WO2023090305A1 - 核酸構築物 - Google Patents

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WO2023090305A1
WO2023090305A1 PCT/JP2022/042317 JP2022042317W WO2023090305A1 WO 2023090305 A1 WO2023090305 A1 WO 2023090305A1 JP 2022042317 W JP2022042317 W JP 2022042317W WO 2023090305 A1 WO2023090305 A1 WO 2023090305A1
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WO
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yeast
schizosaccharomyces
nucleic acid
polynucleotide
promoter
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PCT/JP2022/042317
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English (en)
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鶴谷篤生
栗原宏征
Original Assignee
東レ株式会社
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to nucleic acid constructs capable of expressing polynucleotides in yeast of the genus Schizosaccharomyces.
  • Yeast of the genus Schizosaccharomyces is one of the model organisms of microorganisms, and its application to protein production and chemical production is also being studied. In order to produce proteins and chemical products using microorganisms, it is necessary to express polynucleotides encoding enzyme genes in microorganisms, and promoters are required for this purpose.
  • a promoter is a nucleic acid sequence that controls the expression of a polynucleotide connected downstream, and types of promoters include those that are constitutively or inducibly expressed.
  • types of promoters include those that are constitutively or inducibly expressed.
  • promoters that can be used in Schizosaccharomyces yeast CMV promoter (Non-Patent Document 1), hsp9 promoter, nmt1 promoter (Non-Patent Document 2) and the like are known.
  • a nucleic acid construct is prepared by connecting a polynucleotide, which is a recombinant gene, downstream of a promoter that is highly expressed in continuous culture, and this nucleic acid construct is introduced.
  • Continuous culturing of genetically modified microorganisms is expected to increase the production efficiency of proteins and chemical products.
  • the subject that the nucleic acid construct using a well-known promoter does not fully function was newly discovered.
  • an object of the present invention is to provide a nucleic acid construct containing a promoter that is highly expressed in continuous culture of Schizosaccharomyces yeast, a Schizosaccharomyces yeast introduced with the construct, and a method for expressing a target polynucleotide in the construct. is to provide
  • the present inventors have comprehensively analyzed the gene expression of yeast of the genus Schizosaccharomyces, and as a result of intensive studies to solve the above problems, have found that the The inventors have found that the above problems can be solved by a nucleic acid construct, and have completed the present invention.
  • the present invention comprises the following (1) to (12).
  • (1) comprising a Schizosaccharomyces yeast-derived translationally controlled tumor protein (TCTP) gene promoter and a polynucleotide fragment, wherein the polynucleotide fragment is artificially connected downstream of the promoter so as to be expressed under the control of the promoter; and nucleic acid constructs.
  • the promoter is a polynucleotide comprising the following nucleotide sequence (a) or (b).
  • a recombinant Schizosaccharomyces yeast comprising the nucleic acid construct according to any one of (1) to (6).
  • a method for expressing a polynucleotide comprising the step of continuously culturing the recombinant Schizosaccharomyces yeast according to (7).
  • a culture solution obtained by culturing yeast is filtered with a separation membrane, an unfiltered solution containing the yeast is retained or circulated in the culture solution, and a fermentation raw material is added to the culture solution.
  • the method for expressing the polynucleotide according to (8) comprising the steps of: (10) A method for producing a chemical, comprising culturing the recombinant Schizosaccharomyces yeast according to (7). (11) The method for producing a chemical product according to (10), wherein the culture is continuous culture. (12) The continuous culture is performed by culturing yeast and filtering the resulting culture solution with a separation membrane, retaining or circulating the unfiltered liquid containing the yeast in the culture solution, and adding fermentation raw materials to the culture solution. A method for producing a chemical product according to (11), comprising steps.
  • a polynucleotide fragment connected to a promoter can be highly expressed in yeast of the genus Schizosaccharomyces during continuous culture. Therefore, the present invention is useful for producing proteins and chemical products using Schizosaccharomyces yeast.
  • the yeast of the genus Schizosaccharomyces refers to a yeast belonging to the taxonomic genus Schizosaccharomyces, for example, Schizosaccharomyces cryophilus, Schizosaccharomyces japonicus, Schizosaccharomyces kambucha, Schiz osaccharomyces octosporus, Schizosaccharomyces osmophilus, Schizosaccharomyces versatilis, Schizosaccharomyces malidevorans, Schizosaccharomyces pombe.
  • sequence identity of base sequences refers to the degree of matching between two or more base sequences that can be compared. That is, the higher the identity between two base sequences, the higher the identity or similarity between those sequences.
  • the degree of nucleotide sequence identity is determined, for example, using FASTA, a sequence analysis tool, using default parameters. Alternatively, it can be determined using the algorithm BLAST by Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. 90:5873-7 (1993)). Specific methods of these analysis methods are known, and the National Center of Biotechnology Information (NCBI) website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) can be referred to.
  • NCBI National Center of Biotechnology Information
  • Nucleic acid construct comprises a promoter and a polynucleotide fragment of a Schizosaccharomyces yeast-derived translationally controlled tumor protein (TCTP) gene, and downstream of the promoter, the polynucleotide fragment is controlled by the promoter. It relates to nucleic acid constructs in which said polynucleotide fragments are artificially connected so that they are expressed under.
  • TCTP Schizosaccharomyces yeast-derived translationally controlled tumor protein
  • TCTP promoter A translationally controlled tumor protein (TCTP) gene promoter derived from yeast belonging to the genus Schizosaccharomyces (hereinafter sometimes simply referred to as "TCTP promoter") controls the expression of the TCTP gene in the wild type of the microorganism. There is no particular limitation as long as it is a DNA sequence.
  • TCTP genes of Schizosaccharomyces yeast include Schizosaccharomyces pombe TCTP gene (NCBI Accession Number: NM_001019749), Schizosaccharomyces octosporus TCTP gene (NCBI Accession Number er: XM_013161615), Schizosaccharomyces cryophilus (NCBI Accession Number: XM_013168673.1), Schizosaccharomyces japonicus ( NCBI Accession Number: XM_002173941.2), etc., and TCTP promoters derived from these yeasts are preferably used in the present invention.
  • the promoter nucleotide sequence of a gene includes the upstream (5' side) and optionally downstream (3' side) of the transcription initiation site.
  • the method for examining the transcription initiation site is not particularly limited, but it can be identified from mRNA sequence information or various databases.
  • the transcription start point of the TCTP gene of Schizosaccharomyces pombe can be identified from the mRNA sequence of the TCTP gene obtained from NCBI Reference Sequence: NM_001019749.2.
  • the base of the transcription initiation point of the TCTP gene of Schizosaccharomyces yeast is +1, its downstream (3' side) is +, and its upstream (5' side) is 0 or -.
  • any nucleic acid region containing a transcription initiation site preferably from -1000 to +200, more preferably from -500 to +150, and even more preferably from -150 to +150.
  • Specific examples include the base sequences set forth in SEQ ID NOS: 1-8, preferably the base sequences set forth in SEQ ID NOS: 5-8, and more preferably SEQ ID NO: 5.
  • the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 are the -359 to +41 nucleic acid region of the TCTP gene on the genome of Schizosaccharomyces pombe, the -194 to +22 nucleic acid region of the TCTP gene on the genome of Schizosaccharomyces octosporus, and the Schizosaccharomyces cryophile us and the -242 to +133 nucleic acid region of the TCTP gene on the genome of Schizosaccharomyces japonicus.
  • the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 5 to 8 are the -64 to +41 nucleic acid region of the TCTP gene on the genome of Schizosaccharomyces pombe, the -94 to +22 nucleic acid region of the TCTP gene on the genome of Schizosaccharomyces octosporus, and the Schizosaccharomyces cryophilus -108 to +8 nucleic acid region of the TCTP gene on the genome of Schizosaccharomyces japonicus, and -70 to +133 nucleic acid region of the TCTP gene on the genome of Schizosaccharomyces japonicus. 8 shows the results of multiple alignment of the nucleotide sequences described in 8.
  • the TCTP promoter may have nucleotide sequence mutations within the range of having promoter activity. Substitutions, deletions, insertions, additions and the like are examples of nucleotide sequence mutations.
  • the nucleotide sequence of the mutated promoter has preferably 85% or more, more preferably 90%, and still more preferably 95% or more identity with the nucleotide sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 8. .
  • polynucleotide fragments are connected so that they are expressed under the control of the TCTP promoter.
  • "Expressed under the control of a promoter” means that any one or more of the expression level, expression time, expression method, expression site, etc. of the connected polynucleotide fragment is controlled by a specific promoter. is not limited to the control of the promoter alone. That is, in the present invention, the expression level of the polynucleotide fragment may be changed by factors other than the TCTP promoter. For example, a method of controlling expression may be added by adding a new activator or the like.
  • the polynucleotide fragment used in the present invention is not particularly limited as long as it is expressed under the control of the TCTP promoter.
  • the polynucleotide fragment may be a base sequence that expresses a functional nucleic acid that functions without encoding a protein, such as a double-stranded RNA precursor that causes RNAi or a ribozyme. can be
  • the method of artificially connecting polynucleotide fragments so that they are expressed under the control of the TCTP promoter is not particularly limited, and is obvious to those skilled in the art.
  • the term “artificially connected” refers to a state in which a polynucleotide fragment other than the wild-type TCTP gene is connected downstream of the TCTP promoter.
  • the nucleic acid construct of the present invention is not limited to DNA sequences in which only the TCTP promoter and polynucleotide fragments are present, and other base sequences may be present.
  • a terminator sequence for terminating transcription of a polypeptide fragment may be added to the 3' end of the nucleic acid construct of the present invention, and a restriction enzyme sequence may be added to the 5' end or 3' of the nucleic acid construct of the present invention. may be added, a restriction enzyme sequence may be inserted into the nucleic acid construct of the present invention, or the nucleic acid construct of the present invention may be incorporated into a plasmid.
  • the terminator sequence that can be added to the nucleic acid construct of the present invention is not particularly limited, and includes adh1 terminator, sv40 terminator, tef terminator, nmt1 terminator, ura4 terminator and the like.
  • the plasmid into which the nucleic acid construct of the present invention is incorporated is not particularly limited, the plasmid described in PombeNet (https://dornsife.usc.edu/pombenet/vectors/) can be used. Specifically, pAUR224 (Takara Bio), REP series, pKS series, pFA6a series and the like can be mentioned.
  • the method for obtaining the nucleic acid construct of the present invention is not particularly limited, and it can be obtained by a conventional chemical synthesis method or genetic engineering method. For example, it can be obtained by artificially synthesizing a DNA in which a polynucleotide fragment is connected downstream of the TCTP promoter based on base sequence information registered with NCBI or the like.
  • a DNA in which a polynucleotide fragment is connected downstream of the TCTP promoter based on base sequence information registered with NCBI or the like.
  • services such as GeneWiz Inc. can be used.
  • microorganisms such as Schizosaccharomyces pombe, for example, Molecular Cloning-A Laboratory Manual Third Edition (Joseph Sambrook, David W.
  • the promoter sequence is cloned, and the desired poly Nucleotide fragments may be joined by, for example, restriction enzyme method or homologous recombination method.
  • restriction enzyme method for example, "In Fusion” marketed by Takara Bio Inc. can be used.
  • Recombinant Schizosaccharomyces yeast As one embodiment of the present invention, a recombinant Schizosaccharomyces yeast containing the nucleic acid construct and a polynucleotide located downstream of the TCTP promoter contained in the nucleic acid construct using the recombinant yeast is provided.
  • the method for introducing the nucleic acid construct into the yeast of the genus Schizosaccharomyces is not particularly limited. Examples thereof include the lithium acetate method and the electroporation method, which are often used in yeast recombination.
  • a transformant can be efficiently obtained by the method of Yeast, 22:799-804 (2005).
  • Schizosaccharomyces japonicus Cold Spring Harb. Protoc. , 996:998 (2017) describe transformation methods.
  • One embodiment of introducing a nucleic acid construct into a yeast of the genus Schizosaccharomyces is a method of introducing the nucleic acid construct onto the genome of the yeast of the genus Schizosaccharomyces.
  • a method for introducing a nucleic acid construct into the genome a DNA fragment having a nucleotide sequence homologous to the gene locus of the genomic DNA to be introduced, a selection marker cassette, and a DNA fragment linked with the nucleic acid construct of the present invention may be introduced into yeast. good.
  • genome editing techniques such as the Cre/LoxP system and CRISPR-Cas9 may be used.
  • the method of introducing the target DNA onto the genomic DNA of Schizosaccharomyces pombe is described in BMC Biotechnol. , 16:76 (2016).
  • One embodiment of introducing a nucleic acid construct into a yeast of the genus Schizosaccharomyces is a method of introducing a vector containing the nucleic acid construct into the yeast of the genus Schizosaccharomyces.
  • Methods for obtaining vectors containing nucleic acid constructs are not particularly limited and are obvious to those skilled in the art. For example, it can be obtained by artificial synthesis in the same manner as the aforementioned nucleic acid constructs. Alternatively, it may be connected to a vector that functions in Schizosaccharomyces yeast by restriction enzyme method or homologous recombination method.
  • a vector that functions in Schizosaccharomyces yeast is not particularly limited as long as it is stably retained in host cells and replicated in microorganisms. Examples include pAUR224 (Takara Bio Inc.), pTIN (RNA, 26(11): 1743-1752 (2020)), pDUAL series (Yeast, Nov; 21(15): 1289-305 (2004)), and the like. .
  • TCTP promoter contained in the nucleic acid construct of the present invention functions favorably in continuous culture of Schizosaccharomyces yeast
  • continuous culture of recombinant yeast into which the nucleic acid construct has been introduced can , downstream of the TCTP promoter can be suitably expressed in recombinant yeast.
  • continuous culture refers to a culture method in which the feed solution is supplied and the culture solution is withdrawn at appropriate times, and the addition timing, composition, rate, method, etc. of the feed solution are not particularly limited. It is not necessary that the start times of feeding and withdrawal be the same. Also, the supply and withdrawal of the feed liquid may be continuous or intermittent. Examples of continuous culture include continuous culture methods using chemostats and separation membranes. Continuous culture using a separation membrane is preferred.
  • Continuous culture using a separation membrane is a method of culturing microorganisms to produce chemicals. It is a culture method that allows the yield and productivity of a product to be maintained at a high level over a long period of time by retaining the microorganisms in the culture solution and maintaining a high concentration of the microorganisms in the culture solution.
  • the timing of collecting the unfiltered liquid containing the recombinant yeast to be cultured may be during the continuous culture, that is, after starting the supply of the fermentation raw material and the filtration of the culture liquid, but preferably the unfiltered liquid in a steady state. It is preferred to collect the filtrate.
  • the sugar concentration in the filtrate is preferably 5 g/L or less, more preferably 2 g/L or less, under the condition that the sugar concentration contained in the supplied fermentation raw material is 100 to 200 g/L. It is preferable to collect the non-filtrate in the continuous culture, which is preferably maintained at 0.3 g/L or less.
  • the sugar concentration in the present invention refers to the total concentration of sugars as a carbon source that can be assimilated by the yeast used for culture.
  • concentration is the sum of them.
  • sugar concentration is calculated by converting the weight into monosaccharides.
  • Continuous culture using a separation membrane may follow a method well known to those skilled in the art, for example, it can be performed according to the continuous culture method described in WO 2007/097260 or WO 2010/038613. .
  • Yeast was shaken overnight in 10 mL of YPD medium (100 g/L glucose (Nacalai Tesque Co., Ltd.), 10 g/L dry yeast powder (Nacalai Tesque Co., Ltd.), 20 g/L "Bacto peptone” (Becton Dickinson Company, Ltd.)). It was then cultured (pre-preculture). The pre-preculture was inoculated into 100 mL of fresh YPD medium and cultured with shaking in a 500 mL baffled flask for 24 hours (preculture). 15 mL of the pre-culture solution was added to the fermentation reaction tank containing the above fermentation raw materials to initiate the main culture.
  • YPD medium 100 g/L glucose (Nacalai Tesque Co., Ltd.), 10 g/L dry yeast powder (Nacalai Tesque Co., Ltd.), 20 g/L "Bacto peptone” (Becton Dickinson Company, Ltd.)
  • RNA samples at this time were used for expression analysis as a batch phase.
  • the sugar concentration in the filtrate was analyzed by the method of Reference Example 1 to confirm that glucose, fructose, and sucrose were each maintained at 0 g/L, and the unfiltered solution for RNA extraction was collected. bottom.
  • RNA samples at this time were used for expression analysis as a continuous culture phase. Operating conditions for continuous culture using a separation membrane are shown below.
  • Fermentation reactor capacity 2L Separation membrane used: Polyvinylidene fluoride filtration membrane membrane separation element Effective filtration area: 218 cm 2 Temperature adjustment: 30°C Fermentation reaction tank aeration rate: non-aerated fermentation reaction tank stirring speed: 300 rpm Flux set value: 0.18 (m 3 /m 2 /day) Cross-flow filtration flow rate 100 (cm/sec) Sterilization: The fermenter containing the separation membrane element is autoclaved at 121°C for 20 minutes for autoclave sterilization. Average pore size: 0.1 ⁇ m Standard deviation of average pore size: 0.035 ⁇ m Membrane surface roughness: 0.06 ⁇ m Pure water permeability coefficient: 50 ⁇ 10 ⁇ 9 (m 3 /m 2 /sec/Pa).
  • Yeast was shaken overnight in 10 mL of YPD medium (100 g/L glucose (Nacalai Tesque Co., Ltd.), 10 g/L dry yeast powder (Nacalai Tesque Co., Ltd.), 20 g/L "Bactopeptone” (Becton Dickinson Company, Ltd.)). It was then cultured (pre-preculture). The pre-preculture was inoculated into 100 mL of fresh YPD medium and cultured with shaking in a 500 mL baffled flask for 24 hours (preculture). 15 mL of the pre-culture solution was added to the fermentation reaction tank containing the above fermentation raw materials to initiate the main culture.
  • YPD medium 100 g/L glucose (Nacalai Tesque Co., Ltd.), 10 g/L dry yeast powder (Nacalai Tesque Co., Ltd.), 20 g/L "Bactopeptone” (Becton Dickinson Company, Ltd.)
  • RNA sample at this time was used for expression analysis as a batch phase.
  • sugar concentration in the fermentation broth was analyzed by the method of Reference Example 1 to confirm that glucose, fructose, and sucrose were maintained at 0 g/L, respectively, and the culture broth for RNA extraction was collected. .
  • the RNA sample at this time was used for expression analysis as a continuous culture phase. The operating conditions for chemostat culture are shown below.
  • Fermentation reactor capacity 2L Temperature adjustment: 30°C Fermentation reaction tank aeration rate: non-aerated fermentation reaction tank stirring speed: 300 rpm Sterilization: Fermentation tanks including raw material tanks and extraction lines are autoclaved at 121°C for 20 minutes to sterilize with high-pressure steam.
  • RNA extraction 5 ml of the culture solution collected for RNA extraction was collected in a 15 ml centrifuge tube and centrifuged (8000 xg, 5 minutes, 4°C) to collect the cells. bottom. The recovered cells were washed with sterilized Milli-Q water. RNA extraction was performed based on the method of Schmitt et al. (Nucl. Acids. Res., 18:3091-3092 (1990)). The recovered RNA was finally dissolved in 20 to 50 ⁇ l of "UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water" (Thermo Fisher Scientific, Inc.).
  • sequence data of each polynucleotide As a result, sequence data of each polynucleotide, annotation results of each polynucleotide, and polynucleotide expression level data as FPKM (fragments per kilobase of exon per million reads mapped) values were obtained.
  • Table 2 shows the FPKM value of TCTP and promoter genes used in chemical production research (J. Biosci. Bioeng., 124 (4): 392-399 (2017)) among known promoters for reference. FPKM values for (nmt1, hsp9) are listed.
  • Example 2 Preparation of recombinant yeast (1) Obtaining plasmid vector TCTP promoter (hereinafter also referred to as TCTP1), Sac1 and Sal1 described in SEQ ID NO: 1 at the Nco1 and Xho1 sites of pAUR224 (Takara Bio Inc.). A plasmid was designed in which the gene for the fluorescent protein mRuby (FPbase ID: 6KLAW) was introduced into the site, and pAURTCTP1-mRuby was obtained from Genewith Gene Synthesis Service.
  • TCTP1 plasmid vector TCTP promoter
  • Sac1 and Sal1 described in SEQ ID NO: 1 at the Nco1 and Xho1 sites of pAUR224 (Takara Bio Inc.).
  • a plasmid was designed in which the gene for the fluorescent protein mRuby (FPbase ID: 6KLAW) was introduced into the site, and pAURTCTP1-mRuby was obtained from Genewith Gene Synthesis Service.
  • YEA selection medium YEL medium with 20 g/L purified agar powder (Nacalai Tesque, Inc.) and 0.5 ⁇ g/mL Aureobasidin A (Takara Bio Inc.)
  • the formed colonies were photographed with a fluorescence image scanner (“PRINTGRAPH2M” (ATTO Co., Ltd.) LED: Cyan, exposure 429 ms, filter: 595 nm), and the glowing colonies were fished and obtained as the recombinant yeast pAURTCTP1-mRuby strain. .
  • Example 3 Evaluation of Promoter Activity (1) Continuous Culture of Recombinant Yeast Recombinant yeast strain pAURTCTP1-mRuby was cultured by continuous culture using a separation membrane. YEL selection medium with a 5-fold concentration (25 g/L dry yeast powder (Nacalai Tesque, Inc.), 90 g/L glucose (Nacalai Tesque, Inc.), 0.5 ⁇ g/mL Aureobasidin A (Takara Bio Inc.) was used as the fermentation raw material. company)) was used.
  • Recombinant yeast was added to 10 mL of YEL selection medium (5 g / L dry yeast powder (Nacalai Tesque, Inc.), 30 g / L glucose (Nacalai Tesque, Inc.), 0.5 ⁇ g / mL Aureobasidin A (Takara Bio Inc.)) and cultured overnight with shaking (pre-preculture).
  • the pre-preculture was inoculated into 100 mL of a fresh YEL selective medium and cultured with shaking in a 500 mL baffled flask for 24 hours (preculture). 15 mL of the pre-culture solution was added to the fermentation reaction tank containing the above fermentation raw materials to initiate the main culture. Continuous culture was started 24 hours after the start of main culture.
  • the culture medium for activity evaluation was recovered.
  • the sugar concentration in the filtrate was analyzed by the method of Reference Example 1 to confirm that glucose was maintained at 0 g/L, and the non-filtrate for activity evaluation was recovered. Operating conditions for continuous culture using a separation membrane are shown below.
  • Fermentation reactor capacity 2L Separation membrane used: Polyvinylidene fluoride filtration membrane membrane separation element Effective filtration area: 218 cm 2 Temperature adjustment: 30°C pH control during fermentation: 4.0 Fermentation reaction tank aeration rate: non-aerated fermentation reaction tank stirring speed: 300 rpm Flux set value: 0.18 (m 3 /m 2 /day) Cross-flow filtration flow rate 50 (cm/sec) Sterilization: The fermenter containing the separation membrane element is autoclaved at 121°C for 20 minutes for autoclave sterilization. Average pore size: 0.1 ⁇ m Standard deviation of average pore size: 0.035 ⁇ m Membrane surface roughness: 0.06 ⁇ m Pure water permeability coefficient: 50 ⁇ 10 ⁇ 9 (m 3 /m 2 /sec/Pa).
  • Comparative Example 2 Evaluation of CMV promoter activity
  • the recombinant yeast pAUR224-mRuby strain obtained in Comparative Example 1 was cultured in the same manner as in Examples 3 (1) and (2), and the promoter activity was evaluated. evaluated. The results are summarized in Table 3.
  • Example 4 Creation of recombinant yeast (1) Obtaining plasmid vector TCTP1 promoter between the Nco1 and Xho1 recognition sites of pAUR224 (Takara Bio Inc.), or the TCTP promoter described in SEQ ID NO: 5 (hereinafter also referred to as TCTP2 ) was inserted and the gene for the fluorescent protein mScarlet (FPbase ID: FVS3D) was connected downstream thereof, pAURTCTP1-mScarlet and pAURTCTP2-mScarlet were obtained by the gene synthesis service of Genewith.
  • Example 5 Evaluation of promoter activity (1) Continuous culture of recombinant yeast Recombinant yeast pAURTCTP1-mScarlet strain and pAURTCTP2-mScarlet were used, and a separation membrane was used in the same procedure as in Example 3 (1). Continuous culture was performed, and the cells for activity measurement were collected.
  • Comparative Example 4 Evaluation of CMV promoter activity
  • the recombinant yeast pAUR224-mScarlet strain obtained in Comparative Example 1 was cultured in the same manner as in Example 5 (1) and (2), and the promoter activity was evaluated. evaluated. The results are summarized in Table 4.
  • the TCTP promoter is a promoter highly expressed in Schizosaccharomyces yeast during continuous culture. Moreover, it was confirmed from Example 5 and Comparative Example 4 that the function as a promoter is sufficient as long as it contains the base sequence of SEQ ID NO: 5, and that the TCTP promoter has a higher expression level than the CMV promoter. Based on the above, it was evaluated that the target polynucleotide can be highly expressed during continuous culture by using a nucleic acid construct in which the target polynucleotide is connected downstream of the TCTP promoter.

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Abstract

シゾサッカロマイセス属酵母由来ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｔｕｍｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＣＴＰ）遺伝子プロモーターおよびポリヌクレオチド断片を含み、前記プロモーターの下流に、前記ポリヌクレオチド断片が前記プロモーターの支配下で発現するように人為的に接続した核酸構築物を有するシゾサッカロマイセス属酵母を連続培養することで、前記プロモーターの支配下にある前記ポリヌクレオチド断片を高発現させることができる。

Description

核酸構築物
　本発明は、シゾサッカロマイセス属酵母でポリヌクレオチドを発現させることができる核酸構築物に関する。
　シゾサッカロマイセス属酵母は微生物のモデル生物のひとつであり、タンパク質生産や化学品の製造への適用も研究されている。微生物を用いてタンパク質や化学品の製造を行うためには、微生物内で酵素遺伝子をコードしたポリヌクレオチドを発現させる必要があり、そのためにはプロモーターが必要である。
　プロモーターとは、下流に接続されたポリヌクレオチドの発現を支配する核酸配列であり、プロモーターの種類としては、構成的または誘導的に発現するものなどがある。シゾサッカロマイセス属酵母で利用可能なプロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター（非特許文献１）、ｈｓｐ９プロモーター、ｎｍｔ１プロモーター（非特許文献２）などが知られている。
Ｇｉｇａ－Ｈａｍａ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２，４００－４０４（１９９４） Ｓｕｙａｍａ　Ａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ，Ｖｏｌ．１２４，４，３９２－３９９（２０１７）
　微生物培養によるタンパク質や化学品の製造方法では、培養方法としてバッチ発酵、フェドバッチ発酵、連続培養が用いられるが、中でも、連続培養は基質阻害や生産物阻害が起こりにくく、生産性が高くなるという特徴がある。したがって、遺伝子組換え微生物を利用した酵素や化学品の製造方法では、連続培養で高発現するプロモーターの下流に組換え遺伝子であるポリヌクレオチドを接続した核酸構築物を作成し、この核酸構築物を導入した遺伝子組換え微生物を連続培養することで、タンパク質や化学品の製造効率が高まることが期待される。しかしながら、組換えシゾサッカロマイセス属酵母の連続培養において、公知のプロモーターを利用した核酸構築物では十分に機能しないという課題が新規に見出された。
　そこで、本発明の目的は、シゾサッカロマイセス属酵母の連続培養で高発現するプロモーターを含む核酸構築物、該構築物が導入されたシゾサッカロマイセス属酵母、および該構築物内の目的ポリヌクレオチドを発現させる方法を提供することにある。
　本発明者らは、シゾサッカロマイセス属酵母の遺伝子発現を網羅的に解析し、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、シゾサッカロマイセス属酵母由来のｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｔｕｍｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＣＴＰ）遺伝子プロモーターを含む核酸構築物によって前記課題が解決することを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は以下の（１）～（１２）で構成される。
（１）シゾサッカロマイセス属酵母由来ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｔｕｍｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＣＴＰ）遺伝子プロモーターおよびポリヌクレオチド断片を含み、前記プロモーターの下流に、前記ポリヌクレオチド断片を前記プロモーターの支配下で発現するように人為的に接続した、核酸構築物。
（２）前記シゾサッカロマイセス属酵母が、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｒｙｏｐｈｉｌｕｓまたはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓである、（１）に記載の核酸構築物。
（３）前記プロモーターが、ＴＣＴＰ遺伝子の５’非翻訳領域を含み、該非翻訳領域の下流に前記ポリヌクレオチド断片を人為的に接続した、（１）または（２）に記載の核酸構築物。
（４）前記プロモーターが以下の（ａ）または（ｂ）の塩基配列を含むポリヌクレオチドである、（１）～（３）のいずれかに記載の核酸構築物。
（ａ）配列番号１～４のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１～４のいずれかに記載の塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド
（５）前記プロモーターが以下の（ｃ）または（ｄ）の塩基配列を含むポリヌクレオチドである、（１）～（３）のいずれかに記載の核酸構築物。
（ｃ）配列番号５～８のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号５～８のいずれかに記載の塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド
（６）前記ポリヌクレオチド断片がタンパク質をコードする、（１）～（５）のいずれかに記載の核酸構築物。
（７）（１）～（６）のいずれかに記載の核酸構築物を含む、組換えシゾサッカロマイセス属酵母。
（８）（７）に記載の組換えシゾサッカロマイセス属酵母を連続培養する工程を含む、ポリヌクレオチドの発現方法。
（９）前記連続培養が、酵母を培養し得られた培養液を分離膜で濾過し、前記酵母を含む未濾過液を前記培養液に保持または環流し、発酵原料を前記培養液に追加する工程を含む、（８）に記載のポリヌクレオチドの発現方法。
（１０）（７）に記載の組換えシゾサッカロマイセス酵母を培養する工程を含む、化学品の製造方法。
（１１）前記培養が連続培養である、（１０）に記載の化学品の製造方法。
（１２）前記連続培養が、酵母を培養し得られた培養液を分離膜で濾過し、前記酵母を含む未濾過液を前記培養液に保持または環流し、発酵原料を前記培養液に追加する工程を含む、（１１）に記載の化学品の製造方法。
　本発明の核酸構築物を利用すれば、シゾサッカロマイセス属酵母でプロモーターに接続されたポリヌクレオチド断片を連続培養時に高発現させることができる。従って本発明は、シゾサッカロマイセス属酵母を用いたタンパク質や化学品の製造に有用である。
ＴＣＴＰプロモーター活性を有する塩基配列（配列番号５～８）のマルチプルアライメントの結果を示す。
　本明細書中、他の定義がなされない限り、本願に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者が一般に理解する意味を有するものである。
　本明細書において、シゾサッカロマイセス属酵母とは、分類学上のＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に該当する酵母のことを指し、例えばＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｒｙｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｋａｍｂｕｃｈａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｏｓｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｍａｌｉｄｅｖｏｒａｎｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅが挙げられる。
　本明細書において、塩基配列の「配列同一性」とは、対比可能な２つ以上の塩基配列同士の一致の程度をいう。すなわち、ある２つの塩基配列の同一性が高いほどそれらの配列の同一性又は類似性は高い。塩基配列の同一性の程度は、例えば、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。若しくは、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．９０：５８７３－７（１９９３））を用いて決定できる。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を参照すればよい。
　１．核酸構築物
　本発明は、その一実施形態として、シゾサッカロマイセス属酵母由来ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｔｕｍｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＣＴＰ）遺伝子のプロモーターおよびポリヌクレオチド断片を含み、前記プロモーターの下流に、前記ポリヌクレオチド断片が前記プロモーターの支配下で発現するように前記ポリヌクレオチド断片を人為的に接続した、核酸構築物に関する。
　シゾサッカロマイセス属酵母由来のｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｔｕｍｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＣＴＰ）遺伝子プロモーター（以下、単に「ＴＣＴＰプロモーター」と記載することもある。）とは、当該微生物の野生型においてＴＣＴＰ遺伝子の発現を支配しているＤＮＡ配列である限り特に制限されない。
　シゾサッカロマイセス属酵母のＴＣＴＰ遺伝子としては、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ　ＴＣＴＰ遺伝子（ＮＣＢＩ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒ：ＮＭ＿００１０１９７４９）、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ　ＴＣＴＰ遺伝子（ＮＣＢＩ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒ：ＸＭ＿０１３１６１６１５）、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｒｙｏｐｈｉｌｕｓ（ＮＣＢＩ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒ：ＸＭ＿０１３１６８６７３．１）、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ（ＮＣＢＩ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒ：ＸＭ＿００２１７３９４１．２）などが挙げられ、本発明においてはこれら酵母由来のＴＣＴＰプロモーターが好ましく用いられる。
　遺伝子のプロモーター塩基配列は、当業者には明らかである通り、転写開始点の上流（５’側）および必要に応じて下流（３’側）を含む。転写開始点を調べる方法は、特に限定されないが、ｍＲＮＡの配列情報や各種データベースから特定することができる。例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅのＴＣＴＰ遺伝子の転写開始点は、ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿００１０１９７４９．２から得られるＴＣＴＰ遺伝子のｍＲＮＡ配列から特定することができる。
　本発明で用いられるＴＣＴＰプロモーターとしては、シゾサッカロマイセス属酵母のＴＣＴＰ遺伝子の転写開始点の塩基を＋１、その下流（３’側）が＋の値、その上流（５’側）が０もしくは－の値とした場合、好ましくは－１０００～＋２００、より好ましくは－５００～＋１５０、さらに好ましくは－１５０～＋１５０の転写開始点を含む任意の核酸領域が挙げられる。具体例として、配列番号１～８に記載の塩基配列が挙げられ、好ましくは配列番号５～８に記載の塩基配列、より好ましくは配列番号５が挙げられる。
　配列番号１～４に記載の塩基配列は、それぞれ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅのゲノム上のＴＣＴＰ遺伝子の－３５９～＋４１の核酸領域、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓのゲノム上のＴＣＴＰ遺伝子の－１９４～＋２２の核酸領域、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｒｙｏｐｈｉｌｕｓのゲノム上のＴＣＴＰ遺伝子の－３３３～＋８の核酸領域、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓのゲノム上のＴＣＴＰ遺伝子の－２４２～＋１３３の核酸領域である。
　配列番号５～８に記載の塩基配列は、それぞれ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅのゲノム上のＴＣＴＰ遺伝子の－６４～＋４１の核酸領域、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓのゲノム上のＴＣＴＰ遺伝子の－９４～＋２２の核酸領域、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｒｙｏｐｈｉｌｕｓのゲノム上のＴＣＴＰ遺伝子の―１０８～＋８の核酸領域、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓのゲノム上のＴＣＴＰ遺伝子の－７０～＋１３３の核酸領域であり、図１にはＣｌｕｓｔａｌ　Ｗ２（設定：デフォルト）による配列番号５～８に記載の塩基配列のマルチプルアライメント結果を示す。
　ＴＣＴＰプロモーターは、プロモーター活性を有する範囲において塩基配列の変異を有していても良い。塩基配列の変異としては、置換、欠失、挿入、付加などが挙げられる。この場合、変異を有するプロモーターの塩基配列は、配列番号１～８のいずれかに記載の塩基配列と、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有する。
　本発明の核酸構築物は、ポリヌクレオチド断片がＴＣＴＰプロモーターの支配下で発現するように接続されている。「プロモーターの支配下で発現」とは、接続されたポリヌクレオチド断片の発現量、発現時期、発現方法、発現部位などのいずれかひとつ以上が、特定のプロモーターで制御されていることを指し、特定のプロモーターだけの制御に限定するものではない。すなわち、本発明においては、ＴＣＴＰプロモーター以外の要因によってポリヌクレオチド断片の発現量などが変化しても良く、例えば、新たなアクチベーター等を付加することによって発現の制御方法を追加しても良い。
　本発明に用いられるポリヌクレオチド断片はＴＣＴＰプロモーターの支配下で発現させるためのものであれば特に制限はなく、その目的の範囲内であれば任意の２塩基以上のＤＮＡ配列であればよい。また、ポリヌクレオチド断片はタンパク質をコードする塩基配列であっても、ＲＮＡｉを引き起こす二本鎖ＲＮＡの前駆体やリボザイムのようにタンパク質をコードせずに機能する機能性核酸を発現する塩基配列であっても良い。
　ＴＣＴＰプロモーターの支配下で発現するようにポリヌクレオチド断片を人為的に接続する方法は特に制限はされず、当業者には明らかである。ここで、本明細書における「人為的に接続」された状態とは、野生型ＴＣＴＰ遺伝子以外のポリヌクレオチド断片がＴＣＴＰプロモーターの下流に接続された状態を指す。
　本発明の核酸構築物は、ＴＣＴＰプロモーターとポリヌクレオチド断片だけが存在するＤＮＡ配列に限定されたものではなく、その他の塩基配列が存在していても良い。例えば、本発明の核酸構築物の３’末端にポリペプチド断片の転写を終結させるためのターミネーター配列を付加したものであってもよく、本発明の核酸構築物の５’末端または３’に制限酵素配列を付加したものであってもよく、本発明の核酸構築物に制限酵素配列を挿入したものであってもよく、さらにはプラスミドに本発明の核酸構築物を組み込んだものであっても良い。
　本発明の核酸構築物に付加されうるターミネーター配列は特に制限はないが、ａｄｈ１ターミネーター、ｓｖ４０ターミネーター、ｔｅｆターミネーター、ｎｍｔ１ターミネーター、ｕｒａ４ターミネーターなどが挙げられる。
　本発明の核酸構築物を組み込むプラスミドは特に制限はないが、ＰｏｍｂｅＮｅｔ（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｒｎｓｉｆｅ．ｕｓｃ．ｅｄｕ／ｐｏｍｂｅｎｅｔ／ｖｅｃｔｏｒｓ／）に記載のプラスミドが使用できる。具体的には、ｐＡＵＲ２２４（タカラバイオ）、ＲＥＰシリーズ、ｐＫＳシリーズ、ｐＦＡ６ａシリーズなどが挙げられる。
　本発明の核酸構築物の取得方法は特に制限されず、通常の化学合成法または遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、ＮＣＢＩなどに登録されている塩基配列の情報などを元に、ＴＣＴＰプロモーターの下流にポリヌクレオチド断片が接続されたＤＮＡを人工合成することで取得できる。ＤＮＡの人工合成には、例えば、ジーンウィズ社等のサービスを利用することができる。あるいは、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ等の微生物から、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ　ＴＨＩＲＤ　ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｊｏｓｅｐｈ　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｄａｖｉｄ　Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，２００１）記載の方法に従って、プロモーター配列をクローニングし、目的のポリヌクレオチド断片を、例えば、制限酵素法や相同組換え法で接続すれば良い。相同組換え法としては、例えば、タカラバイオ株式会社から発売されている“Ｉｎ　Ｆｕｓｉｏｎ”などを用いることで行うことができる。
　２．組換えシゾサッカロマイセス属酵母
　本発明の一実施形態として、前記核酸構築物を含む組換えシゾサッカロマイセス属酵母および、当該組換え酵母を用いて核酸構築物に含まれるＴＣＴＰプロモーターの下流に位置するポリヌクレオチドを発現させる方法が提供される。
　核酸構築物をシゾサッカロマイセス属酵母に導入する方法としては特に限定されない。例えば、酵母の組換えでよく利用される酢酸リチウム法やエレクトロポレーション法などが挙げられる。Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅにおいてはＹｅａｓｔ，２２：７９９－８０４（２００５）の方法によって効率よく形質転換体を取得できる。Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓにおいては、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ．Ｐｒｏｔｏｃ．，９９６：９９８（２０１７）に形質転換方法が記載されている。
　核酸構築物をシゾサッカロマイセス属酵母に導入する一実施形態として、核酸構築物をシゾサッカロマイセス属酵母のゲノム上に導入する方法がある。核酸構築物をゲノム上に導入する方法として、導入させたいゲノムＤＮＡの遺伝子座と相同な塩基配列を持つＤＮＡ断片と選択マーカーカセットおよび本発明の核酸構築物を連結させたＤＮＡ断片を酵母に導入すれば良い。この際にＣｒｅ／ＬｏｘＰシステムやＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９などのゲノム編集技術を利用しても良い。Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅのゲノムＤＮＡ上に目的ＤＮＡを導入する方法は、ＢＭＣ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：７６（２０１６）の手法で行うことができる。
　核酸構築物をシゾサッカロマイセス属酵母に導入する一実施形態として、核酸構築物を含むベクターをシゾサッカロマイセス属酵母に導入する方法がある。核酸構築物を含むベクターの取得方法は特に制限されず、当業者には明らかである。例えば、前述の核酸構築物と同様に人工合成で取得することができる。また、シゾサッカロマイセス属酵母で機能するベクターに制限酵素法や相同組換え法で接続すれば良い。
　シゾサッカロマイセス属酵母で機能するベクターとしては、宿主細胞内で安定に保持され、微生物内で複製されるものであれば特に限定されない。例えば、ｐＡＵＲ２２４（タカラバイオ株式会社）、ｐＴＩＮ（ＲＮＡ，２６（１１）：１７４３－１７５２（２０２０））、ｐＤＵＡＬシリーズ（Ｙｅａｓｔ，Ｎｏｖ；２１（１５）：１２８９－３０５（２００４））などが挙げられる。
　３．ポリヌクレオチドの発現方法
　本発明の核酸構築物に含まれるＴＣＴＰプロモーターは、シゾサッカロマイセス属酵母の連続培養において好適に機能するため、核酸構築物を導入した組換え酵母を連続培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　ｃｕｌｔｕｒｅ）することで、ＴＣＴＰプロモーターの下流に接続したポリヌクレオチド断片を、組換え酵母内で好適に発現させることができる。本明細書における連続培養とは、適当な時期から流加液の供給及び培養液の引き抜きを行う培養方法を指し、流加液の添加時期、組成、速度、方法などは特に限定されない。流加液供給と引き抜きの開始時期は必ずしも同じである必要はない。また、流加液の供給と引き抜きは連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。連続培養の例としてはケモスタットや分離膜を利用した連続培養方法などが存在する。好ましくは、分離膜を利用した連続培養である。
　分離膜を利用した連続培養は、微生物を培養して化学品を製造する方法において、微生物を培養し、微生物を含む培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収すると同時に、濾過された微生物を培養液に保持し、培養液中の微生物の濃度を高く維持することで、長期間にわたって生産物の収率や生産性を高く維持することが可能となる培養方法である。
　分離膜を利用した連続培養では、発酵原料の供給と培養液の濾過を開始すると、供給された発酵原料は微生物によって代謝され、しばらくすると一定の速度で微生物が増殖する定常状態となる。定常状態であることの確認は、濾過液中に含まれる生産物や、発酵原料の濃度等を分析して、生産物の生産速度や、未利用の発酵原料の濃度等が一定になっていることを確認すればよい。
　培養する組換え酵母を含む未濾過液を回収するタイミングは、連続培養を行っている間、つまり発酵原料の供給および培養液の濾過を開始した後であればよいが、好ましくは定常状態の未濾過液を回収することが好ましい。例えば、定常状態として、供給される発酵原料中に含まれる糖濃度が１００～２００ｇ／Ｌの条件で、濾過液中の糖濃度が好ましくは５ｇ／Ｌ以下、より好ましくは２ｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは０．３ｇ／Ｌ以下に保持されている連続培養での未濾過液を回収することが好ましい。ここで、本発明における糖濃度とは、培養に用いる酵母が資化可能な炭素源としての糖の合計値の濃度を指す。例えば、グルコース、フルクトースが炭素源として含まれる場合は、それらを合計した値の濃度である。また、スクロースなどの多糖の場合には、単糖に分解されたときの重量に換算し糖濃度を算出する。
　分離膜を利用した連続培養は当業者に周知の方法に従えばよく、例えば、国際公開第２００７／０９７２６０号または国際公開第２０１０／０３８６１３号に記載されている連続培養方法に従って実施することができる。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
　（参考例１）糖類の分析
　糖類濃度は、下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。
カラム：“Ｓｈｏｄｅｘ　ＳＨ１０１１”（昭和電工株式会社）
移動相：５ｍＭ　硫酸（流速０．６ｍＬ／分）
反応液：なし
検出方法：ＲＩ（示差屈折率）
温度：６５℃。
　（参考例２）分離膜を利用した連続培養
　酵母としてＳｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ　９７２ｈ－を用い、分離膜を利用した連続培養で培養を行った。発酵原料には、Ｋａｓｅｔｐｈｏｌ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，から購入したケーンモラセスを、水で希釈し、糖濃度を調製したものを用いた。具体的には、ケーンモラセスの原液と水を混合し、一部 を分取した。分取した原料に含まれる糖濃度を参考例１の方法で分析した。分取後に残った発酵原料の比重と重量を測定し体積を求めた。糖分析の結果と計算によって求めた発酵原料の体積から、糖の総重量を算出した。そこに水を添加することで糖濃度を調整し、オートクレープで滅菌処理したものを発酵原料として以下の実験に用いた。発酵原料を調製した後の、糖濃度の分析結果を表１に示す。
　酵母を１０ｍＬのＹＰＤ培地（１００ｇ／Ｌ　グルコース（ナカライテスク株式会社）、１０ｇ／Ｌ　乾燥酵母粉末（ナカライテスク株式会社）、２０ｇ／Ｌ　“Ｂａｃｔｏペプトン”（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｌｔｄ））で一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を新鮮なＹＰＤ培地１００ｍＬに植菌し５００ｍＬバッフルフラスコで２４時間振とう培養した（前培養）。前培養液を１５ｍＬ上記の発酵原料を含む発酵反応槽に添加し、本培養を開始した。本培養開始後２４時間の時点で連続培養を開始すると同時に未濾過の培養液をＲＮＡ抽出用に回収した。この時のＲＮＡサンプルを、バッチフェーズとして発現解析に用いた。連続培養を開始後、参考例１の方法で濾過液中の糖濃度を分析し、グルコース、フルクトース、スクロースがそれぞれ０ｇ／Ｌに保持されたことを確認し、ＲＮＡ抽出用の未濾過液を回収した。この時のＲＮＡサンプルを、連続培養フェーズとして発現解析に用いた。分離膜を利用した連続培養の運転条件を下記に示した。
　［分離膜を利用した連続培養条件］
発酵反応槽容量：２Ｌ
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン製濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積：２１８ｃｍ２
温度調整：３０℃
発酵反応槽通気量：無通気
発酵反応槽撹拌速度：３００ｒｐｍ
フラックス設定値：０．１８（ｍ３／ｍ２／日）
クロスフロー濾過流速１００（ｃｍ／秒）
滅菌：分離膜エレメントを含む発酵槽は１２１℃、２０分のオートクレーブにより高圧蒸気滅菌
平均細孔径：０．１μｍ
平均細孔径の標準偏差：０．０３５μｍ
膜表面粗さ：０．０６μｍ
純水透過係数：５０×１０－９（ｍ３／ｍ２／秒／Ｐａ）。
　（参考例３）ケモスタット培養
　酵母としてＳｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ　９７２ｈ－を用い、ケモスタット培養を行った。発酵原料には、Ｍｉｔｒｐｈｏｌ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，から購入したケーンモラセスを、水で希釈し、糖濃度を調製したものを用いた。具体的には、ケーンモラセスの原液と水を混合し、一部を分取した。分取した原料に含まれる糖濃度を参考例１の方法で分析した。分取後に残った発酵原料の比重と重量を測定し体積を求めた。糖分析の結果と計算によって求めた発酵原料の体積から、糖の総重量を算出した。そこに水を添加することで糖濃度を調整し、オートクレープで滅菌処理したものを発酵原料として以下の実験に用いた。発酵原料を調製した後の、糖濃度の分析結果を表１に示す。
　酵母を１０ｍＬのＹＰＤ培地（１００ｇ／Ｌ　グルコース（ナカライテスク株式会社）、１０ｇ／Ｌ　乾燥酵母粉末（ナカライテスク株式会社）、２０ｇ／Ｌ　“バクトペプトン”（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｌｔｄ））で一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を新鮮なＹＰＤ培地１００ｍＬに植菌し５００ｍＬバッフルフラスコで２４時間振とう培養した（前培養）。前培養液を１５ｍＬ上記の発酵原料を含む発酵反応槽に添加し、本培養を開始した。本培養開始後２４時間の時点で連続培養を開始すると同時にＲＮＡ抽出用の培養液を回収した。この時のＲＮＡサンプルをバッチフェーズとして発現解析に用いた。連続培養を開始後、参考例１の方法で発酵液中の糖濃度を分析し、グルコース、フルクトース、スクロースがそれぞれ０ｇ／Ｌに保持されたことを確認し、ＲＮＡ抽出用の培養液を回収した。この時のＲＮＡサンプルを連続培養フェーズとして発現解析に用いた。ケモスタット培養の運転条件を下記に示す。
　［ケモスタット培養］
発酵反応槽容量：２Ｌ
温度調整：３０℃
発酵反応槽通気量：無通気
発酵反応槽撹拌速度：３００ｒｐｍ
滅菌：原料タンクおよび引き抜きラインを含む発酵槽は１２１℃、２０分のオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（実施例１）プロモーターの同定
　（１）ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ抽出
　ＲＮＡ抽出のために回収した培養液５ｍｌを１５ｍｌ遠心チューブに分取し、遠心分離（８０００ｘｇ，５分，４℃）し、菌体を回収した。回収した菌体を滅菌ミリＱ水で洗浄した。ＲＮＡ抽出はＳｃｈｍｉｔｔらの方法（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１８：３０９１－３０９２（１９９０））を元に行った。回収したＲＮＡは最終的に２０～５０μｌの“ＵｌｔｒａＰｕｒｅ　ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ　Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ　Ｗａｔｅｒ”（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）に溶解した。
　（２）網羅的発現量解析
　網羅的発現量解析はタカラバイオ株式会社のＨｉＳｅｑシステム（イルミナ社）によるＲＮＡ－ｓｅｑ受託サービスを利用した（ｈｔｔｐｓ：／／ｃａｔａｌｏｇ．ｔａｋａｒａ－ｂｉｏ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｕｔａｋｕ／ｂａｓｉｃ＿ｉｎｆｏ．ｐｈｐ？ｕｎｉｔｉｄ＝Ｕ１００００６５５７ｓｈａ－ｐｕａｎｃｈｏｒ０３）。なお、解析手法は２０１７年時点の物である。（１）で得られたｔｏｔａｌ　ＲＮＡを網羅的発現量解析に供することで、酵母内のポリヌクレオチドの発現量を測定した。その結果、各ポリヌクレオチドの配列データ、各ポリヌクレオチドのアノテーション結果およびＦＰＫＭ（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｐｅｒ　ｋｉｌｏｂａｓｅ　ｏｆ　ｅｘｏｎ　ｐｅｒ　ｍｉｌｌｉｏｎ　ｒｅａｄｓ　ｍａｐｐｅｄ）値としてポリヌクレオチドの発現量データを取得した。
　（３）高発現プロモーター配列の同定
　（２）で得られた発現量データとアノテーションデータを元に、バッチ発酵フェーズと連続培養フェーズにおける各ポリヌクレオチドの発現量を比較し、連続培養で発現量の高いポリヌクレオチドを特定した。ポリヌクレオチドのアノテーション情報から、上流のゲノムＤＮＡ配列を探索しプロモーター配列を同定した。
　その結果、ＴＣＴＰ遺伝子の発現量が連続培養フェーズで高発現することを見出し、配列番号１に記載の配列をプロモーター配列として取得した。表２にＴＣＴＰのＦＰＫＭ値と、参考として既知のプロモーターの内、化学品生産の研究（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１２４（４）：３９２－３９９（２０１７））で利用されているプロモーターの遺伝子（ｎｍｔ１、ｈｓｐ９）のＦＰＫＭ値を記載する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（実施例２）組換え酵母の作成
　（１）プラスミドベクターの取得
　ｐＡＵＲ２２４（タカラバイオ株式会社）のＮｃｏ１とＸｈｏ１サイトに配列番号１に記載のＴＣＴＰプロモーター（以降ＴＣＴＰ１とも表記する。）、Ｓａｃ１およびＳａｌ１サイトに蛍光タンパクｍＲｕｂｙ（ＦＰｂａｓｅ　ＩＤ：６ＫＬＡＷ）の遺伝子を導入したプラスミドを設計し、ジーンウィズ遺伝子合成サービスによりｐＡＵＲＴＣＴＰ１－ｍＲｕｂｙを取得した。
　（２）形質転換体の取得
　Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ　９７２ｈ－にＹｅａｓｔ，２２：７９９－８０４（２００５）に記載の方法を一部改変し、（１）で取得したｐＡＵＲＴＣＴＰ１－ｍＲｕｂｙを導入した。具体的には、上記論文の方法におけるヒートショック後の菌体を８０００ｒｐｍで５分遠心し、上清を取り除いた後、ＹＥＬ培地（５ｇ／Ｌ　乾燥酵母粉末（ナカライテスク株式会社）、３０ｇ／Ｌ　グルコース（ナカライテスク株式会社））を１ｍＬ加え、３０℃で６時間静置した。静置後の菌体をＹＥＡ選択培地（ＹＥＬ培地に２０ｇ／Ｌ　精製寒天粉末（ナカライテスク株式会社）、０．５μｇ／ｍＬ　オーレオバシジンＡ（タカラバイオ株式会社）を添加）に植菌し、３０℃で４日間培養した。形成したコロニーを蛍光イメージスキャナー（“ＰＲＩＮＴＧＲＡＰＨ２Ｍ”（ＡＴＴＯ株式会社）ＬＥＤ：Ｃｙａｎ、露光４２９ｍｓ、フィルター：５９５ｎｍ）にて撮影し、光っているコロニーを釣菌、組換え酵母ｐＡＵＲＴＣＴＰ１－ｍＲｕｂｙ株として取得した。
　（実施例３）プロモーター活性の評価
　（１）組換え酵母の連続培養
　組換え酵母ｐＡＵＲＴＣＴＰ１－ｍＲｕｂｙ株を用い、分離膜を利用した連続培養で培養を行った。発酵原料には、５倍濃度のＹＥＬ選択培地（２５ｇ／Ｌ　乾燥酵母粉末（ナカライテスク株式会社）、９０ｇ／Ｌ　グルコース（ナカライテスク株式会社）、０．５μｇ／ｍＬ　オーレオバシジンＡ（タカラバイオ株式会社））を用いた。組換え酵母を１０ｍＬのＹＥＬ選択培地（５ｇ／Ｌ　乾燥酵母粉末（ナカライテスク株式会社）、３０ｇ／Ｌ　グルコース（ナカライテスク株式会社）、０．５μｇ／ｍＬ　オーレオバシジンＡ（タカラバイオ株式会社））で一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を新鮮なＹＥＬ選択培地１００ｍＬに植菌し５００ｍＬバッフルフラスコで２４時間振とう培養した（前培養）。前培養液を１５ｍＬ上記の発酵原料を含む発酵反応槽に添加し、本培養を開始した。本培養開始後２４時間の時点で連続培養を開始した。この際に、活性評価用の培養液を回収した。連続培養を開始後、参考例１の方法で濾過液中の糖濃度を分析し、グルコースが０ｇ／Ｌに保持されたことを確認し、活性評価用の未濾過液を回収した。分離膜を利用した連続培養の運転条件を下記に示した。
　［分離膜を利用した連続培養条件］
発酵反応槽容量：２Ｌ
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン製濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積：２１８ｃｍ２
温度調整：３０℃
発酵中のｐＨ制御：４．０
発酵反応槽通気量：無通気
発酵反応槽撹拌速度：３００ｒｐｍ
フラックス設定値：０．１８（ｍ３／ｍ２／日）
クロスフロー濾過流速５０（ｃｍ／秒）
滅菌：分離膜エレメントを含む発酵槽は１２１℃、２０分のオートクレーブにより高圧蒸気滅菌
平均細孔径：０．１μｍ
平均細孔径の標準偏差：０．０３５μｍ
膜表面粗さ：０．０６μｍ
純水透過係数：５０×１０－９（ｍ３／ｍ２／秒／Ｐａ）。
　（２）プロモーター活性の評価
　（１）で回収した菌体の生菌数（ｃｅｌｌ／ｍＬ）を“ＣｏｕｎｔＳｔａｒ”（Ａｂｅｒ社、測定方法：ｓｔａｎｄａｒｄ）にて測定した。また、菌体を適宜希釈しマルチプレートリーダー（“ＳｙｎｅｒｇｙＨＴ－Ｉ”（ＢｉｏＴｅｋ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））にてＥｘ：５３０ｎｍ、Ｅｍ：５９０ｎｍの条件で蛍光強度を測定した。得られた蛍光強度を生菌数で割ることにより、生菌数あたりの蛍光強度（Ｃｏｕｎｔ／ｃｅｌｌ／ｍＬ）を算出し、プロモーター活性を測定した。結果を表３にまとめる。
　（比較例１）ＣＭＶプロモーター組換え酵母の作成
　（１）プラスミドベクターの取得
　実施例１で作成したプラスミドから制限酵素Ｓａｃ１（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）とＳａｌ１（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を用いてｍＲｕｂｙ遺伝子を取り出し、ｐＡＵＲ２２４（タカラバイオ株式会社）のＳａｃ１およびＳａｌ１部位に“Ｌｉｇａｔｉｏｎ－Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ　Ｋｉｔ”（株式会社ニッポン・ジーン）で導入し、ｐＡＵＲ２２４－ｍＲｕｂｙを取得した。
　（２）形質転換体の取得
　Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ　９７２ｈ－に、（１）で取得したｐＡＵＲ２２４－ｍＲｕｂｙを、実施例２の（２）と同様の手法で形質転換を行い、組換え酵母ｐＡＵＲ２２４－ｍＲｕｂｙ株を取得した。
　（比較例２）ＣＭＶプロモーターの活性評価
　比較例１で取得した組換え酵母ｐＡＵＲ２２４－ｍＲｕｂｙ株について実施例３（１）、（２）と同様の手法で、培養菌体を取得し、プロモーター活性を評価した。結果を表３にまとめる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　（実施例４）組換え酵母の作成
　（１）プラスミドベクターの取得
　ｐＡＵＲ２２４（タカラバイオ株式会社）のＮｃｏ１とＸｈｏ１認識部位の間にＴＣＴＰ１プロモーター、または、配列番号５に記載のＴＣＴＰプロモーター（以降ＴＣＴＰ２とも表記する。）が挿入され、その下流に蛍光タンパクｍＳｃａｒｌｅｔ（ＦＰｂａｓｅ　ＩＤ：ＦＶＳ３Ｄ）の遺伝子が接続されたｐＡＵＲＴＣＴＰ１－ｍＳｃａｒｌｅｔおよびｐＡＵＲＴＣＴＰ２－ｍＳｃａｒｌｅｔをジーンウィズ社の遺伝子合成サービスによって取得した。
　（２）形質転換体の取得
　実施例２（２）に記載の手法と同様の手法を用いて、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ　９７２ｈ－に（１）で取得したｐＡＵＲＴＣＴＰ１－ｍＳｃａｒｌｅｔ、または、ｐＡＵＲＴＣＴＰ２－ｍＳｃａｒｌｅｔを導入し、組換え酵母ｐＡＵＲＴＣＴＰ１－ｍＳｃａｒｌｅｔ株およびｐＡＵＲＴＣＴＰ２－ｍＳｃａｒｌｅｔ株を取得した。
　（実施例５）プロモーター活性の評価
　（１）組換え酵母の連続培養
　組換え酵母ｐＡＵＲＴＣＴＰ１－ｍＳｃａｒｌｅｔ株およびｐＡＵＲＴＣＴＰ２－ｍＳｃａｒｌｅｔを用いて、実施例３（１）と同様の手順にて分離膜を利用した連続培養を行い、活性測定用の菌体を回収した。
　（２）プロモーター活性の評価
　（１）で回収した菌体の生菌数（ｃｅｌｌ／ｍＬ）をＣｏｕｎｔＳｔａｒ（Ａｂｅｒ社、測定方法：ｓｔａｎｄａｒｄ）にて測定した。また、菌体を適宜希釈し、マルチプレートリーダー（“ＳｙｎｅｒｇｙＨＴＸ”（ＢｉｏＴｅｋ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社））にてＥｘ：５４０ｎｍ、Ｅｍ：６２０ｎｍの条件で蛍光強度を測定した。得られた蛍光強度を生菌数で割ることにより、生菌数あたりの蛍光強度（Ｃｏｕｎｔ／ｃｅｌｌ／ｍＬ）を算出し、プロモーター活性を測定した。結果を表４にまとめる。
　（比較例３）ＣＭＶプロモーター組換え酵母の作成
　（１）プラスミドベクターの取得
　ｐＡＵＲ２２４（タカラバイオ株式会社）のＸｈｏ１部位に“Ｉｎ　Ｆｕｓｉｏｎ”（タカラバイオ社製）でｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子を導入できるように、当該キットのマニュアルに記載の方法に従ってプライマーを設計し、実施例４（１）で作成したプラスミドを鋳型にＰＣＲでｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子を増幅した。その後、ｐＡＵＲ２２４（タカラバイオ株式会社）のＸｈｏ１部位に“Ｉｎ　Ｆｕｓｉｏｎ”（タカラバイオ社製）で増幅遺伝子を導入し、ｐＡＵＲ２２４－ｍＳｃａｒｌｅｔを取得した。
　（２）形質転換体の取得
　Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ　９７２ｈ－に（１）で取得したｐＡＵＲ２２４－ｍＳｃａｒｌｅｔを、実施例２（２）と同様の手法で導入し、組換え酵母ｐＡＵＲ２２４－ｍＳｃａｒｌｅｔ株を取得した。
　（比較例４）ＣＭＶプロモーターの活性評価
　比較例１で取得した組換え酵母ｐＡＵＲ２２４－ｍＳｃａｒｌｅｔ株について実施例５（１）、（２）と同様の手法で、培養菌体を取得し、プロモーター活性を評価した。結果を表４にまとめる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　（まとめ）
　実施例１、３、５からＴＣＴＰプロモーターは、シゾサッカロマイセス属酵母において連続培養時に高発現するプロモーターであることが確認された。また、実施例５および比較例４からプロモーターとしての機能は配列番号５に記載の塩基配列を含んでいれば良く、ＴＣＴＰプロモーターはＣＭＶプロモーターと比較して発現量が高いことが確認された。以上から、ＴＣＴＰプロモーターの下流に目的ポリヌクレオチドを接続した核酸構築物を利用することで、連続培養時に目的ポリヌクレオチドを高発現できると評価した。

Claims (12)

  1. 　シゾサッカロマイセス属酵母由来ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｔｕｍｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＣＴＰ）遺伝子プロモーターおよびポリヌクレオチド断片を含み、前記プロモーターの下流に、前記ポリヌクレオチド断片を前記プロモーターの支配下で発現するように人為的に接続した、核酸構築物。
  2. 　前記シゾサッカロマイセス属酵母が、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｒｙｏｐｈｉｌｕｓまたはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓである、請求項１に記載の核酸構築物。
  3. 　前記プロモーターが、ＴＣＴＰ遺伝子の５’非翻訳領域を含み、該非翻訳領域の下流に前記ポリヌクレオチド断片を人為的に接続した、請求項１または２に記載の核酸構築物。
  4. 　前記プロモーターが以下の（ａ）または（ｂ）の塩基配列を含むポリヌクレオチドである、請求項１～３のいずれかに記載の核酸構築物。
    （ａ）配列番号１～４のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
    （ｂ）配列番号１～４のいずれかに記載の塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド
  5. 　前記プロモーターが以下の（ｃ）または（ｄ）の塩基配列を含むポリヌクレオチドである、請求項１～３のいずれかに記載の核酸構築物。
    （ｃ）配列番号５～８のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
    （ｄ）配列番号５～８のいずれかに記載の塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド
  6. 　前記ポリヌクレオチド断片がタンパク質をコードする、請求項１～５のいずれかに記載の核酸構築物。
  7. 　請求項１～６のいずれかに記載の核酸構築物を含む、組換えシゾサッカロマイセス属酵母。
  8. 　請求項７に記載の組換えシゾサッカロマイセス属酵母を連続培養する工程を含む、ポリヌクレオチドの発現方法。
  9. 　前記連続培養が、酵母を培養し得られた培養液を分離膜で濾過し、前記酵母を含む未濾過液を前記培養液に保持または環流し、発酵原料を前記培養液に追加する工程を含む、請求項８に記載のポリヌクレオチドの発現方法。
  10. 　請求項７に記載の組換えシゾサッカロマイセス酵母を培養する工程を含む、化学品の製造方法。
  11. 　前記培養が連続培養である、請求項１０に記載の化学品の製造方法。
  12. 　前記連続培養が、酵母を培養し得られた培養液を分離膜で濾過し、前記酵母を含む未濾過液を前記培養液に保持または環流し、発酵原料を前記培養液に追加する工程を含む、請求項１１に記載の化学品の製造方法。
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