272株,采用与参考例21同样的条件进行分批发酵,制造出乙醇(表4)。其结果确认到马克斯克鲁维酵母NBRC272株在分批发酵(pH值3)时没有残糖,生产乙醇。
(参考例26)热带假丝酵母NBRC199株的利用分批发酵(pH值3)进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用作为香草醛耐性且丙酮耐性酵母的热带假丝酵母NBRC199株,采用与参考例21同样的条件进行分批发酵,制造出乙醇(表4)。其结果确认到热带假丝酵母NBRC199株在分批发酵(pH值3)时没有残糖,生产乙醇。
(参考例27)Lindnera fabinii NBRC10858株的利用分批发酵(pH值3)进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用作为香草醛耐性且丙酮耐性酵母的Lindnera fabiniiNBRC10858株,采用与参考例21同样的条件进行分批发酵,制造出乙醇(表4)。其结果确认到Lindnera fabinii NBRC10858株在分批发酵(pH值3)时没有残糖,生产乙醇。
(参考例28)Lindnera fabianii NBRC1253株的利用分批发酵(pH值3)进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用作为香草醛耐性且丙酮耐性酵母的Lindnerafabianii NBRC1253株,采用与参考例21同样的条件进行分批发酵,制造出乙醇(表4)。其结果确认到Lindnera fabianii NBRC1253株在分批发酵(pH值3)时没有残糖,生产乙醇。
(参考例29)Candida methanosorbosa BCRC21489株的利用分批发酵(pH值3)进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用作为香草醛耐性且丙酮耐性酵母的Candidamethanosorbosa BCRC21489株,采用与参考例21同样的条件进行分批发酵,制造出乙醇(表4)。其结果确认到Candida methanosorbosa BCRC21489株在分批发酵(pH值3)时没有残糖,生产乙醇。
(参考例30)树干毕赤酵母BCRC21777株的利用分批发酵(pH值3)进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用不是香草醛耐性酵母而是丙酮耐性酵母的树干毕赤酵母BCRC21777株,采用与参考例21同样的条件进行分批发酵,制造出乙醇(表4)。其结果确认到树干毕赤酵母BCRC21777株在分批发酵(pH值3)时没有残糖,生产乙醇。
(参考例31)甲基营养酵母BCRC22528株的利用分批发酵(pH值3)进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用作为香草醛耐性且丙酮耐性酵母的甲基营养酵母BCRC22528株,采用与参考例21同样的条件进行分批发酵,制造出乙醇(表4)。其结果确认到甲基营养酵母BCRC22528株在分批发酵(pH值3)时没有残糖,生产乙醇。
[表4]
(比较例1)酿酒酵母NBRC10505株的利用分离膜的连续发酵(pH值3)进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用作为不具有香草醛耐性和丙酮耐性的酵母的酿酒酵母NBRC10505株,作为培养基,使用与参考例21相同的葡萄糖作为发酵原料的主成分的连续发酵用YPAD培养基,进行利用了分离膜的连续培养。作为分离膜元件采用中空纤维的形态。连续发酵用YPAD培养基的组成以酵母提取物1%、细菌蛋白胨2%(w/v)、葡萄糖8%(w/v)、腺嘌呤0.04%(w/v)进行。将酿酒酵母NBRC10505株用试管接种于5ml的表2所示的前培养培养基,振荡培养一晚(前前前培养)。将所得的培养液接种于新鲜的前培养培养基50ml,在500ml容积坂口烧瓶中在30℃的温度振荡培养8小时(前前培养)。将前前培养液接种于连续发酵装置的1.5L的连续发酵用YPAD培养基(接种前通过4N KOH将pH值调整为3),将发酵反应槽通过附属的搅拌机以400rpm进行搅拌,进行发酵反应槽的通气量的调整、温度调整、pH值的调整,进行19小时培养(前培养)。前培养结束后,立即使发酵液循环泵开动,进一步进行培养基的连续供给,一边以使连续发酵装置的发酵液量成为1.5L的方式进行培养液的过滤量的控制一边在以下的条件下进行250小时的连续培养,制造出乙醇(表5)。收率按照(式1)算出值。
发酵反应槽容量:2(L)
使用分离膜:聚1,1-二氟乙烯过滤膜
膜分离元件有效过滤面积:473(cm2)
温度调整:30(℃)
发酵反应槽通气量:50(mL/分钟)
发酵反应槽搅拌速度:400(rpm)
pH值调整:通过4N KOH将pH值调整为3
发酵液的取出量:5.5(L/天)
灭菌:包含分离膜元件的培养槽、和使用培养基全部通过121℃,20min的高压灭菌器进行高压蒸气灭菌。
此外,所使用的膜为具有以下性质的膜,使过滤时的膜间差压在0.1~19.8kPa之间变化。
平均细孔径:0.1μm
平均细孔径的标准偏差:0.035μm
膜表面粗糙度:0.06μm
纯水透过系数:50×10-9m3/m2/s/pa。
将前培养中的培养液的残糖浓度以及从利用分离膜的连续发酵开始至结束时的滤液中的残糖浓度示于图1。其结果表明酿酒酵母NBRC10505株在利用分离膜的连续发酵(pH值3)时,连续发酵中未被消耗的大量的残糖会在滤液中产生,生产效率降低。
(比较例2)candida pignaliae NBRC10307株的利用分离膜的连续发酵(pH值3)进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用作为不具有香草醛耐性和丙酮耐性的酵母的candidapignaliae NBRC10307株,采用与比较例1同样的条件进行230小时的利用分离膜的连续发酵,制造出乙醇(表5)。将前培养中的培养液的残糖浓度以及从利用分离膜的连续发酵开始至结束时的滤液中的残糖浓度示于图1。其结果表明candida pignaliae NBRC10307株在利用分离膜的连续发酵(pH值3)时,连续发酵中未被消耗的大量的残糖会在滤液中产生,生产效率降低。
(比较例3)墨西哥毕赤酵母NBRC10320株的利用分离膜的连续发酵(pH值3)进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用不是香草醛耐性酵母而是丙酮耐性酵母的墨西哥毕赤酵母NBRC10320株,采用与比较例1同样的条件进行215小时的利用分离膜的连续发酵,制造出乙醇(表5)。将前培养中的培养液的残糖浓度以及从利用分离膜的连续发酵开始至结束时的滤液中的残糖浓度示于图1。其结果表明墨西哥毕赤酵母NBRC10320株在利用分离膜的连续发酵(pH值3)时,连续发酵中未被消耗的大量的残糖会在滤液中产生,生产效率降低。表明,为了在利用分离膜的连续发酵(pH值3)的条件下抑制残糖,并效率良好地生产化学品,需要使用具有香草醛耐性的株。
(实施例1)酿酒酵母NBRC2260株的利用分离膜的连续发酵(pH值3)进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用作为香草醛耐性且丙酮耐性酵母的酿酒酵母NBRC2260株,采用与比较例1同样的条件进行240小时的利用分离膜的连续发酵,制造出乙醇(表5)。将前培养中的培养液的残糖浓度以及从利用分离膜的连续发酵开始至结束时的滤液中的残糖浓度示于图1。其结果表明酿酒酵母NBRC2260株可以从连续发酵刚开始后显著地抑制残糖,可以效率良好地生产乙醇。
(实施例2)马克斯克鲁维酵母NBRC272株的利用分离膜的连续发酵(pH值3)进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用作为香草醛耐性酵母且丙酮耐性酵母的马克斯克鲁维酵母NBRC272株,采用与比较例1同样的条件进行220小时的利用分离膜的连续发酵,制造出乙醇(表5)。将前培养中的培养液的残糖浓度以及从利用分离膜的连续发酵开始至结束时的滤液中的残糖浓度示于图1。其结果表明马克斯克鲁维酵母NBRC272株可以从连续发酵刚开始后显著地抑制残糖,可以效率良好地生产乙醇。
(实施例3)热带假丝酵母NBRC199株的利用分离膜的连续发酵(pH值3)进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用作为香草醛耐性酵母且丙酮耐性酵母的热带假丝酵母NBRC199株,采用与比较例1同样的条件进行250小时的利用分离膜的连续发酵,制造出乙醇(表5)。将前培养中的培养液的残糖浓度以及从利用分离膜的连续发酵开始至结束时的滤液中的残糖浓度示于图1。其结果表明热带假丝酵母NBRC199株可以从连续发酵刚开始后显著地抑制残糖,可以效率良好地生产乙醇。
(实施例4)Lindnera fabinii NBRC10858株的利用分离膜的连续发酵(pH值3)进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用作为香草醛耐性酵母且丙酮耐性酵母的Lindnerafabinii NBRC10858株,采用与比较例1同样的条件进行230小时的利用分离膜的连续发酵,制造出乙醇(表5)。将前培养中的培养液的残糖浓度以及从利用分离膜的连续发酵开始至结束时的滤液中的残糖浓度示于图2。其结果表明Lindnera fabinii NBRC10858株可以从连续发酵刚开始后显著地抑制残糖,可以效率良好地生产乙醇。
(实施例5)Lindnera fabianii NBRC1253株的利用分离膜的连续发酵(pH值3)进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用作为香草醛耐性酵母且丙酮耐性酵母的Lindnerafabianii NBRC1253株,采用与比较例1同样的条件进行230小时的利用分离膜的连续发酵,制造出乙醇(表5)。将前培养中的培养液的残糖浓度以及从利用分离膜的连续发酵开始至结束时的滤液中的残糖浓度示于图2。其结果表明Lindnera fabianii NBRC1253株可以从连续发酵刚开始后显著地抑制残糖,可以效率良好地生产乙醇。
(实施例6)Candida methanosorbosa BCRC21489株的利用分离膜的连续发酵(pH值3)进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用作为香草醛耐性酵母且丙酮耐性酵母的Candidamethanosorbosa BCRC21489株,采用与比较例1同样的条件进行230小时的利用分离膜的连续发酵,制造出乙醇(表5)。将前培养中的培养液的残糖浓度以及从利用分离膜的连续发酵开始至结束时的滤液中的残糖浓度示于图2。其结果表明具有香草醛耐性且丙酮耐性的Candida methanosorbosa BCRC21489株可以从连续发酵刚开始后显著地抑制残糖,可以效率良好地生产乙醇。
(实施例7)树干毕赤酵母BCRC21777株的利用分离膜的连续发酵(pH值3)进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用是香草醛耐性酵母而不是丙酮耐性酵母的树干毕赤酵母BCRC21777株,采用与比较例1同样的条件进行230小时的利用分离膜的连续发酵,制造出乙醇(表5)。将前培养中的培养液的残糖浓度以及从利用分离膜的连续发酵开始至结束时的滤液中的残糖浓度示于图2。其结果表明树干毕赤酵母BCRC21777株在连续发酵刚开始后在滤液中产生残糖,但随后如果继续连续发酵,则可以显著地抑制残糖,可以效率良好地生产乙醇。
(实施例8)甲基营养酵母BCRC22528株的利用分离膜的连续发酵(pH值3)进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用作为香草醛耐性且丙酮耐性酵母的甲基营养酵母BCRC22528株,采用与比较例1同样的条件进行230小时的利用分离膜的连续发酵,制造出乙醇(表5)。将前培养中的培养液的残糖浓度以及从利用分离膜的连续发酵开始至结束时的滤液中的残糖浓度示于图2。其结果表明甲基营养酵母BCRC22528株可以从连续发酵刚开始后显著地抑制残糖,可以效率良好地生产乙醇。
[表5]
(参考例32)酿酒酵母NBRC10505株的利用分离膜的连续发酵(pH值5)进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用作为不具有香草醛耐性和丙酮耐性的酵母的酿酒酵母NBRC10505株,接种前未将pH值调整为3,将pH值调整为5,除此以外,采用与比较例1同样的条件进行200小时的利用分离膜的连续发酵,制造出乙醇(表6)。其结果表明酿酒酵母NBRC10505株在利用分离膜的连续发酵(pH值5)时效率良好地生产乙醇。
(参考例33)酿酒酵母NBRC2260株的利用分离膜的连续发酵(pH值5)进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用作为香草醛耐性且丙酮耐性酵母的酿酒酵母NBRC2260株,接种前未将pH值调整为3,将pH值调整为5,除此以外,采用与比较例1同样的条件进行210小时的利用分离膜的连续发酵,制造出乙醇(表6)。其结果表明酿酒酵母NBRC2260株效率良好地生产乙醇。
[表6]
表6乙醇发酵结果3(利用膜的连续发酵、pH5)
参考例32 | 参考例33 | |
培养时间(hr) | 200 | 210 |
总投入葡萄糖(g) | 3667 | 3850 |
总生产乙醇(g) | 1540 | 1655 |
未利用葡萄糖(g) | 1 | 1 |
收率(g/g) | 0.42 | 0.43 |
(参考例34)酿酒酵母NBRC10505/△PDC1::LDH株的利用分批发酵(pH值3)进行的乳酸的制造
作为乳酸发酵微生物,使用作为不具有香草醛耐性和丙酮耐性的酵母的酿酒酵母NBRC10505/△PDC1::LDH株,采用与参考例21同样的条件进行分批发酵,制造出乳酸(表7)。其结果确认到酿酒酵母NBRC10505/△PDC1::LDH株在分批发酵(pH值3)时没有残糖,生产乳酸。
(参考例35)酿酒酵母NBRC2260/△PDC1::LDH株的利用分批发酵(pH值3)进行的乳酸的制造
作为乳酸发酵微生物,使用作为香草醛耐性且丙酮耐性酵母的酿酒酵母NBRC2260/△PDC1::LDH株,采用与参考例21同样的条件进行分批发酵,制造出乳酸(表7)。其结果确认到酿酒酵母NBRC2260/△PDC1::LDH株在分批发酵(pH值3)时没有残糖,生产乳酸。
(参考例36)酿酒酵母NITE BP-1087株的利用分批发酵(pH值3)进行的乳酸的制造
作为乳酸发酵微生物,使用作为不具有香草醛耐性和丙酮耐性的酵母的酿酒酵母NITE BP-1087株,采用与参考例21同样的条件进行分批发酵,制造出乳酸(表8)。其结果确认到酿酒酵母NITE BP-1087株在分批发酵(pH值3)时没有残糖,生产乳酸。
(参考例37)酿酒酵母NITE BP-1088株的利用分批发酵(pH值3)进行的乳酸的制造
作为乳酸发酵微生物,使用作为不具有香草醛耐性和丙酮耐性酵母的酵母的酿酒酵母NITE BP-1088株,采用与参考例21同样的条件进行分批发酵,制造出乳酸(表8)。其结果确认到酿酒酵母NITE BP-1088株在分批发酵(pH值3)时没有残糖,生产乳酸。
(参考例38)酿酒酵母NITE BP-1089株的利用分批发酵(pH值3)进行的乳酸的制造
作为乳酸发酵微生物,使用作为不具有香草醛耐性和丙酮耐性的酵母的酿酒酵母NITE BP-1089株,采用与参考例21同样的条件进行分批发酵,制造出乳酸(表8)。其结果确认到酿酒酵母NITE BP-1089株在分批发酵(pH值3)时没有残糖,生产乳酸。
(比较例4)酿酒酵母NBRC10505/△PDC1::LDH株的利用分离膜的连续发酵(pH值3)进行的乳酸的制造
作为乳酸发酵微生物,使用作为不具有香草醛耐性和丙酮耐性的酵母的酿酒酵母NBRC10505/△PDC1::LDH株,采用与比较例1同样的条件进行190小时的利用分离膜的连续发酵,制造出乳酸(表7)。其结果表明酿酒酵母NBRC10505/△PDC1::LDH株在利用分离膜的连续发酵(pH值3)时产生残糖,生产效率降低。
(实施例9)酿酒酵母NBRC2260/△PDC1::LDH株的利用分离膜的连续发酵(pH值3)进行的乳酸的制造
作为乳酸发酵微生物,使用作为香草醛耐性且丙酮耐性酵母的酿酒酵母NBRC2260/△PDC1::LDH株,前培养的pH值调整时使用5N Ca(OH)2,除此以外,采用与比较例1同样的条件进行200小时的利用分离膜的连续发酵,制造出乳酸(表7)。将前培养中的培养液的残糖浓度以及从利用分离膜的连续发酵开始至结束时的滤液中的残糖浓度示于图4。其结果表明酿酒酵母NBRC2260/△PDC1::LDH株可以从连续发酵开始时起显著地抑制残糖,可以效率良好地生产乳酸。
(比较例5)酿酒酵母NITE BP-1087株的利用分离膜的连续发酵(pH值3)进行的乳酸的制造
作为乳酸发酵微生物,使用作为不具有香草醛耐性和丙酮耐性的酵母的酿酒酵母NITE BP-1087株,采用与比较例1同样的条件进行190小时的利用分离膜的连续发酵,制造出乳酸(表8)。其结果表明酿酒酵母NITE BP-1087株在利用分离膜的连续发酵(pH值3)时产生残糖,生产效率降低。即表明,即使是低pH值耐性酵母如果不具有香草醛耐性则在利用分离膜的连续发酵(pH值3)时也不能抑制残糖,不能效率良好地生产乳酸。
(比较例6)酿酒酵母NITE BP-1088株的利用分离膜的连续发酵(pH值3)进行的乳酸的制造
作为乳酸发酵微生物,使用作为不具有香草醛耐性和丙酮耐性的酵母的酿酒酵母NITE BP-1088株,采用与比较例1同样的条件进行200小时的利用分离膜的连续发酵,制造出乳酸(表8)。其结果表明酿酒酵母NITE BP-1088株在利用分离膜的连续发酵(pH值3)时产生残糖,生产效率降低。即表明,即使是低pH值耐性酵母如果不具有香草醛耐性则在利用分离膜的连续发酵(pH值3)时也不能抑制残糖,不能效率良好地生产乳酸。
(比较例7)酿酒酵母NITE BP-1089株的利用分离膜的连续发酵(pH值3)进行的乳酸的制造
作为乳酸发酵微生物,使用作为不具有香草醛耐性和丙酮耐性的酵母的酿酒酵母NITE BP-1089株,采用与比较例1同样的条件进行210小时的利用分离膜的连续发酵,制造出乳酸(表8)。其结果表明酿酒酵母NITE BP-1089株在利用分离膜的连续发酵(pH值3)时产生残糖,生产效率降低。即表明,即使是低pH值耐性酵母如果不具有香草醛耐性则在利用分离膜的连续发酵(pH值3)时也不能抑制残糖,不能效率良好地生产乳酸。
[表7]
表7乳酸发酵结果2(分批发酵,利用膜的连续发酵、pH3)
[表8]
表8乳酸发酵结果1(分批发酵、利用膜的连续发酵、pH3)
(参考例39)酿酒酵母NBRC10505株的利用分批发酵(pH值3.5)进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用作为不具有香草醛耐性和丙酮耐性的酵母的酿酒酵母NBRC10505株,将pH值调整为3.5,除此以外,采用与参考例37同样的条件进行分批发酵,制造出乙醇(表9)。其结果确认到酿酒酵母NBRC10505株在分批发酵(pH值3.5)时没有残糖,生产乳酸。
(参考例40)酿酒酵母NBRC2260株的利用分批发酵(pH值3.5)进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用作为香草醛耐性且丙酮耐性酵母的酿酒酵母NBRC2260株,将pH值调整为3.5,除此以外,采用与参考例37同样的条件进行分批发酵,制造出乙醇(表9)。其结果确认到酿酒酵母NBRC2260株在分批发酵(pH值3.5)时没有残糖,生产乳酸。
(比较例8)酿酒酵母NBRC10505株的利用分离膜的连续发酵(pH值3.5)进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用作为不具有香草醛耐性和丙酮耐性的酵母的酿酒酵母NBRC10505株,将pH值调节为3.5,除此以外,采用与比较例1同样的条件进行225小时的利用分离膜的连续发酵,制造出乙醇(表9)。其结果表明酿酒酵母NBRC10505株在利用分离膜的连续发酵(pH值3.5)时会产生残糖,生产效率降低。
(实施例10)酿酒酵母NBRC2260株的利用分离膜的连续发酵(pH值3.5)进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用作为香草醛耐性且丙酮耐性酵母的酿酒酵母NBRC2260株,将pH值调节为3.5,除此以外,采用与比较例1同样的条件进行260小时的利用分离膜的连续发酵,制造出乙醇(表9)。其结果表明可以显著地抑制残糖,可以效率良好地生产乙醇。
[表9]
表9乙醇发酵结果4(分批发酵、利用膜的连续发酵、pH3.5)
参考例39 | 参考例40 | 比较例8 | 实施例10 | |
培养时间(hr) | 21 | 15 | 225 | 260 |
总投入葡萄糖(g) | 80 | 80 | 4125 | 4767 |
总生产乙醇(g) | 33 | 33 | 1429 | 2049 |
未利用葡萄糖(g) | 0 | 0 | 722 | 1 |
收率(g/g) | 0.41 | 0.41 | 0.41 | 0.43 |
(比较例9)酿酒酵母NBRC10505株的利用分离膜的连续发酵(pH值3,糖供给速度2g/(L·hr))进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用作为不具有香草醛耐性和丙酮耐性的酵母的酿酒酵母NBRC10505株,将取出速度设定为0.9L/天,将培养基供给速度设定为2g/(L·hr),除此以外,采用与比较例1同样的条件进行190小时的利用分离膜的连续发酵,制造出乙醇(表10)。其结果表明酿酒酵母NBRC10505株在利用分离膜的连续发酵(糖供给速度2g/(L·hr))时会产生残糖,生产效率降低。
(比较例10)酿酒酵母NBRC10505株的利用分离膜的连续发酵(pH值3,糖供给速度4g/(L·hr))进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用作为不具有香草醛耐性和丙酮耐性的酵母的酿酒酵母NBRC10505株,将取出速度设定为1.8L/天,将糖供给速度设定为4g/(L·hr),除此以外,采用与比较例1同样的条件进行200小时的利用分离膜的连续发酵,制造出乙醇(表10)。其结果表明酿酒酵母NBRC10505株在利用分离膜的连续发酵(糖供给速度4g/(L·hr))时会产生残糖,生产效率降低。
(比较例11)酿酒酵母NBRC10505株的利用分离膜的连续发酵(pH值3,糖供给速度5g/(L·hr))进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用作为不具有香草醛耐性和丙酮耐性的酵母的酿酒酵母NBRC10505株,将取出速度设定为2.25L/天,将糖供给速度设定为5g/(L·hr),除此以外,采用与比较例1同样的条件进行210小时的利用分离膜的连续发酵,制造出乙醇(表10)。其结果表明酿酒酵母NBRC10505株在利用分离膜的连续发酵(糖供给速度5g/(L·hr))时会产生残糖,生产效率降低。
(比较例12)酿酒酵母NBRC10505株的利用分离膜的连续发酵(pH值3,糖供给速度8g/(L·hr))进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用作为不具有香草醛耐性和丙酮耐性的酵母的酿酒酵母NBRC10505株,将取出速度设定为3.6L/天,将糖供给速度设定为8g/(L·hr),除此以外,采用与比较例1同样的条件进行190小时的利用分离膜的连续发酵,制造出乙醇(表10)。其结果表明酿酒酵母NBRC10505株在利用分离膜的连续发酵(糖供给速度8g/(L·hr))时会产生残糖,生产效率降低。
(比较例13)酿酒酵母NBRC10505株的利用分离膜的连续发酵(pH值3,糖供给速度10g/(L·hr))进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用作为不具有香草醛耐性和丙酮耐性的酵母的酿酒酵母NBRC10505株,将取出速度设定为4.5L/天,将糖供给速度设定为10g/(L·hr),除此以外,采用与比较例1同样的条件进行200小时的利用分离膜的连续发酵,制造出乙醇(表10)。其结果表明酿酒酵母NBRC10505株在利用分离膜的连续发酵(糖供给速度10g/(L·hr))时会产生残糖,生产效率降低。
[表10]
(实施例11)酿酒酵母NBRC2260株的利用分离膜的连续发酵(pH值3,糖供给速度2g/(L·hr))进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用作为香草醛耐性且丙酮耐性酵母的酿酒酵母NBRC10505株,将取出速度设定为0.9L/天,将糖供给速度设定为2g/(L·hr),除此以外,采用与比较例1同样的条件进行195小时的利用分离膜的连续发酵,制造出乙醇(表11)。其结果表明酿酒酵母NBRC2260株可以显著地抑制残糖,可以效率良好地生产乙醇。
(实施例12)酿酒酵母NBRC2260株的利用分离膜的连续发酵(pH值3,糖供给速度4g/(L·hr))进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用作为香草醛耐性且丙酮耐性酵母的酿酒酵母NBRC2260株,将取出速度设定为1.8L/天,将糖供给速度设定为4g/(L·hr),除此以外,采用与比较例1同样的条件进行195小时的利用分离膜的连续发酵,制造出乙醇(表11)。其结果表明可以显著地抑制残糖,可以效率良好地生产乙醇。
(实施例13)酿酒酵母NBRC2260株的利用分离膜的连续发酵(pH值3,糖供给速度5g/(L·hr))进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用作为香草醛耐性且丙酮耐性酵母的酿酒酵母NBRC2260株,将取出速度设定为2.25L/天,将糖供给速度设定为5g/(L·hr),除此以外,采用与比较例1同样的条件进行210小时的利用分离膜的连续发酵,制造出乙醇(表11)。其结果表明可以显著地抑制残糖,可以效率良好地生产乙醇。
(实施例14)酿酒酵母NBRC2260株的利用分离膜的连续发酵(pH值3,糖供给速度8g/(L·hr))进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用作为香草醛耐性且丙酮耐性酵母的酿酒酵母NBRC2260株,将取出速度设定为3.6L/天,将糖供给速度设定为8g/(L·hr),除此以外,采用与比较例1同样的条件进行195小时的利用分离膜的连续发酵,制造出乙醇(表11)。其结果表明可以显著地抑制残糖,可以效率良好地生产乙醇。
(实施例15)酿酒酵母NBRC2260株的利用分离膜的连续发酵(pH值3,糖供给速度10g/(L·hr))进行的乙醇的制造
作为乙醇发酵微生物,使用作为香草醛耐性且丙酮耐性酵母的酿酒酵母NBRC2260株,将取出速度设定为4.5L/天,将糖供给速度设定为10g/(L·hr),除此以外,采用与比较例1同样的条件进行205小时的利用分离膜的连续发酵,制造出乙醇(表11)。其结果表明可以显著地抑制残糖,可以效率良好地生产乙醇。
[表11]
产业可利用性
通过本发明,可以在低pH值条件下的利用了分离膜的连续发酵时不大量剩余糖,提高各种化学品的发酵生产的效率。
Claims (5)
1.一种化学品的制造方法,是将酵母的培养液用分离膜进行过滤,将未滤过液保持在培养液中或回流到培养液中,并且,将发酵原料追加到培养液中,在pH值3.5以下的条件下进行连续发酵的化学品的制造方法,作为所述酵母,使用在以下的条件(a)下获得的培养液的600nm下的吸光度为在以下的条件(b)下获得的培养液的600nm下的吸光度的20%以上的酵母,
条件(a):用以终浓度1g/L的方式加有香草醛的YPAD培养基培养40小时,培养开始时的600nm下的吸光度为0.2,
条件(b):除了使YPAD培养基不含香草醛以外,与条件(a)同样地培养。
2.根据权利要求1所述的化学品的制造方法,作为所述酵母,使用在所述条件(a)下获得的培养液的600nm下的吸光度为在所述条件(b)下获得的培养液的600nm下的吸光度的50%以上的酵母。
3.根据权利要求1或2所述的化学品的制造方法,作为所述酵母,使用在以下的条件(c)下获得的培养液的600nm下的吸光度为在以下的条件(d)下获得的培养液的600nm下的吸光度的20%以上的酵母,
条件(c):用以v/v计加有丙酮4%的YPAD培养基培养40小时,培养开始时的600nm下的吸光度为0.2,
条件(d):除了使YPAD培养基不含丙酮以外,与条件(c)同样地培养。
4.根据权利要求1~3的任一项所述的化学品的制造方法,所述发酵原料的供给速度为4g/(L·hr)以上。
5.根据权利要求1~4的任一项所述的化学品的制造方法,所述化学品为有机酸或醇。
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