JP2008048726A - 変異型ピルビン酸脱炭酸酵素5遺伝子を有する酵母及び乳酸の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ピルビン酸脱炭酸酵素をコードするDNAの一部が欠失、置換、挿入等の変異によりピルビン酸脱炭酸酵素活性が温度依存的に変化する酵母であり、かつ乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を組み込んだ酵母を提供する。また、該酵母を糖質存在下で培養し、培養物中から採取することを特徴とする乳酸の製造方法を提供する。
【選択図】なし
Description
(1):ピルビン酸脱炭酸酵素により基質ピルビン酸からアセトアルデヒドが生じる。
(2):(1)において生じたアセトアルデヒドをアルコール脱水素酵素が還元型ニコチンアミドジヌクレオチド(NADH)を補酵素としてエタノールに変換する。
(3):(2)においてアルコール脱水素酵素がアセトアルデヒドをエタノールに変換する際に減少するNADHの量を測定する。
ヒト由来L−ldh遺伝子のクローニングは下記のように実施した。具体的には、ヒト由来LDH遺伝子を酵母ゲノム上のPDC1プロモーターの下流に連結することでL−乳酸発酵能力を持つ酵母を造成した。ポリメラーゼ・チェーン・リアクション(PCR)には、La−Taq(宝酒造)、あるいはKOD-Plus-polymerase(東洋紡)を用い、付属の取扱説明に従って行った。
アフリカツメカエル(ゼノプス・レービス)由来のL−ldh遺伝子のクローニングは下記のように行った。L−ldh遺伝子は、PCR法によりクローニングを行った。PCRには、アフリカツメカエル(ゼノプス・レービス)の腎臓由来cDNAライブラリー(STRATAGENE社製)より、各付属のプロトコールに従い調製したファージミドDNAをPCRの鋳型とした。
下記、酵母分子遺伝学的な手法を実施に用いた生育培地としてはYPD培地、YPAD培地、YPG培地、YPAG培地、SD培地、SPO培地、は「「メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology)」、1991年、(米国)、第194巻」に従い調整した。酵母最小培地であるSD培地には必要に応じて、アミノ酸及び核酸塩基[トリプトファン、チロシン、ヒスチジン、アルギニン、メチオニン、ウラシル(最終濃度各20 mg/L)、チロシン、ロイシン、イソロイシン、リジン(各30 mg/L)、バリン(150 mg/L)、フェニルアラニン(60 mg/L)、スレオニン(200 mg/L)、およびアデニン(40 mg/L)]を加えて用いた。グリセロールを炭素源とした最小培地にはSG培地[グルコースの代わりにグリセロール30 g]を用いた。酵母の合成完全培地にはSC培地[1 literあたりグルコース20 g、Yeast Nitrogen Base w/o amino acids(Difco社製) 6.7 g、ロイシンを除く標準19種アミノ酸76 mg、ロイシン380 mg、イノシトール76 mg、p-アミノ安息香酸8 mg、アデニン40 mg、およびウラシル76 mg]を用い、グリセロールを炭素源とした培地にはSCG培地[グルコースの代わりにグリセロール30 g]を用いた。必要に応じて任意のアミノ酸及び核酸塩基を加えない培地(例えばウラシルを加えない培地はSCG-Ura培地)を用いた。尚、これらはYeast Synthetic Drop-out Medium Supplements(Sigma-Aldrich社製)を用いても調整できる。四分子解剖用培地にはYPAD培地あるいはYPAG培地1 literに精製寒天粉末(ナカライ社製)20 gを加え、90 mmシャーレ(岩城硝子社製)に寒天培地12 mlを満たすことで調整した。5-FOA培地は1 literあたりグルコース20 g、Yeast Nitrogen Base w/o amino acids 6.7 g、Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements w/o uracil(Sigma-Aldrich社製) 1.92 g、ウラシル50 mg、および5-FOA(和光純薬社製)1 g(高圧蒸気滅菌後添加)を含む。平板培地を調整するときは、断らない限り1 literあたりBactoagar(Difco) 20 g、あるいは精製寒天粉末(ナカライ社製)20 gを加えた。滅菌は1 kg/cm2、20分間の条件でオートクレーブを用い高圧蒸気滅菌した。
BY4741株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号15及び配列番号16で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたPCRにより、PDC5遺伝子を含む2.7kbの増幅DNA断片を得た。該断片をNotIで消化し、予めNotIで消化しておいたプラスミドpRS316のNotI間隙に挿入した。得られたプラスミドpRS316−PDC5によって、SW013株をウラシル非要求性に形質転換した。該形質転換体がグルコースを唯一炭素源として生育能力が回復し、且つ37℃での生育能力を有していることを確認した。該形質転換体から、プラスミドpRS316−PDC5を常法によって回収し、pRS316に挿入した2.7kbの塩基配列を常法によって決定し、pRS316−PDC5はPDC5遺伝子が含まれていることを確認した。
プラスミドpRS316−pdc5ts9およびpRS316−pdc5ts11をNotIで消化し、pdc5ts9およびpdc5ts11変異遺伝子を含む2.7kb断片を得た。該断片を用いてSW012株をウラシル要求性に形質転換し、5FOA培地で25℃に保温し生育する形質転換体を選択した。得られた形質転換体群を新鮮なSC−Ura培地にレプリカし34℃で保温した。レプリカした形質転換体群の中で34℃で生育しない形質転換体を選択し、pdc5ts9温度感受性変異株SW015株、pdc5ts11温度感受性変異株SW016株とした。
PDC野生型株、Δpdc1欠失株およびΔpdc1 pdc5温度感受性株のPDC活性を測定した。
寒天培地上からNBRC10505株、SW010株、SW015株、およびSW016株をそれぞれ少量とり、3mLのYPD液体培地に植菌し一晩培養した(前培養)。前培養液を新しいYPD液体培地20mLに1%植菌し、100mL容坂口フラスコを用いて30℃の温度で24時間振とう培養した(本培養)。本培養液10mLを遠心分離により集菌、10mLのリン酸バッファーで洗浄後、1mLのリン酸バッファーに懸濁した。上記菌体懸濁液をエッペンドルフチューブに移し、さらに等量のガラスビーズ(SIGMA社製、直径0.6mm)を加え、Micro Tube Mixer(TOMY社製)を用い4℃で菌体を破砕した。このようにして菌体を破砕した後、遠心分離して得られる上清をPDC酵素液とした。
上記(a)で得られたPDC酵素液の濃度を、ウシIgG(1.38mg/mL、BIO−RAD社製)をスタンダードとして作製した検量線をもとにBCA Protein Assay Kit(PIERCE社製)により測定し、それぞれのPDC酵素液が2mg/mLになるように滅菌水で希釈した。次に、表1に示した割合でPDC酵素液およびNADHを除いた混合液をセミミクロキュベットに分注し、測定を始める直前にPDC酵素液及びNADHを加え混合した。
上記で取得したpdc5温度感受性変異株の乳酸発酵試験を行った。ヒト由来LDH遺伝子を含むプラスミドpL−ldh5でSW015株、およびSW016株を形質転換することで、ヒト由来LDHを導入した。乳酸発酵試験には表3に示す乳酸発酵培地を高圧蒸気滅菌(121℃、15分)した。
移動相:5mM p−トルエンスルホン酸(流速0.8mL/min)
反応液:5mM p−トルエンスルホン酸、20mM ビストリス、
0.1mM EDTA・2Na(流速0.8mL/min)
検出方法:電気伝導度
温度:45℃。
移動相 :1mM 硫酸銅水溶液
流速:1.0ml/min
検出方法 :UV254nm
温度 :30℃。
ここで、LはL−乳酸の濃度、DはD−乳酸の濃度を表す。
培地:1L 乳酸発酵培地
培養温度:30℃
通気量:100 ml/min
撹拌速度:200 1/min
pH:5.0
中和剤:1N NaOH溶液。
上記で取得したpdc5温度感受性変異株の乳酸発酵試験を行った。アフリカツメガエル由来LDH遺伝子を含むプラスミドpL−ldh9でSW015株、およびSW016株を形質転換することで、アフリカツメガエル由来LDHを導入した。乳酸発酵試験には表3に示す乳酸発酵培地を高圧蒸気滅菌(121℃、15分)した。
移動相:5mM p−トルエンスルホン酸(流速0.8mL/min)
反応液:5mM p−トルエンスルホン酸、20mM ビストリス、
0.1mM EDTA・2Na(流速0.8mL/min)
検出方法:電気伝導度
温度:45℃。
移動相:1mM 硫酸銅水溶液
流速:1.0ml/min
検出方法:UV254nm
温度:30℃。
ここで、LはL−乳酸の濃度、DはD−乳酸の濃度を表す。
培地:1L 乳酸発酵培地
培養温度:30℃
通気量:100 ml/min
撹拌速度:200 1/min
pH:5.0
中和剤:1N NaOH溶液。
また、対照比較例としてPDC5野生型株を用いた発酵試験を行った。ヒト由来LDH遺伝子を含むプラスミドpL−ldh5でPDC5野生型株であるSW011株を形質転換した形質転換細胞を用い、pdc5温度感受性変異株と同条件で発酵試験を行った。その試験結果を表4に示した。
更に、対照比較例としてアフリカツメガエル由来LDHを含むプラスミドpL−ldh9で形質転換したSW011株を、pdc5温度感受性変異株と同条件で発酵試験を行った。その試験結果を表4に示した。
樹脂としてポリフッ化ビニリデン(PVDF)樹脂を、また溶媒としてN,N−ジメチルアセトアミド(DMAc)をそれぞれ用い、これらを90℃の温度下に十分に攪拌し、下記組成を有する原液を得た。
・PVDF:13.0重量%
・DMAc:87.0重量%。
・水 :30.0重量%
・DMAc:70.0重量%
この多孔性膜をガラス板から剥がした後、80℃の温度の熱水に3回浸漬してDMAcを洗い出し、分離膜を得た。多孔質樹脂層表面の9.2μm×10.4μmの範囲内を、倍率10,000倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は0.1μmであった。次に、上記分離膜について純水透水透過係数を評価したところ、50×10-9m3/m2/s/Paであった。純水透水量の測定は、逆浸透膜による25℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ1mで行った。また、平均細孔径の標準偏差は0.035μmで、膜表面粗さは0.06μmであった。
本発明の酵母としてアフリカツメガエル由来プラスミドpL−ldh9で形質転換したSW015株を用い、発酵培地として表3に示す組成の乳酸発酵培地を用い、図2に示す連続発酵装置を用いて連続培養を行い、乳酸の連続発酵試験を行った。また、上記の乳酸発酵培地は、121℃の温度で15分間高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜には、参考例1で作成したポリフッ化ビニリデン(PVDF)を主成分とする多孔性膜を用いた。この実施例9における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
・発酵反応槽容量:1.5(L)
・使用分離膜:PVDF濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積:120平方cm
・温度調整:32(℃)
・発酵反応槽通気量:20(ml/min)
・発酵反応槽攪拌速度:800(rpm)
・pH調整:1N NaOHによりpHを5に調整した
・滅菌:分離膜エレメントを含む培養槽および使用培地は、総て121℃の温度で20分間のオートクレーブにより高圧蒸気滅菌した
・膜透過水量制御:膜間差圧による流量制御(0.1kPa以上20kPa以下で制御)。
対照比較例として、アフリカツメガエル由来LDHを含むプラスミドpL−ldh9で形質転換したSW011株を用いて、その他の条件はすべて実施例7と同様で連続乳酸発酵試験を行った。その試験結果を表5に示した。
2 分離膜エレメント
3 水頭差制御装置
4 気体供給装置
5 攪拌機
6 レベルセンサ
7 培地供給ポンプ
8 pH調整溶液供給ポンプ
9 pHセンサ・制御装置
10 温度調節器
Claims (12)
- ヒト又はアフリカツメガエル由来の乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵母であって、ピルビン酸脱炭酸酵素1をコードする遺伝子が欠失し、野生型ピルビン酸脱炭酸酵素5をコードする遺伝子の塩基配列の一部が欠失、挿入、置換及び/又は付加された塩基配列からなる変異型ピルビン酸脱炭酸酵素5遺伝子を有することを特徴とする酵母。
- 酵母細胞内のピルビン酸脱炭酸酵素の比活性が野生型酵母細胞内の比活性の3分の1以下に低下したことを特徴とする、請求項1に記載の酵母。
- 前記変異型ピルビン酸脱炭酸酵素5が温度感受性であることを特徴とする、請求項1又は2に記載の酵母。
- 前記変異型ピルビン酸脱炭酸酵素5が、摂氏34度以上で温度感受性を示すことを特徴とする、請求項3に記載の酵母。
- 前記野生型ピルビン酸脱炭酸酵素5をコードする遺伝子の塩基配列が、配列番号21に示す塩基配列からなる遺伝子であることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の酵母。
- 前記変異型ピルビン酸脱炭酸酵素5をコードする遺伝子が、配列番号19又は20のいずれかに示す塩基配列からなる遺伝子であることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の酵母。
- 前記酵母がサッカロミセス(Saccharomyces)属に属することを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の酵母。
- 前記酵母がサッカロミセス・セレビセ(Saccharomyces cerevisiae)であることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の酵母。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の酵母を培養することを特徴とする、乳酸の製造方法。
- 酵母を摂氏25〜34度で培養することを特徴とする、請求項9に記載の乳酸の製造方法。
- 連続培養を行うことを特徴とする、請求項9又は10に記載の乳酸の製造法。
- 連続培養が、発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵培地を前記の発酵培養液に追加する連続培養である、請求項11に記載の乳酸の製造法。
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